ES2963331T3 - Biomateriales con función inmunomoduladora diseñados con FasL - Google Patents

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Hong Zhao
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Abstract

En el presente documento se describen biomateriales diseñados con FasL, así como métodos para fabricar y usar dichos biomateriales diseñados con FasL, tales como para inmunomodulación, tales como para inducir inmunosupresión y tolerancia inmune específica, tales como para prevenir o reducir los riesgos de rechazo de células o injertos de tejido y/o el tratamiento de trastornos autoinmunes como la diabetes tipo I. En realizaciones específicas, los biomateriales diseñados con FasL son microgeles biotinilados unidos a SA-FasL. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Biomateriales con función inmunomoduladora diseñados con FasL
Campo técnico
En el presente documento se describen biomateriales diseñados con FasL (ligando de la proteína Fas) y los biomateriales para su uso, tal como para inmunomodulación, tal como para tratar enfermedades autoinmunitarias, incluida la diabetes tipo 1, y prevenir o reducir los riesgos de rechazo de injerto.
Antecedentes
El trasplante de células (como de médula ósea y células madre), tejidos (como los islotes pancreáticos) y órganos (como riñón, corazón, hígado) exógenos, se ha convertido en una importante y eficaz alternativa terapéutica para pacientes con determinadas enfermedades. No obstante, el trasplante de injertos exógenos entre pacientes genéticamente diferentes (aloinjertos entre miembros de la misma especie o xenoinjertos entre miembros de diferente especie) está limitado por la capacidad de controlar el reconocimiento inmunológico y el rechazo del injerto por parte del receptor. Incluso para los autoinjertos (donde las células de injerto se obtienen del propio tejido del paciente, por ejemplo, por pluripotencia inducida), la eficacia del trasplante dependerá de controlar la respuesta autoinmunitaria a los injertos.
Por ejemplo, el trasplante de médula ósea (MO) se ha considerado que es un tratamiento extraordinariamente prometedor para los trastornos hematopoyéticos y autoinmunitarios y para determinados cánceres. Un obstáculo para el trasplante de médula ósea es la posibilidad de rechazo del tejido trasplantado, mediado por los linfocitos T y las células NK del hospedador. La enfermedad de injerto contra hospedador (EICH) es otra posible consecuencia adversa del trasplante de médula ósea. Los linfocitos T del donante en el tejido trasplantado pueden generar una respuesta inmunitaria contra los órganos vitales del hospedador, que a menudo conduce a la muerte de éste. Por lo tanto, las reacciones hospedador contra injerto y la EICH limitan el uso clínico del trasplante de médula ósea, que de otro modo podría utilizarse ampliamente para tratar diversas enfermedades e impedir el rechazo de injerto exógeno.
La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por la pérdida de masa de células p productoras de insulina y, por tanto, del control glucémico, debido a una respuesta inmunitaria coordinada contra antígenos específicos de células p que requiere linfocitos T CD4+. El restablecimiento de la masa de células p mediante el trasplante alógeno de islotes es actualmente la intervención clínica preferida para mejorar el control glucémico en pacientes con inestabilidad glucémica grave. Incluso con productos autólogos de células beta, el controlar la respuesta inmunitaria contra las células autólogas, seguirá siendo importante para la eficacia terapéutica. La longevidad de los injertos alógenos no está únicamente limitada a las respuestas inmunitarias del hospedador, sino también por el fracaso secundario del injerto debido a los efectos tóxicos de la inmunosupresión crónica necesaria para controlar el rechazo.
Los agentes farmacológicos inmunosupresores son la base de los regímenes para el control del rechazo de aloinjertos. Aunque estos fármacos son eficaces para reducir la gravedad de los episodios de rechazo, son inespecíficos y no logran crear un estado de tolerancia permanente específica del injerto. Por lo tanto, la exposición continua del receptor a estos agentes inmunosupresores se asocia a un riesgo significativamente mayor de infecciones oportunistas y neoplasias malignas. Adicionalmente, estos agentes inmunosupresores inespecíficos pueden inducir efectos secundarios graves e indeseables en el hospedador. Estas reacciones adversas a menudo superan los beneficios para los pacientes con enfermedades en las que el cuerpo identifica ciertas partes de sí mismo como "exógenas" y lanza un ataque inmunitario adaptativo que da como resultado la autoinmunidad, como se observa en la diabetes tipo 1, artritis, lupus y esclerosis múltiple.
