CN110494156B

CN110494156B - 基于胶原和胶原样肽的水凝胶、角膜植入物、填料胶及其用途

Info

Publication number: CN110494156B
Application number: CN201780077356.7A
Authority: CN
Inventors: 梅·格里菲斯; 艾因·萨玛特; 伽各蒙汗·莱迪·加格木莱迪
Original assignee: Xiwei Suzhou Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Xiwei Suzhou Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2016-10-13
Filing date: 2017-10-13
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2037-10-13
Also published as: EP3558345A1; CA3079051C; US11426492B2; EP3558345A4; CA3079051A1; WO2018069873A1; CN110494156A; US20200046884A1

Abstract

本发明提供基于胶原和胶原样肽的水凝胶、角膜植入物、填料胶及其用途。本发明代表了基于胶原和胶原样肽的水凝胶、角膜植入物和填料胶领域中的进步。本发明公开了用DMTMM交联的胶原和新型胶原样肽、以及它们在制备水凝胶、角膜植入物和填料胶中的用途，与现有的角膜植入物相比，它们是高效且稳健的。此外，本发明涉及治疗角膜缺陷和疾病的方法。

Description

基于胶原和胶原样肽的水凝胶、角膜植入物、填料胶及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年10月13日提交的美国临时专利申请No.62/407,650的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

技术领域

本发明涉及使用DMTMM作为交联剂交联的胶原和经修饰的胶原样肽。本发明还涉及制备水凝胶、角膜植入物和填料胶的方法，所述水凝胶、角膜植入物和填料胶包含用DMTMM交联的胶原和胶原样肽。

背景技术

角膜是眼睛的透明覆盖物和主要折射部件。它负责将光传输到视网膜。人角膜由三个主要层组成，即最外面的上皮层、含有角膜细胞的中间基质和最里面的内皮细胞的单层。

全世界失明的主要原因之一是角膜疾病。这些疾病导致角膜透明度丧失，并随后使视力恶化。存在各种各样的引起角膜瘢痕并可能导致完全失明的传染性和炎症性眼病。微生物攻击是角膜疾病的常见原因。

对于角膜盲症最广泛接受的治疗是在移除受损组织后移植全厚度健康供体角膜。该过程被称为穿透性角膜移植术(penetrating keratoplastry，PK)。不幸地是，由于以下原因，穿透性角膜移植术的方法存在几个缺点：

·据2016年报导，供体组织供应量远低于已产生的全球1270万未治疗患者的移植需求，同时每年增加150万新患者。

·由于自身免疫情况、化学灼伤和感染等原因，供体角膜常常在大部分患者中被排斥。

·角膜移植物的存活率随着时间的推移而降低。

·供体角膜衍生感染如HSV是与人类供体角膜移植相关的另一严重并发症。应该筛选供体角膜，这是一种昂贵的程序，在美国，每个角膜的处理费约为2.5-3.5千美元。

人类角膜替代品的开发研究历史悠久，包括人工和天然替代品。已经尝试了使用来自猪和绵羊的角膜进行异种移植物的移植。但是所述方法存在许多缺点，例如免疫排斥以及由于病原体传播引起的跨物种疾病。

已经研究了脱细胞器官以评估它们作为移植物在相同或跨物种中的潜力，因为它们能够保留靶器官的原生细胞外基质。但是，由于不相容和排斥，脱细胞角膜也具有缺点。

被称为人工角膜(keratoprostheses，KPro)的人造角膜已经开发了200多年。已经使用了利用石英晶体植入物、诸如聚(甲基丙烯酸甲酯)和聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)等的塑料光学芯的人造角膜。但是，对于大部分患者而言，这种人造角膜的使用涉及终生抗生素以及免疫抑制的需求。这些人造角膜的保留率极低，超过一半的人造角膜不会持续超过三年。此外，患者有患上青光眼的风险，这是一种非常严重的副作用，可导致失明。

由于胶原是角膜细胞外基质的主要成分，因此胶原制成的人造角膜作为人类供体角膜的替代品已经引起了很大的兴趣。尽管现在可用通过重组方式生产的胶原，但是胶原的主要来源还是提取动物蛋白。为了提供机械强度、酶稳定性和移植的可行性，胶原通过不同的机制进行交联。

由猪和牛胶原制成并且移植到动物模型中的光学上透明和细胞友好的角膜植入物表现出免疫原性反应。动物源性胶原来自异质源，并且由于在每个不同来源中加工和筛选的水平不同，因此，需要非常小心传播疾病以及在宿主中引发免疫应答的风险。

重组人胶原的使用减轻了异质性和病原体传播问题。然而，重组人胶原的生产和纯化是一种昂贵的过程，其使得人造角膜的价格对于最需要的个体而言是遥不可及的。因此，可替代具有相同物理化学和生物学特性的重组人胶原的替代物将是巨大的进步。已经开发出胶原样肽(CLP)或胶原模拟肽(collagen mimetic peptides)作为胶原的功能性替代物。

迄今为止，已开发出基于使用各种交联剂交联的胶原样肽的角膜植入物。N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联体系已用于角膜植入物的开发。但是已经发现它们对周围细胞具有细胞毒性。

DMTMM在各种各样的应用中被用作交联剂。但是，其在水凝胶和植入物开发方面的用途不为人所知。DMTMM作为交联剂的使用比以前使用的交联剂具有前所未有的优势。这些优点包括改善的机械性能、改善的热性能和较低的细胞毒性作用。

在现有技术中，已经开发出具有与胶原非常相似特征的胶原样肽。一种具有36个氨基酸的此胶原样肽已被用作本发明的基础肽，其经过修饰以赋予机械强度和多功能性，例如抗炎性和对基质金属蛋白酶(MMP)的抗性。

与现有技术中公开的植入物相比，基于与DMTMM交联并含有MMP切割基序和抗炎基序的胶原样肽的植入物是高效的。

因此，本发明设想克服现有技术的问题，以解决开发具有改进的机械性能和较低细胞毒性作用的角膜植入物过程中长期存在的问题。此外，用于开发本发明的方法将使改进的植入物对于生活在低收入国家的世界上90％的视障者来说更容易接受和负担得起。

此外，本发明还可用于美容目的，例如用于矫正屈光不正，用作矫正先前激光眼科手术(PRK、LASIK、LASEK)的填充物，或者用作嵌上体(onlay)、嵌入体(inlay)和环(ring)替代激光眼科手术来纠正视力。填料胶也可用作抗衰老用具来填补皱纹。

发明内容

本发明涉及经修饰的胶原样肽，其中所述肽可操作地与一个或更多个具有MMP切割位点、抗炎特性和/或细胞粘附位点的功能性肽基序融合。

此外，本发明公开了化学修饰的胶原或胶原样肽-PEG(CLP-PEG)缀合物(conjugate)。本发明还涉及CLP-PEG缀合物，其使用4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)作为交联剂而交联为网络。

本发明公开了包含用DMTMM交联的CLP-PEG缀合物的水凝胶。此外，水凝胶含有干细胞或第二层抗炎生物聚合物。

本发明还涉及使用用交联剂交联的含纤维蛋白原的CLP-PEG缀合物制备水凝胶的方法，优选交联剂为4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)。CLP-PEG水凝胶以植入物或填料胶的形式存在。

此外，本发明涉及使用水凝胶的治疗方法，其包括将凝血酶预先施用于角膜缺陷。将含有纤维蛋白原的CLP-PEG与DMTMM混合并分配到角膜缺损的腔中。凝血酶与纤维蛋白原反应形成纤维蛋白，从而产生水凝胶。

本发明还涉及通过制备水凝胶制造角膜植入物并在惰性或非氧化气氛下的加湿室中将植入物模塑为角膜状植入物的方法。

附图说明

图1描述了用于重组产生胶原样肽的pCOLDI载体的载体图谱。

图2示出了重组产生的CLP，如SDS-PAGE凝胶上的条带所示。

图3描述了CLP-PEG(顶部)和8-臂-PEG-马来酰亚胺(底部)在DMSO-d6中的1H-NMR谱的比较结果。使用2.5δppm的溶剂峰作为内标。通过在7δppm处乙烯质子峰的完全消失证实CLP与PEG-马来酰亚胺的成功缀合。

图4示出了使用DMTMM交联化学的热辅助不可逆溶胶(左)-凝胶(右)转变。

图5示出了CLP-PEG和对照RHC-MPC上的原代角膜缘干细胞。两者都支持这些干细胞的增殖，其以DeltaNp63的存在为特征。

图6示出了DMTMM交联胶原植入物的振荡流变学研究。

图7示出了用不同量的DMTMM制备的植入物上人角膜上皮细胞(HCEC)的体外增殖。

图8示出了切除的猪眼的体外缝合试验。

图9描述了手术和未手术的兔角膜和CLP-水凝胶植入物的振荡流变学研究的结果；(a)储能模量(Storage modulus)，(b)损耗模量(Loss Modulus)和(c)损耗角正切(Losstangent)，作为在0.27％剪切应变振幅下的振动频率(Frequency)的函数。

图10描述了用不同交联剂交联的CLP植入物的振荡流变学研究。

图11描述了体外毒性研究，其中显示了人角膜上皮细胞在具有不同量的DMTMM的组织培养塑料上的生长。

图12示出了内路贴片(ab interno patch)(A)和被制造成角膜植入物的CLP-PEG水凝胶(B)的储能(G′)和损耗(G″)模量作为剪切应变振幅为0.27％时的振荡频率的函数的结果。与内路贴片相比，角膜植入物的较高G′值表明植入物的刚度高于内路贴片(abinterno patch)。

图13描述了测试的三种修补模式：A)从外部施加到标准化缺陷的氰基丙烯酸酯胶贴。将胶贴施加到从手术单上切下的3mm塑料圆盘的内表面上并施加到角膜上。B)将100μm直径3mm的交联胶原贴片从内部施加到标准化缺损上作为内路贴片。C)将100μm的3mm胶原内路贴片与CLP-PEG胶的外部施用相组合以密封标准化缺陷并替换丢失的角膜组织。

图14描述了A)穿孔人角膜的实例。B)实验设置：示出了在人造前房装置内的体外穿孔角膜模型。C)填充含有纤维蛋白胶的CLP-PEG的穿孔角膜模型。其他体外角膜模型用D)用氰基丙烯酸酯胶(对照)的常规外路(ab externo)修补，E)仅胶原水凝胶作为内路贴片修补，F)具有CLP-PEG填充物的胶原水凝胶内部贴片修补。

图15描述了FTIR研究的结果，显示了存储时间从14个月到10天不等的7种不同植入物样品的红外光谱叠加。

图16示出了术后12个月的所有8只手术动物。眼睛中可见一些血管和浑浊。总体而言，浑浊和血管稍微更突出，甚至在CLP-PEG组内，而含MPC的组中浑浊度在植入物内位于***。对胶原含量的分析表明，与健康的未手术角膜相比，CLP-PEG植入物具有更高的胶原蛋白I和V的总含量，而CLP-PEG-MPC植入物具有总体上显著减少的胶原。然而，CLP-MPC显示出相似的高分子量，即以成熟的胶原纤维作为健康的未手术对照。

