CN110494564B - 来自甜菊的鼠李糖合成酶及基因 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，提供具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质，以及编码该蛋白质的多核苷酸。本发明提供由葡萄糖制造鼠李糖的方法，该方法使用来自甜菊的鼠李糖合成酶及基因。本发明还提供使用来自甜菊的鼠李糖合成酶的甜菊醇糖苷的制造方法。

Description

来自甜菊的鼠李糖合成酶及基因
技术领域
本发明涉及具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质，及编码该蛋白质的多核苷酸，以及使用该蛋白质的鼠李糖及甜菊醇糖苷的制造方法。
背景技术
在菊科甜菊(Stevia rebaudiana)的叶中包含作为二萜的一种被称作甜菊醇(Steviol)的次级代谢产物,由于甜菊醇糖苷呈现砂糖的约300倍的甜味而作为低热量的甜味剂在食品产业中被利用。肥胖作为深刻的社会问题在国际上日益严峻，从增进健康及削减医疗费的观点出发低热量甜味剂的需求也日益增大。目前，人工合成的氨基酸衍生物阿斯巴甜(Aspartame)、乙酰磺胺酸钾(Acesulfame Potassium)作为人工甜味剂被利用，但像甜菊醇糖苷这样天然存在的低热量甜味剂更为安全，从而期待其容易得到消费者理解(Public Acceptance)。
甜菊的主要甜菊醇糖苷，以糖最终修饰为添加了4个糖的被称为瑞鲍迪苷A(Rebaudioside A；RebA)的糖苷(图1)。作为其前体的甜菊醇3糖糖苷的甜菊苷(Stevioside)在量上最多，这两种物质是甜菊的甜味的核心物质。已知甜菊苷在甜菊叶中的含量最多，且呈现砂糖的250～300倍程度的甜味。RebA是甜味高(砂糖的350～450倍)且味道好的甜菊醇4糖糖苷，这些作为低热量甜味剂受瞩目。除此以外，已知存在被认为是反应中间体的糖苷或糖的种类不同的类似物。例如，RebA的4个糖苷糖均为葡萄糖，但是已知有在其中13位的葡萄糖的2位上添加了并非葡萄糖而是鼠李糖的瑞鲍迪苷C(RebC)或在同位置上添加了木糖的瑞鲍迪苷F(RebF)。
达成RebA的生物合成的酶基因，通过甜菊的Expressed Sequence Tag(EST)分析得到分离(非专利文献1及2，专利文献1)。植物激素即二萜的赤霉素(Gibberellin)的前体即贝壳杉烯酸(ent-kaurenoic acid)的13位通过贝壳杉烯酸13位羟基化酶(EK13H)被羟基化从而生成甜菊醇(图1)(专利文献1)。首先，甜菊醇的13位的羟基通过甜菊的UDP糖依赖性糖基转移酶(UDP-sugar dependent glycosyltransferase:UGT)即UGT85C2而糖苷化(葡糖基化)从而生成甜菊单糖苷(steviolmonoside)(非专利文献1，2)。甜菊单糖苷的13位的葡萄糖的2位进一步葡糖基化从而生成甜菊双糖苷(steviolbioside)，或者甜菊单糖苷的19位的羧基葡糖基化生成名为甜叶悬钩子苷(Rubusoside)的甜菊醇的二糖糖苷。UGT91D2作为对甜菊双糖苷或甜叶悬钩子苷的13位葡萄糖的2位进行葡糖基化的酶被报告(以前称为UGT91D-like3)(专利文献2)。另一方面，已有报告指出13位的葡萄糖的3位由于UGT76G1而葡糖基化，对于19位的羧酸分别由于UGT74G1而葡糖基化(非专利文献2)。报告指出像这样确定负责糖苷化直至RebA的酶基因，使甜菊醇糖苷的生物合成酶群在酵母菌中异位表达，通过培养而生产甜菊醇糖苷(专利文献3)，甜菊酶的产业上的利用正在进行中。
作为含有葡萄糖以外的糖苷糖的甜菊醇糖苷，已知有RebC(含有鼠李糖)或RebF(含有木糖)，然而添加葡萄糖以外的糖的UGT酶尚不明确。进一步，关于葡萄糖以外的UDP-糖的生成，报告有拟南芥中的UDP鼠李糖合成酶(非专利文献3)，然而在甜菊中尚不明确。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：EP 1 897 951 B1
专利文献2：WO2013/137487
专利文献3：WO2014/122328
非专利文献
非专利文献1：Brandle and Telmer(2007)Phytochemistry 68,1855-1863
非专利文献2：Richman et al(2005)Plant J.41,56-67
非专利文献3：Oka et al(2007)J.Biol.Chem.282,5389-5403
非专利文献4：Natsume et al(2015)Plant Cell Physiol.56,428-441
发明内容
本发明的课题在于，提供具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质，以及编码该蛋白质的多核苷酸。
本发明者们进行了深入研究，结果成功确定了甜菊中由葡萄糖生成鼠李糖的SrRHM1及SrRHM2蛋白质的氨基酸序列及编码该蛋白质的基因序列。本发明，基于上述见识。
通过使用本发明的酶可以由葡萄糖生成鼠李糖。此外，使用这样生成的鼠李糖，可以生产具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷。此外，通过促进或阻碍该酶的作用，可以控制甜菊植物体中的甜菊醇糖苷的种类。进一步，使用本发明的酶的表达基因，可以通过代谢工程学途径生产具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷。
附图说明
图1表示甜菊醇糖苷群的名称与结构。图1中“Glc-Glc(β2→1)”表示“Glc-Glc”以β2，1糖苷键键合，“Glc-Glc(β3→1)”表示“Glc-Glc”以β3，1糖苷键键合。
图2表示对PCR产物进行基于0.8％琼脂糖凝胶的电泳，并进行溴化乙锭染色的结果。
图3表示制备的酶的SDS-PAGE分离后的CBB染色及使用抗HisTag抗体的蛋白质印迹分析的结果。
图4-1表示负对照组的由UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖的活性。
图4-2表示拟南芥的AtRHM2的由UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖的活性。
图4-3表示重组SrRHM1#1的由UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖的活性。
图4-4表示重组SrRHM1#2的由UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖的活性。
图4-5表示重组SrRHM1#3的由UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖的活性。
图4-6表示重组SrRHM2#1的由UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖的活性。
图4-7表示重组SrRHM2#2的由UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖的活性。
图5表示SrRHM重组蛋白质的比活性。
图6表示实施例4中得到的各植物体的SrRHM基因的表达。
图7表示酵母菌中，来自甜菊的RHM与UGT85C2、UGT91D2L#16、UGT74G1及UGT76G1的共表达。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细的说明。以下的实施方式为用于说明本发明的例示，并非将本发明仅限定于该实施方式的意思。本发明，只要不脱离该主旨，可以用各种各样的方式实施。另外，本说明书中引用的所有的文献及公开公报、专利公报以及专利文献，作为参考纳入本说明书中。此外，本说明书包含2017年4月12日提出申请的作为本申请的优先权主张的基础的日本专利申请(日本特愿2017-079041号)的说明书及附图中记载的内容。
本发明者们率先成功确定了甜菊中由葡萄糖生成鼠李糖的SrRHM1蛋白质及SrRHM2蛋白质的氨基酸序列与编码该蛋白质的基因序列。SrRHM1蛋白质中含有3种变异体SrRHM1#1、SrRHM1#2及SrRHM1#3，其氨基酸序列分别为序列号2、4及6，其CDS序列分别由序列号1、3及5表示。SrRHM2蛋白质中含有2种变异体SrRHM2#1及SrRHM2#2，其氨基酸序列分别为序列号8及10，其CDS序列分别由序列号7及9表示。
在此，所谓用语“SrRHM1蛋白质”，包括3种变异体SrRHM1#1、SrRHM1#2及SrRHM1#3的各蛋白质，用语“SrRHM2蛋白质”，包括2种变异体SrRHM2#1及SrRHM2#2的各蛋白质。
多核苷酸及酶，可以通过下述实施例中所述的方法、公知的基因工程学的方法、公知的合成方法等而获得。
1.来自甜菊的鼠李糖合成酶
本发明提供选自以下(a)～(c)中的任一项所述的蛋白质(以下，称“本发明的蛋白质”)。
(a)由序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列构成的蛋白质；
(b)由序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列中，1～33个氨基酸缺失、取代、***及/或添加的氨基酸序列构成，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质；
(c)具有相对于序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列具有95％以上的序列一致性的氨基酸序列，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质。
上述(b)或(c)所述的蛋白质，代表性的，为天然存在的序列号2、4、6、8或10的多肽的变异体，也包含可使用例如，"Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A LaboratoryManual Vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons 1987-1997"、"Nuc.Acids.Res.,10,6487(1982)"、"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)"、"Gene,34,315(1985)"、"Nuc.Acids.Res.,13,4431(1985)"、"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)"等所述的部位特异性变异导入法，而人为获取的物质。
本说明书中，作为“由序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列中，1～33个氨基酸缺失、取代、***及/或添加的氨基酸序列构成，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质”，可列举由序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列中，例如，1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个(1～数个)、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸缺失、取代、***及/或添加的氨基酸序列构成，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、***、及/或添加的数，一般而言越小越优选。
此外，作为上述蛋白质，可列举具有与序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列具有95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上或99.9％以上的序列一致性的氨基酸序列，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质。上述序列一致性的数值一般而言越大越优选。
在此，所谓“由葡萄糖生成鼠李糖的活性”，是指如下述式中所示由葡萄糖生成鼠李糖的活性。
根据本发明的优选方式，上述葡萄糖以尿苷二磷酸葡糖的形式存在。此外，根据本发明的其他的优选方式，上述鼠李糖以尿苷二磷酸鼠李糖的形式存在。
或者，在使用本发明的蛋白质由葡萄糖生成鼠李糖时，作为中间体得到具有下述结构的4-酮基-6-脱氧葡萄糖也可。
由葡萄糖生成鼠李糖的活性，可以通过以下方法进行验证：在含有被检测蛋白质及葡萄糖(例如，UDP-葡萄糖)1～1000μM(优选100～700μM，最优选500μM)的pH6.0～8.0的中性区域的缓冲液(例如，磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液)中，于20～40℃的温度下孵育10分钟～2小时后进行提纯，通过LC-MS分析(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)等公知的方法对提纯后的生成物进行分析。
LC-MS分析的结果，检测到鼠李糖时，可以称上述被检测蛋白质具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性。
上述鼠李糖生成反应，一般于1分钟～12小时左右结束。
所谓本发明的蛋白质的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基缺失、取代、***及/或添加，是指在同一序列中任意且1个或多个的氨基酸序列中的位置上，有1个或多个氨基酸残基缺失、取代、***及/或添加，也可同时发生缺失、取代、***及添加中的2种以上。
以下示出可相互取代的氨基酸残基的例子。包含于同一组的氨基酸残基可以相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G群：苯基丙氨酸、酪氨酸。
本发明的蛋白质，可以通过使编码该蛋白质的多核苷酸(参考后述的“本发明的多核苷酸”)在适当的宿主细胞内表达而获取，也可以根据Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等化学合成法来制造。此外，还可以利用Advanced Automation PeptideProtein Technologies公司制、Perkin Elmer公司制、Protein Technologies公司制、PerSeptive公司制、Applied Biosystems公司制、SHIMADZU公司制等肽合成机进行化学合成。
2.鼠李糖的制造方法
通过利用本发明的蛋白质具有的由葡萄糖生成鼠李糖的活性，可以简单且大量地制造鼠李糖。
于是，在其他的实施方式中，本发明提供使本发明的蛋白质与葡萄糖反应而制造鼠李糖的方法。具体而言，本发明的鼠李糖的制造方法，为含有使选自以下(a)～(c)中的任一项所述的蛋白质与葡萄糖反应的工序的鼠李糖的制造方法：
(a)由序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列构成的蛋白质；
(b)由序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列中，1～33个氨基酸缺失、取代、***及/或添加的氨基酸序列构成，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质；
(c)具有相对于序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列具有95％以上的序列一致性的氨基酸序列，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质。
在此，关于上述(a)～(c)，如已对“本发明的蛋白质”所做出的说明。此外，根据本发明的优选方式，上述葡萄糖以尿苷二磷酸葡糖的形式存在。此外，根据本发明的其他的优选方式，上述鼠李糖以尿苷二磷酸鼠李糖的形式存在。或者，在使用本发明的转化体由葡萄糖生成鼠李糖时，作为中间体得到具有上述结构的4-酮基-6-脱氧葡萄糖也可。
本发明的第1鼠李糖的制造方法，也可以进一步含有对上述工序中的生成物进行提纯的工序。
生成的鼠李糖，可通过适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)进行萃取，可通过乙酸乙酯以及其他有机溶剂：水的梯度、高效液相色谱法(HighPerformance Liquid Chromatography：HPLC)、超高效液相色谱(Ultra(High)PerformanceLiquid chromatography：UPLC)等公知的方法进行提纯。