La práctica clínica actual es administrar inmunosupresores que impiden la actividad de los linfocitos T. Estos inmunosupresores se administran durante un período prolongado en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y, a menudo, durante toda la vida del paciente que ha recibido injertos exógenos. La necesidad de utilizar inmunosupresores a largo plazo hace que el éxito del tratamiento dependa de un seguimiento médico frecuente y expone al paciente a graves efectos secundarios de los fármacos.
Headen, DM: "Microfluidics-based Microgel Synthesis for Immunoisolation and Immunomodulation in Pancreatic Islet Transplantation", (XP055542432, mayo de 2017), indica que se diseñaron microgeles de PEG-4MAL que podrían capturar y presentar la proteína quimérica SA-FasL (ligando (L) de la proteína Fas conjugado con estreptavidina (SA)) en su forma bioactiva, pero no desvela cómo se logró.
Por lo tanto, existe la necesidad de composiciones y métodos útiles para efectuar la inmunomodulación, tal como para impedir o reducir los riesgos de rechazo de injertos celulares o tisulares y/o para el tratamiento de la diabetes tipo I. También existe la necesidad de composiciones y métodos útiles para inducir la tolerancia inmunitaria.
Sumario de la invención
La invención trata de biomateriales diseñados con FasL como se define en la reivindicación 1, así como del biomaterial como se define en la reivindicación 10, para su uso en la inducción de la tolerancia inmunitaria, y un método para fabricar dichos biomateriales diseñados con FasL como se define en la reivindicación 21.
De acuerdo con la invención, se proporciona un biomaterial diseñado para presentar una proteína FasL, en donde se diseña un hidrogel para presentar proteínas FasL, y en donde el hidrogel comprende una proteína FasL quimérica que comprende un resto de FasL y un resto de estreptavidina o avidina conjugado al hidrogel a través de biotina. De acuerdo con algunas realizaciones, el hidrogel es un microgel de polietilenglicol (PEG) diseñado para mostrar un resto de biotina. De acuerdo con algunas realizaciones, se proporcionan hidrogeles de polietilenglicol (PEG) que presentan la proteína FasL. En realizaciones específicas, los hidrogeles pueden comprender restos de biotina conjugados con restos de SA-FasL.
De acuerdo con cualquier realización, el resto de FasL puede ser una proteína FasL resistente a metaloproteinasas de la matriz.
De acuerdo con cualquier realización, el biomaterial puede comprender un fármaco inmunosupresor, tal como rapamicina. Los hidrogeles diseñados con FasL pueden comprender además un fármaco inmunosupresor, tal como rapamicina. Los biomateriales o hidrogeles diseñados con FasL que además comprenden un fármaco inmunosupresor pueden proporcionar una liberación controlada del fármaco.
De acuerdo con cualquier realización, el biomaterial puede comprender una célula de injerto, tales como las CMSP (células mononucleares de sangre periférica), células de médula ósea, células madre hematopoyéticas, células madre, células madre mesenquimatosas, células dendríticas, células dendríticas pulsadas con autoantígenos, productos de células beta humanas y esplenocitos. La célula de injerto puede estar encapsulada en el biomaterial.
De acuerdo con la invención, se proporciona un biomaterial según la invención para su uso en la inducción de la tolerancia inmunitaria en un sujeto que lo necesite. De acuerdo con algunas realizaciones, la administración es por trasplante.
De acuerdo con cualquier realización, el sujeto puede ser un ser humano, un primate no humano, un cerdo, un perro, un gato, una vaca, una oveja, un caballo, un conejo, un ratón o una rata.
En algunas realizaciones, el sujeto necesita tolerancia inmunitaria a una célula de injerto, tales como las CMSP, células de médula ósea, células madre hematopoyéticas, células madre, células madre mesenquimatosas, células dendríticas, células dendríticas pulsadas con autoantígenos, productos de células beta humanas y esplenocitos. El biomaterial puede ser para su uso impidiendo o reduciendo los riesgos de rechazo de injertos celulares o tisulares y/o para el tratamiento de la diabetes tipo 1.
De acuerdo con cualquier realización, el biomaterial es para uso en un sujeto, cuando el sujeto necesita tolerancia inmunitaria en una célula de injerto, tales como las CMSP, células de médula ósea, células madre hematopoyéticas, células madre, células madre mesenquimatosas, células dendríticas, células dendríticas pulsadas con autoantígenos, productos de células beta humanas y esplenocitos. En algunas realizaciones, el biomaterial comprende la célula de injerto. En algunas realizaciones, la célula de injerto está encapsulada en el biomaterial.