图17描述了在手术刚结束时和术后5周时在两只代表性小型猪的角膜中的CLP-PEG植入物。

图18显示(A)两种不同交联体系EDC-NHS和DMTMM的细胞毒性比较。(B)各种浓度的DMTMM的急性毒性。

图19显示了在培养基中暴露于蛋白质交联剂后用钙黄绿素-AM(calcein-AM)和乙非啶同型二聚体-1(ethidium homodimer-1)染色的融合培养的永生化人角膜上皮细胞。A)在培养后第1天暴露于1％(w/v)DMTMM或含有0.16％(w/v)NHS的0.5％EDC(w/v)(EDC-NHS)后的细胞。对照培养物仅包含培养基。绿色细胞是存活的，而红细胞是死亡的。比例尺：50μm。B)分别暴露于1％或4％DMTMM 2分钟和5分钟后的细胞，2分钟是DMTMM用于交联填充穿孔所需的CLP-PEG量的时间，5分钟是所要求暴露时间的两倍以上。

图20示出了关于确定DMTMM对HCEC的长期毒性的研究结果。

图21示出了具有和不具有RGD的CLP-PEG水凝胶上的皮肤真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞。对照细胞在组织培养塑料(TCP)上生长。成纤维细胞由TCP和CLP-RGD-PEG支持。这些被抗平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体阳性染色，表明这些细胞是活化的成纤维细胞。

图22描述了原代真皮成纤维细胞在组织培养塑料(TCP)以及猪胶原(PC)、CLP-PEG(CLP)和CLP-RGD-PEG(CLP-RGD)的水凝胶上的体外培养结果。在接种到基质上(“预处理”)之前或在接种到基质上之后(“后处理”)，将细胞保持未处理或用TGF-β(10ng/ml)处理。红色染色表明平滑肌肌动蛋白阳性的细胞。DAPI核复染物显示为蓝色。图23描述了(a)显示在手术后12个月植入CLP-PEG的小型猪的角膜TEM。再生的新角膜上皮-基质界面区域显示出产生电子致密的细胞外囊泡。这些通过整体面部SEM截面的3D重建可视化，(b)显示黄色的细胞外囊泡，(c)是对照、RHC-III MPC和CLP-PEG的CD9阳性细胞外囊泡的3D重建，(d)免疫组织化学标记的CD9阳性细胞外囊泡切片，(e)显示针对Rab7染色的EV，(f)显示在不同基质上培养的角膜上皮细胞中的差异EV模式。

图24显示在种植6％和12％CLP-PEG后体外第6天来自大鼠小脑的原代神经元和神经胶质，所述CLP-PEG已掺入RGDSPG和IKVAV肽。神经元(黄色)用抗微管相关蛋白2免疫标记，星形胶质细胞(红色)用抗胶质纤维酸性蛋白免疫标记。小神经胶质细胞用同工凝集素GS-IB4染成绿色。用Hoechst33342将所有细胞核染成蓝色。

序列表简述

SEQ ID NO：1是毕赤酵母菌模板载体(pPink-aMF-COL模拟物-His-P4H-HC)的核酸序列，其包含编码38-氨基酸CLP的10个重复核酸序列。

SEQ ID NO：2是用于克隆的正向引物的核酸序列。

SEQ ID NO：3是用于克隆的反向引物的核酸序列。

SEQ ID NO：4是编码用于制备CLP的38-氨基酸序列的核酸序列。

SEQ ID NO：5是38-氨基酸长的多肽，其用作制备带有附加功能性基序的CLP的基础。该序列包含先前公开的已加入甘氨酸和半胱氨酸残基的36-氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是基质金属蛋白酶(MMP)切割基序，其与包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的肽功能性融合。

SEQ ID NO：7是编码CLP-MMP多肽的核酸，其中MMP切割基序与SEQ ID NO：5中给出的多肽功能性融合。

SEQ ID NO：8是抗炎基序(RYTVELA)，其与包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的肽功能性融合。

SEQ ID NO：9是编码CLP-RYTVELA多肽的核酸，其中抗炎基序与包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的肽功能性融合。

SEQ ID NO：10是包含与MMP切割基序以及抗炎基序(RYTVELA)融合的CLP的多肽。

SEQ ID NO：11是编码SEQ ID NO：10的多肽的核酸。

SEQ ID NO：12是细胞粘附肽基序RGDSPG(来自纤连蛋白)，其与包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的肽功能性融合。

SEQ ID NO：13是编码CLP-RGDSPG多肽的核酸，其中细胞粘附肽基序与包含SEQ IDNO：5的氨基酸序列的肽功能性融合。

SEQ ID NO：14是细胞粘附肽基序IKVAV(来自层粘连蛋白)，其与包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的肽功能性融合。

SEQ ID NO：15是编码CLP-IKVAV多肽的核酸，其中细胞粘附肽基序与包含SEQ IDNO：5的氨基酸序列的肽功能性融合。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有的含义与所述方法所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和组合物也可用于实践或测试所述方法和组合物，但现在描述具有代表性的示例方法和组合物。

在提供范围值的情况下，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述或中间值包含在所述方法和组合物内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内，并且也包括在所述方法和组合物内，受所述范围中任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些所包括的限制之一或两者的范围也包括在方法和组合物中。

应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方式的上下文中描述的方法的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的方法和组合物的各种特征也可单独提供或以任何合适的次组合提供。应注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数所指物，除非上下文另有明确说明。还应注意，可以起草权利要求以排除任何可选要素。因此，本声明旨在作为使用与权利要求元素的叙述相关的“单独”，“仅”等专用术语或使用“否定”限制的先行基础。

对于本领域技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的是，本文描述和示出的每个单独实施方式具有可以容易地与任何其他实施例的特征分离或组合的独立组件和特征，而不脱离本方法的范围或精神。任何列举的方法可以按照所述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。

术语“胶原”是指具有高拉伸强度的***的主要蛋白质，并且存在于大多数多细胞生物中。本文所用的术语是指来自不同来源的所有形式的可用作起始材料的胶原，其包括但不限于重组产生的胶原，从天然存在的来源提取、加工或以其他方式改性的用以制备水凝胶、植入物或填料胶的胶原。

术语“胶原样肽”或“CLP”是指任何与胶原蛋白结构或功能等同的肽。CLP可以进一步含有功能性肽基序，其包括但不限于抗炎基序、MMP切割基序或细胞粘附基序。

术语“胶原样肽-PEG”或“CLP-PEG”或“缀合的CLP”是指与聚乙二醇缀合的任何胶原样肽，聚乙二醇包括但不限于分子量为10-40kDa、具有4-8个臂并且具有六聚甘油或季戊四醇核心的聚乙二醇。

术语“水凝胶”是指包含使用合适的交联剂交联为网络的胶原-PEG或胶原样肽缀合物的凝胶，交联剂包括但不限于DMTMM。分散介质是任何合适的溶剂。

术语“角膜植入物”是指可以施用于受试者的角膜或与受试者的角膜接触的任何材料。角膜植入物可包括水凝胶，所述水凝胶包括使用合适的交联剂交联为网络的胶原或胶原样肽，所述交联剂包括但不限于DMTMM。植入物可进一步包含第二功能聚合物网络，并可用于递送细胞。

如本文所用的术语“填料胶”或“填充剂”旨在包括水凝胶，所述水凝胶包括使用合适的交联剂交联为网络的胶原-PEG或胶原样肽缀合物，并且术语“填料胶”或“填充剂”另外包含一种或更多种组分，其包括但不限于，肽、糖蛋白、密封剂、粘合剂、添加剂等，如纤维蛋白原。

术语“干细胞”代表一类组的未分化细胞，其具有自我更新的能力，同时保留不同的潜力以形成分化的细胞和组织。干细胞可以是多能的(pluripotent)或多潜能(multipotent)的。尽管多能干细胞不能形成完整的生物体，但多能干细胞是能够形成在完整生物体中发现的所有组织的细胞。此外，已知人体细胞可以重编程为类似于胚胎干细胞的未分化状态。该术语包括但不限于角膜干细胞。

术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指通过肽键或修饰的肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或更多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物，它们含有经修饰的残基和非天然存在的氨基酸聚合物。“多肽”是同时指通常称为肽、寡肽或寡聚体的短链，以及通常称为蛋白质的较长的链。多肽可含有除20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。同样，“蛋白质”是指至少两个共价连接的氨基酸，包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可以由天然存在的氨基酸和肽键或合成的拟肽结构组成。因此，本文所用的“氨基酸”或“肽残基”是指天然存在的和合成的氨基酸。“氨基酸”包括亚氨基酸残基，例如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是(R)或(S)构型。

具体实施方式

本发明公开了通过将一种或更多种功能性肽基序添加到先前公开的36-氨基酸肽中而制备的经修饰的胶原样肽。将具有蛋白水解切割位点、抗炎作用和/或细胞粘附基序的肽基序添加到本发明的氨基酸序列中。此外，已将甘氨酸和半胱氨酸残基添加到肽中，其允许聚乙二醇(PEG)的共价结合以形成稳健的水凝胶。

用DMTMM交联的胶原蛋白或胶原样肽用于制备治疗角膜、缺陷和疾病的水凝胶、角膜植入物以及填料胶。

本发明考虑了在开发高效角膜植入物方面的多维度方法，所述角膜植入物包含用DMTMM交联的胶原或胶原样肽。发现用DMTMM交联的胶原或胶原样肽开发的水凝胶比先前使用的EDC/NHS交联体系更有效且细胞毒性更低。

DMTMM相对于常用交联剂的功效

DMTMM首次被用作开发基于胶原和胶原样肽的水凝胶、植入物和填料胶的交联剂。本发明人已经确定，与现有的交联剂如EDC/NHS和N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(CMC)相比，DMTMM是优异的交联剂。

本发明的方法已经开发出高效且坚固的水凝胶，其特征在于以下特性：

a.振荡流变学研究证明了优异的机械性能；

b.改善植入物的可缝合性；

c.用不同交联剂进行的人角膜上皮细胞培养研究证明，细胞毒性更小且没有长期细胞毒性作用；

d.如FTIR光谱研究所证明的，长时间内水凝胶完整性增加；

e.卓越的抗疤痕特性；

f.增加诱导细胞外囊泡的产生。

此外，本发明中开发的水凝胶还具有化妆用途，例如校正屈光不正的能力，用作矫正先前激光眼科手术(PRK、LASIK、LASEK)的填充物，或对于矫正视力用作嵌上体、嵌入体和环以代替激光眼科手术。填料胶也可用作抗衰老工具来填充皱纹。

本发明还涉及制造水凝胶、角膜植入物和填料胶的方法，所述水凝胶、角膜植入物和填料胶包含用DMTMM交联的胶原或胶原样肽。

此外，本发明还涉及使用本发明开发的水凝胶和基于胶原的内路贴片治疗角膜缺陷的方法。本发明还揭示了一种包含基于胶原的内路贴片和填料胶的试剂盒。

在更详细地描述本公开的胶原样肽、缀合物、水凝胶、植入物、填料胶和方法之前，应理解，本发明不限于特定实施方式并且可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不是限制性的，因为所述方法和组合物的范围仅受所附权利要求的限制。

本发明的方面涉及使用36-氨基酸的肽序列作为基础设计的经修饰的胶原样肽。将功能性基序添加到该基础肽序列中以改善基于这些胶原样肽的水凝胶的功能性和治疗功效。加入甘氨酸和半胱氨酸以允许共价结合至8臂聚乙二醇马来酰亚胺(PEG)并形成稳健的水凝胶。添加到基础CLP的功能基序包括MMP切割基序、抗炎基序和细胞粘附基序。

为了赋予对基质金属蛋白酶(MMP)的抗性，加入MMP切割基序以阻止细胞外基质蛋白的降解。

本发明开发的胶原样肽含有MMP切割基序。基质金属蛋白酶(MMPs)，也称为Matrixins，是大约24种人类含锌内肽酶的家族，其能够降解ECM和许多其他蛋白质的组分。MMP在多种病理状态下过表达，例如关节炎疾病、癌症和炎症。