根据本发明的其他方式，提供含有根据本发明的鼠李糖的制造方法而得到的鼠李糖或尿苷二磷酸鼠李糖的甜味剂、饮食品或医药品。甜味剂、饮食品或医药品的例子将在本说明书中稍后说明。此外，根据本发明的进一步其他方式，提供至少含有一个根据本发明的鼠李糖的制造方法而得到的鼠李糖的甜菊醇糖苷。另外，本说明书中，所谓“至少含有一个鼠李糖的甜菊醇糖苷”是指“至少具有一个鼠李糖基的甜菊醇糖苷”。
3.富含鼠李糖的非人类转化体
鼠李糖可使用本发明的蛋白质在细菌(大肠杆菌或酵母菌等)、植物、微生物、昆虫、除人类以外的哺乳动物等的细胞内生成。由于本发明的蛋白质是来自甜菊的酶或其变异体，因此可期待其在细胞内环境中也具有高活性。该情况下，可以将含有编码本发明的蛋白质的多核苷酸(参考下述的“本发明的多核苷酸”)与表达盒的载体，导入来自细菌、微生物、植物、昆虫、除人类以外的哺乳动物等的宿主细胞中，使本发明的蛋白质得到表达，通过使本发明的蛋白质与存在于上述细胞内的葡萄糖或UDP-葡萄糖反应从而可生成鼠李糖或UDP-鼠李糖。
在此，本发明提供导入了选自以下(a)～(d)中的任一项所述的多核苷酸(以下称“本发明的多核苷酸”)的非人类转化体(以下称“本发明的转化体”)。
(a)含有序列号1、3、5、7或9的碱基序列的多核苷酸；
(b)编码由序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；
(c)编码由序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列中，1～33个氨基酸缺失、取代、***及/或添加的氨基酸序列构成，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质的多核苷酸；
(d)编码具有相对于序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列具有95％以上的序列一致性的氨基酸序列，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质的多核苷酸。
根据本发明的优选方式，上述葡萄糖以尿苷二磷酸葡糖的形式存在。此外，根据本发明的其他的优选方式，上述鼠李糖以尿苷二磷酸鼠李糖的形式存在。或者，在使用本发明的转化体由葡萄糖生成鼠李糖时，作为中间体得到具有上述结构的4-酮基-6-脱氧葡萄糖也可。
本说明书中，所谓“多核苷酸”是指DNA或RNA。上述的本发明的多核苷酸，可以通过公知的基因工程学的方法或公知的合成方法而获得。
本发明的多核苷酸，优选以***到适当的表达载体的状态导入宿主中。
适当的表达载体，通常由含有下述物质而构成：
(i)在宿主细胞内可以转录的启动子；
(ii)与该启动子结合的本发明的多核苷酸；及，
(iii)和RNA分子的转录终止及聚腺苷酸化相关，作为在宿主细胞内发挥作用的信号的构成要素而含有的表达盒。
作为表达载体的制作方法，可列举利用质粒、噬菌体或黏质体的方法，并无特别限定。
载体的具体的种类无特别限定，可在宿主细胞中适当选择可以表达的载体。即，根据宿主细胞的种类，为了确切的使本发明的多核苷酸表达，选择适宜的启动子序列，将在各种质粒中编入了此序列和本发明的多核苷酸的载体作为表达载体使用即可。
本发明的表达载体，依赖于需要导入的宿主的种类含有表达控制区域(例如，启动子、终止子及/或复制起点等)。作为细菌用表达载体的启动子，使用惯用的启动子(例如，trc启动子、tac启动子、lac启动子等)，作为酵母菌用启动子，例如可列举GAL1启动子、GAL10启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、PH05启动子等，作为丝状真菌用启动子，例如可列举淀粉酶、trpC等。此外，作为使植物细胞内的目的基因表达的启动子的例子，可列举在植物细胞内具有使多核苷酸组成性表达的启动子的载体，或具有由于外在刺激活化为诱导型的启动子的载体。作为使多核苷酸组成性表达的启动子的例子，可列举花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子、rd29A基因启动子、rbcS启动子、mac-1启动子等。作为由于外在刺激活化为诱导型启动子的例子，可列举小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、四环霉素应答性启动子、金属硫蛋白启动子及热休克蛋白启动子等。作为动物细胞宿主用启动子，可列举病毒性启动子(例如，SV40初期启动子、SV40后期启动子等)。
表达载体优选至少含有一种选择标记。作为上述标记，可以利用营养缺陷型标记(ura5、niaD、TRP1、URA3、HIS3、LEU2)、耐药性标记(潮霉素、博来霉素)、耐遗传霉素性基因(G418r)、耐铜性基因(CUP1)(Marin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.81,p.337,1984)、耐浅蓝霉素性基因(fas2m、PDR4)(分别为，猪腰淳嗣等，生物化学，vol.64,p.660,1992；Hussain et al.,Gene,vol.101,p.149,1991)等。
本发明的转化体，被期待能高效地生产鼠李糖。用于转化的宿主细胞无特别限定，可适用各种公知的细胞。例如作为宿主细胞的例子，可列举大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌、酵母菌(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、裂殖酵母Schizosaccharomycespombe)等微生物、植物细胞、除人类以外的动物细胞等。
用于上述宿主细胞的适当的培育培养基及条件在该领域众所周知。此外，成为转化的对象的生物也无特别限定，可列举以上述宿主细胞为例的各种微生物或植物或除人类以外的动物。
此外，关于一般的分子生物学的方法，可以参考"Sambrook&Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics,A laboratory manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY)”等。
本发明的一种方式中，作为转化的宿主细胞可以使用任意的酵母菌。具体而言，可列举酵母菌(Saccharomyces)属等的酵母菌，但并不限定于此。
作为酵母菌的转化方法，可利用通常所用的公知的方法。例如，可以通过电穿孔法"Meth.Enzym.,194,p182(1990)"、原生质球法"Proc.(12)JP 4918504B22012.4.18Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)"、醋酸锂法"J.Bacteriology,153,p163(1983)"、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)、Methods in yeast genetics,2000Edition:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中记载的方法来实施，但并不限定于此。转化株，通过选拔在具有与使用的选择标记相符的选择压的培养基(例如，含有抗生素的培养基或缺失营养素的培养基)上繁殖的菌株而获得。
在本发明的1种方式中，作为转化体中使用的宿主细胞，可使用任意的植物体。本实施方式所涉及的植物转化体，通过将含有本发明所涉及的多核苷酸的重组载体，导入植物体中从而使由该多核苷酸编码的多肽得到表达而获取。或者，由于本发明的基因会遗传给后代，从而通过将本发明的转化体作为杂交亲本使用，可以得到具有该基因的新型植物体。
本发明中成为转化的对象的植物体是指以下任何物质：植物体全体、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、软组织、木质部、维管束、栅栏薄壁组织、海绵状组织等)或植物培养细胞、又或者各种形态的植物细胞(例如悬浊培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈伤组织等。作为转化所使用的植物体，并无特别限定，可以是属于单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物体的任意一种皆可。作为特别优选的例子，优选使用以甜菊醇作为糖苷配基而生物合成各种糖苷而被熟知的植物体，作为这样的植物体，可列举甜菊或甜叶悬钩子(Rubus suavissimus)等。
在向植物的基因导入中，使用本领域的技术人员所公知的转化方法(例如，农杆菌法、基因枪法、PEG法、电穿孔法、粒子枪法等)。
导入了基因的细胞或植物组织，首先通过潮霉素耐受性等耐药性的选择，然后依照常规再生为植物体。由转化细胞到植物体的再生可以根据植物细胞的种类，以本领域的技术人员所公知的方法实施。
对本发明的多核苷酸是否已导入到植物中的确认，可以通过PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等来实施。
通过培养这样得到的转化体，可以使转化体生产鼠李糖。如上所述，通过向转化体的培养系中添加葡萄糖或含有葡萄糖的植物萃取物作为底物，可以促进鼠李糖的制造。通过对累积的生成物进行萃取、提纯，可以得到目的物鼠李糖。
4.转化体的萃取物及其利用
此外，本发明在其他的实施方式中，提供上述转化体的萃取物。本发明的转化体在具有适当的底物时，或者从外部添加适当的底物时，相比其野生型，鼠李糖的含量高，因此认为在其萃取物中，以高浓度含有具有鼠李糖或鼠李糖基的甜菊醇糖苷。
本发明的转化体的萃取物，可以通过用玻璃珠、均化机或超声破碎仪等粉碎转化体，对该粉碎物进行离心处理，回收其上清液而获得。进一步，根据上述鼠李糖的萃取方法，可以施加进一步的萃取工序。
本发明的转化体的萃取物可以依照常规用于，例如甜味剂、饮食品、医药品、工业原料的制造等用途。
此外本发明在其他的实施方式中，提供含有本发明的转化体的萃取物的甜味剂、饮食品、医药、工业原料(饮食品等的原料)。含有本发明的转化体的萃取物的甜味剂、饮食品、医药、工业原料的制备依照常规。如此，含有本发明的转化体的萃取物的甜味剂、饮食品、医药、工业原料等含有使用本发明的转化体生成的具有鼠李糖或鼠李糖基的甜菊醇糖苷。
作为本发明的饮食品的例子，可列举营养补充食品、健康食品、特定保健用食品、功能性表示食品、幼儿用食品、老人用食品等。本说明书中，食品为固体、流体及液体，以及他们的混合物，是可摄食物品的总称。
所谓营养补充食品，是指强化特定的营养成分的食品。所谓健康食品，是指健康的或者对健康有利的食品，包含营养补充食品、自然食品、减肥食品等。所谓特定保健用食品，是指含有对身体的生理学机能等有影响的成分，在科学上证明其特定的保健效果，向国家出示科学性的依据，接受了有效性或安全性的审查的食品。所谓功能性表示食品，是指作为以科学性依据为基础在商品包装上表示其功能性的物品，向消费者厅申报的食品。所谓幼儿用食品，是指用于提供给至约6岁的儿童的食品。所谓老人用食品，是指为使其比未处理的食品容易消化及吸收而处理的食品。
本发明的饮食品，作为甜味剂使用具有鼠李糖或鼠李糖基的甜菊醇糖苷。因此，本发明的食品是低热量的，具有有助于促进健康或维持健康的优点。
作为这些饮食品的形态的例子，可以是面包、面类、意大利面、米饭、糕点类(蛋糕、冰淇淋、棒冰、炸面包圈、烤制点心、糖果、口香糖、橡皮糖、片剂糖，以及日式丸子及日式馒头等日本糕点)、豆腐及其加工品等农产食品、清酒、药用酒、甜料酒、食醋、酱油、日本大酱等发酵食品、酸奶、火腿、培根、香肠等畜产食品、鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品、果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等或者调味料。作为进一步的食品的形态的例子，可列举低热量饮料、无糖饮料、水果罐头、乳制饮料、粉末饮料、酸奶、果冻、调味汁、面蘸汁、腌菜、日本佃煮(Tsukudani)、酱油、日本大酱、腌制食品、Vermont醋、糖醋藠头、糖醋生姜、醋藕，此外，腌菜、天妇罗及蒲烧的酱汁、烤肉的酱汁、酱等，口香糖、糖果及饴糖、牙膏、炸鱼饼、日式煎蛋卷、炒面酱、中华冷面汁、醋腌青花鱼、冰点心、雪葩、甜筒冰淇淋、鱼肉加工食品、点心、日本米果、玉米杯、调味海苔、油炸面团、拌饭料等。
本发明的医药品(组合物)的剂型并无特别限定，可以为溶液状、膏状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型。
本发明的医药组合物根据需要，可以进一步含有其他的医药活性成分(例如，消炎成分)或辅助成分(例如，润滑成分、载体成分)。
5.具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷的制造方法
根据本发明的其他方式，提供一种甜菊醇糖苷的制造方法，其特征在于，包含使本发明的蛋白质与葡萄糖反应得到鼠李糖的工序，与将鼠李糖转移至甜菊醇或甜菊醇糖苷的工序。
具体而言，本发明的甜菊醇糖苷的制造方法为包含使选自以下的(a)～(c)中的任一项所述的蛋白质：
(a)由序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列构成的蛋白质；
(b)由序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列中，1～33个氨基酸缺失、取代、***及/或添加的氨基酸序列构成，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质；
(c)具有相对于序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列具有95％以上的序列一致性的氨基酸序列，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质，
与葡萄糖反应得到鼠李糖的工序；
及将鼠李糖转移至甜菊醇或甜菊醇糖苷的工序的甜菊醇糖苷的制造方法。
使本发明的蛋白质与葡萄糖反应得到鼠李糖的工序，正如于“2.鼠李糖的制造方法”中所记载的内容。将鼠李糖转移至甜菊醇或甜菊醇糖苷的工序，只要能向甜菊醇或甜菊醇糖苷转移鼠李糖即可，并无特别限定，例如，使用将鼠李糖转移至甜菊醇或甜菊醇糖苷的酶来实施。作为上述酶，可以使用UGT91D2酶(序列号11)或UGT91D2#16酶(序列号13)等。此外，也可以使用导入编码上述酶的基因(序列号12及14)的宿主细胞将鼠李糖转移至甜菊醇或甜菊醇糖苷。根据本发明的优选方式，将所述鼠李糖转移至甜菊醇或甜菊醇糖苷的工序，通过使用导入(i)含有序列号11或13的碱基序列的多核苷酸，或(ii)编码相对于序列号12或14的氨基酸序列具有90％以上的一致性，且具有在与甜菊醇糖苷的13位上键合的葡萄糖上以1→2键合的方式添加鼠李糖的活性的蛋白质的多核苷酸的非人类转化体而实施。
进一步，使用导入了编码与由甜菊醇至瑞鲍迪苷C的一系列的糖苷合成相关的糖苷化酶的基因或对这些基因进行表达的宿主细胞，通过在同宿主细胞中使本发明的多核苷酸进行表达，可以制造更高度地糖苷化的甜菊醇糖苷(例如，甜菊中具有鼠李糖基的杜克苷A、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷N及瑞鲍迪苷O等)。作为与由甜菊醇至瑞鲍迪苷C的一系列的糖苷合成相关的糖苷化酶及其基因的例子，可列举UGT91D2(CDS序列：序列号11，氨基酸序列：序列号12)、UGT91D2#16(CDS序列：序列号13，氨基酸序列：序列号14)、UGT85C2(CDS序列：序列号15，氨基酸序列：序列号16)、UGT74G1(CDS序列：序列号17，氨基酸序列：序列号18)及UGT76G1(CDS序列：序列号19，氨基酸序列：序列号20)等。本发明的甜菊醇糖苷的制造方法的优选方式中，进一步包含使用导入了下述(a)～(e)中至少一种的多核苷酸的非人类转化体的工序。
(a)(i)含有序列号15的碱基序列的多核苷酸，或(ii)编码相对于序列号16的氨基酸序列具有90％以上的一致性，且具有在甜菊醇糖苷的13位的羟基上添加葡萄糖的活性的蛋白质的多核苷酸；
(b)(i)含有序列号17的碱基序列的多核苷酸，或(ii)编码相对于序列号18的氨基酸序列具有90％以上的一致性，且具有在甜菊醇糖苷的19位的羧酸上添加葡萄糖的活性的蛋白质的多核苷酸；
(c)(i)含有序列号19的碱基序列的多核苷酸，或(ii)编码相对于序列号20的氨基酸序列具有90％以上的一致性，且具有在甜菊醇糖苷的13位的葡萄糖的3位上以1→3键合的方式添加葡萄糖的活性的蛋白质的多核苷酸；