En algunas realizaciones, el sujeto necesita tratamiento para la diabetes tipo 1, y el biomaterial puede ser para su uso en la administración al sujeto de células de los islotes pancreáticos. En algunas realizaciones, el sujeto necesita tratamiento o prevención de rechazo de aloinjerto, y el biomaterial puede ser para su uso en la administración al sujeto de células de un donante de aloinjerto. En algunas realizaciones, el sujeto necesita tratamiento o prevención de rechazo de xenoinjerto, y el biomaterial puede ser para su uso en la administración al sujeto de células de un donante de xenoinjerto. En algunas realizaciones, el donante del xenoinjerto es un ser humano, un primate no humano, un cerdo, un perro, un gato, una vaca, una oveja, un caballo, un conejo, un ratón o una rata. En algunas realizaciones, el sujeto necesita tratamiento o prevención de rechazo de autoinjerto, y opcionalmente al sujeto se le administran células de injerto autólogas. En algunas realizaciones, las células de injerto autólogas pueden obtenerse mediante pluripotencia inducida. En algunas realizaciones, el sujeto necesita tratamiento o prevención de autoinmunidad, y opcionalmente al sujeto se le administra un autoantígeno presentado en una célula seleccionada de (i) una célula que expresa el autoantígeno (ii) una célula que lleva el autoantígeno y (iii) una célula dendrítica pulsada con el autoantígeno.
De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona un método para fabricar biomateriales de acuerdo con la invención como se define en la reivindicación 21.
Breve descripción de los dibujos
LaFIG.1 muestra una representación gráfica de la producción de microgeles como se describe en el presente documento, que proporcionan una presentación controlada de proteínas inmunomoduladoras. LaFIG. 1Amuestra gráficamente cómo se utilizaron microfluidos de enfoque de flujo para generar microgeles biotinilados a partir de macrómeros de PEG-4MAL funcionalizados con biotina. Se inmovilizó SA-FasL en los microgeles biotinilados, y los microgeles de SA-FasL inmunomoduladores resultantes se cotrasplantaron con islotes debajo de la cápsula renal de ratones diabéticos, induciendo la aceptación del injerto. LaFIG. 1Bmuestra que los microgeles con biotina anclada (panel superior izquierdo, gris) podrían capturar estreptavidina (panel inferior izquierdo, gris claro), y que los microgeles sin biotina no capturaron estreptavidina (paneles de la derecha), (barra de escala de 200 pm). LaFIG. 1Cmuestra microgeles biotinilados que capturan y presentan estreptavidina (SA) de manera dependiente de la dosis hasta alcanzar la saturación a 150 pg/ml. LaFIG. 1Dmuestra que SA-FasL presentado en microgeles mantiene la bioactividad e induce apoptosis dependiente de la dosis en células sensibles a FasL.
LaFIG. 2muestra imágenes que representan que los microgeles diseñados con FasL prolongan la retención de SA-FasLin vivo.SA-FasL se marcó con un colorante del IR cercano y se implantó debajo de la cápsula renal de ratones y se tomaron imágenesin vivo.LaFIG. 2Amuestra imágenes representativas de la localización de SA-FasL en el lugar del injerto cuando se presenta en microgeles, a diferencia de la señal difusa medida en animales que recibieron SA-FasL libre. Los gráficos cromáticos son congruentes entre los animales del mismo grupo de tratamiento. No se muestran imágenes de los días 18 y 21 porque la señal era insignificante. LaFIG. 2Bmuestra un gráfico que representa un ajuste de curva de la cuantificación de fluorescencia y degradación exponencialin vivo,que demuestra que los microgeles presentadores de SA-FasL prolongan la retención de proteínas en comparación con SA-FasL libre(p<0,0001;n=8).