包含MMP切割基序的组合物用于在炎症部位切割MMP。加入细胞粘附基序如RGDSPG(来自纤连蛋白)和IKVAV(来自层粘连蛋白)以增强角膜上皮细胞增殖和分化以及神经突向外生长。

本发明的另一方面涉及胶原样肽的重组生产。胶原样肽的重组生产提供了无可挑剔的高产率，因此导致以较低的费用控制所需的较高纯度。

在本发明中，将编码经修饰的胶原样肽的核酸克隆到表达载体中用于重组表达。在优选的实施方式中，载体是pCOLDI表达载体。

使用限制性位点和合适的正向和反向引物将核酸克隆到上述表达载体中。在优选的实施方式中，限制性位点是NdeI和XbaI。

对于脯氨酸残基向羟脯氨酸的翻译后修饰，编码脯氨酰4-羟化酶的表达载体与编码胶原样肽的载体一起转化。在优选的实施方式中，用于编码脯氨酰4-羟化酶的载体是pET载体。

使用用于表达重组胶原样肽的合适宿主细胞。在优选的实施方式中，使用的宿主细胞是大肠杆菌BL-21(DE3)菌株。在优选的实施方式中，宿主细胞用于产生无内毒素的重组蛋白。

对于CLP的重组表达，选择抗抗生素的预培养细菌。在优选的实施方式中，抗生素是氨苄青霉素。

存在于宿主中的启动子是诱导型启动子。在优选的实施方式中，启动子是IPTG。

通过离心收获重组宿主细胞并进行裂解以回收重组蛋白。在优选的实施方式中，通过超声处理进行裂解。

使用合适的纯化***进一步纯化胶原样多肽。在一个优选的实施方式中，特异性结合附着于CLP的N-末端的组氨酸标签的Ni-NTI柱用于纯化。

重组表达的蛋白质不会在人体细胞中引发内毒素反应，并用于制备水凝胶和植入物。

可选择地，使用肽合成仪合成肽。

本发明的其他方面涉及使用DMTMM制备交联为网络的胶原或CLP-PEG水凝胶。此外，制备使用水凝胶的植入物和填料胶。为了制备水凝胶，胶原或重组产生的胶原样肽与聚乙二醇缀合，聚乙二醇分子量为10-40kDa、具有4-8个臂并且具有六聚甘油或季戊四醇核心。在优选的实施方式中，使用MW为40KDa和具有六聚甘油核心的8-臂-PEG-马来酰亚胺。将得到的CLP-PEG缀合物进行三阶段过滤。在一个优选的实施方式中，三阶段过滤方法包括使用P3烧结玻璃漏斗，0.45μm无菌过滤器，然后通过截留分子量为12-14KDa的再生纤维素透析膜相对水透析进行纯化。最后将纯化的溶液冻干。

为了制备水凝胶，使用合适的交联剂使CLP-PEG水溶液交联。在优选的实施方式中，制备15％(w/w)CLP-PEG水溶液，并加入2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)作为缓冲液。优选实施方式中的交联剂是4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(4-(4，6-Dimethoxy-1，3，5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride，DMTMM)。

在另一个实施方式中，将纤维蛋白原与CLP-PEG混合，然后加入DMTMM以制备水凝胶。将凝血酶预先施加到角膜缺陷上，当它与水凝胶的纤维蛋白原接触时，反应转化成纤维蛋白，纤维蛋白是一种优质的填料胶。

为了制备植入物，将水凝胶模制成角膜状植入物并在惰性或非氧化气氛下于加湿室中固化过夜。在优选的实施方式中，所述惰性或非氧化气氛是氮气氛。

为了制备CLP-PEG填料胶，将CLP-PEG缀合物溶解在去离子水中。所得溶液在37℃下表现为液体并且是可注射的。任选地，可以将纤维蛋白原添加到该溶液中。在将15％(w/w)CLP-PEG的溶液从37℃冷却至25℃的同时添加DMTMM是制备填料胶的优选方式。

本发明的另一方面涉及具有抗炎生物聚合物、小药物和预先装载干细胞的经修饰的植入物。水凝胶的缓慢胶凝动力学允许均匀掺入第二网络抗炎和防污生物聚合物。在优选的实施方式中，抗炎和防污生物聚合物是2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱网络(MPC)。CLP-MPC植入物适合用作具有严重病理状况例如化学灼伤、严重感染、自身免疫病症等的角膜植入物。较慢的胶凝动力学还允许各种小分子药物如万古霉素的共价结合。

本发明的另一方面涉及制备用预先装载干细胞的基于胶原或CLP的植入物，用于将干细胞递送至其自身内源性干细胞耗尽的患者。在一个优选的实施方式中，在植入物上生长DeltaNp63阳性角膜缘上皮细胞，并且发现植入物支持干细胞的增殖。

本发明的其他方面涉及所开发的植入物的表征，其包括机械表征、热表征和细胞毒性表征。

对于机械表征，对这些水凝胶和植入物进行振荡流变学研究。结果表明，与先前公开的植入物相比，植入物具有高得多的储能模量和更低的损耗角正切(tangent loss)。

对于热表征，进行差示扫描量热分析，其显示用各种当量的DMTMM制备的水凝胶的玻璃化转变温度与人角膜的玻璃化转变温度相匹配。

通过比较使用不同交联剂制备的植入物对其上人角膜上皮细胞的生长来进行进一步的细胞毒性表征。为了比较，将HCEC接种到组织培养板上并且比较DMTMM和EDC/NHS交联***对永生化人角膜上皮细胞的影响。

在另一方面，测试了DMTMM对HCEC的长期毒性。将HCEC与DMTMM一起温育并培养长达7天。进行染色以检查细胞的活力。

在另一个方面，在新西兰白色雄性兔子移植植入物之前和之后的不同时间测量角膜的厚度。

在本发明的其他方面，展现了植入物的可缝合性、抗瘢痕性质、细胞外囊泡产生的诱导和植入物在长时间内的稳定性。

在本发明的另一个方面，已经表明，在切除的猪眼上测试的植入物的可缝合性被发现能够承受多次间断缝合而几乎没有断裂。

在本发明的另一方面，使用FTIR光谱法研究样品的长期完整性。对样品进行650-4000cm^-1的波扫描，并且在样品之间没有发现显著的光谱差异，表明在14个月的储存期间植入物的完整性。

在另一方面，测试了植入物的抗瘢痕形成特性。植入物上的原代真皮成纤维细胞的体外培养显示CLP植入物可能用作预先形成或原位固化的再生支架或模板，以具有抗瘢痕形成作用。

在另一方面，测试了植入物诱导细胞外囊泡产生的能力。研究小型猪新角膜以表征外来体，并且在植入CLP-PEG和RHCIII-MPC的切片上进行的免疫组织化学显示外来体的CD9标记和核内体标记物Rab-7的差异染色。结果显示角膜中的CLP-PEG植入物促进细胞外囊泡的再生。

在另一方面，展示了治疗角膜和缺陷和疾病的方法。在角膜上进行穿孔并制作标准化的角膜缺损。然后通过使用A)采用氰基丙烯酸酯胶的传统外部修补；B)仅基于胶原水凝胶的内路贴片；C)胶原水凝胶内路贴片以及CLP-PEG填充剂。

此外，评估破裂压力以显示使用CLP-PEG-纤维蛋白原填料胶进行修补是密封角膜缺陷的最佳方法。

实施例

实施例1：胶原样肽

使用36-氨基酸肽(Pro-Lys-Gly)₄(Pro-Hyp-Gly)₄(Asp-Hyp-Gly)₄作为基础设计胶原样肽。向该多肽序列中加入甘氨酸和半胱氨酸以允许共价结合至8臂聚乙二醇马来酰亚胺(PEG)并形成稳健的水凝胶。向其中加入另外的肽基序，使多肽成为多功能的。

将包含10个编码38-氨基酸CLP的核酸序列的重复序列的毕赤酵母模板载体(pPink-aMF-COL模拟物-His-P4H-HC)用作模板载体。模板载体的核酸序列由SEQ ID NO：l表示。

使用包含SEQ ID NO：2所示的核酸序列的正向引物和包含SEQ ID NO：3的核酸序列的反向引物，分离编码38-氨基酸序列的核酸的一个重复。该重复序列的核酸序列由SEQID NO：4表示。

使用NdeI和XbaI限制性位点将与添加的功能性基序融合的该重复序列克隆到pCOLDI载体(Takara Bio Inc)中。使用的正向引物和反向引物分别由SEQ ID NO：2和SEQID NO：3表示。

在本发明中，使用38-氨基酸多肽作为基础合成了几种多肽。38-氨基酸的多肽由SEQ ID NO：5表示。

基质金属蛋白酶(MMP)切割基序在功能上与包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的肽融合。MMP基序由SEQ ID NO：6表示，编码CLP-MMP多肽的核酸由SEQ ID NO：7所示。

抗炎基序(RYTVELA)在功能上与包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的肽融合。抗炎基序由SEQ ID NO：8表示，编码CLP-MMP多肽的核酸由SEQ ID NO：9表示。

此外，设计了编码与MMP切割基序以及抗炎基序融合的CLP的核酸。融合多肽由SEQID NO：10表示，编码融合多肽的核酸由SEQ ID NO：11表示。如SEQ ID NO：10所示的CLP用于涉及植入物评估的所有实验，除非在具体实施例中另有说明。

此外，修饰胶原样肽以将细胞粘附肽基序RGDSPG(来自纤连蛋白)和IKVAV(来自层粘连蛋白)掺入肽序列中。

融合多肽CLP-RGDSPG由SEQ ID NO：12表示，编码该融合多肽的核酸由SEQ ID NO：13表示。

融合多肽CLP-IKVAV由SEQ ID NO：14表示，编码该融合多肽的核酸由SEQ ID NO：15表示。

实施例2：重组胶原样肽的重组生产

将实施例1的核酸克隆到pCOLDI表达载体(Takara Bio Inc)中。表达载体pCOLDI的载体图谱如图1所示。该过程中使用的限制性位点是NdeI和XbaI。此外，使用的正向引物和反向引物分别由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3表示。

对于翻译后修饰脯氨酸残基为羟脯氨酸，使用包含编码脯氨酰4-羟化酶的核酸的pET载体。

将表达载体(pCOLDI和pET)均转化到大肠杆菌BL-21(DE3)菌株中。大肠杆菌BL-21(DE3)电感受态菌株以商标名

出售。

BL21(DE3)细菌细胞用于生产无内毒素的重组蛋白。

对于CLP的重组表达，将4-20μL抗氨苄青霉素溶液的预培养细菌接种到含有100μg/mL氨苄青霉素和0.5％葡萄糖的40mL LB Miller培养基中，并于37℃下在振动板(150rpm)上生长16小时。16小时后，将细菌培养物给予含有100μg/mL氨苄青霉素的1L LBMiller，并在37℃和150rpm振荡下生长直至OD₆₀₀为0.6-0.8。

加入IPTG以达到1.5mM IPTG CLP蛋白培养物的终浓度。然后将细菌于室温下在振动板(150rpm)上生长16小时。

离心20分钟(5000×g，室温)收获重组宿主细胞。弃去上清液，将沉淀物储存在-20℃。此后，将细菌沉淀重悬于10mL变性结合缓冲液(20mM磷酸氢二钠、0.5M NaCl、40mM咪唑、8M尿素(U5378，Sigma)，pH8.0)/1gm沉淀中，并通过超声处理裂解。