(d)(i)含有序列号11或13的碱基序列的多核苷酸，或(ii)编码相对于序列号12或14的氨基酸序列具有90％以上的一致性，且具有在甜菊醇糖苷的19位的葡萄糖上以1→2键合的方式添加葡萄糖的活性的蛋白质的多核苷酸；
(e)(i)含有序列号19的碱基序列的多核苷酸，或(ii)编码相对于序列号20的氨基酸序列具有90％以上的一致性，且具有在甜菊醇糖苷的19位的葡萄糖上以1→3键合的方式添加葡萄糖的活性的蛋白质的多核苷酸。
甜菊醇糖苷，只要含有鼠李糖基即可，并无特别限定，优选选自杜克苷A、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷N及瑞鲍迪苷O或这些的组合。
6.根据具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷含量对植物体进行筛选的方法
本发明，提供根据具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷含量对植物体进行筛选的方法(以下，称“本发明的筛选方法”)。在此，所谓“筛选”，是指对具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷含量在一定量以上(或以下)的植物体及其以外的植物体进行识别，对具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷含量高(或低)的植物体进行选择。具体而言，本发明的筛选方法，为对具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷含量高的植物体、具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷含量低的植物体或不含有具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷的植物体进行筛选的方法。从而，通过使用本发明的筛选方法，也可以选择不具有鼠李糖基，仅含有葡萄糖基的甜菊醇糖苷的含量高的植物。
本发明的筛选方法为根据具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷的含量对植物体进行筛选的方法，
该方法为包含由被检验植物体对选自以下(a)～(d)中的多核苷酸进行定量的工序，及将所述多核苷酸量与标准值进行比较，根据多核苷酸量对被试验植物体进行分类的工序的方法。
(a)含有序列号1、3、5、7或9的碱基序列的多核苷酸；
(b)编码由序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；
(c)编码由序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列中，1～33个氨基酸缺失、取代、***及/或添加的氨基酸序列构成，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质的多核苷酸；
(d)编码具有相对于序列号2、4、6、8或10的氨基酸序列具有95％以上的序列一致性的氨基酸序列，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质的多核苷酸。
在本发明的筛选方法的优选方式中，提供根据具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷的含量对植物体进行筛选的方法，
该方法包含由被检验植物体对选自以下(a’)～(d’)中的多核苷酸进行定量的工序，及将所述多核苷酸量与标准值进行比较，根据多核苷酸量对被试验植物体进行分类的工序。
(a’)含有序列号7或9的碱基序列的多核苷酸；
(b’)编码由序列号8或10的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；
(c’)编码由序列号8或10的氨基酸序列中，1～33个氨基酸缺失、取代、***及/或添加的氨基酸序列构成，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质的多核苷酸；
(d’)编码具有相对于序列号8或10的氨基酸序列具有95％以上的序列一致性的氨基酸序列，且具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质的多核苷酸。
对该多核苷酸进行定量的第1工序，可以通过微阵列法、RealTime PCR法、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交法等公知的方法实施。
在将上述对多核苷酸量与标准值进行比较，根据多核苷酸量对被试验植物体进行分类的第2工序中，只要是本领域的技术人员即可对“标准值”进行适当设定。例如，将标准值设定为任意的甜菊植物体的一部分(叶、茎、根等)中含有的该多核苷酸的量，在分类中，在被试验植物体的对应部分(叶、茎、根等)中含有的该多核苷酸的量比上述标准值多(少)时，可将该被试验植物体归类为具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷含量高(低)的植物体。
或者，标准值也可以是变动的。例如，对多种被试验植物体进行比较，可将其中在第1位至第n位(n为1以上的整数)上该多核苷酸量高(低)的被试验植物体归类为具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷含量高(低)的植物体，此时，在第n+1位上该多核苷酸量多的被试验植物体的该多核苷酸量成为标准值。
实施例
以下，用实施例对本发明进行更具体地说明，然而本发明的范围并不限定于这些实施例。
[实施例1]鼠李糖合成酶的候选基因的分离
本实施例中使用的分子生物学的方法，只要没有其他详述，依照MolecularCloning(Sambrook等,Cold Spring Harbour Laboratory Press,2001)中所记载的方法。
使用RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN)由甜菊叶提取总RNA，通过DNAase set(QIAGEN)消化混合的DNA。通过BioAnalyzer的RNA6000 nano chip(Agilenttechnologies)对萃取的RNA的品质进行确认后，使用TrueSeq Standard total RNA withRiboZero Plant Kit(Illumina)以本领域的技术人员推荐的方法，构建cDNA文库。通过BioAnalyzer的DNA1000chip(Agilent technologies)对生成的文库的品质进行确认后，使用Cycleave PCR Quantification Kit(TaKaRa Bio)进行定量。使用HiSeq1500(Illumina)测序仪对文库进行Pair end(2x101循环)的测序。使用Trinity程序由(非专利文献4)中记载的方法对得到的读取片段(Read)的碱基序列进行De Novo组装，得到甜菊叶的EST信息。
对于得到的甜菊EST，将公知的AtRHM2(序列号21)的序列信息(非专利文献3)作为查询提供给基于tBlastx的相似性检索分析。其结果，发现与AtRHM2在DNA水平上表现出74％及72％的序列一致性的甜菊SrRHM1#1基因(序列号1)及SrRHM2#1基因(序列号7)。
为了得到甜菊叶中发现的SrRHM1基因及SrRHM2基因，以下述引物集(序列号22及23，以及序列号24及25)将由多种不同血统的甜菊叶制备的cDNA作为模板实施了PCR。
SrRHM1-pET-FW(序列号22)
TGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTACTTACGTGCCAAAG
SrRHM1-pET-RV(序列号23)
GTTAGCAGCCGGATCCTTAATGTTTTTTGTTAGGTTCGAATACG
SrRHM2Full-Fw(序列号24)
TGCCGCGCGGCAGCCATATGACCAGTTATACACCTAAAAAC
SrRHM2Full-Rv(序列号25)
GTTAGCAGCCGGATCCTTAGGTTGTCTTGTTGGGTGCAAATAC
关于甜菊叶cDNA，是利用RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN)由甜菊叶中提出总RNA，通过用Random Oligo-dT引物对其中的0.5μg进行反转录(RT)反应而获得。
PCR反应液(50μl)由来自甜菊叶的cDNA 1μl、1×ExTaq buffer(TaKaRaBio)、0.2mM dNTPs、引物各0.4pmol/μl、ExTaq polymerase 2.5U所组成。PCR反应，于94℃下反应3分钟后，对94℃下1分钟、50℃下1分钟、72℃下2分钟的反应进行了总计30个循环的扩增。对PCR产物进行基于0.8％琼脂糖凝胶的电泳，并进行溴化乙锭染色后，得到由SrRHM1及SrRHM2基因的cDNA推断的约2.0kb大小的扩增带(图2)。
该约2kb的PCR产物亚克隆至pET15b载体(Novagen公司)的NdeI及BamHI的位点上，使用DNA Sequencer model 3100(Applied Biosystems)，由基于合成寡核苷酸引物的引物步移法确定序列。其结果，明确了除序列号1的SrRHM1#1以外，还存在与其在DNA及氨基酸水平上表现出99％的序列一致性的SrRHM1#2及SrRHM1#3总计3种类的SrRHM1基因(序列号3及5)。同样得到了与SrRHM2#1在DNA及氨基酸水平上表现出99％的序列一致性的SrRHM2#2(序列号9)。另外，这些SrRHM基因与位于本载体NdeI位点上游的His标签和***的基因的开放阅读框相匹配，为了使融合了SrRHM1和His标签的嵌合蛋白进行表达而进行了设计。
另外，相对于拟南芥的AtRHM2，来自甜菊的SrRHM1#1、SrRHM1#2及SrRHM1#3在DNA水平上表现出74％的序列一致性，SrRHM2#1及#2在DNA水平上表现出72％的序列一致性。
[实施例2]重组蛋白质的表达及提纯
为了明确本发明的酶的生物化学机能，使本发明的酶在大肠杆菌中进行了表达。使用上述得到的3种SrRHM1基因及2种SrRHM2基因的大肠杆菌表达用质粒依照常规对大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行了转化。将得到的转化体在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基(10g/l typtone pepton，5g/l yeast extract，1g/l NaCl)4ml中，于37℃下振动培养一晚。将达到静止期的培养液4ml接种于相同组成的培养基80ml中，于37℃下振动培养。在菌体浓度(OD600)大约达到0.5的时间点添加最终浓度0.5mM的IPTG，于18℃下振动培养20小时。
以下所有操作于4℃下实施。通过对培养的转化体进行离心分离(5,000×g，10min)收集菌群，添加Buffer S[20mM HEPES缓冲液(pH 7.5)、20mM imidazol,14mMβ-巯基乙醇]1ml/g cell，并悬浊。接下来，实施超声波破碎(15sec×8回)，并实施离心分离(15,000×g，15min)。将得到的上清液作为粗酶液进行了回收。将粗酶液负荷于用Buffer S进行了平衡化的His SpinTrap(GE Healthcare)中，并进行了离心(70×g，30sec)。用缓冲液洗净后，用含有100mM及500mM的imidazole的Buffer S各5ml，对与层析柱结合的蛋白质进行了阶段性的洗脱。利用Microcon YM-30(Amicon)对各洗脱部分向20mM HEPES缓冲液(pH7.5)、14mMβ-巯基乙醇进行了缓冲液置换(透析倍数约500倍)。
制备的酶的SDS-PAGE分离后的CBB染色及利用了抗HisTag抗体的蛋白质印迹的结果，在200mM imidazole洗脱部分中，在SrRHM1或SrRHM2与His标签的融合嵌合蛋白的推断分子量的约75kDa附近检测出于负对照组(pET15b empty vector)中未发现的蛋白质，因此将该部分用于酶分析(图3)。
[实施例3]酶活性测定
标准的酶反应条件如以下所示。用蒸馏水制备100μl反应液(100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)、5mM UDP-葡萄糖(底物)、2mM NADPH、5mM DTT、2mM EDTA、提纯酶溶液60μl)，使其于30℃下反应24小时。在下述条件下对5μl酶反应液进行了LC-MS分析。
LC条件
色谱柱：TOSOH TSKgel Amide-80 3μm(2.0 x 150mm)
流动相：A:10mM醋酸铵水溶液,B:乙腈
梯度：0-0.2min(B conc 95％恒定)，
0.2-14.0min(B conc 95％→30％)，
14.0-14.2min(B conc 30％→95％)
20.0min分析结束
流速：0.2mL/min
色谱柱温箱：40℃
MS条件
ESI(负模式)
MRM测定(CE 25)：m/z 565.1→323.0(UDP-葡萄糖)
m/z 549.1→323.0(UDP-鼠李糖)
以上述条件对酶反应液进行了分析，结果在负对照的空载体实验组中仅在保留时间约10分钟处检测出底物UDP-葡萄糖(图4-1)。另一方面，在正对照的拟南芥的AtRHM2的重组蛋白质的反应组中除底物UDP-葡萄糖以外，在保留时间约9.6分钟处检查出UDP-鼠李糖(图4-2)。
接下来，使重组SrRHM1#1、SrRHM1#2及SrRHM1#3蛋白质分别与UDP-葡萄糖反应，结果在任一反应组中皆确认到显著的UDP-鼠李糖的合成(图4-3、4-4及4-5)。
同样，关于SrRHM2也进行了活性评估。使SrRHM2#1，SrRHM2#2蛋白质分别与UDP-葡萄糖反应，结果在任一反应组中皆确认到显著的UDP-鼠李糖的合成(图4-6、4-7)。
接下来，对这些重组蛋白质的比活性进行了评估。将反应后的残存UDP-葡萄糖量与反应生成的UDP-鼠李糖量的总计定标为1。其结果，确认了本发明的重组蛋白质(SrRHM1#1、SrRHM1#2及SrRHM1#3蛋白质以及SrRHM2#1及SrRHM2#2蛋白质)相比拟南芥的AtRHM2的重组蛋白质具有高鼠李糖生成活性。此外，还确认了相比SrRHM1类，SrRHM2类的鼠李糖生成量高的倾向(图5)。
以上结果显示SrRHM1#1、SrRHM1#2及SrRHM1#3蛋白质以及SrRHM2#1及SrRHM2#2蛋白质为在甜菊叶中进行表达的UDP-鼠李糖合成酶。从而，认为这些酶与甜菊中具有鼠李糖基的杜克苷A、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷N及瑞鲍迪苷O等的合成有关。
[实施例4]基因表达分析
关于此次发现活性的两种SrRHM基因的表达，通过RT-PCR法对含有RebC的独立甜菊植物体(1，2)及未检出RebC的甜菊植物体(3，4)的叶中有无表达进行了分析。
对于SrRHM1通过序列号22及23，SrRHM2通过序列号24、25的引物集，在与实施例1相同的条件下，进行了32循环的扩增。作为内部标准基因使用甜菊的肌动蛋白基因(SrACTIN)，通过序列号26及27的引物集进行了扩增(23循环)。
SrRHM1-pET-FW(序列号22)
TGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTACTTACGTGCCAAAG
SrRHM1-pET-RV(序列号23)
GTTAGCAGCCGGATCCTTAATGTTTTTTGTTAGGTTCGAATACG
SrRHM2Full-Fw(序列号24)
TGCCGCGCGGCAGCCATATGACCAGTTATACACCTAAAAAC
SrRHM2Full-Rv(序列号25)
GTTAGCAGCCGGATCCTTAGGTTGTCTTGTTGGGTGCAAATAC
SrACTIN-Fw(序列号26)
ATGGCCGATACTGAGGATATTCAG
SrACTIN-Rv(序列号27)
AGCACTTCCTGTGGACAATGGA
其结果，确认了在未检出RebC的甜菊植物体(3，4)中特异性的SrRHM2的基因表达减少(图6)。从而，表示甜菊叶中在甜菊醇糖苷的鼠李糖转移中使用的UDP-鼠李糖，主要由SrRHM2供应。
[实施例5]使用酵母菌的UDP-鼠李糖的发酵生产
接下来，使用得到的SrRHM1及SrRHM2，对在酵母菌中能否进行UDP-鼠李糖的合成进行了研究。
酵母菌用表达载体的构建
为了将UDP-鼠李糖合成酶基因编入酵母菌表达载体而设计了下述引物集。
StRHM1集