LaFIG. 3muestra la supervivencia de injertos alógenos de islotes cotrasplantados con microgeles que presentan SA-FasL. LaFIG. 3Amuestra un gráfico que representa la supervivencia del injerto de islotes. Se diseñaron microgeles biotinilados con SA-FasL (1 pg de proteína/1000 microgeles) y se trasplantaron conjuntamente con islotes BALB/c no modificados (500/trasplante) debajo de la cápsula renal de receptores C57BL/6 químicamente diabéticos. Se utilizó rapamicina a razón de 0,2 mg/kg de inyección i.p. diaria durante 15 dosis a partir del día del trasplante en los grupos indicados. Se controlaron los niveles de glucemia de los animales y se consideró que dos lecturas diarias consecutivas de > 250 mg/dl correspondían a animales diabéticos (rechazo) (p < 0,0001, **p < 0,01, ***p < 0,001). LaFIG. 3Bmuestra inmunotinción de un injerto funcional prolongado (> 200 días) y de un injerto rechazado de receptores que recibieron microgeles presentadores de SA-FasL. Sólo los injertos funcionales (panel superior) mostraron estructuras positivas a insulina (zona en gris claro) y a ADN (gris oscuro). Los injertos rechazados (panel inferior) no mostraron tinción con insulina. Las puntas de flecha blancas indican microgeles. El tejido se tiñó de tinción de contraste para detectar ADN (gris oscuro), (barra de escala de 100 pm). LaFIG. 3Cmuestra un gráfico que representa que los ratones con injertos de islotes trasplantados, cotrasplantados con microgel de SA-FasL y rapamicina, muestran la misma respuesta a la glucosa que los ratones con islotes sin tratamiento previo el día 200 después del trasplante.
LaFIG. 4muestra gráficos que representan el control inmunitario y el papel de linfocitos Treg CD4+CD25+FoxP3+ en la aceptación del injerto de islotes. LaFIG. 4Amuestra gráficos que representan una respuesta sistémica de supervivientes de injerto prolongado a antígenos donantes. Los esplenocitos de los grupos indicados se marcaron con éster de succinimidil-carboxifluoresceína (CFSE, siglas del inglés) y se usaron como respondedores a estimuladores irradiados de donantes BALB/c y de terceros C3H en un ensayoex vivode reacción de linfocitos mixtos. La dilución del colorante CFSE en linfocitos T CD4+ y CD8+ se evaluó utilizando anticuerpos contra moléculas CD4 y CD8 en citometría de flujo y se representó gráficamente como porcentaje de división de cada población celular. LaFIG. 4Bmuestra un análisis de evolución temporal de tipos de células inmunitarias. Células individuales preparadas a partir del bazo, los riñones y los ganglios linfáticos que drenan los riñones de los grupos indicados los días 3 y 7 después del trasplante de los islotes, se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia contra moléculas de la superficie celular que definen poblaciones de linfocitos Tef CD4+ (CD4+CD44hiCD62L'°), Tef CD8+ (CD8+CD44hiCD62L'°) y Treg (CD4+CD25+FoxP3+) y se analizaron mediante citometría de flujo. Las proporciones de linfocitos Treg con respecto a linfocitos Tef CD4+ y Tef CD8+, se representan gráficamente (media ± EEM,ap<0,05, aap<0,005).LaFIG. 4Cmuestra gráficos que muestran que el empobrecimiento de los linfocitos Treg da como resultado un rechazo de corta duración de los injertos de islotes establecidos. Ratones (n=5) CS7BL/6.FoxP3EGFP/DTR se trasplantaron con injertos de islotes BALB/c y microgeles que presentaban SA-FasL bajo una protección transitoria de tratamiento con rapamicina (administrada por vía i.p. diariamente a 0,2 mg/kg durante 15 dosis). Después, estos ratones recibieron inyección i.p. de toxina diftérica (DT,diphtheria toxin)50 pg/kg el día 50 después del trasplante (flecha), para el empobrecimiento de linfocitos Treg.
LaFIG. 5muestra un gráfico que muestra que para la aceptación del injerto de islotes se requieren linfocitos Treg. El empobrecimiento de linfocitos Treg da como resultado un rechazo de corta duración de los injertos de islotes establecidos. Ratones CS7BL/6.FoxP3EGFP/DTR se trasplantaron con injertos de islotes BALB/c y microgeles presentadores de SA-FasL bajo una protección transitoria de tratamiento rapamicina (administrada por vía i.p. diariamente a 0,2 mg/kg durante 15 dosis). Para el empobrecimiento de linfocitos Treg, una cohorte de ratones recibió inyección i. p. de toxina diftérica 50 pg/kg el día 50 después del trasplante (flecha), mientras que otro grupo no se trató.