将溶液在4℃下超声处理60×10秒，期间间隔10秒并且在最初的30脉冲和最后30脉冲之间间歇45分钟。然后将样品在4℃下以5000×g离心2×20分钟，并将上清液转移到新管中，然后将其储存在4℃。

实施例3：重组胶原样肽的纯化

使用Ni-NTI柱纯化胶原样多肽，所述柱特异性结合附着于CLP的N-末端的组氨酸标签。

用10-15CV变性结合缓冲液平衡Ni-NTA柱，并施加蛋白质样品的上清液。用3×2mL变性结合缓冲液洗涤柱子，用5CV变性洗脱缓冲液(20mM磷酸氢二钠、0.5M氯化钠、0.5M咪唑、8M尿素，pH8.0)洗脱蛋白质。收集样品并使用SDS PAGE分析。使用标准规程对重组CLP进行SDS-PAGE。SDS-PAGE的结果如图2所示。SDS PAGE结果的E1-E5示出了由SEQ ID NO：10表示的CLP的洗脱液。使用300mM咪唑使His标签多肽显现。

对于透析，收集所有含有蛋白质的洗脱液并在一个50ml管中混合。根据制造商的使用移液管的规程使用

透析盒G2(#87730，Thermo Scientific)。纯化蛋白质的天然结合缓冲液用作透析缓冲液，并在4℃下进行透析过夜。

为了进一步减少所透析的CLP蛋白质溶液的盐含量，使用具有8.3mL SEPHADEX^TMG-25介质(52-1308-00BB，GE Healthcare)的PD-10脱盐柱和所提供的重力规程(gravityprotocol)于室温下进行凝胶过滤。用6mL 1X磷酸盐缓冲盐水(PBS，P5368，Sigma)进行洗脱，并将洗脱液保持在4℃的冰上。

将CLP样品在-80℃于falcon管中完全冷冻。然后用封口膜代替盖子并用使液体蒸发的注射器穿孔。将管置于真空下直至所有液体蒸发。

实施例4：CLP-PEG缀合物的制备

将前面实施例中获得的重组胶原样肽用于制备CLP-PEG缀合物。8臂-PEG-马来酰亚胺(MW：40KDa，六聚甘油核心)购自Creative PEG Works(Chapel Hill，NC，USA)。

用N₂喷射(sparge)20mL水20分钟。向喷射的水中加入8-臂PEG-马来酰亚胺(770mg，18.7μmol)直至完全溶解。将CLP(625mg，149.5μmol，相对于PEG为8摩尔当量)作为固体粉末加入到搅拌的溶液中。

将反应混合物在25℃搅拌20分钟直至PEG完全溶解。通过逐滴加入2MNaOH将反应混合物的pH调节至4.5，并进一步分三部分加入30mL喷射水以适当搅拌。将反应烧瓶用铝箔覆盖，并在25℃下搅拌5天。在第5天结束时，加入另外的50mL水并将反应混合物的pH重新调节至4.5。

然后将溶液吸取到50mL注射器中并通过0.45μM注射过滤器过滤。然后将过滤的溶液转移到截留分子量(MWCO)为12-14kDa，优选截留分子量为14kDa的透析管中。然后将含有滤液的透析管转移到含有pH 4.5水的2L烧杯中(通过逐滴加入浓HCl调节pH并使用pH电极测量)。用大磁力搅拌棒搅拌烧杯并用铝箔覆盖。透析水每天更换两次，持续7天。然后将透析袋的内容物转移至50mL Falcon管中，作为25mL等分试样。然后将溶液在-80℃冰箱中冷冻过夜。然后将Falcon管冷冻干燥，并且获得如棉状固体的CLP-PEG缀合物。(温度＝-48℃，真空＝90×10^-3巴)。此过程在使用的***上花费了5天。

为了制备10％(w/w)CLP-PEG溶液，将300mg CLP-PEG加入无菌注射器的枪管中。加入2700μL水至10mL无菌注射器的柱塞，使其终浓度为10％(w/w)。

用封口膜密封注射器，使CLP-PEG在室温下重建2-3周。对于重建过程，用刮刀定期搅拌混合物并在培养箱中加热至37℃。一旦溶液完全重悬浮，将其加热至高于其熔化温度，高于37℃并以3000rpm离心10分钟。重复该过程直至从注射器中除去所有气泡。

使用DMSO-d₆作为溶剂，通过¹H-NMR谱(Jeol 400MHz NMR谱仪，Joel Nordic AB，Sollentuna，Sweden)表征CLP-PEG缀合物。光谱分析的结果如图3所示。

使用2.5δppm的溶剂峰作为内标。通过在7δppm处乙烯基质子峰的完全消失证实CLP与PEG-马来酰亚胺的成功缀合。

实施例5：CLP-PEG水凝胶和植入物的制备

制备15％(w/w)CLP-PEG(每个CLP-PEG分子中32个赖氨酸)水溶液。加入26μl0.625M的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)溶液作为缓冲液。

用于制备水凝胶的交联剂是4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)。

为了制备水凝胶，交联剂采用的浓度为CLP-PEG中每个赖氨酸残基1当量。交联剂以在0.625M MES溶液中10％的形式加入。

将得到的含有CLP-PEG和交联剂的混合物充分混合并模塑成角膜状植入物，并在氮气氛下于加湿室中固化过夜。该水凝胶中的最终CLP-PEG浓度为9.8％(w/w)。

还使用用DMTMM交联的胶原制备水凝胶和植入物。

实施例6：CLP-PEG填料胶的制备

使用DMTMM化学，基于CLP-PEG开发了热辅助化学交联制剂。

为了制备CLP-PEG填料胶，将CLP-PEG缀合物以15％(w/w)浓度溶解于去离子水(pH7)中。所得溶液在37℃下表现为液体并且是可注射的。但是，由于CLP的模板组装，该溶液在冷却至25℃时凝固成凝胶。CLP-PEG的溶胶-凝胶转变是可逆的。

通过加入DMTMM的10mM PBS溶液至终浓度为4％(w/v)同时将15％(w/w)CLP-PEG的溶液从37℃冷却至25℃使该溶胶-凝胶转变不可逆。获得的水凝胶用作填料胶。

DMTMM在CLP中分别引发侧链羧酸与来自天冬氨酸和赖氨酸的胺之间的酰胺键形成。该凝胶通常在2分钟内凝固。

图4描述了使用DMTMM交联化学的热辅助不可逆溶胶(左)-凝胶(右)转变。

由于角膜表面温度约为34℃，因此可以在37℃下与DMTMM混合后将该材料注射到角膜表面上，由于角膜表面温度较低，材料在体内发生不可逆角膜凝胶化。如果需要，进一步冷却角膜以促进该过程。

实施例7：基于胶原的内路贴片的制备

为了制备基于胶原的内路贴片，将10％(w/w)猪I型胶原(分子量300KDa，每个胶原蛋白分子114个赖氨酸，Nordic Biolabs AB，Stockholm，Sweden)水溶液加入到200μl的0.625M MES溶液中并加载到注射器混合***上。此外，加入12μl、2M的NaOH以达到pH为5.5。

将所得溶液进一步充分混合，偶尔在冰上冷却。以在0.625M的MES溶液中浓度为10％的方式加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(相对于胶原中赖氨酸数为0.4当量)并充分混合。然后以在0.625M的MES溶液中浓度为5％的方式加入EDC(相对于胶原中赖氨酸的数量为0.7当量)。在加入EDC后，将反应混合物非常快速地混合并模塑成100μm厚的薄片，并在氮气氛下于加湿室中固化过夜。内路贴片中的最终胶原浓度为5.5％(w/w)。

可以将该基于胶原的内路贴片和实施例5中提供的CLP-PEG填料胶包装到用于临床应用的试剂盒中。

实施例8：具有纤维蛋白原的CLP-PEG水凝胶的制备

为了增强CLP-PEG水凝胶和填料胶的性质，添加纤维蛋白原。使用如实施例3中制备的300mg 10％CLP-PEG。将30mg纤维蛋白原(可凝结蛋白-TISSEEL^TM试剂盒)和2700μL水加入到注射器枪管中，使最终浓度为10％(w/w)CLP-PEG和1％(w/w)纤维蛋白原。

用封口膜密封注射器，使CLP-PEG和纤维蛋白原在室温下重构2-3周。为了帮助重构过程，用刮刀定期搅拌混合物，且可以在培养箱中加热至37℃。一旦溶液完全重新悬浮，将其加热至高于其熔化温度，即37℃，并以3000rpm离心10分钟。重复该过程直至从注射器中除去所有气泡。

实施例9：CLP-PEG-纤维蛋白原填料胶的制备

注射器内含有10％w/w CLP-PEG和1％(w/w)纤维蛋白原的溶液在高于37℃的温度下表现为液体(可注射)，但由于CLP的模板组装，当冷却至25℃时凝固成凝胶。然而，这种溶胶-凝胶转变是可逆的。为了使这种溶胶-凝胶转变不可逆，我们加入交联剂4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)的10mM PBS溶液至混合物中使DMTMM的最终浓度为2％w/w，同时将CLP-PEG和纤维蛋白原的溶液从37℃以上冷却至25℃。

为了制备CLP-PEG-纤维蛋白，将CLP-PEG/纤维蛋白原混合物在50℃下加热5分钟。将适量的CLP-PEG/纤维蛋白原混合物转移至2mL玻璃注射器中。

用10mM PBS填充T型件***(T-piece system)。将含有CLP-PEG/纤维蛋白原混合物的注射器连接到T型件***。将T型件***在50℃培养箱中加热5分钟。将溶液混合75次。在10mM PBS中制备10％(w/w)DMTMM溶液。通过T型件***上的添加端口将DMTMM溶液添加到Hamilton微注射器中。将溶液再次混合75次以获得含有CLP-PEG-纤维蛋白原胶的水凝胶。

将水凝胶浇铸到500μM角膜模具中以制备植入物。然后使用夹具拧紧模具。然后将模具/夹具于室温下置于湿度室中24小时。然后将模具从夹具中取出并使其在水中浸泡18小时。然后将植入物脱模并转移到含有10mM PBS的无菌小瓶中。

实施例10：CLP-PEG-纤维蛋白原填料胶的应用

CLP-PEG-纤维蛋白原填料胶的应用与凝血酶组合进行。

通过向凝血酶小瓶(TISSEEL^TM试剂盒)中加入4mL 10mM PBS，以250U/mL重构凝血酶。在使用前将溶液在室温下混合20分钟。可以将溶液等分到几个Eppendorf管中并冷冻以备将来使用。

将凝血酶应用于创面床(wound bed)/基质内袋(intrastromal pocket)。然后将填料胶涂敷到伤口上。当与CLP-PEG-纤维蛋白原填料胶结合时，凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。

实施例11：掺入第二抗炎生物聚合物网络和附着小药物分子

使用实施例5中获得的水凝胶，并且缓慢胶凝动力学允许均匀掺入抗炎和防污的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)的生物聚合物第二网络。图16中描述了稳定整合的CLP-PEG-MPC植入物。

CLP-MPC植入物适合用作具有严重病理状况(例如化学灼伤，严重感染，自身免疫病症等)的角膜植入物。第二层的掺入还允许各种小分子药物如万古霉素的共价结合。此外，在植入物的制造过程中已经结合了各种持续的药物释放***。

