CN110494559B - 不分化地维持用培养基添加剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供以176μM以上的浓度含L‑色氨酸或L‑色氨酸衍生物的多能性干细胞培养用的培养基。

Description

不分化地维持用培养基添加剂
【技术领域】
本发明涉及用于维持未分化状态的同时使多能性干细胞有效率地增殖的培养基、及使用所述培养基的多能性干细胞的增殖方法等。
【背景技术】
ES细胞(Embryonic stem cell)或诱导多能性干细胞(iPS：induced pluripotentstem cell)等的多能性干细胞从其优良的增殖性或多分化能力而期待在再生医疗等中使用。特别是iPS细胞比较容易制作－得到，制作时的伦理的制约少，再者，从移植时的排斥反应的观点来看，被看作非常优良的再生医疗的材料。
在使用多能性干细胞而进行再生医疗时，疾病的治疗或治疗法的开发研究需要大量的多能性干细胞。因此，开发及改良使大量的多能性干细胞的供给成为可能的多能性干细胞培养方法变得重要。就是在其中，需要的是培养基的改良。培养大量的细胞需要大量的培养基。例如，培养106个iPS细胞而制作1010个程度的心肌细胞，在移植到患者一人时，每一人患者需要100L的培养基，少估培养基所耗的费用也达大概100,000美元。抑制培养基所耗的费用的方法之一是增加每单位培养基体积能培养的细胞数。即，存在更高效率并且低成本的有效的多能性干细胞培养用培养基的需求。
通常，向培养基添加必须氨基酸。例如，作为干细胞培养用培养基的mTeSR1培养基(非专利文献1、2、3)或Essential-8培养基(非专利文献4)以Dulbecco改变Eagle培养基(DMEM)/F12培养基作为基础培养基，加bFGF或胰岛素等几种因子。此DMEM/F12培养基中的氨基酸的含量基于血液中的游离氨基酸量设定，含9.0200mg/L的L-色氨酸。至今开发了多种培养基，但对于培养基中的氨基酸组成，几乎未改良。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】特开2004-135672号公报
【专利文献2】特开2007-228815号公报
【专利文献3】US2010/0317104A1
【专利文献4】WO2011/100286A2
【非专利文献】
【非专利文献1】Ludwig TE et.al.Nat.Methods 3(8)：637-46；2006
【非专利文献2】Ludwig TE et.al.Nat.Biotechnol 24(2)：185-7；2006
【非专利文献3】Masters et.al.Human Cell Culture.Dordrecht：SpringerNetherlands；2007
【非专利文献4】Chen G et.al.Nat.Methods 8(5)424-9；2011
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
本发明的目的是提供能使多能性干细胞有效率地增殖的培养基、及使用所述培养基而使多能性干细胞有效率地增殖的方法。
【用于解决课题的手段】
本发明人为达成上述目的，关注于多能性干细胞的培养过程中的培养基中的氨基酸量变化。结果发现，在多能性干细胞的培养过程中培养基中的L-色氨酸量急速减少，在培养基中所含的全氨基酸中L-色氨酸最快速地的枯渴。其中，作为必须氨基酸的L-色氨酸与其他氨基酸比，培养基配方浓度低(非专利文献1、2、3、4)，预测在多能性干细胞的大量增殖时很快不足，成为限制细胞增殖的要因。从而，本发明人发现，通过使培养基中的L-色氨酸量增加，或在培养的途中添加L-色氨酸而补充消耗的L-色氨酸，可促进多能性干细胞的增殖，从而完成本发明。
即，本发明如以下。
[1]多能性干细胞培养用的培养基，其以176μM以上的浓度含L-色氨酸或L-色氨酸衍生物。
[2][1]的培养基，其中培养基中以176μM～1408μM的浓度含L-色氨酸或L-色氨酸衍生物。
[3][1]或[2]的培养基，其为无血清培养基。
[4][1]～[3]之任一项的培养基，其中多能性干细胞是诱导多能性干细胞。
[5][1]～[4]之任一项的培养基，其中色氨酸衍生物是色氨酸和氨基酸经肽键键合的二肽。
[6][5]的培养基，其中二肽是L-丙氨酰-L-色氨酸。
[7]多能性干细胞的培养方法，其包括在[1]～[6]之任一项的培养基中培养多能性干细胞。
[8][7]的方法，其为用于使多能性干细胞增殖的方法。
[9]多能性干细胞培养调制物，其含[1]～[6]之任一项的培养基及多能性干细胞。
[10]多能性干细胞的培养方法，其包括以下的工序：
(1)在含L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的培养基中培养多能性干细胞；
(2)向得到的多能性干细胞培养物添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物，补充(1)中消耗的培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的一部分或全部；及
(3)继续培养添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的多能性干细胞培养物。
[11][10]的方法，其中含L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的培养基是无血清培养基。
[12][10]或[11]的方法，其中色氨酸衍生物是色氨酸和氨基酸经肽键键合的二肽。
[13][12]的方法，其中二肽是L-丙氨酰-L-色氨酸。
[14]用于促进多能性干细胞的增殖的培养基添加剂，其含L-色氨酸或L-色氨酸衍生物。
[15][14]的培养基添加剂，其中色氨酸衍生物是色氨酸和氨基酸经肽键键合的二肽。
[16][15]的培养基添加剂，其中二肽是L-丙氨酰-L-色氨酸。
【发明的效果】
根据本发明，由于促进多能性干细胞的细胞增殖变得可能，可有效大量地培养多能性干细胞。作为由本培养基的使用导致的具体性的效果，可与以往的培养基比而在短期间得到目标细胞数，无需向特化于大量培养的培养设备的变更，即使在既有的设备培养，也期待得到目标细胞数等。从而，可大幅地削减多能性干细胞的培养中所耗的人的成本及金钱的成本。
【附图的简单的说明】