LaFIG.6muestra la aceptación inmunitaria de injertos alógenos de islotes cotrasplantados con microgeles de SA-FasL en el panículo adiposo epididimario. LaFIG. 6Amuestra un gráfico que representa la supervivencia del injerto de islotes. Se diseñaron microgeles biotinilados con SA-FasL (1 |jg de proteína/1000 microgeles) y se cotrasplantaron con islotes BALB/c no modificados (600/panículo adiposo, 1200 total/receptor) en el panículo adiposo epididimario de receptores C57BL/6 químicamente diabéticos. Se utilizó rapamicina a razón de 0,2 mg/kg de inyección i.p. diaria durante 15 dosis a partir del día del trasplante. Se controlaron los niveles de glucemia de los animales y se consideró que dos lecturas diarias consecutivas de > 250 mg/dl correspondían a animales diabéticos (rechazo) (p<0,0008).LaFIG. 6Bmuestra imágenes de inmunotinción de un injerto funcional prolongado (> 60 días) de ratones que recibieron microgeles de SA-FasL rapamicina que muestran estructuras positivas a glucagón e insulina. El ADN teñido con DAPI (diamidino-2-fenilindol) marca las células tanto positivas como negativas al glucagón o a la insulina. (barra de escala de 50 jm ). LaFIG. 6Cmuestra un gráfico en el que no se aprecian diferencias entre el microgel con SA-FasL y los grupos de control en los niveles séricos de enzimas hepáticas (la línea discontinua indica niveles superiores a los normales de enzimas), y los paneles situados bajo los gráficos muestran imágenes de secciones histológicas que revelan que no se aprecian diferencias en los niveles de enzimas hepáticas entre los grupos de microgel SA-FasL y de control.
LaFIG. 7muestra un gráfico que representa que SA-FasL está anclada a microgeles biotinilados de manera dependiente de la dosis. SA-FasL se marcó con éster NHS conjugado con AlexaFluor488 (Thermo Fisher) y el colorante libre se eliminó tres veces mediante desalinización en una columna Zeba (MWCO de 7k, Thermo Fisher). Los microgeles biotinilados (104) se suspendieron en 500 j l de solución SA-FasL o solo SA a las concentraciones indicadas durante 1 h. Después los microgeles se lavaron mediante centrifugación 10 veces en seroalbúmina bovina al 1 % en PBS para eliminar la proteína no unida. Los microgeles funcionalizados se colocaron en una placa de 96 pocillos y se leyeron en un lector de placas Biotek HT340, y la señal de fondo (pocillo vacío) se restó de todos los valores (n = 2 (SA) o 3 (SA-FasL), media ± EEM). Los valores de fluorescencia se convirtieron a concentraciones absolutas utilizando una curva patrón.
LaFIG. 8muestra un gráfico que representa que el anclaje directo de SA-FasL al macrómero de PEG-4MAL reduce la bioactividad. Durante 1 hora, se hicieron reaccionar varias dosis de SA-FasL con 10 j l de macrómero de PEG-4MAL al 10 % en solución. Durante toda la noche se incubó SA-FasL soluble sin tratar o SA-FasL PEGilada con células A20 y el número de células apoptóticas se determinó mediante citometría de flujo después de teñir con anexina V-ApC y yoduro de propidio (n = 2, media ± EEM).
LaFIG. 9muestra un gráfico que representa la tolerancia sostenida a la glucosa en ratones C57BL/6 químicamente diabéticos trasplantados con microgeles que presentan SA-FasL (1 jg de proteína/1000 microgeles); mientras que los injertos de islotes BALB/c sin tratamiento previo (500) solo muestran tolerancia a la glucosa bajo una pequeña protección de tratamiento con rapamicina (administrada por vía i.p. diariamente a 0,2 mg/kg durante 15 dosis). Los controles incluyeron ratones sometidos al mismo régimen, excepto que recibieron microgeles sin SA-FasL.