实施例12：具有预装干细胞的基于CLP的植入物

测试了用DMTMM交联的基于CLP的植入物的不利影响。基于DMTMM的植入物的细胞增殖数据在图7中给出。数据表明DMTMM对干细胞无细胞毒性。

测试了CLP-PEG植入物的体内干细胞递送能力。DeltaNp63角膜缘上皮细胞在CLP-PEG植入物上生长，基于RHC-MPC的植入物用作对照。

图5显示与在RHC上生长的细胞相比，DeltaNp63阳性角膜缘角膜上皮细胞的生长。CLP-PEG和对照RHC-MPC上的原代角膜缘干细胞。两者都支持这些干细胞的增殖，其特征在于DeltaNp63的存在。

CLP-PEG植入物具有用于结合干细胞以递送至其内源性干细胞耗尽的患者的潜力。

实施例13：CLP-PEG角膜植入物和基于胶原的内路贴片的机械表征

进行研究以表征和比较本发明的CLP-PEG植入物。

使用各种浓度的交联剂，其产生具有不同程度弹性的水凝胶。制备以下具有N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(CMC)和DMTMM作为交联剂的水凝胶：

表1：使用的各种浓度的交联剂

N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(CMC)交联水凝胶在频率扫描实验中仅到20Hz是稳定，而用不同浓度的DMTMM交联的水凝胶可耐受高达90Hz振荡频率。

DMTMM交联胶原植入物的振荡流变学研究结果如图6所示。结果表明，用DMTMM交联的胶原基水凝胶的机械强度有了前所未有的改善。DMTMM的较慢凝胶动力学允许聚合物链在整个水凝胶中非常精细和均匀地缠结，这解释了这些材料的非常高的回弹性。

在另一项研究中，还评估了仅CLP植入物的机械性能。通过将水凝胶植入兔角膜中来评估CLP-PEG水凝胶与宿主角膜的物理整合。使用振荡流变学研究将术后6个月后再生的新角膜的剪切特性与初始植入物和健康兔角膜的剪切特性进行比较。如频率扫描测量所发现的：与正常健康兔角膜相比，CLP-PEG植入物具有高得多的储能模量和低得多的损耗角正切。结果表明，植入物更硬且更不柔顺。

天然兔角膜具有相对高的损耗角正切。在被植入的角膜和未手术的健康角膜的情况下，发现损耗角正切在0.15-0.25的范围内，而植入物的损耗角正切在0.01-0.02之内。

由于初始植入物和再生或健康角膜的机械特性存在巨大差异，并且对于任何给定的兔子，手术和未手术的角膜之间没有显著差异，因此，结论是植入物稳定地整合到宿主组织中。

图9中示出了手术和未手术的兔角膜以及CLP-水凝胶植入物的振荡流变学。结果给出了在0.27％剪切应变幅度下作为振荡频率的函数的储能模量，损耗模量和损耗角正切。

此外，研究了使用DMTMM交联策略的两种类型的CLP-植入物，其包括具有略高固体含量的仅CLP-植入物(G1.1-CLP)和CLP-MPC植入物(G2.0.x-CLP-MPC)。

DMTMM交联策略使得仅CLP植入物中的固体含量进一步增加。这些具有较高固体含量的植入物具有优异的机械性能，以便于手术操作，但是由于表面侵蚀，预计也会在体内缓慢降解。

如振荡流变学中观察到的，发现G1.1-CLP的储能模量是G1.0-CLP近1.5倍高，表明机械性能优异。还测试了CLP-MPC制剂(G2.0.x-CLP-MPC)的机械性能，并与仅CLP制剂进行了比较。在频率扫描测量中发现所有样品稳定至约15Hz。

发现，对于除CLP-MPC之外的所有样品，频率的线性粘弹性区域为0-15Hz。

发现，除了样品(S4)的所有样品的储能模量均在14000-15000Pa范围内，样品(S4)的储能模量在21000-22000Pa范围内。然而，所有样品的粘性模量均为在相似的范围内。

发现G2.0.2-CLP-MPC和G1.1-CLP的机械性能非常相似，细胞培养数据显示这些制剂与细胞相容。

振荡流变学研究的结果如图10所示。

实施例14：差示扫描量热分析

水凝胶的差示扫描量热(DSC)分析显示玻璃化转变温度范围为43℃至63℃，这取决于如表2所示的用于交联的DMTMM的当量。

表2用各种当量的DMTMM交联的13％猪胶原水凝胶的DSC分析

DMTMM当量	起始温度(℃)	T<sub>g</sub>(℃)
			0.4	43.3±0.35	43.4±0.35
0.6	44.9±0.38	45.1±0.18
			0.8	39.7±0.67	47.9±0.57
1.0	54.5±0.35	54.6±0.41
			1.5	62.8	62.9

水凝胶与人角膜的玻璃化转变温度65.1℃相匹配。

此外，实施例9描述了CLP-PEG植入物和手术或未手术角膜的量热分析。手术或未手术角膜的玻璃化转变温度在62-65℃的范围内，而发现初始植入物的转变温度为131.0±1.1℃。

表3 CLP-PEG水凝胶植入物和手术或未手术角膜的热性质

样品	转变温度(℃)
		CLP-PEG水凝胶	131.0±1.1
动物样本1(手术的角膜)	63.1±0.5
		动物样本1(未手术的角膜)	63.5±0.2
动物样本2(手术的角膜)	62.2±0.9
		动物样本2(未手术的角膜)	64.3±0.5

实施例15：使用HCEC的体外细胞毒性评价和与不同交联剂的比较

为了研究交联剂DMTMM对人角膜上皮细胞的影响，用两种配方(DMTMM 1当量(eqv)和DMTMM 1.5当量)进行体外细胞培养研究。如图7所示，这两种制剂在细胞生长方面没有显著差异，并且与组织培养塑料(TCP)上的细胞生长相当。

在另一个实验中，比较DMTMM交联剂与EDC/NHS交联体系对永生化人角膜上皮细胞的作用。

使用0.22μm过滤器对所有使用的溶液进行无菌过滤。将HCEC以10000个细胞/孔的密度接种到96孔组织培养板上。它们补充有包含0.05mg/ml牛垂体提取物、5ng/ml表皮生长因子和1mg/ml青霉素/链霉素的角质形成细胞无血清培养基(KSFM；Gibco，Invitrogen，Stockholm，Sweden)，并在37℃和5％CO₂下于加湿培养箱中生长至汇合。在测试之前使细胞生长至汇合。

将KSFM中1％DMTMM(w/v)与浓度为0.5％(w/v)EDC和0.16％(w/v)NHS的共反应物(之前用于交联CLP-PEG的交联剂)进行比较。测试了5和15分钟的暴露时间。结果如图18B和图19所示。将HCEC暴露于1％DMTMM或0.5％EDC和0.16％NHS 5分钟，未导致活力的任何显著差异。然而，暴露15分钟后，观察到暴露于EDC-NHS的培养物中比暴露于DMTMM中具有更多的死细胞。在与EDC-NHS***刚刚温育后的活的(绿色)和死的(红色)细胞显示了即使在非常低的浓度下(EDC+NHS-0.5％+0.16％)如所预期具有非常高的毒性，但当细胞与相当高浓度的DMTMM(1％DMTMM)一起温育15分钟时观察到很少至几乎没有细胞毒性。

实施例16：DMTMM的长期细胞毒性测定

测试了DMTMM对HCEC的长期毒性。将HCEC与4％DMTMM一起温育2和5分钟，并在培养物中保持长达7天。在不同时间点对活(绿色)和死亡(红色)细胞染色显示DMTMM没有引起毒性。更确切地说，细胞似乎完全从任何压力中恢复，并且在稍后的时间点如在组织培养塑料(TCP)上一样正常生长。从这些实验可以得出结论，DMTMM交联体系在所需浓度范围内对细胞没有长期毒性，应该能够使我们甚至包裹细胞并最终带来制造载有患者自身干细胞和基质细胞的角膜植入物。这在化学蛋白质交联领域是史无前例，其中尽管在细胞环境中存在非常相同的官能团，但交联***不会对细胞产生任何急性或长期毒性。

图20示出了实验结果，其中已经测试了4％DMTMM对HCEC的影响。

在另一个测试细胞毒性的实验中，然后在抽吸培养基后，将KSFM中浓度为1％和4％(w/v)的DMTMM交联剂加入细胞中。将细胞暴露于交联剂2和5分钟，然后用KSFM三次冲洗洗掉含交联剂的培养基。

使用含有钙黄绿素-AM和乙非啶同型二聚体-1(活/死活力/细胞毒性试剂盒，Invitrogen，Oregon，USA)的0.01M PBS在1至7天的不同时间点进行活死染色，以评估HCEC的存活力。使用共聚焦激光扫描显微镜(LSM800Carl Zeiss，Gottingen，Germany)，对每个盘的三个不同视野区拍摄活细胞(绿色荧光)和坏死细胞(红色荧光)的照片。对照培养物由仅暴露于培养基的细胞组成。

为了确定细胞是否长期受到不利影响，在DMTMM暴露后第7天将HCEC分开并接种到1型胶原蛋白包被板(BioCoat，Corning，USA)上，并在21天时检查细胞在气举(airlifting)时的分层能力。

如图19B所示的结果表明，在暴露至交联剂2分钟后，将DMTMM浓度增加至4％不会导致细胞死亡的任何显著变化。这是交联15％(w/w)水性CLP-PEG以形成水凝胶所需的时间量。在暴露5分钟后，这是所需暴露时间的两倍以上，观察到更多的死细胞，但大多数细胞仍然存活。因此，DMTMM对人角膜上皮细胞没有长期细胞毒性作用。

实施例17：离体穿孔和密封

从穆尔菲尔兹生物库(Moorfields Biobank)伦理委员会获得了标准化角膜穿孔中替代密封方法的破裂压力离体研究的伦理批准。人体角膜巩膜扣状体安装在人工前房(Barron Artificial AC；Katena，New Jersy，USA)且制作了标准化的角膜缺陷。使用400μm一次性散光角膜切开术刀片作为量规，在400μm处标记2mm皮肤活检穿孔器(Acu-Punch；Acuderm，Florida，USA)。2mm穿孔器用于集中于400μm的预标记深度的角膜的部分环钻测试。用小儿新月形刀片进行帽(cap)的层状剥离(Lamellar dissection)，留下约400μm的残余基质深度。在具有1mm皮肤活检穿孔器的中央基质床中产生随后的中央全厚度缺陷，以模拟临床实践中常见的全厚度角膜穿孔。

为了测试CLP-PEG/纤维蛋白原胶和纤维蛋白胶的破裂压力，在猪角巩膜纽扣上制作标准化的角膜缺损。4mm穿孔器用于集中于深度约为200μm的中央角膜的部分环钻测试。用小儿新月形刀片进行帽的层状剥离，留下残留的基质深度，然后用3mm穿孔器环钻至约200μm的深度。在具有1mm皮肤活检穿孔器的中央基质床中产生随后的中央全厚度缺陷，以模拟临床实践中常见的全厚度角膜穿孔。

在如上所述制备标准化角膜穿孔后，测试了用于密封角膜缺损的实验条件。尝试了五种密封方法。

第一种密封方法是使用氰基丙烯酸酯胶和3mm透明塑料贴片的当前标准处理外路修补(ab externo patching)。简而言之，通过穿刺术***气泡以帮助形成干燥的眼表面，并且在标准穿孔周围的角膜上皮清创术之后使用箭头手术海绵(arrow-tip surgicalsponges)来干燥任何残余液体。使用皮肤活检穿孔器从透明的聚乙烯手术单(UnomedicalSterile Surgical Drapes，Oklahoma City，USA)冲压3mm塑料贴片。在用氰基丙烯酸酯胶涂覆之后，将单个贴片从外部直接施加到测试缺陷上。使用相同的方法，使用纤维蛋白胶密封角膜缺陷。