【图1】在以成为最终浓度44μM、176μM、352μM、704μM、1408μM的方式添加L-色氨酸的Essential-8培养基中的人诱导多能性干细胞201B7的细胞被覆率(％)。向6孔板以单细胞接种每1孔13,000个201B7细胞，培养6天。将以成为上述的浓度的方式添加L-色氨酸的时间设为0小时，在24、48、72、96、120小时后测量细胞被覆率。得到了L-色氨酸浓度依赖性地显示增殖促进效果的结果。
【图2】在以成为最终浓度44μM、176μM、352μM、704μM、1408μM的方式添加L-色氨酸的mTeSR1培养基中的人诱导多能性干细胞201B7的细胞被覆率(％)。向6孔板以单细胞接种每1孔13,000个201B7细胞，培养6天。将以成为上述的浓度的方式添加L-色氨酸的时间设为0小时，在24、48、72、96、120小时后测量细胞被覆率。得到了L-色氨酸浓度依赖性地显示增殖促进效果的结果。
【图3】在以成为最终浓度44μM、176μM、352μM、704μM、1408μM的方式添加L-色氨酸的TeSR2培养基中的人诱导多能性干细胞201B7的细胞被覆率(％)。向6孔板以单细胞接种每1孔13,000个201B7细胞，培养6天。将以成为上述的浓度的方式添加L-色氨酸的时间设为0小时，在24、48、72、96、120小时后测量细胞被覆率。得到了L-色氨酸浓度依赖性地显示增殖促进效果的结果。
【图4】在以成为最终浓度44μM、176μM、352μM、704μM、1408μM的方式添加L-色氨酸的mTeSR1培养基中的人诱导多能性干细胞253G4的细胞被覆率(％)。向6孔板以单细胞接种每1孔40,000个253G4细胞，培养6天。将以成为上述的浓度的方式添加L-色氨酸的时间设为0小时，在24、48、72、96、120小时后测量细胞被覆率。得到了L-色氨酸浓度依赖性地显示增殖促进效果的结果。
【图5】在以成为最终浓度44μM、176μM、352μM、704μM、1408μM的方式添加L-色氨酸的mTeSR1培养基中的人胚胎干细胞H9的细胞被覆率(％)。向6孔板以单细胞接种每1孔10,000个H9细胞，培养6天。将以成为上述的浓度的方式添加L-色氨酸的时间设为0小时，在24、48、72、96、120小时后测量细胞被覆率。得到了L-色氨酸浓度依赖性地显示增殖促进效果的结果。
【图6】在以成为最终浓度44μM、176μM、352μM、704μM、1408μM的方式添加L-色氨酸的添加10％FCS的DMEM培养基中的人胎儿肾脏来源细胞293T的细胞被覆率(％)。向6孔板以单细胞接种每1孔10,000个293T细胞，培养6天。将以成为上述的浓度的方式添加L-色氨酸的时间设为0小时，在24、48、72、96、120小时后测量细胞被覆率。不得到显示L-色氨酸浓度依赖性的增殖促进效果的结果。
【图7】在以成为最终浓度50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM的方式添加L-犬尿氨酸的mTeSR1培养基中的人诱导多能性干细胞201B7的细胞被覆率(％)。向6孔板以单细胞接种每1孔20,000个201B7细胞，培养6天。将L-犬尿氨酸添加时设为0，在0、24、48、72、96、120小时后测量细胞被覆率。得到了在L-犬尿氨酸50-500μM添加区中显示增殖促进效果的结果。
【图8】在以成为最终浓度50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM的方式添加犬尿喹啉酸的mTeSR1培养基中的人诱导多能性干细胞201B7的细胞被覆率(％)。向6孔板以单细胞接种每1孔20,000个201B7细胞，培养6天。将犬尿喹啉酸添加时设为0，在0、24、48、72、96、120小时后测量细胞被覆率。得到了在犬尿喹啉酸50-500μM添加区中显示增殖促进效果的结果。
【具体实施方式】
本发明提供促进细胞的细胞增殖的培养基(以下，将其也称为本发明的培养基)、促进细胞的增殖的方法(以下，将其也称为本发明的方法)、及细胞增殖促进用的培养基添加剂。
(1)L-色氨酸或L-色氨酸衍生物
L-色氨酸(2-氨基-3-(吲哚基)丙酸)是构成蛋白质的必须氨基酸的一种。
本说明书中，L-色氨酸包含L-色氨酸的盐。作为L-色氨酸的盐，例如，可举出盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、磷酸盐等的无机酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、醋酸盐、蚁酸盐、丙酸盐、安息香酸盐、三氟醋酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、或者对甲苯磺酸盐等的有机酸盐；钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐等的无机碱盐、三乙基铵盐、三乙醇铵盐、吡啶鎓盐、二异丙基铵盐等的有机碱盐；精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等的氨基酸盐等，但不限于这些。
作为L-色氨酸的盐，优选使用盐酸盐、钠盐或钾盐。
L-色氨酸可由公知的方法得到。例如，作为L-色氨酸的制造方法，可举出特开2012-223092号公报、特开2012-100537号公报、特开2011-167071号公报、特开2010-263790号公报、特开2010-110217号公报中记载的方法等，但不限于这些。
另外，L-色氨酸也可使用商业上可得到的。作为商业上可得到的L-色氨酸，可举出和光纯药工业公司038-23581(型号)、东京化成工业公司T0541(型号)、NACALAI TESQUE公司13043-92(型号)、MP Biomedicals公司ICN1031505(型号)、Sigma-Aldrich公司T8941(型号)等，但不限于这些。
L-色氨酸衍生物只要是向培养基中提供L-色氨酸，就不特别限定，可举出例如培养基添加时由水解提供L-色氨酸的物质等。作为L-色氨酸衍生物，可举出色氨酸和氨基酸经肽键键合的二肽、色氨酸的C1～6烷基酯、N乙酰色氨酸等，但不限于这些。
作为结合了色氨酸和氨基酸的二肽的例，可举出L-丙氨酰-L-色氨酸、L-精氨酰-L-色氨酸、L-天冬酰胺酰-L-色氨酸、L-天冬氨酸-L-色氨酸、L-半胱氨酰-L-色氨酸、L-谷氨酰胺酰-L-色氨酸、L-谷氨酸-L-色氨酸、甘氨酰-L-色氨酸、L-组氨酰-L-色氨酸、L-异亮氨酰-L-色氨酸、L-亮氨酰-L-色氨酸、L-赖氨酰-L-色氨酸、L-甲硫氨酰-L-色氨酸、L-苯基丙氨酰-L-色氨酸、L-脯氨酰-L-色氨酸、L-丝氨酰-L-色氨酸、L-苏氨酰-L-色氨酸、L-酪氨酰-L-色氨酸、L-缬氨酰-L-色氨酸、L-色氨酰-L-色氨酸、L-色氨酰-L-丙氨酸、L-色氨酰-L-精氨酸、L-色氨酰-L-天冬酰胺、L-色氨酰-L-天冬氨酸、L-色氨酰-L-半胱氨酸、L-色氨酰-L-谷氨酰胺、L-色氨酰-L-谷氨酸、L-色氨酰-甘氨酸、L-色氨酰-L-组氨酸、L-色氨酰-L-异亮氨酸、L-色氨酰-L-亮氨酸、L-色氨酰-L-赖氨酸、L-色氨酰-L-甲硫氨酸、L-色氨酰-L-苯丙氨酸、L-色氨酰-L-脯氨酸、L-色氨酰-L-丝氨酸、L-色氨酰-L-苏氨酸、L-色氨酰-L-酪氨酸、L-色氨酰-L-缬氨酸等，但不限于这些。