LaFIG. 10muestra que los microgeles SA-FasL no afectan a la salud o función de los islotes. Los islotes de rata se cultivaron con microgeles SA-FasL (proporción islote:microgel de 1:2) durante 24 horas. LaFIG. 10Amuestra un gráfico que representa la actividad metabólica en islotes libres o islotes cotrasplantados con microgeles SA-FasL. LaFIG. 10Bmuestra un gráfico que representa que no hay diferencias en la secreción de insulina estimulada por glucosa entre islotes libres o islotes cotrasplantados con microgeles SA-FasL. LaFIG. 10Cmuestra una representación gráfica que revela que los islotes cotrasplantados con microgeles SA-FasL (SA-FasL-M) presentan una reducción en la secreción de citocinas proinflamatorias MIP-1 e IL6, pero no de MCP-1 en comparación con los islotes libres(*p<0,05, aap < 0,01).LaFIG. 10Dmuestra una imagen de tinción de células muertas y vivas, que revela que no hay diferencias en la proporción de células vivas y muertas entre islotes libres o islotes cotrasplantados con microgeles SA-FasL. LaFIG. 10Emuestra imágenes de inmunotinción de insulina y glucagón y cotinción de ADN con DAPI, que revela que no hay diferencias entre los islotes libres o los islotes cotrasplantados con microgeles SA-FasL con respecto a la expresión de insulina y glucagón. (barra de escala de 50 jm).
LaFIG. 11muestra imágenes de una sección de trasplantes teñida con hematoxilina y eosina en la cápsula renal 21 días después del trasplante para confirmar que sigue habiendo microgeles FasL en el lugar del injerto. Las puntas de flecha blancas indican la posición de los microgeles.
LaFIG. 12muestra un gráfico que representa que la nefrectomía retorna a los sujetos trasplantados con islotes y microgeles de SA-FasL rapamicina al estado hiperglucémico. Los riñones se extirparon el día 200 después del trasplante (flecha).
LaFIG. 13muestra un gráfico que representa la supervivencia del injerto de islotes tras el trasplante de microgeles SA-FasL cotrasplantados con islotes. Los microgeles biotinilados se diseñaron con SA-FasL (1 jg de proteína/1000 microgeles, a menos que se indique lo contrario) y se cotrasplantaron con islotes BALB/c no modificados o diseñados con SA-FasL (500/trasplante) debajo de la cápsula renal de receptores C57BL/6 químicamente diabéticos. Se utilizó rapamicina a razón de 0,2 mg/kg de inyección i.p. diaria durante 15 dosis a partir del día del trasplante en los grupos indicados. Se controlaron los niveles de glucemia de los animales y se consideró que dos lecturas diarias consecutivas de > 250 mg/dl correspondían a animales diabéticos (rechazo) (Dp <0,05, aap<0,01).
LaFIG. 14muestra gráficos de citometría de flujo que representan la proliferación de células inmunitarias según un ensayo con CFSE. Los esplenocitos recogidos de un grupo de receptores de trasplante seleccionado, se marcaron con CFSE y se usaron como respondedores a esplenocitos irradiados (2000 cGy) procedentes de ratones C3H donantes o de terceros en un ensayoin vitrode proliferación estándar. Después de 4 días en cultivo, las células se tiñeron con 7AAD y Ab (anticuerpos) conjugados con fluorescencia contra CD4 y CD8, y se analizaron para determinar la dilución de CFSE seleccionando células vivas usando BD LSR II. Los datos se analizaron utilizando el programa informático Diva.
LaFIG. 15muestra gráficos de citometría de flujo que crean un perfil inmunitario del bazo, los riñones y los ganglios linfáticos que drenan los riñones de ratones que rechazan el injerto y con injerto prolongado (> 200 días). Mediante dispersión mecánica suave, se prepararon células individuales procedentes del bazo y de los ganglios linfáticos y mediante digestión con colagenasa se prepararon las procedentes del riñón que albergaba islotes. Las células se tiñeron usando anticuerpos contra marcadores de superficie celular o FoxP3 intracelular. Los datos se recopilaron utilizando BD LSR II y se analizaron utilizando el programa informático Diva.
LaFIG. 16muestra un análisis de citometría de flujo de linfocitos Tef y Treg en varios tejidos de receptores de injerto de islotes al principio del postrasplante. Células individuales preparadas a partir del bazo, los riñones y los ganglios linfáticos que drenan los riñones de los grupos indicados los días 3 y 7 después del trasplante de los islotes, se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia contra moléculas de la superficie celular de linfocitos Tef CD4+ (CD4+CD44hiCD62L'°), Tef CD8+ (CD8+CD44hiCD62L'°) y Treg (CD4+CD25+FoxP3+) y se analizaron mediante citometría de flujo. Se muestran números absolutos de células en los tejidos indicados (media ± EEM,ap<0,05, aap<0,01, aaap<0,005).