第二种密封方法是单独使用100μm厚的化学交联的胶原-水凝胶内路贴片。评估在DSAEK手术中可以切割成所需形状、***并用气泡定位的胶原水凝胶片。22在此，用外科角膜刀制作一个3.2mm的3步角膜缘切口，用镊子通过该切口***3mm直径圆盘的测试水凝胶。将圆盘置于缺损下并使用气泡漂浮到位，如在内皮角膜移植术中那样。贴片以30号针头为中心。一旦达到令人满意的位置，就增加输注并测量破裂压力。

第三个条件是胶原-水凝胶内路贴片与CLP-PEG填料胶相结合。如在第二密封方法中给出的那样***基于水凝胶的内路贴片。将一滴纤维蛋白胶放入缺陷中以涂覆缺损的基部和壁。随后，施用CLP-PEG填料胶以完全填充缺陷，并且用纤维素眼科海绵(Weck-Cel；Beaver-Visitec，Massachusetts，USA)使前表面平滑以类似于角膜前表面。干燥后，增加输注并测量破裂压力。

第四个条件是使用CLP-PEG-纤维蛋白原胶与凝血酶组合。缺陷用250U/mL凝血酶包被。注入CLP-PEG/纤维蛋白原胶以完全填充缺陷。在使胶干燥后，增加输注并测量破裂压力。

图13显示了具有宏观穿孔的人角膜的示例和图解方案，示出了在简化的标准化离体人角膜模型中重现这种缺陷。标准化缺陷包括直径为1mm的中心全厚度缺陷，周围的部分厚度缺陷直径为2mm，深度为400μm。测试的三种修补模式如下：A)从外部施加到标准化缺陷的氰基丙烯酸酯胶贴。将胶贴施加到从手术单上切下的3mm塑料圆盘的内表面上并施加到角膜上。B)将100μm直径3mm的交联胶原贴片从内部施加到标准化缺陷上作为内路贴片。C)将100μm的3mm胶原内路贴片与CLP-PEG水凝胶的外部施用组合以密封标准化缺陷并替换丢失的角膜组织。

实施例18：***压力评估

为了评估在前面的例子中制造的密封件的***压力，通过动脉内血压监测器(Infinity 540；Draeger，Lubeck，Germany)将人工前房连接到氯化钠注射液，其使用血压袖带调节输注压力。在施加测试贴片后，增加输注压力直到密封件泄露，导致流体流出。然后记录破裂压力(mmHg)作为输注压力的连续痕量对比时间的峰值。使用单因素方差分析和随后的Tukey事后检验来比较三种条件下的破裂压力的差异。表4总结了三种不同修补方式记录的破裂压力。

表4各种测试材料的破裂压力(mmHg)

尽管氰基丙烯酸酯胶具有最高的破裂压力(p＜0.0001)，但是其中有用其他材料时没有见到的30％的失败率(没有实现密封)。

*100μm胶原水凝胶内路贴片；

§100μm水凝胶内路贴片加外部施用的CLP-PEG胶；

#没有达到密封的实例。这些结果不包括在平均值或标准偏差的计算中.；

SD＝标准偏差。

使用氰基丙烯酸酯胶的常规外路修补获得最高的破裂压力，平均(标准偏差)破裂压力为325.9±30.4mmHg，然后使用纤维蛋白胶进行外路修补。然而，所获得的表面是粗糙的，并且在13个实验穿孔的3个中，在使用氰基丙烯酸酯胶时发生泄漏，因为密封未能形成。

使用100μm厚的胶原水凝胶的内路修补在10个样品的10个中产生有效密封。然而，虽然实现了足够的密封，但平均***压力仅为46.3±3.7mmHg，并且观察到贴片的凸起。

使用CLP-PEG填料胶结合100μm内路贴片，凸起不太明显，因为CLP-PEG填料胶增强了水凝胶贴片，有助于防止其穿过角膜缺陷。用该技术观察到更高的平均破裂压力(86.6±5.4mmHg)。

尽管使用氰基丙烯酸酯胶获得了最佳结果，但它缺乏基于CLP的水凝胶的有效性。在基于CLP-PEG的水凝胶中，与其他基于CLP-PEG的水凝胶相比，CLP-PEG-纤维蛋白原胶的水凝胶给出了最好的结果。

图14描述了A)穿孔人角膜的实例。B)实验设置显示在人造前房装置内的体外穿孔角膜模型。C)填充含有CLP-PEG的纤维蛋白胶的穿孔角膜模型。其他体外角膜模型用D)采用氰基丙烯酸酯胶的常规外路修补(对照)，E)胶原水凝胶仅作为内路贴片，F)胶原水凝胶和CLP-PEG填充物的内部贴片。

实施例19：角膜植入物的可缝合性

通过放置12根间断的缝合线在离体的猪眼上测试水凝胶的可缝合性，并且发现植入物经受多次间断缝合而几乎没有断裂。对离体的猪眼进行体外缝合试验的结果如图8所示。

实施例20：水凝胶的FTIR光谱学以评估样品的长期完整性

测试了开发的CLP植入物的储存条件。将新制备或长期储存的CLP-PEG水凝胶进行FTIR光谱学分析以检查光谱的任何变化。为此目的，用液氮将水凝胶冷冻并冻干。使用通用ATR在Perkin Elmer IR(红外光谱)分光光度计上对冻干的干燥水凝胶进行FTIR光谱分析。对样品进行650-4000cm^-1的波扫描。结果总结在图15中。发现样品之间的光谱没有显著差异，表明在10天到14天的储存期间植入物的完整性。

实施例21：角膜厚度测量

通过深层前板层角膜移植术(DALK)将先前实施例中制备的水凝胶移植到新西兰白色雄性兔中以确定它们对角膜再生的能力。植入物强度足以耐受环钻、植入手术和缝合。术后4只兔中有3只没有观察到不良炎症反应。在手术后1个月，如荧光素染色所证明的那样，所有植入物和周围的兔角膜都是透明的，具有完全的上皮覆盖。所有动物中，愈合过程伴随着轻度角膜新血管形成。然而，在所有动物，新血管逐渐消退并且在植入后3个月不再存在。然而，所有植入物都保持透明并覆盖有上皮细胞。

在表5中示出了在手术之前和之后的不同时间点，所有动物的双眼的角膜厚度变化。在所有动物中，眼压保持在正常范围内。

表5在手术之前和手术之后不同时间点所有动物的两只眼睛的中央角膜厚度(μm，M±SD)

实施例22：猪的体内安全性评价

符合良好实验室原则(GLP)，NV/MC/CHEM(98)17，1997，并获得Stockholms Norra

的当地道德许可，包含9.7％的DMTMM交联的CLP(w/w)的CLP-PEG植入物移植到四只接受受控碱烧伤的

小型猪的角膜中。在动物中测试含有8.5％CLP的掺入MPC的CLP-PEG植入物。

在完全麻醉下切除猪自身中央角膜组织500μm厚、6.5mm的扣状体后，通过前板层角膜移植术将直径6.75mm和500μm厚的植入物植入每只猪的一个角膜中。使用覆盖的缝合线将植入物固定到位。在手术后施用抗菌和抗炎眼用溶液(

具有3mg/mL***和1mg/mL妥拉霉素的悬浮液，Alcon，瑞典)5周，此时移除缝合线。监测角膜的任何不良反应12个月。

图16显示了术后12个月的所有8只手术动物。眼睛中可见一些血管和浑浊。总体而言，浑浊和血管稍微更突出，甚至在CLP-PEG组内，而含MPC组中的浑浊在植入物内的***。对胶原含量的分析表明，CLP-PEG植入物的胶原1和V的总含量高于健康的未手术角膜，而CLP-PEG-MPC植入物的胶原总体显著减少。然而，CLP-MPC显示出相似的高分子量，即成熟的胶原原纤维作为健康的未手术对照。

实施例23：水凝胶的抗瘢痕形成性质

为了分析水凝胶的抗瘢痕形成性质，测试仅CLP和含有来自纤连蛋白的SEQ IDNO：8所示的RGDSPG基序的CLP。

测试了具有和不具有RGDSPG的CLP-PEG水凝胶上的皮肤真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞。对照细胞在组织培养塑料(TCP)上生长。成纤维细胞由TCP和CLP-RGDSPG-PEG支持。这些被抗平滑肌肌动蛋白(SMA)的抗体阳性染色，表明这些细胞是活化的成纤维细胞。图21描述了实验结果。

在另一个实验中，研究了在组织培养塑料(TCP)、猪I型胶原水凝胶(PC)、CLP-PEG和CLP-RGDSPG-PEG水凝胶上培养的真皮成纤维细胞的比较性质。

通过在没有任何处理的情况下铺设在TCP上来活化成纤维细胞。在接种到基质上(“预处理”)之前或在接种到基质上之后(“后处理”)，使用TGF-β(10ng/mL)处理一些成纤维细胞。类似地，猪I型胶原水凝胶(PC)、CLP-PEG和CLP-RGDSPG-PEG水凝胶也被处理和活化，如通过抗SMA抗体的阳性染色所示。

图22显示了原代真皮成纤维细胞在组织培养塑料(TCP)和猪胶原(PC)、CLP-PEG(CLP)和CLP-RGDSPG-PEG(CLP-RGD)的水凝胶上的体外培养。在接种到基质上(“预处理”)之前或在接种到基质上之后(“后处理”)，将细胞保持未处理或用TGF-β(10ng/ml)处理。红色染色表明是平滑肌肌动蛋白阳性的细胞。DAPI核的复染物显示为蓝色。结果显示CLP类似物能够潜在的用作预制或原位固化的再生支架或模板，以具有抗瘢痕形成效果。

实施例24：细胞外囊泡产生的诱导

研究小型猪新角膜以表征外来体，并且在植入CLP-PEG和RHCIII-MPC的切片上进行的免疫组织化学显示外来体的CD9标记和内体标记物Rab-7的差异染色。

植入RHCIII-MPC和CLP-PEG植入物的小型猪的TEM图像显示出特征性的基底表面形态，具有许多内陷和外泌体如基底表面下的囊泡。

与健康的未手术对照相比，植入CLP-PEG的角膜显示CD9染色增加但RHCIII-MPC没有。

植入CLP-PEG和RHCII-MPC的角膜均显示Rab7的染色增加。通过培养在CMP-PEG和RHCIII-MPC植入物上的人角膜上皮细胞，在体外研究中进行进一步检查。在CMP-PEG和RHCIII-MPC植入物中均观察到连接细胞的染色CD9的囊泡网络。

另一方面，与组织培养塑料相比，Rab7染色的囊泡仅保留在细胞内并且在两种植入物的细胞培养物中增加。

因此，可以得出结论，角膜中的无细胞CLP-PEG植入物促进再生。与RHCIII-MPC植入物相比，这些植入物中的外泌体释放增加。检查他们所载物质显示了所包括的这些与修复和再生相关的胶原和其他大分子。当接种角膜上皮细胞时，CLP-PEG植入物能够在细胞培养物中体外刺激外泌体(exosome)产生。因此，CLP-PEG刺激外泌体的产生，进而促进再生。