作为色氨酸的C1-6烷基酯，可举出L-色氨酸甲基酯、L-色氨酸乙基酯等，但不限于这些。
本说明书中，L-色氨酸衍生物包含L-色氨酸衍生物的盐。作为L-色氨酸衍生物的盐，作为L-色氨酸的盐，可举上述的。
在多能性干细胞的培养中使用时，L-色氨酸衍生物优选L-丙氨酰-L-色氨酸、甘氨酰-L-色氨酸。
本说明书中，L-色氨酸衍生物包含L-色氨酸的代谢物或其盐。作为L-色氨酸代谢物，在多能性干细胞的培养中使用时，优选L-犬尿氨酸、犬尿喹啉酸。
L-色氨酸衍生物可由公知的方法得到。例如，作为L-色氨酸二肽的制造方法，可举出一般的固相合成法等，但不限于这些。
另外，L-色氨酸衍生物也可使用商业上可得到的。作为商业上可得到的L-色氨酸衍生物，可举出和光纯药工业公司038-23581(型号)、东京化成工业公司T0541(型号)、NACALAI TESQUE公司13043-92(型号)、MP Biomedicals公司ICN1031505(型号)、Sigma-Aldrich公司T8941(型号)等，但不限于这些。
(2)多能性干细胞
本说明书中，多能性干细胞是指有自身复制能及分化/增殖能力的未成熟的细胞，且有可向构成生物体的全部组织或细胞分化的能力的细胞。作为多能性干细胞的例，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能性干细胞(iPS细胞)(Takahashi K et al.，Cell.2007Nov 30；131(5)：861-72)、***干细胞(mGS细胞)(Kanatsu-Shinohara M etal.，Biol Reprod.2007Jan；76(1)：55-62)、胚胎生殖细胞(Matsui Y et al.，Cell.1992Sep 4；70(5)：841-7)等。
多能性干细胞可由公知的方法得到。例如，胚胎干细胞(ES细胞)是，可举出培养哺乳动物的胚盘胞中的内部细胞块的方法(例如Manipulating the Mouse Embryo：ALaboratory Manual，Fourth Edition2014Cold Spring Harbor Laboratory Press中记载的方法)、培养由体细胞核移植制作的初期胚的方法(Wilmut et al.，Nature.1997Feb 27；385(6619)：810-3、Wakayama et al.，Nature.1998Jul 23；394(6691)：369-74、Wakayama Tet al.，Science.2001Apr 27；292(5517)：740-3)等，但不限于这些。
再者胚胎干细胞也可从指定的机关得到。例如，作为人ES细胞的KhES-1细胞、KhES-2细胞及KhES-3细胞可从京都大学再生医科学研究所得到。
作为诱导多能性干细胞的入手方法的例，可举出向体细胞导入核初始化物质(例如，Oct3/4、Sox2、c-Myc及Klf4等)的方法(Takahashi K et al.，Cell.2006Aug 25；126(4)：663-76、WO2007/069666国际公开公报)，但不限于此。另外，诱导多能性干细胞可基于Takahashi K et al.，Nat Protoc.2007；2(12)：3081-9、Aoi et al.，Science.2008Aug1；321(5889)：699-702、Takahashi,K et al.，Cell.2007Nov 30；131(5)：861-72、Yu,J etal.，Science.2007Dec 21；318(5858)：1917-20、Nakagawa,M et al.，NatBiotechnol.2008Jan；26(1)：101-6等中记载的方法而制作，但不限于这些。
再者诱导多能性干细胞也可从指定的机关得到。例如作为人iPS细胞的253G1细胞、201B7细胞可从iPSAcademia日本株式会社购入。
胚胎生殖细胞可通过根据常规方法单离始原生殖细胞，将其在LIF、bFGF及SCF的存在下培养来诱导。另外，mGS细胞可基于WO2005/100548中记载的方法而从***细胞制作。
在本发明中使用的多能性干细胞优选为胚胎干细胞或诱导多能性干细胞，更优选为诱导多能性干细胞。
在本发明中，通常，使用哺乳动物来源的多能性干细胞。作为哺乳动物，例如，可举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等的啮齿类、兔等的兔目、猪、牛、山羊、马、绵羊等的有蹄目、狗、猫等的猫目、人、猴、恒河猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等的灵长类等，但不限于这些。在本发明中，优选使用小鼠等的啮齿类或人等的灵长类来源的多能性干细胞、更优选人来源的多能性干细胞。
在本发明中，最优选使用人诱导多能性干细胞。
(3)多能性干细胞培养用的培养基
作为本发明的一实施方式，本发明提供含有高浓度的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的多能性干细胞培养用的培养基(本说明书中，也称为本发明的培养基)。通过使用本发明的培养基，使多能性干细胞有效率地增殖变得可能。特别是，本发明的培养基对于维持未分化状态的同时，使多能性干细胞增殖，维持有用。
本发明的培养基以含高浓度的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物作为特征。“高浓度”是指高于与人血液中的游离L-色氨酸浓度相当的L-色氨酸浓度(44μM)。使用含有与人血液中的游离L-色氨酸浓度相当的L-色氨酸的通常的培养基而进行多能性干细胞的培养，则由培养基中的L-色氨酸的早期的枯渴限制多能性干细胞的增殖。本发明的培养基由于含有高浓度的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物，可在多能性干细胞培养时难以发生L-色氨酸的枯渴，达成多能性干细胞的高的增殖率、及经长期的多能性干细胞的增殖。