Apa-SrRHM1-F(下划线部为ApaI识别部位)：
5’-GGGCCCATGGCTACTTACGTGCCAAAG-3’(序列号28)
Xho-SrRHM1-R(下划线部为XhoI识别部位)：
5’-CTCGAGTTAATGTTTTTTGTTAGGTTCGAATACG-3’(序列号29)
StRHM2集
Bam-SrRHM2-F(下划线部为BamHI识别部位)：
5’-GGATCCATGACCAGTTATACACCTAAAAACATCC-3’(序列号30)Xho-SrRHM2-R(下划线部为XhoI识别部位)：
5’-CTCGAGTTAGGTTGTCTTGTTGGGTGC-3’(序列号31)
通过将SrRHM1作为模板与SrRHM1集，将SrRHM2作为模板与SrRHM2集组成模板与引物的组合，使用耐热性KOD DNA聚合酶(东洋纺)，通过PCR进行扩增，在各自的ORF的两端添加了限制酶位点。利用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen)对得到的DNA片段进行亚克隆，利用DNA Sequencer model 3100(Applied Biosystems)，由基于合成寡核苷酸引物的引物步移法确定序列，确认了作为目标的UGT基因分别被克隆。
为了使上述基因在酵母菌中表达，使用pESC酵母菌表达***(Stratagene)构建了以下表达载体。
·质粒pESC-TRP-SrRHM1的构建以限制酶ApaI和XhoI将SrRHM1切出，与以限制酶ApaI和限制酶XhoI将载体pESC-TRP(Stratagene)切断的产物进行连接，得到质粒pESC-TRP-SrRHM1。
·质粒pESC-TRP-SrRHM2的构建以限制酶BamHI和XhoI将SrRHM2切出，与以限制酶BamHI和限制酶XhoI将载体pESC-TRP(Stratagene)切断的产物进行连接，得到质粒pESC-TRP-SrRHM2。
酵母菌的转化
将Saccharomyces cerevisiae YPH499株(ura3-52 lys2-801amberade2-101ochretrp1-Δ63his3-Δ200leu2-Δ1a)作为宿主，用醋酸锂法，通过质粒pESC-TRP-SrRHM1，pESC-TRP-SrRHM2进行了转化。作为转化株，选择了在SC-Trp琼脂培养基(每1L中，Yeastnitrogen base without amino acids 6.7g、葡萄糖20g、氨基酸混合粉-Trp 1.3g、Bactoagar 20g)上繁殖的酵母菌。另外氨基酸混合粉-Trp是将腺嘌呤硫酸盐2.5g、L-精氨酸盐酸盐1.2g、L-天冬氨酸6.0g、L-谷氨酸6.0g、L-组氨酸1.2g、L-亮氨酸3.6g、L-赖氨酸1.8g、L-蛋氨酸1.2g、L-苯丙氨酸3.0g、L-丝氨酸22.5g、L-苏氨酸12g、L-酪氨酸1.8g、L-缬氨酸9.0g、尿嘧啶1.2g混合调制而成。另一方面，通过载体pESC-TRP，将以与上述同样的方法转化的菌株作为对照菌株(C-1菌株)。
导入基因的表达诱导与表达分析
将得到的转化株以下述方式培养。
首先，作为预培养在SC-Trp液体培养基(去除SC-Trp琼脂培养基的Bacto agar)10ml中，分别接种各转化株，于30℃下震动培养1天。接下来，作为正式培养，将预培养液的1ml接种到10ml的SG-Trp液体培养基(每1L中，Yeast nitrogen base without aminoacids 6.7g、半乳糖20g、氨基酸混合粉-Trp 1.3g)，于30℃下震动培养2天。
为了确认在转化株中导入的基因是否进行了表达，从培养液中收集菌体，用RNeasy Mini Kit，提取了总RNA。
取总RNA 1μg，以Superscript II逆转录酶(Thermo Fisher Scientific)、随机六聚体作为引物，合成了cDNA。
为了确认导入基因的表达，制作以下引物。
SrRHM1表达确认用
SrRHM1-r1
5’-CGAGTTAGGTATTTGGACACCA-3’(序列号32)
SrRHM2表达确认用
SrRHM2-r1
5’-TACCGGGTCCTGAAAGATGAC-3’(序列号33)
GAL10p区域(启动子区域)
PGAL10-f3：
5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’(序列号34)
各导入基因的表达通过以下引物的组合，将之前合成的cDNA作为模板，使用ExTaq(TAKARA BIO)实施PCR，通过对其产物进行琼脂糖凝胶电泳进行了确认。
SrRHM1：SrRHM1-r1(序列号32)与PGAL10-f3(序列号34)
SrRHM2：SrRHM2-r1(序列号33)与PGAL10-f3(序列号34)
将确认了导入的基因得到表达的菌株分别作为SR1-1菌株，SR2-1菌株。
UDP-糖的分析
从以与上述表达分析相同的操作进行培养得到的10ml培养液中，通过离心分离回收酵母菌体，向其中添加15ml冰冷却的1M甲酸(1-丁醇饱和)，于4℃下缓慢搅拌1小时。对通过离心分离去除了菌体的上清液进行冷冻干燥。将得到的冷冻干燥物溶解至200μl水中，提供给HPLC。
HPLC条件如下所示。
色谱柱：COSMOSIL(R)5C18-ARII(4.6mmI.D.x 250mm)
柱温：40℃
流动相：20mM醋酸三乙胺(pH7.0)，流速：1ml/min
检测：UV260
其结果，相对于在C-1菌株中未确认到UDP-鼠李糖的生成，在SR-1菌株、SR2-1菌株中均确认了UDP-鼠李糖的生成。
[实施例6]使用酵母菌的RebC的生成
来自甜菊的糖苷化酶基因cDNA的克隆
在cDNA的克隆中，分别使用下述引物集。
UGT85C2基因扩增用引物集
CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw(下划线部为NdeI识别部位)：
5’-CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3’(序列号35)
BglII-SrUGT85C2-Rv(下划线部为BglII识别部位)：
5’-AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3’(序列号36)
UGT91D2及UGT91D2#16基因扩增用引物集
SrUGT91D2-pET15b-FW
5’-TGCCGCGCGGCAGCCATATGTACAACGTTACTTATCATC-3’(序列号37)
SrUGT91D2-pET15b-RV
5’-GTTAGCAGCCGGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAA-3’(序列号38)
UGT74G1基因扩增用引物集
CACC-NdeI-SrUGT74G1-Fw(下划线部为NdeI识别部位)：
5’-CACCCATATGGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAAT-3’(序列号39)
BamHI-SrUGT74G1-Rv(下划线部为BamHI识别部位)：
5’-GGATCCTTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATT-3’(序列号40)
UGT76G1基因扩增用引物集
CACC-NdeI-SrUGT76G1-Fw(下划线部为NdeI识别部位)：
5’-CACCCATATGGAAAATAAAACGGAGACCA-3’(序列号41)
BamHI-SrUGT76G1-Rv(下划线部为BamHI识别部位)：
5’-GGATCCTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTA-3’(序列号42)
PCR反应液(50μl)由来自甜菊叶的cDNA 1μl、1×KOD plus buffer(TOYOBO)、0.2mM dNTPs、引物各0.4pmol/μl、1mM MgSO4、1U耐热性KOD plus polymerase所组成。PCR反应，于95℃下反应5分钟后，对94℃下0.5分钟、50℃下0.5分钟、68℃下2分钟的反应进行了总计30个循环的扩增。对各PCR产物进行基于0.8％琼脂糖凝胶的电泳，并进行溴化乙锭染色，结果得到由各自的模板DNA推断的约1.4kb大小的扩增带。
此PCR产物用制造商所推荐的方法亚克隆到了pENTR-TOPO Directional载体(Invitrogen)。使用DNA Sequencer model 3100(Applied Biosystems)，由基于合成寡核苷酸引物的引物步移法确定序列，确认了作为目标的UGT基因，即UGT85C2、UGT91D2及UGT91D2#16、UGT74G1、UGT76G1的全部UGT基因完成了克隆。
酵母菌用表达载体的构建
为了将这些UGT基因及UDP-鼠李糖合成酶基因编入酵母菌表达载体而设计了下述引物集。
SrUGT85C2集
Bgl2-UGT85C2-F(下划线部为BglII识别部位)：
5’-ACAGATCTATGGATGCAATGGCTACAACTGAGA-3’(序列号43)
Sal-UGT85C2-R(下划线部为SalI识别部位)：
5’-TAGTCGACTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTTC-3’(序列号44)
SrUGT91D2集
NotI-UGT91DIL3-F(下划线部为NotI识别部位)：
5’-AAGCGGCCGCATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAAA-3’(序列号45)
Pac-UGT91D1L3-R(下划线部为PacI识别部位)：
5’-CGTTAATTAACTCTCATGATCGATGGCAACC-3’(序列号46)
SrUGT74G1集
Not-UGT74G1-F(下划线部为NotI识别部位)：
5’-AAGCGGCCGCATGGCGGAACAACAAAAGATCAAG-3’(序列号47)
Pac-UGT74G1-R(下划线部为PacI识别部位)：
5’-CGTTAATTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATTCG-3’(序列号48)
SrUGT76G1集
Bam-UGT76G1-F(下划线部为BamHI识别部位)：
5’-AAGGATCCATGGAAAATAAAACGGAGACCACCG-3’(序列号49)
Sal-UGT76G1-R(下划线部为SalI识别部位)：
5’-GCGTCGACTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTAGAGACTCTAA-3’(序列号50)
通过将UGT85C2作为模板与SrUGT85C2集、将UGT91D2或UGT91D2L#16作为模板与SrUGT91D2集、将UGT74G1作为模板与SrUGT74G1集、将UGT76G1作为模板与SrUGT76G1集组成模板与引物的组合，利用耐热性KOD DNA聚合酶(东洋纺)，通过PCR扩增，在各自的ORF的两端添加了限制酶位点。利用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen)对得到的DNA片段进行亚克隆，利用DNA Sequencer model 3100(Applied Biosystems)，由基于合成寡核苷酸引物的引物步移法确定序列，确认了作为目标的UGT基因分别被克隆。
为了使上述基因在酵母菌中表达，使用pESC酵母菌表达***(Stratagene)构建了以下表达载体。
(1)质粒pESC-URA-UGT56或pESC-URA-UGT56R的构建
以限制酶BglII和限制酶SalI将UGT85C2切出，与以限制酶BamHI和限制酶SalI将载体pESC-URA(Stratagene)切断的产物进行连接，得到质粒pESC-URA-UGT-1。将以限制酶NotI和限制酶PacI将该质粒pESC-URA-UGT-1切断的产物与以限制酶NotI和限制酶PacI对UGT91D2或UGT91D2L#16进行切出的产物连接，得到pESC-URA-UGT56或pESC-URA-UGT56R。
(2)质粒pESC-HIS-UGT78的构建
以限制酶BamHI和限制酶SalI将UGT76G1切出，与以相同限制酶将载体pESC-HIS(Stratagene)切断的产物进行连接，得到质粒pESC-HIS-UGT-8。将以限制酶NotI和限制酶PacI将该质粒pESC-HIS-UGT-8切断的产物与以限制酶NotI和限制酶PacI对UGT74G1进行切出的产物连接，得到pESC-HIS-UGT78。
酵母菌的转化
将Saccharomyces cerevisiae YPH499株(ura3-52lys2-801amberade2-101ochretrp1-Δ63his3-Δ200leu2-Δ1a)作为宿主，用醋酸锂法，导入表1的质粒。作为转化株，选择了在SC-Trp&Ura&His琼脂培养基(每1L中，Yeast nitrogen base without amino acids6.7g、葡萄糖20g、氨基酸混合粉-Trp&Ura&His 1.3g、Bacto agar 20g)上繁殖的酵母菌。
[表1]
表1
另外，氨基酸混合粉-Trp&Ura&His是将腺嘌呤硫酸盐2.5g、L-精氨酸盐酸盐1.2g、L-天冬氨酸6.0g、L-谷氨酸6.0g、L-亮氨酸3.6g、L-赖氨酸1.8g、L-蛋氨酸1.2g、L-苯丙氨酸3.0g、L-丝氨酸22.5g、L-苏氨酸12g、L-酪氨酸1.8g、L-缬氨酸9.0g混合调制而成。
导入基因的表达诱导与表达分析
将得到的转化株以下述方式培养。
首先，作为预培养在SC-Trp&Ura&His液体培养基(去除SC-Trp&Ura&His琼脂培养基的Bacto agar)10ml中，分别接种各转化株，于30℃下震动培养1天。接下来，作为正式培养，将预培养液的1ml接种到10ml的SG-Trp&Ura&His液体培养基(每1L中，Yeast nitrogenbase without amino acids 6.7g、半乳糖20g、氨基酸混合粉-Trp&Ura&His 1.3g)，于30℃下震动培养2天。
为了确认在转化株中导入的基因是否进行了表达，从培养液中收集菌体，用RNeasy Mini Kit，提取了总RNA。
取总RNA 1μg，以Superscript II逆转录酶(Thermo Fisher Scientific)、随机六聚体作为引物，合成了cDNA。
为了确认导入基因的表达，制作以下引物。
UGT85C2表达确认用
UGT85C2-r1：
5’-CAAGTCCCCAACCAAATTCCGT-3’(序列号51)
UGT91D2及UGT91D2L3#16表达确认用
UGT91D1L3-r1：
5’-CACGAACCCGTCTGGCAACTC-3’(序列号52)
UGT74G1表达确认用
UGT74G1-r1：
5’-CCCGTGTGATTTCTTCCACTTGTTC-3’(序列号53)
UGT76G1表达确认用
UGT76G1-r1：
5’-CAAGAACCCATCTGGCAACGG-3’(序列号54)
GAL10p区域(启动子区域)
PGAL10-f3：
5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’(序列号55)
GAL1p区域(启动子区域)
PGAL1-f3：
5’-CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC-3’(序列号56)
各导入基因的表达通过以下引物的组合，将之前合成的cDNA作为模板，利用ExTaq(TAKARA BIO)实施了PCR，通过对该产物进行琼脂糖凝胶电泳进行了确认。
UGT85C2：UGT85C2-r1(序列号51)与PGAL1-f3(序列号56)
UGT91D2或UGT91D2L3：UGT91D1L3-r1(序列号52)与PGAL10-f3(序列号55)
UGT74G1：UGT74G1-r1(序列号53)与PGAL1-f3(序列号56)
UGT76G1：UGT76G1-r1(序列号54)与PGAL10-f3(序列号55)
由此，确认了导入的基因在转化株中进行了表达。
新型甜菊醇糖苷的生产
除了向SG-Trp&Ura&His液体培养基每1ml中添加2μg的甜菊醇(ChromaDex Inc.)以外，在与上述实施例5相同的条件下进行了培养。培养结束后，通过将培养液离心分离，分离成上清液和菌体。用乙腈对培养上清液进行洗净后，提供给用水平衡后的Sep-Pak C18层析柱，用20％乙腈进行洗净后，用80％乙腈进行洗脱，干燥固化后，溶解至少量的80％乙腈中制备糖苷样本。将该糖苷样本提供给以下的分析。