图23描述了实验结果。

图23(a)显示了在手术后12个月植入CLP-PEG的小型猪的角膜TEM。再生的新角膜上皮-基质界面区域显示出产生电子致密的细胞外囊泡。这些通过整体面SEM截面的3D重建可视化。图23(b)显示细胞外囊泡为黄色。图23(c)是对照RHC-III MPC和CLP-PEG的CD9阳性细胞外囊泡的3D重建。免疫组织化学标记的切片为在图23(d)中标记的切片。图23(e)显示了针对Rab7染色的EV。图23(f)显示了在不同底物上培养的角膜上皮细胞中的差异EV模式。

实施例25：细胞特异性和生长的增强

使用由结合RGDSPG和IKVAV肽基序的CLP-PEG制备的植入物。RGDSPG和IKVAV肽基序如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所示。

形态学以及各种细胞类型的比例取决于细胞粘附肽序列的存在以及CLP-PEG水凝胶的固体含量百分比。如结果所示，6％(w/w)CLP-PEG水凝胶表面上的小脑外植体分化成顶部具有神经元-星形胶质细胞环的小神经胶质细胞的汇合层，类似于视网膜和视神经的神经胶质管。在12％(w/w)CLP-PEG水凝胶上，从小脑外植体生长的细胞不能紧密粘附于水凝胶表面，而是在铺板后形成小球状体。

随后的星形胶质细胞和神经元的生长保留了球状结构。与单独的CLP相比，在12％(w/w)水凝胶中掺入RGDSPG和IKVAV序列增加了细胞粘附并刺激了较长神经突的生长，导致每个神经元覆盖的区域更大，特别是在含有CLP-RGDSPG的水凝胶中。

CLP-RGDSPG-PEG产生均匀分布的具有高神经突密度的神经元-神经胶质细胞培养物和变形虫形状的小神经胶质细胞，其物理缠结在神经元-星形胶质细胞垫内。然而，在CLP-IKVAV-PEG上，分化的神经元-星形胶质细胞网络被组织成离散的神经元束，小胶质细胞具有圆形或棒状形态。

与单独的CLP相比，与用细胞粘附肽标记的CLP上的神经细胞的差异生长相似，原代皮肤成纤维细胞在单独CLP凝胶上显示出受阻的生长，同时在RGDS存在下显示出增强的细胞附着和增殖。这些结果显示细胞粘附肽的关键作用，以优化模拟原始胶原蛋白的植入物的细胞结合、增殖和分化能力。使用用DMTMM交联的CLP-PEG作为固体植入物或作为掺入这些其他生物活性基序的填充剂将允许角膜(或皮肤)伤口的再生而无需移植。

图24显示在种植于6％和12％CLP-PEG以及已掺入RGDS和IKVAV肽的CLP-PEG上之后在体外第6天从大鼠小脑获得的原代神经元和神经胶质。神经元(黄色)用抗微管相关蛋白2免疫标记，星形胶质细胞(红色)用抗胶质纤维酸性蛋白免疫标记。小胶质细胞用同工凝集素GS-IB4染成绿色。用Hoechst33342将所有细胞核染成蓝色。还显示了由RGDS的存在激活的成纤维细胞，但单独的CLP即使明显支持神经和神经胶质，也不会支持这些瘢痕再生细胞。

序列表

<110> 海德拉巴眼科实验室有限公司(HYDERABAD EYE RESEARCH FOUNDATION)

<120> 基于胶原和胶原样肽的水凝胶、角膜植入物、填料胶及其用途

<130> C8IBCN190439

<140> PCT/IB2017/056342

<141> 2017-10-13

<150> US 62407650

<151> 2016-10-13

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13751

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 包含10个胶原样肽的重复序列的pPINKa-HC 载体 (pPink-aMF-COL 模拟物-His-P4H-HC)

<400> 1

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

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caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg gaattcgaaa cgatgagatt 960

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tgacccaggt gaccctggtg acccaggtgg tccaagaggt gacgctggtc ctaaaggtcc 1800

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gccctccact aattagtgta ctacccaatc ttgcctcttc gggtgtcttt tataaggaca 3060

gattcacaag ctcttgttgc ccaatacaca catacacaca gagataatag cagtcccgcg 3120

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tgaagctgac tactatcaca cagaattgtg gatggagcaa gcccttagac agttggatga 3720

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gcttcacgag agaggacagg agttcagaag accttgcaca ctttccgagt tggagtaggt 4740

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ttcagagtac agaagattaa gtgagaagtt cgtttgtgca agcttaatga gtcacaatct 5040

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taatatatat aacgtgaata ggaaattaag gaaattttgg atctaataat gtgctgtatg 5340