本发明的培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的浓度只要是可达成多能性干细胞的增殖促进，就不特别限定，例如，本发明的培养基中的L-色氨酸浓度是176μM以上、优选352μM以上、再优选为704μM以上。本发明的培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度的上限值理论上是L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的饱和浓度，从向培养基的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的溶解性或成本的观点来看，培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度优选为1408μM以下。
本发明的培养基有促进多能性干细胞的增殖的效果。“促进多能性干细胞的增殖”是指在本发明的培养基中进行培养之时，除了L-色氨酸浓度与人血液中的游离L-色氨酸浓度相当(44μM)之外，与在有与本发明的培养基相同的组成的对照培养基中进行培养之时比较，促进多能性干细胞的增殖。
对于本发明的培养基中所含的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物以外的成分，只要是可达成多能性干细胞的增殖促进效果，就不特别限定，可适宜采用在通常的多能性干细胞的维持培养中使用的组成。
本发明的培养基可通过以成为上述浓度的方式向能进行多能性干细胞的维持培养的培养基添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物来制作。在培养基的制作中，可使用1种L-色氨酸或L-色氨酸衍生物，也可组合使用多种L-色氨酸及/或L-色氨酸衍生物。
本发明的培养基也可以通常在哺乳动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基而调制。作为基础培养基，只要是可达成多能性干细胞的增殖促进等的期望的效果，就不特别限定，例如，可举BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、IMDM/F12培养基、火腿培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、或者这些的混合培养基等，可在动物细胞的培养中使用的培养基。另外，也可以通常作为多能性干细胞培养用使用的培养基作为基础培养基而调制。作为市售的干细胞培养用的基础培养基，可举出StemFit(注册商标)AK培养基(味之素株式会社)、Essential 8培养基(Life Technologies公司)、mTeSR1培养基(STEMCELLTechnologies公司)、TeSR2培养基(STEMCELL Technologies公司)、RHB培养基(StemCells,Inc.公司)、TeSRTM-E6(STEMCELL Technologies公司)、hESF-GRO培养基(NIPRO株式会社)、HESF-DIF培养基(NIPRO株式会社)、CSTI-7(株式会社细胞科学研究所)、Essential 6培养基(Life Technologies公司)等。
本发明的培养基从回避化学上未确定的成分的混入的观点来看，优选为含有成分化学上确定的培养基(Chemically defined medium；CDM)。本发明的培养基从回避化学上未确定的成分的混入的观点来看，优选为无血清培养基。在本发明中的“无血清培养基”是指不含未调整或未纯化的血清的培养基。在本发明中，含纯化的血液来源成分或动物组织来源成分(例如，bFGF等的生长因子)的培养基只要是不含无调整或未纯化的血清，就也含在无血清培养基中。
无血清培养基也可含有血清替代物。作为血清替代物，例如，可举适宜含有血清白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’巯基甘油、或者这些的均等物等。所涉及的血清替代物例如，可由WO98/30679中记载的方法调制。作为血清替代物，也可利用市售品。作为涉及的市售的血清替代物，例如，可举出KnockoutTM SerumReplacement(Life Technologies公司：以下，有时也记为KSR)、Chemically-definedLipid concentrated(Life Technologies公司)、GlutamaxTM(Life Technologies公司)、B27(Life Technologies公司)、N2(Life Technologies公司)等，但不限于这些。
通常，本发明的培养基除了L-色氨酸之外，含L-色氨酸以外的全部必须氨基酸(L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、及L-缬氨酸)。
本发明的培养基优选含全部非必须氨基酸(L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-丝氨酸、L-酪氨酸、L-脯氨酸)。其中，也可代替L-谷氨酰胺而使用L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
本发明的培养基也可除了上述的20种氨基酸之外，含L-胱氨酸等的天然氨基酸。
本发明的培养基也可还含有培养基添加物。作为培养基添加物，可举出Y-27632等的ROCK(ρ-associated coiled-coil forming kinase/ρ结合激酶)抑制剂、青霉素-链霉素等的抗生物质、维生素类、L-抗坏血酸、磷酸L-抗坏血酸基镁、丙酮酸钠、2-氨基乙醇、葡萄糖、碳酸氢钠、HEPES、胰岛素、***、硒酸钠、腐胺等，但不限于这些。添加物优选含在公知的浓度范围内。
本发明的培养基也可含脂肪酸。作为本发明的培养基中所含的脂肪酸，可举出油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、酪酸、醋酸、棕榈油酸、缬草酸(缬草酸)、己酸、庚酸(庚基酸)、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、珠光脂酸、客烯酸、桐酸、花生酸、8,11-二十碳二烯酸、5,8,11-二十碳三烯酸、山嵛酸、木蜡酸、神经酸、蜡酸、褐煤酸、蜜蜡酸等，但不限于这些。本发明的培养基中所含的脂肪酸可为饱和脂肪酸，也可为不饱和脂肪酸。