基于HPLC的分析
通过HPLC对得到的甜菊醇糖苷进行了分析，条件如下所述。
色谱柱：COSMOSIL 5C18-AR-II 4.6mmI.D.x 250mm(nacalai tesque)
流动相：A；乙腈，B；10mM磷酸钠缓冲液(pH2.6)
B conc.70％→30％40分钟linear gradient
流速：1ml/分钟
温度：40℃
检测：UV 210nm
使UDP-鼠李糖合成酶基因与甜菊醇糖苷化酶基因共表达的S1-5678菌株、S1-56R78菌株、S2-5678菌株、S2-56R78菌株中生成了rebC。相比使UGT91D2表达的菌株，使UGT91D2L#16表达的菌株rebC的生成量多。使UGT91D2L#16表达的结果示于图7。
工业实用性
根据本发明，利用SrRHM1及SrRHM2基因可以由葡萄糖生成鼠李糖。此外，通过控制含有鼠李糖基的甜菊醇糖苷的含量，可以控制甜菊甜味制剂的甜度及味道。特别是SrRHM2的基因表达与含有鼠李糖基的甜菊醇糖苷的有无的关联性高，认为可将该基因作为标记用于构成甜菊植物体的甜味糖苷的糖的质的选拔。此外，本发明提供不仅在植物中，在微生物中也可以通过代谢工程途径生产以RebC为代表的含有鼠李糖基的甜菊醇糖苷的分子工具。
序列表
<110> SUNTORY HOLDINGS LIMITED
<120> 来自甜菊的鼠李糖合成酶及基因
<130> G1685WO
<150> JP 2017-079041
<151> 2017-04-12
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2022
<212> DNA
<213> 甜菊（Stevia rebaudiana）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2022)
<400> 1
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Met Ala Thr Tyr Val Pro Lys Asn Ile Leu Ile Thr Gly Ala Ala Gly
1 5 10 15
ttc atc gcc tct cat gtt gct aac cgc tta gtc aga agc tac cct gat 96
Phe Ile Ala Ser His Val Ala Asn Arg Leu Val Arg Ser Tyr Pro Asp
20 25 30
tac aag att gtt gtg ctt gac aag ctt gat tat tgt tcc aat ctt aaa 144
Tyr Lys Ile Val Val Leu Asp Lys Leu Asp Tyr Cys Ser Asn Leu Lys
35 40 45
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Asn Leu Asn Pro Ser Lys Ser Ser Pro Asn Phe Lys Phe Val Lys Gly
50 55 60
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Asp Ile Gly Ser Ala Asp Leu Val Asn Tyr Leu Leu Ile Thr Glu Ser
65 70 75 80
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Ile Asp Thr Ile Met His Phe Ala Ala Gln Thr His Val Asp Asn Ser
85 90 95
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Phe Gly Asn Ser Phe Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Tyr Gly Thr His
100 105 110
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Val Leu Leu Glu Ala Cys Lys Val Thr Gly Gln Ile Arg Arg Phe Ile
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His Val Ser Thr Asp Glu Val Tyr Gly Glu Thr Glu Glu Asp Ala Val
130 135 140
gtt ggt aac cat gaa gct tca caa ctt ctt cct acc aac ccg tat tcc 480
Val Gly Asn His Glu Ala Ser Gln Leu Leu Pro Thr Asn Pro Tyr Ser
145 150 155 160
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Ala Thr Lys Ala Gly Ala Glu Met Leu Val Met Ala Tyr Gly Arg Ser
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180 185 190
aat caa ttt cca gag aaa cta atc cct aaa ttc atc ctt ctg gcg atg 624
Asn Gln Phe Pro Glu Lys Leu Ile Pro Lys Phe Ile Leu Leu Ala Met
195 200 205
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tat ctg tac tgt gaa gat gtt gca gaa gct ttt gaa gta att ctt cac 720
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aaa gga gaa gtt ggt cat gtt tac aac ata ggg acg aaa aaa gaa agg 768
Lys Gly Glu Val Gly His Val Tyr Asn Ile Gly Thr Lys Lys Glu Arg
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cga gtg att gat gtt gca aaa gat atg tgc aag ctt ttc aat atg gat 816
Arg Val Ile Asp Val Ala Lys Asp Met Cys Lys Leu Phe Asn Met Asp
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Pro Asp Ser Ser Ile Lys Phe Val Glu Asn Arg Pro Phe Asn Asp Gln
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Gln Ile Gly Val Gln Ile Pro Asn Ser Lys Pro Ser Gly Val Ser Phe
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340 345 350
Pro Glu Asn Ala Asp Phe Asp Ser Ala Asp Val Ala Ile Asn Thr Ser
355 360 365
Gln Ile Gly Val Gln Ile Pro Asn Ser Lys Pro Ser Gly Val Leu Val
370 375 380
Lys Lys Pro Gly Leu Lys Phe Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Gly Trp Ile
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Gly Gly Leu Leu Gly Lys Leu Cys Asp Lys Gln Gln Ile Gln Tyr Glu
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Tyr Gly Arg Gly Arg Leu Glu Asp Arg Ser Gln Leu Leu Ala Asp Ile
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Pro Ile Ser Ser Asp Leu Asn Asn Pro Arg Asn Phe Ile Thr Lys Ile
545 550 555 560
Ala Arg Tyr Asp Lys Val Val Asn Ile Pro Asn Ser Met Ser Ile Leu
565 570 575
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Gly Ile Trp Asn Phe Thr Asn Pro Gly Val Val Ser His Asn Glu Ile
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<213> 甜菊（Stevia rebaudiana）
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Asp Ile Gly Ser Ala Asp Leu Val Asn Tyr Leu Leu Ile Thr Glu Ser
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100 105 110
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<213> 甜菊（Stevia rebaudiana）
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Arg Gly Lys Pro Leu Thr Ile His Gly Asp Gly Ser Asn Val Arg Ser
210 215 220
Tyr Leu Tyr Cys Glu Asp Val Ala Glu Ala Phe Glu Val Val Leu His
225 230 235 240
Lys Gly Glu Val Gly His Val Tyr Asn Ile Gly Thr Lys Lys Glu Arg
245 250 255
Arg Val Ile Asp Val Ala Lys Asp Ile Cys Asn Leu Phe Glu Ile Asp
260 265 270
His Glu Ser Arg Ile Lys Phe Val Glu Asn Arg Pro Phe Asn Asp Gln
275 280 285
Arg Tyr Phe Leu Asp Asp Glu Lys Leu Lys Ser Leu Gly Trp Val Glu
290 295 300
Arg Thr Thr Trp Gln Glu Gly Leu Lys Lys Thr Met Lys Trp Tyr Thr
305 310 315 320
Met Asn Pro Asp Trp Trp Gly Asp Val Ser Gly Ala Leu Leu Pro His
325 330 335
Pro Arg Met Leu Met Met Pro Gly Gly Ile Gln Ser Asp Ser Pro His
340 345 350
Ser Gly Ile Ile Ser Thr Pro Met Glu Lys Pro Gly His Leu Ser Gly
355 360 365
Pro Gly Ile Asn Ser Ser Asn Lys Pro Gly Phe Lys Phe Leu Ile Tyr
370 375 380
Gly Arg Thr Gly Trp Ile Gly Gly Leu Leu Gly Lys Leu Cys Glu Lys
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Gln Gly Ile Gln Tyr Glu Tyr Gly Lys Gly Arg Leu Glu Asn Arg Ala
405 410 415
Gln Ile Val Ser Asp Ile Gln Asn Val Lys Pro Thr His Val Phe Asn
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Ala Ala Gly Val Thr Gly Arg Pro Asn Val Asp Trp Cys Glu Ser His
435 440 445
Lys Thr Glu Thr Ile Arg Thr Asn Val Ser Gly Thr Leu Asn Leu Ala
450 455 460
Asp Val Cys Arg Glu Asn Gly Ile Leu Met Met Asn Phe Ala Thr Gly
465 470 475 480
Cys Ile Phe Glu Tyr Asp Asp Ala His Pro Glu Gly Ser Gly Ile Gly
485 490 495
Phe Lys Glu Glu Asp Thr Pro Asn Phe Thr Gly Ser Phe Tyr Ser Lys
500 505 510
Thr Lys Ala Met Val Glu Glu Leu Leu Lys Glu Tyr Asp Asn Val Cys
515 520 525
Thr Leu Arg Val Arg Met Pro Ile Ser Ser Asp Leu Asn Asn Pro Arg
530 535 540
Asn Phe Ile Thr Lys Ile Ala Arg Tyr Asp Lys Val Val Asn Ile Pro
545 550 555 560
Asn Ser Met Thr Ile Leu Asp Glu Leu Leu Pro Ile Ser Ile Glu Met
565 570 575
Ala Lys Arg Asn Leu Lys Gly Ile Trp Asn Phe Thr Asn Pro Gly Val
580 585 590
Val Ser His Asn Glu Val Leu Glu Met Tyr Lys Asp Tyr Ile Asn Pro
595 600 605
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610 615 620
Val Ala Pro Arg Ser Asn Asn Glu Leu Asp Thr Ser Lys Leu Lys Lys
625 630 635 640
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<213> 甜菊（Stevia rebaudiana）
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ttc atc gcc tct cat gta gct aat cgt ctt gtt aga acc tat ccg gat 96
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20 25 30
tac aaa att gtt gtg ctt gac aag ctt gat tac tgc tca aat ctc aaa 144
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35 40 45
aac cta aac ccc tct aaa tca tct ccc aat ttc aaa ttc gtt aaa gga 192
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50 55 60
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Asp Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Asn His Leu Leu Leu Thr Glu Ser
65 70 75 80