ccgacatcgg gcatcgtaga ttgtatagta tcgctgacac tataataagc cagccaaaac 5400

ccctaaacca gttgccctcc actaattagt gtactaccca atcttgcctc ttcgggtgtc 5460

ttttataagg acagattcac aagctcttgt tgcccaatac acacatacac acagagataa 5520

tagcagtcct cgaggaaacg atgagattcc catccatttt taccgcagtc ttgttcgccg 5580

catccagtgc tttggctgac gcccctgagg aggaggacca tgtcttggtc ttgagaaagt 5640

ctaactttgc cgaggcactt gctgcccata agtacttgct tgttgaattt tacgctccat 5700

ggtgtggtca ctgcaaggct ttggcccctg aatacgccaa agctgctggt aaattgaaag 5760

cagagggatc tgaaattaga cttgccaagg tcgatgcaac cgaagagtcc gacttggccc 5820

aacagtacgg tgttagagga tatccaacta ttaagttttt cagaaacgga gataccgcat 5880

ctcctaaaga gtatactgct ggaagagaag ccgatgacat cgttaattgg ttgaagaaaa 5940

gaactggtcc agccgcaact acattgcctg atggagctgc cgcagaatcc cttgtcgagt 6000

cttccgaagt tgctgtcatt ggtttcttta aggatgttga gtcagacagt gctaaacaat 6060

ttttgcaggc tgccgaagcc attgatgaca tcccatttgg tatcacttct aattccgatg 6120

ttttctcaaa gtaccaattg gataaagacg gagttgtcct ttttaagaaa ttcgatgagg 6180

gtagaaacaa ttttgaggga gaagtcacaa aggaaaactt gcttgacttc atcaagcata 6240

accaattgcc acttgttatc gagtttaccg aacagactgc tcctaagatt ttcggtggag 6300

aaattaaaac tcacatcttg ttgtttttgc ctaagtcagt tagtgattac gacggtaaat 6360

tgtctaactt caagacagca gctgagtcct tcaagggaaa aatcttgttt attttcatcg 6420

attccgacca taccgataac caaagaatct tggaattttt cggtcttaag aaagaagagt 6480

gtccagccgt tagattgatt actcttgaag aggaaatgac aaagtataaa cctgagtcag 6540

aggaattgac agctgagaga attaccgaat tttgccatag attcttggaa ggtaaaatta 6600

agccacactt gatgagtcaa gagcttccag aagattggga caagcagcct gttaaagtct 6660

tggttggtaa aaactttgag gatgttgctt tcgacgaaaa gaaaaatgtc ttcgttgaat 6720

tttacgcacc atggtgtggt cattgcaagc aattggctcc tatttgggat aagcttggag 6780

agacttataa agaccacgaa aacattgtca tcgctaaaat ggattcaact gcaaatgagg 6840

ttgaagctgt caaggttcac tcatttccaa cattgaaatt tttccctgca agtgctgata 6900

gaacagttat tgactataac ggagagagaa ccttggatgg ttttaagaag ttccttgaaa 6960

gtggtggaca ggatggtgct ggagatgacg atgacttgga agaccttgag gaagccgaag 7020

agcctgatat ggaagaagac gatgaccaaa aagccgttca cgacgagttg tagaccggtc 7080

ttgctagatt ctaatcaaga ggatgtcaga atgccatttg cctgagagat gcaggcttca 7140

tttttgatac ttttttattt gtaacctata tagtatagga ttttttttgt cattttgttt 7200

cttctcgtac gagcttgctc ctgatcagcc tatctcgcag ctgatgaata tcttgtggta 7260

ggggtttggg aaaatcattc gagtttgatg tttttcttgg tatttcccac tcctcttcag 7320

agtacagaag attaagtgag aagttcgttt gtgcaagctt agcggccgcc ttccaaactc 7380

tcatggattc tcaggtaata ggtattctag gaggaggcca gctaggccga atgattgttg 7440

aggccgctag caggctcaat atcaagaccg tgattcttga tgatggtttt tcacctgcta 7500

agcacattaa tgctgcgcaa gaccacatcg acggatcatt caaagatgag gaggctatcg 7560

ccaagttagc tgccaaatgt gatgttctca ctgtagagat tgagcatgtc aacacagatg 7620

ctctaaagag agttcaagac agaactggaa tcaagatata tcctttacca gagacaatcg 7680

aactaatcaa ggataagtac ttgcaaaagg aacatttgat caagcacaac atttcggtga 7740

caaagtctca gggtatagaa tctaatgaaa aggcgctgct tttgtttgga gaagagaatg 7800

gatttccata tctgttgaag tcccggacta tggcttatga tggaagaggc aattttgtag 7860

tggagtctaa agaggacatc agtaaggcat tagagttctt gaaagatcgt ccattgtatg 7920

ccgagaagtt tgctcctttt gttaaagaat tagcggtaat ggttgtgaga tcactggaag 7980

gcgaagtatt ctcctaccca accgtagaaa ctgtgcacaa ggacaatatc tgtcatattg 8040

tgtatgctcc ggccagagtt aatgacacca tccaaaagaa agctcaaata ttagctgaaa 8100

acactgtgaa gactttccca ggcgctggaa tcttcggagt tgagatgttc ctattgtctg 8160

atggagaact tcttgtaaat gagattgctc caaggcccca caattctggt cactatacaa 8220

tcgatgcatg tgtaacatct cagttcgaag cacatgtaag agccataact ggtctgccaa 8280

tgccactaga tttcaccaaa ctatctactt ccaacaccaa cgctattatg ctcaatgttt 8340

tgggtgctga aaaatctcac ggggaattag agttttgtag aagagcctta gaaacacccg 8400

gtgcttctgt atatctgtac ggaaagacca cccgattggc tcgtaagatg ggtcatatca 8460

acataatagg atcttccatg ttggaagcag aacaaaagtt agagtacatt ctagaagaat 8520

caacccactt accatccagt actgtatcag ctgacactaa accgttggtt ggagttatca 8580

tgggttcaga ctctgatcta cctgtgattt cgaaaggttg cgatatttta aaacagtttg 8640

gtgttccatt cgaagttact attgtctctg ctcatagaac accacagaga atgaccagat 8700

atgcctttga agccgctagt agaggtatca aggctatcat tgcaggtgct ggtggtgctg 8760

ctcatcttcc aggaatggtt gctgccatga ctccgttgcc agtcattggt gttcctgtca 8820

agggctctac gttggatggt gtagactcgc tacactcgat tgtccaaatg cctagaggtg 8880

ttcctgtggc tacggttgct atcaacaacg ccaccaatgc cgctctgttg gccatcagga 8940

ttttaggtac aattgaccac aaatggcaaa aggaaatgtc caagtatatg aatgcaatgg 9000

agaccgaagt gttggggaag gcatccaact tggaatctga agggtatgaa tcctatttga 9060

agaatcgtct ttgaatttag tattgttttt taatagatgt atatataata gtacacgtaa 9120

cttatctatt ccattcataa ttttatttta aaggttcggt agaaatttgt cctccaaaaa 9180

gttggttaga gcctggcagt tttgataggc attattatag attgggtaat atttaccctg 9240

cacctggagg aactttgcaa agagcctcat gtgcggcgcg ccaggccata atggccaaac 9300

ggtttctcaa ttactatata ctactaacca tttacctgta gcgtatttct tttccctctt 9360

cgcgaaagct caagggcatc ttcttgactc atgaaaaata tctggatttc ttctgacaga 9420

tcatcaccct tgagcccaac tctctagcct atgagtgtaa gtgatagtca tcttgcaaca 9480

gattattttg gaacgcaact aacaaagcag atacaccctt cagcagaatc ctttctggat 9540

attgtgaaga atgatcgcca aagtcacagt cctgagacag ttcctaatct ttaccccatt 9600

tacaagttca tccaatcaga cttcttaacg cctcatctgg cttatatcaa gcttaccaac 9660

agttcagaaa ctcccagtcc aagtttcttg cttgaaagtg cgaagaatgg tgacaccgtt 9720

gacaggtaca cctttatggg acattccccc agaaaaataa tcaagactgg gcctttagag 9780

ggtgctgaag ttgacccctt ggtgcttctg gaaaaagaac tgaagggcac cagacaagcg 9840

caacttcctg gtattcctcg tctaagtggt ggtgccatag gatacatctc gtacgattgt 9900

attaagtact ttgaaccaaa aactgaaaga aaactgaaag atgttttgca acttccggaa 9960

gcagctttga tgttgttcga cacgatcgtg gcttttgaca atgtttatca aagattccag 10020

gtaattggaa acgtttctct atccgttgat gactcggacg aagctattct tgagaaatat 10080

tataagacaa gagaagaagt ggaaaagatc agtaaagtgg tatttgacaa taaaactgtt 10140

ccctactatg aacagaaaga tattattcaa ggccaaacgt tcacctctaa tattggtcag 10200

gaagggtatg aaaaccatgt tcgcaagctg aaagaacata ttctgaaagg agacatcttc 10260

caagctgttc cctctcaaag ggtagccagg ccgacctcat tgcacccttt caacatctat 10320

cgtcatttga gaactgtcaa tccttctcca tacatgttct atattgacta tctagacttc 10380

caagttgttg gtgcttcacc tgaattacta gttaaatccg acaacaacaa caaaatcatc 10440

acacatccta ttgctggaac tcttcccaga ggtaaaacta tcgaagagga cgacaattat 10500

gctaagcaat tgaagtcgtc tttgaaagac agggccgagc acgtcatgct ggtagatttg 10560

gccagaaatg atattaaccg tgtgtgtgag cccaccagta ccacggttga tcgtttattg 10620

actgtggaga gattttctca tgtgatgcat cttgtgtcag aagtcagtgg aacattgaga 10680

ccaaacaaga ctcgcttcga tgctttcaga tccattttcc cagcaggaac cgtctccggt 10740

gctccgaagg taagagcaat gcaactcata ggagaattgg aaggagaaaa gagaggtgtt 10800

tatgcggggg ccgtaggaca ctggtcgtac gatggaaaat cgatggacac atgtattgcc 10860

ttaagaacaa tggtcgtcaa ggacggtgtc gcttaccttc aagccggagg tggaattgtc 10920

tacgattctg acccctatga cgagtacatc gaaaccatga acaaaatgag atccaacaat 10980

aacaccatct tggaggctga gaaaatctgg accgataggt tggccagaga cgagaatcaa 11040

agtgaatccg aagaaaacga tcaatgaacg gaggacgtaa gtaggaattt atggtttggc 11100

cataatggcc tagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 11160

cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 11220

aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 11280

acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 11340

ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 11400

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 11460

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 11520

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 11580

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 11640

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 11700

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 11760

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 11820

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 11880

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 11940

agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 12000

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 12060

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 12120

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 12180

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 12240

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 12300

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 12360

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 12420

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 12480

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 12540

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 12600

ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 12660

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 12720

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 12780

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 12840

agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 12900

cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 12960

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 13020

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 13080

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 13140

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 13200

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 13260

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 13320

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 13380

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 13440

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 13500

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 13560

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 13620

aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg 13680

caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 13740

ccagtgaatt g 13751

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物

<400> 2

gccgcatatg agatttccta gtattttcac c 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物

<400> 3

gccgtctaga ggtacctcaa tgatgatgat g 31

<210> 4

<211> 1554

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 胶原样肽的一个重复的核酸序列

<400> 4

catcctggtt tcttcacctc catcggtcag atgacagatt tgattcatac cgaaaaggac 60

cttgttactt ctttgaagga ttacatcaag gctgaagagg acaagttgga acaaatcaag 120

aaatgggcag agaaacttga tagattgacc tccactgcta caaaggaccc agaaggtttt 180

gttggacacc ctgtcaacgc tttcaaactt atgaagagat tgaacacaga gtggagtgaa 240

ttggagaatc ttgttttgaa ggatatgtca gacggtttta ttagtaacct taccatccaa 300

agaccagtct tgtcaaatga tgaagaccag gttggagctg ccaaagcttt gcttagactt 360

caagatactt acaacttgga taccgacact attagtaagg gtaatttgcc tggagtcaaa 420

cataagtctt ttcttacagc agaagattgt ttcgagttgg gtaaagttgc atacactgaa 480

gctgactact atcacacaga attgtggatg gagcaagccc ttagacagtt ggatgaagga 540

gagatttcta ccatcgataa agtttccgtc cttgactact tgtcatatgc cgtttaccaa 600

cagggagatt tggacaaggc attgcttttg actaagaaac ttttggaact tgatccagag 660

catcaaagag ctaacggtaa tttgaagtac ttcgaataca ttatggctaa agagaaggat 720

gttaacaaat ctgcctccga tgaccaatcc gaccagaaga ctacaccaaa gaaaaaggga 780

gttgctgtcg attatcttcc tgaaagacaa aaatacgaga tgttgtgtag aggtgaagga 840

attaagatga caccaagaag acagaaaaag ttgttttgca gatatcatga tggtaacaga 900

aacccaaaat tcatcttggc ccctgcaaag caagaagatg agtgggacaa acctagaatt 960

atcagattcc acgatattat ctccgacgct gaaattgaga tcgtcaaaga tcttgctaag 1020

ccaagattga gaagagccac tatttcaaat cctatcactg gtgacttgga aacagttcat 1080

tacagaatct caaagagtgc ttggttgtcc ggatacgaga acccagttgt ctcaagaatt 1140

aatatgagaa tccaggatct tactggtttg gacgtttcta ctgccgaaga gttgcaagtc 1200

gcaaactatg gagttggtgg acagtacgaa ccacactttg atttcgcaag aaaggatgaa 1260

cctgacgctt tcaaagagct tggtacagga aatagaattg ctacctggtt gttttacatg 1320

tctgacgtct ccgctggtgg agccaccgtt ttcccagaag tcggtgcctc agtttggcct 1380

aaaaagggta ctgctgtttt ctggtataat ttgttcgcaa gtggagaggg agattactct 1440

actagacacg cagcttgccc tgttttggtc ggtaacaaat gggtttctaa taagtggctt 1500

cacgagagag gacaggagtt cagaagacct tgcacacttt ccgagttgga gtag 1554

<210> 5

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 胶原模拟肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(38)

<223> X是羟基脯氨酸

<400> 5

Cys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Xaa

1 5 10 15

Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Asp Xaa Gly Asp Xaa Gly

20 25 30

Asp Xaa Gly Asp Xaa Gly

35

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MMP基序

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu Trp Ala Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 207

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码具有MMP基序的CLP的核酸

<400> 7

catatgtgtg gcccgaaagg tcccaagggt ccaaaagggc ccaagggtcc acccggaccg 60

ccgggacccc ctggaccccc cggtgatcca ggtgatcctg gagaccctgg tgaccccggt 120

ggaggcggtg ggcgtccgct tggattatgg gctgggggtg gaggacgcgg gggcggaggt 180

catcaccatc atcatcacta atctaga 207

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗炎肽基序

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Ser Arg Tyr Thr Val Glu Leu Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 162

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码具有抗炎基序的CLP的核酸

<400> 9

catatgtgtg gtcctaaggg tcctaaaggt cctaaaggtc ctaaaggtcc tccaggtcca 60

cctggtcctc ctggtcctcc aggtgaccct ggtgaccctg gtgacccagg tgaccctggt 120

gggggggggg ggaggtatac ggtggagttg gcgtaatcta ga 162

<210> 10

<211> 61

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码包含MMP和抗炎基序的CLP的融合多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(61)

<223> X是羟基脯氨酸

<400> 10

Cys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Xaa

1 5 10 15

Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Asp Xaa Gly Asp Xaa Gly

20 25 30

Asp Xaa Gly Asp Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu Trp

35 40 45

Ala Gly Gly Gly Gly Ser Arg Tyr Thr Val Glu Leu Ala

50 55 60

<210> 11

<211> 228

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码包含MMP和抗炎基序的CLP融合蛋白的核酸

<400> 11

catatgtgcg gcccaaaagg acctaagggg cccaaaggcc ctaaaggccc accagggccc 60

ccaggtccgc caggacctcc aggggaccca ggcgatcctg gggatcccgg cgacccagga 120

ggagggggcg gacgtccgct tggcttatgg gcgggtgggg gtggacgccg ctacactgtt 180

gagcttgctg ggggaggagg ccatcaccac caccaccact aaagcaga 228

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RGDSPG细胞粘附基序

<400> 12

Arg Gly Asp Ser Pro Gly

1 5

<210> 13

<211> 132

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码具有RGDSPG基序的CLP的核酸

<400> 13

tgtggtccca agggccctaa agggccgaaa ggacctaagg gtccccctgg gccgccggga 60

ccccctgggc caccgggtga cccaggcgat ccaggggatc caggcgatcc aggacgcggc 120

gattcgccgg ga 132

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IKVAV细胞粘附基序

<400> 14

Ile Lys Val Ala Val

1 5

<210> 15

<211> 129

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码具有IKVAV基序的CLP的核酸

<400> 15

tgtggaccta aaggtcccaa gggtccaaag gggcctaaag gcccccctgg tccgcccgga 60

ccgccaggac cacctggcga tcctggggac ccgggtgatc caggagaccc gggcattaaa 120

gtggcagtt 129

Claims

1.一种CLP-PEG水凝胶，其特征在于，所述CLP-PEG水凝胶包括CLP-PEG，所述CLP-PEG包括聚乙二醇-马来酰亚胺和与一个或更多个肽基序可操作地融合的SEQ ID NO:5所示的多肽，所述肽基序选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14组成的组中，所述CLP-PEG通过4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐作为交联剂交联成网络。

2.如权利要求1所述的CLP-PEG水凝胶，其特征在于，所述CLP-PEG包括SEQ ID NO:10所示的多肽。

3.如权利要求1所述的CLP-PEG水凝胶，其特征在于，所述聚乙二醇-马来酰亚胺具有8-臂和40kDa的分子量。

4.如权利要求1所述的CLP-PEG水凝胶，其特征在于，所述CLP-PEG水凝胶还包括角膜干细胞。

5.如权利要求1所述的CLP-PEG水凝胶，其特征在于，所述CLP-PEG水凝胶还包括抗炎生物聚合物的第二网络，所述抗炎生物聚合物是2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱。

6.一种角膜植入物，其特征在于，所述角膜植入物包含权利要求1所述的CLP-PEG水凝胶。

7.一种CLP-PEG填料胶，其特征在于，所述CLP-PEG填料胶包含权利要求1所述的CLP-PEG水凝胶，其中，4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐的质量体积浓度为4％。