本发明的培养基可对应于其使用目的，适宜采用在公知的细胞培养中使用的组成。例如，以维持多能性干细胞的未分化性的同时增殖作为目的时，本发明的培养基优选不含具有促进多能性干细胞的分化的效果的物质，优选含具有抑制多能性干细胞的分化的效果的物质。作为有抑制多能性干细胞的分化的效果的物质，例如，对于人多能性干细胞，可举FGF2等，对于小鼠多能性干细胞，可举白血病阻止因子(LIF)等。
更具体而言，作为用于维持多能性干细胞的未分化性的同时促进增殖的培养基，可举出向DMEM/F-12培养基添加L-抗坏血酸、硒、转铁蛋白、NaHCO3、胰岛素、FGF2及TGFβ1的培养基(Chen G et al.，Nat Methods.2011May；8(5)：424-429)、向DMEM/F-12培养基添加非必须氨基酸、L谷氨酰胺、β巯基乙醇、胰岛素、转铁蛋白、胆甾醇、血清白蛋白、哌啶酸、氯化锂、FGF2及TGFβ1的培养基(Ludwig TE et al.，Nat Methods.2006Aug；3(8)：637-46)、添加白血病抑制因子、聚乙烯基醇、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、硒、2-巯基乙醇及抗生物质的小鼠胚胎干细胞维持用的无血清培养基(特开2007-228815号公报)、将Pannexin、bFGF、PDGF、EGF及维生素C混合而成的无血清培养基(特开2008-148643号公报)、以含有TGF-β作为特征的间充质干细胞的多分化能维持用培养基(特开2010-094062号公报)等，可参考这些的组成调制本发明的培养基。
例如，本发明的培养基可以向含L-抗坏血酸、硒、转铁蛋白、胰岛素、FGF2及TGFβ1的基础培养基添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物至成为终浓度176μM以上的方式调制，但不限于此。
本发明的培养基的pH优选调整到约6.0～约8.5，更优选约7.0～约7.5。培养基优选进行使用膜滤器等的过滤灭菌等的灭菌处理。
本发明的培养基还可在接附培养、悬浮培养、包埋培养、组织培养等之任一者的培养方法中使用。
另外，本发明的培养基的形态只要是得到了本发明的期望的效果，就不特别限定，例如，可调制为液体培养基、半流动培养基、及固体培养基的形态。另外，也可将本发明的培养基调制为粉末状的形态。通过调制为粉末状的形态，输送或保存可变得极其容易。另外，通过在使用时添加灭菌水及/或琼脂等，可容易地调制液体状、半液体状、或者固体状的培养基。
(4)多能性干细胞的培养方法1
本发明提供多能性干细胞的培养方法(本说明书中，也称为本发明的方法1)，其包括在上述本发明的培养基中培养多能性干细胞。
通过使用本发明的培养基，使多能性干细胞有效率地增殖变得可能。特别是，本发明的培养基对于维持未分化状态的同时，使多能性干细胞增殖，维持有用。从而，本发明的方法1优选为，用于使多能性干细胞增殖的方法，更优选用于维持未分化状态的同时，增殖或维持多能性干细胞的方法。
在本发明的方法1中的，培养基中的多能性干细胞的浓度只要是有期望的效果，就不特别限制，通常100～107个/cm3、优选101～106个/cm3、更优选为102～105个/cm3。
多能性干细胞的培养可通过向预先将L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度调整到期望的浓度的上述本发明的培养基中接种多能性干细胞来进行，也可通过在细胞培养开始后，向培养基中添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物，将L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度调整到本发明的培养基所要求的浓度后，进一步持续培养来进行。
在细胞培养开始后，在添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物时，也可使用以下详述的本发明的培养基添加物。
在本发明的方法1中的培养条件除了使用本发明的培养基之外，只要是可达成多能性干细胞的增殖促进等的期望的效果，就不特别限定，可对应于培养的目的而适宜采用在通常的多能性干细胞的培养中使用的培养条件。
例如，作为维持多能性干细胞的未分化性的同时进行培养的方法，可举出以实验医学别册目的别选的细胞培养流程(羊土公司)等中记载的方法。多能性干细胞的培养可使用小鼠胎仔成纤维细胞(MEF)或小鼠成纤维细胞株(STO)等的饲养细胞，也可在无饲养层环境下进行。
在本发明的方法1中，在细胞的培养中使用的培养器只要是能进行细胞的培养，就不特别限定，可举出瓶、组织培养用瓶、皿、平皿、组织培养用皿、多联皿、微平板、微孔板、多联盘、多孔板、显微镜载玻片、室玻片、培养皿、管、托盘、培养袋、及滚瓶等。
在细胞的培养中使用的培养器可为细胞接附性的，也可为细胞非接附性的，对应于目的适宜选择。
细胞接附性的培养器可以使与培养器的表面的细胞的接附性提升的目的，用细胞外基质(ECM)等的任意的细胞支持用基质或模拟它们的功能的人工物包被。细胞支持用基质可为以干细胞或饲养细胞(使用时)的接附作为目的的任意的物质。
此外的培养条件可适宜设定。例如，培养温度只要是可达成细胞的增殖促进等的期望的效果，就不特别限定，约30～40℃、优选为约37℃。CO2浓度为约1～10％、优选为约2～5％。氧浓度通常是1～40％，可根据培养条件等适宜选择。
在本发明的方法1中，多能性干细胞能由接附培养、悬浮培养、组织培养等的公知的方法培养。
只要是可达成细胞的增殖促进等的期望的效果，就不特别限制，在本发明的方法1中的多能性干细胞的培养的期间通常继续培养2天以上、优选4天以上、更优选为7天以上，理论上可无限继续培养。通过回收在本发明的培养基中培养的多能性干细胞，对其一部分或全部在新鲜的本发明的培养基中进行传代，持续继续培养，可经长期间，维持未分化状态的同时，增殖或维持多能性干细胞。
(5)多能性干细胞培养调制物
本发明提供含上述本发明的培养基及多能性干细胞的多能性干细胞培养调制物(本发明的培养调制物)。
在本发明的培养调制物中的多能性干细胞是生存、增殖的细胞。
在本发明的培养调制物中的多能性干细胞优选单离。“单离”是指进行除去作为目的的成分或细胞以外的因子的操作而脱离天然存在的状态。“单离的多能性干细胞”的纯度(全细胞数中所占的多能性干细胞的数的百分率)通常70％以上、优选80％以上、更优选为90％以上、再者优选99％以上、最优选100％。
在本发明的培养调制物中，多能性干细胞例如，存在于液体状、或者半流动状的本发明的培养基中。在一实施方式中，本发明的培养调制物是多能性干细胞在本发明的培养基中的悬浮液。本发明的培养调制物也可封入适合的容器中。