atc gac acc ata atg cac ttt gca gct caa act cat gtc gac aac tca 288
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85 90 95
ttt ggt aac agc ttc gag ttc aca aag aac aac ata tac ggc aca cat 336
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100 105 110
gtt ctt cta gaa gcc tgc aaa gtc acc cgc cag atc aaa cgg ttc atc 384
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gcc aca aaa gcc ggt gca gaa atg ctc gtt atg gct tat ggt aga tca 528
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165 170 175
tac ggg tta ccc gtg atc acc act aga gga aac aac gtt tat ggc ccg 576
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180 185 190
aat caa ttt cct gaa aaa cta atc cct aaa ttc att ctt tta tcc atg 624
Asn Gln Phe Pro Glu Lys Leu Ile Pro Lys Phe Ile Leu Leu Ser Met
195 200 205
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210 215 220
tat ctt tac tgt gaa gat gtt gca gaa gca ttt gaa gtc gtg tta cat 720
Tyr Leu Tyr Cys Glu Asp Val Ala Glu Ala Phe Glu Val Val Leu His
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aaa gga gaa gtt gga cat gtt tac aac att gga acc aaa aaa gaa aga 768
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cga gtg att gat gtt gct aaa gat ata tgc aat ctt ttt gaa atc gat 816
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cat gaa tca aga atc aaa ttt gtt gaa aac aga cct ttt aac gat caa 864
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aga acc acg tgg caa gag ggt ttg aaa aaa act atg gaa tgg tat acc 960
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cca cgt atg ctg atg atg cca ggt ggc att caa tct gac tca cct cat 1056
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<213> 甜菊（Stevia rebaudiana）
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<211> 1458
<212> DNA
<213> 甜菊（Stevia rebaudiana）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1458)
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<210> 18
<211> 460
<212> PRT
<213> 甜菊（Stevia rebaudiana）
<400> 18
Met Ala Glu Gln Gln Lys Ile Lys Lys Ser Pro His Val Leu Leu Ile
1 5 10 15
Pro Phe Pro Leu Gln Gly His Ile Asn Pro Phe Ile Gln Phe Gly Lys
20 25 30
Arg Leu Ile Ser Lys Gly Val Lys Thr Thr Leu Val Thr Thr Ile His
35 40 45
Thr Leu Asn Ser Thr Leu Asn His Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Ile
50 55 60
Glu Ile Gln Ala Ile Ser Asp Gly Cys Asp Glu Gly Gly Phe Met Ser
65 70 75 80
Ala Gly Glu Ser Tyr Leu Glu Thr Phe Lys Gln Val Gly Ser Lys Ser
85 90 95
Leu Ala Asp Leu Ile Lys Lys Leu Gln Ser Glu Gly Thr Thr Ile Asp
100 105 110
Ala Ile Ile Tyr Asp Ser Met Thr Glu Trp Val Leu Asp Val Ala Ile
115 120 125
Glu Phe Gly Ile Asp Gly Gly Ser Phe Phe Thr Gln Ala Cys Val Val
130 135 140
Asn Ser Leu Tyr Tyr His Val His Lys Gly Leu Ile Ser Leu Pro Leu
145 150 155 160
Gly Glu Thr Val Ser Val Pro Gly Phe Pro Glu Leu Gln Arg Trp Glu
165 170 175
Thr Pro Leu Ile Leu Gln Asn His Glu Gln Ile Gln Ser Pro Trp Ser
180 185 190
Gln Met Leu Phe Gly Gln Phe Ala Asn Ile Asp Gln Ala Arg Trp Val
195 200 205
Phe Thr Asn Ser Phe Tyr Lys Leu Glu Glu Glu Val Ile Glu Trp Thr
210 215 220
Arg Lys Ile Trp Asn Leu Lys Val Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Met
225 230 235 240
Tyr Leu Asp Lys Arg Leu Asp Asp Asp Lys Asp Asn Gly Phe Asn Leu
245 250 255
Tyr Lys Ala Asn His His Glu Cys Met Asn Trp Leu Asp Asp Lys Pro
260 265 270
Lys Glu Ser Val Val Tyr Val Ala Phe Gly Ser Leu Val Lys His Gly
275 280 285
Pro Glu Gln Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Leu Ile Asp Ser Asp Val
290 295 300
Asn Phe Leu Trp Val Ile Lys His Lys Glu Glu Gly Lys Leu Pro Glu
305 310 315 320
Asn Leu Ser Glu Val Ile Lys Thr Gly Lys Gly Leu Ile Val Ala Trp
325 330 335
Cys Lys Gln Leu Asp Val Leu Ala His Glu Ser Val Gly Cys Phe Val
340 345 350
Thr His Cys Gly Phe Asn Ser Thr Leu Glu Ala Ile Ser Leu Gly Val
355 360 365
Pro Val Val Ala Met Pro Gln Phe Ser Asp Gln Thr Thr Asn Ala Lys
370 375 380
Leu Leu Asp Glu Ile Leu Gly Val Gly Val Arg Val Lys Ala Asp Glu
385 390 395 400
Asn Gly Ile Val Arg Arg Gly Asn Leu Ala Ser Cys Ile Lys Met Ile
405 410 415
Met Glu Glu Glu Arg Gly Val Ile Ile Arg Lys Asn Ala Val Lys Trp
420 425 430
Lys Asp Leu Ala Lys Val Ala Val His Glu Gly Gly Ser Ser Asp Asn
435 440 445
Asp Ile Val Glu Phe Val Ser Glu Leu Ile Lys Ala
450 455 460
<210> 19
<211> 1377
<212> DNA
<213> 甜菊（Stevia rebaudiana）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1377)
<400> 19
atg gaa aat aaa acg gag acc acc gtt cgc cgg cgc cgg aga ata ata 48
Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile
1 5 10 15
tta ttc ccg gta cca ttt caa ggc cac att aac cca att ctt cag cta 96
Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu
20 25 30
gcc aat gtg ttg tac tct aaa gga ttc agt atc acc atc ttt cac acc 144
Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr
35 40 45
aac ttc aac aaa ccc aaa aca tct aat tac cct cac ttc act ttc aga 192
Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg
50 55 60
ttc atc ctc gac aac gac cca caa gac gaa cgc att tcc aat cta ccg 240
Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro
65 70 75 80
act cat ggt ccg ctc gct ggt atg cgg att ccg att atc aac gaa cac 288
Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His
85 90 95
gga gct gac gaa tta cga cgc gaa ctg gaa ctg ttg atg tta gct tct 336
Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser
100 105 110
gaa gaa gat gaa gag gta tcg tgt tta atc acg gat gct ctt tgg tac 384
Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr
115 120 125
ttc gcg caa tct gtt gct gac agt ctt aac ctc cga ccg ctt gtt ttg 432
Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Pro Leu Val Leu
130 135 140
atg aca agc agc ttg ttt aat ttt cat gca cat gtt tca ctt cct cag 480
Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln
145 150 155 160
ttt gat gag ctt ggt tac ctc gat cct gat gac aaa acc cgt ttg gaa 528
Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu
165 170 175
gaa caa gcg agt ggg ttt cct atg cta aaa gtg aaa gac atc aag tct 576
Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser
180 185 190
gcg tat tcg aac tgg caa ata ctc aaa gag ata tta ggg aag atg ata 624
Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile
195 200 205
aaa caa aca aaa gca tct tca gga gtc atc tgg aac tca ttt aag gaa 672
Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu
210 215 220
ctc gaa gag tct gag ctc gaa act gtt atc cgt gag atc ccg gct cca 720
Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro
225 230 235 240
agt ttc ttg ata cca ctc ccc aag cat ttg aca gcc tct tcc agc agc 768
Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser
245 250 255
tta cta gac cac gat cga acc gtt ttt caa tgg tta gac caa caa ccg 816
Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro
260 265 270
cca agt tcg gta ctg tat gtt agt ttt ggt agt act agt gaa gtg gat 864
Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp
275 280 285
gag aaa gat ttc ttg gaa ata gct cgt ggg ttg gtt gat agc aag cag 912
Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln
290 295 300
tcg ttt tta tgg gtg gtt cga cct ggg ttt gtc aag ggt tcg acg tgg 960
Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp
305 310 315 320
gtc gaa ccg ttg cca gat ggg ttc ttg ggt gaa aga gga cgt att gtg 1008
Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val
325 330 335
aaa tgg gtt cca cag caa gaa gtg cta gct cat gga gca ata ggc gca 1056
Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala
340 345 350