本发明的培养调制物对于上述本发明的方法1的实施有用。
(6)多能性干细胞的培养方法2
多能性干细胞的培养方法(本发明的培养方法2)，其包括以下的工序：
(1)在含L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的培养基中培养多能性干细胞；
(2)向得到的多能性干细胞培养物添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物，补充(1)中消耗的培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的一部分或全部；及
(3)继续培养添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的多能性干细胞培养物。
也可将本发明的培养基在工序(1)中使用。但是，在工序(1)中使用的培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度只要是能使多能性干细胞增殖的浓度(优选能维持未分化状态的同时，使多能性干细胞增殖，维持的浓度)，就足以，不要求如本发明的培养基一样的“高浓度”。在培养开始时间点，在工序(1)中使用的培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度例如，10μM以上、优选15μM以上、更优选为44μM以上。
在工序(1)中使用的培养基的组成除不要求L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度是“高浓度”的点之外，与本发明的培养基相同。
在工序(1)中的培养条件除不要求培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度是“高浓度”的点之外，与上述本发明的方法1相同。
工序(1)的培养的结果，多能性干细胞增殖(优选维持未分化状态的同时使增殖)、伴随其，培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物被消耗，其培养基中的浓度降低。
在工序(2)中，向在工序(1)中得到的多能性干细胞培养物添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的时机只要是可达成多能性干细胞的增殖促进等的期望的效果，就不特别限制，可在任意的时机添加。例如，在工序(1)中，在培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度减少至不足10μM、优选不足15μM、更优选不足44μM的阶段，添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物。或者，在工序(1)中，将培养开始时的培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度设为100％，其减少至50％以下，优选25％以下的在阶段，添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物。例如，从工序(1)的培养开始起2～5天后，优选3～5天后，更优选4～5天后，可添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物。
添加到培养基中的L-色氨酸及/或L-色氨酸衍生物可使用1种L-色氨酸或L-色氨酸衍生物，也可组合使用多种L-色氨酸及/或L-色氨酸衍生物。
添加到培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的量只要是可达成多能性干细胞的增殖促进等的期望的效果，就不特别限定，以培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的浓度成为能使多能性干细胞增殖的浓度(优选能维持未分化状态的同时，使多能性干细胞增殖，维持的浓度)的方式添加。例如，以培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度成为176μM以上、优选352μM以上的方式进行添加。也可以培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度成为如本发明的培养基一样的“高浓度”的方式进行添加。在一实施方式中，以培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度成为176μM以上、优选352μM以上、再者优选704μM以上的方式进行添加。添加后的培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度的上限值理论上是L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的饱和浓度，从向培养基的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的溶解性或成本的观点来看，培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物浓度优选为1408μM以下。
再者，在本说明书中的“补充在(1)中消耗的培养基中的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的一部分或全部”中，除了在工序(1)中补充培养当初添加的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的量的一部分或全量之外，也含向培养基添加培养当初添加的量以上的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物。
其中，本发明的方法2的特征是，在多能性干细胞的培养中，培养基中所含有的氨基酸之中，最快速地被消耗，由于处于由自外的L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的添加补充枯渴的L-色氨酸的一部分或全部的点，对于L-色氨酸以外的氨基酸，可与L-色氨酸或L-色氨酸衍生物一并添加，也可不添加。
在一实施方式中，在工序(2)中，作为氨基酸，仅添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物，不添加其他氨基酸。
在别的实施方式中，在工序(2)中，可将L-色氨酸以外的氨基酸(L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-丝氨酸、L-酪氨酸、L-脯氨酸)或其衍生物与L-色氨酸或L-色氨酸衍生物一并添加，也可不添加。添加的氨基酸可为1种，也可为多种。
进而，在工序(3)中，继续培养添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的多能性干细胞培养物。在工序(3)中的培养条件可与工序(1)同样，只要是得到了本发明的期望的效果，就也可变更。在本发明的优选的一实施方式中，在工序(3)中的培养条件与工序(1)同样。由于由L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的添加回避L-色氨酸的枯渴，多能性干细胞可持续继续(优选维持未分化状态的同时)增殖。
在本发明的方法2中，由于不要求培养基整体的更换，可由作为氨基酸而仅L-色氨酸或L-色氨酸衍生物，或者仅含L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的一部分的氨基酸的添加维持多能性干细胞的增殖，可低成本、并且有效率地使多能性干细胞增殖。
(7)培养基添加剂
本发明提供含L-色氨酸或L-色氨酸衍生物的培养基添加剂(本说明书中，也称为本发明的培养基添加剂)。本发明的培养基添加剂可在上述本发明的方法1或2中添加L-色氨酸或L-色氨酸衍生物时使用。
本发明的培养基添加剂中所含的L-色氨酸及/或L-色氨酸衍生物可使用1种L-色氨酸或L-色氨酸衍生物，也可组合使用多种L-色氨酸及/或L-色氨酸衍生物。
通过将本发明的培养基添加剂添加到多能性干细胞的培养用培养基中，有促进多能性干细胞的增殖的效果。本发明的培养基添加剂优选为多能性干细胞增殖促进用。
本发明的培养基添加剂只要是不损害期望的效果，就除了L-色氨酸及/或L-色氨酸衍生物之外，可对应于使用的目的，还含血清替代物、培养基添加物、脂肪酸。这些的血清替代物、培养基添加物、脂肪酸优选如上述记载，各自含在公知的浓度范围内。本发明的培养基添加剂只要是不损害期望的效果，就除了L-色氨酸及/或L-色氨酸衍生物之外，可适宜含一直以来在细胞的培养中使用的添加物等。
在一实施方式中，本发明的培养基添加剂是，作为氨基酸，仅含有L-色氨酸或L-色氨酸衍生物，不含有其他氨基酸。
在一实施方式中，本发明的培养基添加剂除了L-色氨酸或L-色氨酸衍生物之外，含有选自L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-丝氨酸及L-甲硫氨酸的1、2、3、4、5或6种氨基酸。此时，对于上述的本发明的培养基添加剂中所含有的氨基酸的氨基酸以外的氨基酸，可含在本发明的培养基添加剂中，也可不含在本发明的培养基添加剂中。
本发明的培养基添加剂只要是不损害期望的效果，就也可除了L-色氨酸及/或L-色氨酸衍生物之外，还以适当量含有任意的添加剂、例如，稳定化剂、张度剂、pH调整剂等。
本发明的培养基添加剂只要是得到了期望的效果，就可为任何的剂形，例如，可举出溶液、固体、粉末状等。在是固体或粉末状时，可使用适合的缓冲液等而以成为期望的浓度的方式溶解而使用。
培养基添加剂是溶液时，该溶液的pH优选调整到约5.0～约8.5，更优选约6.0～约8.0。培养基添加剂是溶液时，该溶液优选进行使用膜滤器等的过滤灭菌等的灭菌处理。
接下来显示参考例及实施例，对本发明更详细地进行说明，但这些不限定本发明的范围。
(参考例)
使用预先定量培养基中的各氨基酸量的培养基而将多能性干细胞201B7株(iPSAcademia日本公司)培养5天，对培养基中的各氨基酸量进行测定。多能性干细胞的培养是向包被基质胶(354277、康宁公司)的100mm组织培养用皿(353003、日本BectonDickinson公司)中接种1,000,000个细胞，于5％CO2/37℃培养。另外，残留在培养基中的氨基酸量的测定由以下的方法进行。氨基酸的定量分析用新保等(Anal Chem.2009Jul 1；81(13)：5172-9.Multifunctional and highly sensitive precolumn reagents for aminoacids in liquid chromatography/tandem mass spectrometry.Shimbo K，Yahashi A，Hirayama K，Nakazawa M，Miyano H.)中报告的LC-MS/MS***实施。细胞培养后上清取到1.5mL管，至测定时于负80℃保存。样品在实施蛋白除去处理后，用APDS试剂实施衍生物化而交付到分析装置。各样品中的氨基酸浓度使用校准曲线算出。结果，在培养开始时以44μM的浓度含的L-色氨酸在培养第4天枯渴。一方面确认到，此外的氨基酸即使在培养5天后也残留在培养基中，最少也约20％左右的残留。从而得知，在多能性干细胞的培养中，L-色氨酸在全氨基酸中最快速地的枯渴。
【实施例】
【实施例1：在3种市售的L-色氨酸的培养基中的增殖促进效果】
起初，将由L-色氨酸的诱导多能性干细胞(iPS细胞)的增殖促进效果使用3种市售培养基而进行评价。人iPS细胞使用从iPSAcademia日本公司购入的201B7株，在5％CO2/37℃的条件下进行。
L-色氨酸(Sigma-Aldrich公司：T8941)以成为指定的浓度的方式添加到Essential-8(Life Technologies公司：A1517001)、mTeSR1(Stem Cell Technologies公司：05850)、TeSR2(Stem Cell Technologies公司：05860)的培养基中，通过在培养中使用来探讨其效果。
调制以成为最终浓度44、176、352、704、1408μM的方式向Essential-8、mTeSR1、TeSR2的培养基添加L-色氨酸(Sigma-Aldrich公司：T8941)的培养基，探讨L-色氨酸的增殖促进效果。准备作为基底膜基质包被基质胶(日本Becton Dickinson公司)的6孔板，每1孔以单细胞接种13,000个细胞。在接种细胞的次日使用如上述调制的培养基而进行评价。将培养期间设为6天，将L-色氨酸添加时设为0，在24、48、72、96、120小时后使用IncuCyte而测量细胞被覆率。在未向接种时使用的培养基添加最终浓度10μM的Y-27632的培养基中进行培养。
每各培养基进行1轮实验的结果示于图1、2、3。得到了L-色氨酸浓度依赖性地显示增殖促进效果的结果。另外，见不到未分化标志物(OCT、Nanog、碱性磷酸酶)的表达受高浓度的L-色氨酸添加的影响(数据未示)。