ttc tgg act cat agc gga tgg aac tct acg ttg gaa agc gtt tgt gaa 1104
Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu
355 360 365
ggt gtt cct atg att ttc tcg gat ttt ggg ctc gat caa ccg ttg aat 1152
Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn
370 375 380
gct aga tac atg agt gat gtt ttg aag gta ggg gtg tat ttg gaa aat 1200
Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn
385 390 395 400
ggg tgg gaa aga gga gag ata gca aat gca ata aga aga gtt atg gtg 1248
Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val
405 410 415
gat gaa gaa gga gaa tac att aga cag aat gca aga gtt ttg aaa caa 1296
Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln
420 425 430
aag gca gat gtt tct ttg atg aag ggt ggt tcg tct tac gaa tca tta 1344
Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu
435 440 445
gag tct cta gtt tct tac att tca tcg ttg taa 1377
Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu
450 455
<210> 20
<211> 458
<212> PRT
<213> 甜菊（Stevia rebaudiana）
<400> 20
Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile
1 5 10 15
Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu
20 25 30
Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr
35 40 45
Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg
50 55 60
Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro
65 70 75 80
Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His
85 90 95
Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser
100 105 110
Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr
115 120 125
Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Pro Leu Val Leu
130 135 140
Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln
145 150 155 160
Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu
165 170 175
Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser
180 185 190
Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile
195 200 205
Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu
210 215 220
Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser
245 250 255
Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro
260 265 270
Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp
275 280 285
Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln
290 295 300
Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp
305 310 315 320
Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val
325 330 335
Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala
340 345 350
Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu
355 360 365
Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn
370 375 380
Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn
385 390 395 400
Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val
405 410 415
Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln
420 425 430
Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu
435 440 445
Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu
450 455
<210> 21
<211> 2004
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 21
atggatgata ctacgtataa gccaaagaac attctcatta ctggagctgc tggatttatt 60
gcttctcatg ttgccaacag attaatccgt aactatcctg attacaagat cgttgttctt 120
gacaagcttg attactgttc agatctgaag aatcttgatc cttctttttc ttcaccaaat 180
ttcaagtttg tcaaaggaga tatcgcgagt gatgatctcg ttaactacct tctcatcact 240
gaaaacattg atacgataat gcattttgct gctcaaactc atgttgataa ctcttttggt 300
aatagctttg agtttaccaa gaacaatatt tatggtactc atgttctttt ggaagcctgt 360
aaagttacag gacagatcag gaggtttatc catgtgagta ccgatgaagt ctatggagaa 420
accgatgagg atgctgctgt aggaaaccat gaagcttctc agctgttacc gacgaatcct 480
tactctgcaa ctaaggctgg tgctgagatg cttgtgatgg cttatggtag atcatatgga 540
ttgcctgtta ttacgactcg cgggaacaat gtttatgggc ctaaccagtt tcctgaaaaa 600
atgattccta agttcatctt gttggctatg agtgggaagc cgcttcccat ccatggagat 660
ggatctaatg tccggagtta cttgtactgc gaagacgttg ctgaggcttt tgaggttgtt 720
cttcacaaag gagaaatcgg tcatgtctac aatgtcggca caaaaagaga aaggagagtg 780
atcgatgtgg ctagagacat ctgcaaactt ttcgggaaag accctgagtc aagcattcag 840
tttgtggaga accggccctt taatgatcaa aggtacttcc ttgatgatca gaagctgaag 900
aaattggggt ggcaagagcg aacaaattgg gaagatggat tgaagaagac aatggactgg 960
tacactcaga atcctgagtg gtggggtgat gtttctggag ctttgcttcc tcatccgaga 1020
atgcttatga tgcccggtgg aagactttct gatggatcta gtgagaagaa agacgtttca 1080
agcaacacgg tccagacatt tacggttgta acacctaaga atggtgattc tggtgacaaa 1140
gcttcgttga agtttttgat ctatggtaag actggttggc ttggtggtct tctagggaaa 1200
ctatgtgaga agcaagggat tacatatgag tatgggaaag gacgtctgga ggatagagct 1260
tctcttgtgg cggatattcg tagcatcaaa cctactcatg tgtttaatgc tgctggttta 1320
actggcagac ccaacgttga ctggtgtgaa tctcacaaac cagagaccat tcgtgtaaat 1380
gtcgcaggta ctttgactct agctgatgtt tgcagagaga atgatctctt gatgatgaac 1440
ttcgccaccg gttgcatctt tgagtatgac gctacacatc ctgagggttc gggtataggt 1500
ttcaaggaag aagacaagcc aaatttcttt ggttctttct actcgaaaac caaagccatg 1560
gttgaggagc tcttgagaga atttgacaat gtatgtacct tgagagtccg gatgccaatc 1620
tcctcagacc taaacaaccc gagaaacttc atcacgaaga tctcgcgcta caacaaagtg 1680
gtggacatcc cgaacagcat gaccgtacta gacgagcttc tcccaatctc tatcgagatg 1740
gcgaagagaa acctaagagg catatggaat ttcaccaacc caggggtggt gagccacaac 1800
gagatattgg agatgtacaa gaattacatc gagccaggtt ttaaatggtc caacttcaca 1860
gtggaagaac aagcaaaggt cattgttgct gctcgaagca acaacgaaat ggatggatct 1920
aaactaagca aggagttccc agagatgctc tccatcaaag agtcactgct caaatacgtc 1980
tttgaaccaa acaagagaac ctaa 2004
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> SrRHM1-pET-FW
<400> 22
tgccgcgcgg cagccatatg gctacttacg tgccaaag 38
<210> 23
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> SrRHM1-pET-RV
<400> 23
gttagcagcc ggatccttaa tgttttttgt taggttcgaa tacg 44
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> SrRHM2Full-Fw
<400> 24
tgccgcgcgg cagccatatg accagttata cacctaaaaa c 41
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> SrRHM2Full-Rv
<400> 25
gttagcagcc ggatccttag gttgtcttgt tgggtgcaaa tac 43
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> SrACTIN-Fw
<400> 26
atggccgata ctgaggatat tcag 24
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> SrACTIN-Rv
<400> 27
agcacttcct gtggacaatg ga 22
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> Apa-SrRHM1-F
<400> 28
gggcccatgg ctacttacgt gccaaag 27
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> Xho-SrRHM1-R
<400> 29
ctcgagttaa tgttttttgt taggttcgaa tacg 34
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> Bam-SrRHM2-F
<400> 30
ggatccatga ccagttatac acctaaaaac atcc 34
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> Xho-SrRHM2-R
<400> 31
ctcgagttag gttgtcttgt tgggtgc 27
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> SrRHM1-r1
<400> 32
cgagttaggt atttggacac ca 22
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> SrRHM2-r1
<400> 33
taccgggtcc tgaaagatga c 21
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> PGAL10-f3
<400> 34
gattattaaa cttctttgcg tccatcca 28
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw
<400> 35
cacccatatg gatgcaatgg ctacaactga gaa 33
<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> BglII-SrUGT85C2-Rv
<400> 36
agatctctag tttcttgcta gcacggtgat tt 32
<210> 37
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> SrUGT91D2-pET15b-FW
<400> 37
tgccgcgcgg cagccatatg tacaacgtta cttatcatc 39
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> SrUGT91D2-pET15b-RV
<400> 38
gttagcagcc ggatccttaa ctctcatgat cgatggcaa 39
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> CACC-NdeI-SrUGT74G1-Fw
<400> 39
cacccatatg gcggaacaac aaaagatcaa gaaat 35
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> BamHI-SrUGT74G1-Rv
<400> 40
ggatccttaa gccttaatta gctcacttac aaatt 35
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> CACC-NdeI-SrUGT76G1-Fw
<400> 41
cacccatatg gaaaataaaa cggagacca 29
<210> 42
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> BamHI-SrUGT76G1-Rv
<400> 42
ggatccttac aacgatgaaa tgtaagaaac ta 32
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> Bgl2-UGT85C2-F
<400> 43
acagatctat ggatgcaatg gctacaactg aga 33
<210> 44
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> Sal-UGT85C2-R
<400> 44
tagtcgacta gtttcttgct agcacggtga tttc 34
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> NotI-UGT91DIL3-F
<400> 45
aagcggccgc atgtacaacg ttacttatca tcaaaattca aa 42
<210> 46
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> Pac-UGT91D1L3-R
<400> 46
cgttaattaa ctctcatgat cgatggcaac c 31
<210> 47
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> Not-UGT74G1-F
<400> 47
aagcggccgc atggcggaac aacaaaagat caag 34
<210> 48
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> Pac-UGT74G1-R
<400> 48
cgttaattaa gccttaatta gctcacttac aaattcg 37
<210> 49
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> Bam-UGT76G1-F
<400> 49
aaggatccat ggaaaataaa acggagacca ccg 33
<210> 50
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> Sal-UGT76G1-R
<400> 50
gcgtcgactt acaacgatga aatgtaagaa actagagact ctaa 44
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> UGT85C2-r1
<400> 51
caagtcccca accaaattcc gt 22
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> UGT91D1L3-r1
<400> 52
cacgaacccg tctggcaact c 21
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> UGT74G1-r1
<400> 53
cccgtgtgat ttcttccact tgttc 25
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> UGT76G1-r1
<400> 54
caagaaccca tctggcaacg g 21
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> PGAL10-f3
<400> 55
gattattaaa cttctttgcg tccatcca 28
<210> 56
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> PGAL1-f3
<400> 56
cctctatact ttaacgtcaa ggagaaaaaa cc 32

Claims (13)

1.一种具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质，其特征在于，为以下（a）的蛋白质：
（a）由序列号8或10的氨基酸序列构成的蛋白质，
所述葡萄糖以尿苷二磷酸葡糖的形式存在，
所述鼠李糖以尿苷二磷酸鼠李糖的形式存在。
2.一种编码具有由葡萄糖生成鼠李糖的活性的蛋白质的多核苷酸，其特征在于，为以下（a）或（b）中的多核苷酸：
（a）由序列号7或9的碱基序列构成的多核苷酸；
（b）编码由序列号8或10的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸，
所述葡萄糖以尿苷二磷酸葡糖的形式存在，
所述鼠李糖以尿苷二磷酸鼠李糖的形式存在。
3.一种载体，其特征在于，含有权利要求2所述的多核苷酸与表达盒。
4.一种转化体，其特征在于，向细胞内导入了权利要求3所述的载体。
5.根据权利要求4所述的转化体，其特征在于，所述细胞为细菌、微生物或植物的细胞。
6.一种萃取物，其特征在于，为权利要求4或5所述的转化体的萃取物。
7.一种甜味剂、饮食品或医药品，其特征在于，含有权利要求6所述的萃取物。
8.一种鼠李糖的制造方法，其特征在于，包含使以下（a）的蛋白质与葡萄糖反应的工序：
（a）由序列号8或10的氨基酸序列构成的蛋白质，
所述葡萄糖以尿苷二磷酸葡糖的形式存在，
所述鼠李糖以尿苷二磷酸鼠李糖的形式存在。
9.一种甜菊醇糖苷的制造方法，其特征在于，包含使以下（a）的蛋白质：
（a）由序列号8或10的氨基酸序列构成的蛋白质，
与葡萄糖反应得到鼠李糖的工序；
及将所述鼠李糖转移至甜菊醇或甜菊醇糖苷的工序，
所述葡萄糖以尿苷二磷酸葡糖的形式存在，
所述鼠李糖以尿苷二磷酸鼠李糖的形式存在。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述将鼠李糖转移至甜菊醇或甜菊醇糖苷的工序通过使用导入了（i）含有序列号11或13的碱基序列的多核苷酸，或（ii）编码由序列号12或14的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸的非人类转化体而实施。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，进一步包含使用导入了下述（a）~（e）中至少一种的多核苷酸的非人类转化体的工序：
（a）（i）含有序列号15的碱基序列的多核苷酸，或（ii）编码由序列号16的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；
（b）（i）含有序列号17的碱基序列的多核苷酸，或（ii）编码由序列号18的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；
（c）（i）含有序列号19的碱基序列的多核苷酸，或（ii）编码由序列号20的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；
（d）（i）含有序列号11或13的碱基序列的多核苷酸，或（ii）编码由序列号12或14的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；
（e）（i）含有序列号19的碱基序列的多核苷酸，或（ii）编码由序列号20的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，进一步包含使用导入了下述（a）~（e）中至少一种的多核苷酸的非人类转化体的工序：
（a）（i）含有序列号15的碱基序列的多核苷酸，或（ii）编码由序列号16的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；
（b）（i）含有序列号17的碱基序列的多核苷酸，或（ii）编码由序列号18的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；
（c）（i）含有序列号19的碱基序列的多核苷酸，或（ii）编码由序列号20的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；
（d）（i）含有序列号11或13的碱基序列的多核苷酸，或（ii）编码由序列号12或14的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；
（e）（i）含有序列号19的碱基序列的多核苷酸，或（ii）编码由序列号20的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。
13.一种筛选方法，为根据具有鼠李糖基的甜菊醇糖苷的含量对植物体进行筛选的方法，其特征在于，
所述方法为包含由被检测植物体对以下（a）或（b）中的多核苷酸进行定量的工序，及将所述多核苷酸量与标准值进行比较，根据多核苷酸量对被试验植物体进行分类的工序的方法，
（a）由序列号7或9的碱基序列构成的多核苷酸；
（b）编码由序列号8或10的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸，
所述鼠李糖以尿苷二磷酸鼠李糖的形式存在。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024010442A1 (en) 2022-07-07 2024-01-11 Purecircle Sdn Bhd High-purity steviol glycosides

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59139309A (ja) * 1983-01-28 1984-08-10 Nonogawa Shoji:Kk 乳化化粧料
CN103732753A (zh) * 2011-08-08 2014-04-16 埃沃尔瓦公司 甜菊醇糖苷类的重组生产
WO2015152707A1 (en) * 2014-04-02 2015-10-08 Purecircle Sdn Bhd Compounds produced from stevia and process for producing the same
EP2957182A1 (en) * 2014-06-18 2015-12-23 Technische Hochschule Mittelhessen Improved natural sweetener compositions

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4918504B1 (zh) 1970-08-22 1974-05-10
US7691425B2 (en) 2003-09-29 2010-04-06 San-Ei Gen F.F.I., Inc. Method for manufacturing α-glycosylisoquercitrin, intermediate product and by-product thereof
US7927851B2 (en) 2006-03-21 2011-04-19 Vineland Research And Innovation Centre Compositions having ent-kaurenoic acid 13-hydroxylase activity and methods for producing same
JP4258670B2 (ja) 2006-05-23 2009-04-30 独立行政法人産業技術総合研究所 Ｕｄｐ−ラムノ−スの製造方法
BR122021005283B1 (pt) * 2010-06-02 2022-02-22 Evolva, Inc Hospedeiro recombinante que compreende genes recombinantes para produção deesteviol ou glicosídeo de esteviol, método para produzir esteviol, glicosídeo de esteviol ou composição de glicosídeo de esteviol e método para sintetizar esteviol ou glicosídeo de esteviol
WO2013137487A1 (ja) 2012-03-16 2013-09-19 サントリーホールディングス株式会社 ステビオール配糖体化酵素およびそれをコードする遺伝子
MX2015010098A (es) 2013-02-11 2016-04-19 Evolva Sa Producción eficiente de glicosidos de esteviol en huéspedes recombinantes.
WO2015016393A1 (ja) * 2013-08-02 2015-02-05 サントリーホールディングス株式会社 ヘキセノール配糖体化酵素の利用方法
JP6561763B2 (ja) 2015-10-22 2019-08-21 富士通コネクテッドテクノロジーズ株式会社 電子機器
BR112018012843A2 (pt) * 2015-12-28 2018-12-04 Evogene Ltd métodos para aumentar pelo menos uma característica, para produzir e para cultivar uma cultura e para selecionar uma planta, polinucleotídeo e polipeptídeo isolados, construção de ácido nucleico, célula vegetal, e, planta transgênica.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59139309A (ja) * 1983-01-28 1984-08-10 Nonogawa Shoji:Kk 乳化化粧料
CN103732753A (zh) * 2011-08-08 2014-04-16 埃沃尔瓦公司 甜菊醇糖苷类的重组生产
WO2015152707A1 (en) * 2014-04-02 2015-10-08 Purecircle Sdn Bhd Compounds produced from stevia and process for producing the same
EP2957182A1 (en) * 2014-06-18 2015-12-23 Technische Hochschule Mittelhessen Improved natural sweetener compositions

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
佚名.PREDICTED: trifunctional UDP-glucose 4,6-dehydratase/UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5- epimerase/UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase RHM1 [Capsicum annuum].Genebank.2016,全文. *
甜叶菊葡糖基转移酶基因UGT76G2的克隆及生物信息学分析;郭书巧等;《基因组学与应用生物学》;20090628(第03期);全文 *

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