【实施例2：L-色氨酸的增殖促进效果-使用别的人诱导多能性干细胞株的培养结果】
接下来，将由L-色氨酸的增殖促进效果使用人诱导多能性干细胞(iPS细胞)的别株253G4及人胚胎干细胞H9株进行评价。培养基使用mTeSR1(Stem Cell Technologies公司：05850)，在5％CO2/37℃的条件下进行培养。
L-色氨酸(Sigma-Aldrich公司：T8941)以成为指定的浓度的方式添加到mTeSR1(Stem Cell Technologies公司：05850)培养基中，通过在培养中使用来探讨其效果。
调制以成为最终浓度44、176、352、704、1408μM的方式向mTeSR1的培养基添加L-色氨酸(Sigma-Aldrich公司：T8941)的培养基，探讨L-色氨酸的增殖促进效果。准备作为基底膜基质包被基质胶(日本Becton Dickinson公司)的6孔板，253G4每1孔以单细胞接种40,000个细胞、H9每1孔以单细胞接种10,000个细胞。在接种细胞的次日取代为上述调制的培养基而进行评价。将培养期间设为6天，将L-色氨酸添加时设为0，在24、48、72、96、120小时后使用IncuCyte而测量细胞被覆率。在未向接种时使用的培养基添加最终浓度10μM的Y-27632的培养基中进行培养。
每各细胞进行5轮实验的结果示于图4、5。L-色氨酸的浓度依赖性增殖促进效果也在别的人多能性干细胞中确认。
【实施例3：L-色氨酸的增殖促进效果-使用人胎儿肾脏来源细胞株HEK293T的培养结果】
接下来，用人胎儿肾脏来源细胞株HEK293T细胞评价由L-色氨酸的增殖促进效果。培养基使用添加10％牛胎儿血清的DMEM培养基(ThermoFisherScientific公司：11965)，在5％CO2/37℃的条件下进行培养。
L-色氨酸(Sigma-Aldrich公司：T8941)以成为指定的浓度的方式添加到添加10％的牛胎儿血清的DMEM培养基(ThermoFisherScientific公司：11965)中，通过在培养中使用来探讨其效果。
调制以成为最终浓度44、176、352、704、1408μM的方式向添加10％牛胎儿血清的DMEM培养基(ThermoFisherScientific公司：11965)添加L-色氨酸(Sigma-Aldrich公司：T8941)的培养基，探讨L-色氨酸的增殖促进效果。准备6孔板，每1孔以单细胞接种10,000个细胞。在接种细胞的次日取代为上述调制的培养基而进行评价。将培养期间设为6天，将L-色氨酸添加时设为0，在24、48、72、96、120小时后使用IncuCyte而测量细胞被覆率。
进行5轮实验的结果示于图6。L-色氨酸的浓度依赖性增殖促进效果在人胎儿肾脏来源细胞株HEK293细胞中确认不到。
【实施例4：在L-犬尿氨酸的市售培养基中的增殖促进效果】
调制以成为最终浓度50、100、200、500、1000μM的方式向mTeSR1培养基添加L-犬尿氨酸(Sigma-Aldrich公司：K8625)的培养基，探讨增殖促进效果。从接种时起2天添加最终浓度10μM的Y-27632。准备作为基底膜基质包被基质胶(日本Becton Dickinson公司)的6孔板，每1孔以单细胞接种20,000个细胞。在接种细胞的次日使用不含Y-27632的如上述调制的培养基而进行评价。将L-犬尿氨酸添加时设为0，在0、24、48、72、96、120小时后使用IncuCyte而测量细胞被覆率。结果示于图7。如图7所示，得到了在L-犬尿氨酸50-500μM添加区中显示细胞增殖促进效果的结果。
【实施例5：在犬尿喹啉酸的市售培养基中的增殖促进效果】
调制以成为最终浓度50、100、200、500、1000μM的方式向mTeSR1培养基添加犬尿喹啉酸(Sigma-Aldrich公司：K3375)的培养基，探讨增殖促进效果。从接种时起2天添加最终浓度10μM的Y-27632。准备作为基底膜基质包被基质胶(日本Becton Dickinson公司)的6孔板，每1孔以单细胞接种20,000个细胞。在接种细胞的次日使用不含Y-27632的如上述调制的培养基而进行评价。将犬尿喹啉酸添加时设为0，在0、24、48、72、96、120小时后使用IncuCyte而测量细胞被覆率。结果示于图8。如图8所示，得到了在犬尿喹啉酸50-500μM添加区中显示细胞增殖促进效果的结果。
【产业上的利用可能性】
根据本发明，促进多能性干细胞的细胞增殖变得可能，可削减多能性干细胞的培养所耗的人的成本及金钱的成本。
本申请以在日本申请的特愿2017-063842(申请日：2017年3月28日)作为基础，其内容全部包含在本说明书中。

Claims (7)

1.多能性干细胞培养用的无血清培养基，其
以176μM～1408μM的浓度含：
L-色氨酸、或
L-色氨酸和氨基酸经肽键键合的二肽；或者
以50μM～500μM的浓度含L-色氨酸衍生物，其选自：L-犬尿氨酸及犬尿喹啉酸。
2.权利要求1所述的无血清培养基，其中多能性干细胞是诱导多能性干细胞。
3.多能性干细胞的培养方法，其包括在权利要求1或2所述的无血清培养基中培养多能性干细胞。
4.权利要求3所述的方法，其为用于使多能性干细胞增殖的方法。
5.多能性干细胞培养调制物，其包含权利要求1或2所述的无血清培养基及多能性干细胞。
6.多能性干细胞的培养方法，其包括下列工序：
(1)在含L-色氨酸或L-色氨酸和氨基酸经肽键键合的二肽、或者L-色氨酸衍生物的无血清培养基中培养多能性干细胞，所述L-色氨酸衍生物选自：L-犬尿氨酸及犬尿喹啉酸；
(2)向得到的多能性干细胞培养物：
以达到176μM～1408μM的浓度的方式添加所述L-色氨酸或所述L-色氨酸和氨基酸经肽键键合的二肽，或者
以达到50μM～500μM的浓度的方式添加所述L-色氨酸衍生物，
补充(1)中消耗的培养基中的所述L-色氨酸或所述L-色氨酸和氨基酸经肽键键合的二肽、或者所述L-色氨酸衍生物的一部分或全部；及
(3)继续培养添加了所述L-色氨酸或所述L-色氨酸和氨基酸经肽键键合的二肽、或者所述L-色氨酸衍生物的多能性干细胞培养物。
7.用于促进多能性干细胞的增殖的培养基添加剂，其
以在无血清培养基中达到176μM～1408μM的浓度的方式含：
L-色氨酸、或
L-色氨酸和氨基酸经肽键键合的二肽；或者
以在无血清培养基中达到50μM～500μM的浓度的方式含L-色氨酸衍生物，其选自：L-犬尿氨酸及犬尿喹啉酸。
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