LaFIG. 17muestra gráficos que representan que la administración de DT (toxina diftérica) a ratones FoxP3/DTR produce un empobrecimiento de linfocitos Treg. A los ratones se les inyectó por vía i.p. toxina diftérica (50 pg/kg de peso corporal). LaFIG. 17Amuestra un gráfico que representa que el empobrecimiento de los linfocitos Treg es transitorio según lo determinado por citometría de flujo. LaFIG. 17Bmuestra un gráfico que representa los niveles de glucemia después de la administración de la DT a ratones FoxP3/DTR.
LaFIG. 18muestra un gráfico que representa los niveles de glucemia para los trasplantes de panículo adiposo epididimario. Las lecturas se tomaron en ratones C57BL/6 químicamente diabéticos trasplantados con microgeles que presentaban SA-FasL (1 pg de proteína/1000 microgeles) e injertos de islotes (500) BALB/c sin tratamiento previo bajo una pequeña protección de tratamiento con rapamicina (administrada por vía i.p. diariamente a 0,2 mg/kg) durante 15 dosis).
Descripción detallada
A continuación se exponen detalles particulares de diversas realizaciones de la invención para ilustrarla. En la siguiente exposición, se describen realizaciones específicas de los diferentes aspectos de la invención. Debe entenderse que cualquier realización específica de un aspecto puede usarse junto con cualquier realización específica de otro aspecto, aunque no se establezcan expresamente todas las permutaciones y combinaciones posibles de realizaciones específicas.
Los biomateriales diseñados con FasL, como se define en la reivindicación 1, son útiles, por ejemplo, para inducir tolerancia inmunitaria o inmunosupresión, tal como puede desearse en el contexto del tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o del tratamiento o prevención del rechazo del injerto.
Después del reconocimiento y la activación de antígeno, los linfocitos T efectores regulan positivamente el receptor de Fas en su superficie y se vuelven sensibles a la apoptosis mediada por FasL (ligando de Fas). Es importante destacar que la apoptosis mediada por FasL es fundamental para la inducción de la autotolerancia y el mantenimiento, ya que la deficiencia de Fas o FasL se asocia a una autoinmunidad masiva tanto en seres humanos como en roedores. Esto sugiere que no existen mecanismos compensatorios para esta ruta, enfatizando aún más su importancia como una diana para la inmunomodulación.
Los biomateriales diseñados con FasL, como se define en la reivindicación 1, proporcionan una carga, presentación y retención controladas de la proteína FasL en sitios dianain vivo,y son eficaces para la inmunomodulación. Los biomateriales diseñados con FasL pueden coadministrarse con un injerto (p. ej., con células de injerto o tejido de injerto) e inducir tolerancia inmunitaria al injerto. Los biomateriales de la invención pueden lograr inmunosupresión prolongada y específica en el lugar del injerto, impidiendo la toxicidad asociada a inmunosupresores farmacológicos sistémicos inespecíficos. Esta es una ventaja exclusiva sobre la terapia génica, porque la expresión continua e incontrolada de FasL, que posee funciones pleiotrópicas y diferentes modos de expresión que pueden regular diferencialmente los tejidos diana (unidos a membrana o solubles), puede tener consecuencias no deseadas. De hecho, la expresión ectópica de FasL utilizando terapia génica para la inmunomodulación en entornos de trasplante ha dado resultados mixtos y opuestos, y algunos estudios muestran un impacto perjudicial de la expresión de FasL sobre la supervivencia del injerto. La presentación localizada y sostenida de FasL, como se describe en el presente documento, supera las complicaciones asociadas a la expresión ectópica de FasL de tipo silvestre en tejidos diana mediante terapia génica. Este concepto de inmunomodulación localizada también limita las posibles toxicidades asociadas a anticuerpos agonistas contra Fas para la inmunomodulación.
Los biomateriales de la invención diseñados con FasL proporcionan la flexibilidad de un producto disponible en el comercio para aplicaciones clínicas más amplias, ya que estos materiales inmunomoduladores pueden prepararse en el momento del trasplante y simplemente mezclarse conjuntamente con células de injerto (tales como islotes) para su suministro sin la necesidad de tener que encapsular las células de injerto o manipularlas para presentarlas a las proteínas.
Los linfocitos T efectores CD8+ y CD4+, en particular, los linfocitos T CD4+, desempeñan un papel fundamental en el inicio y la perpetuación de diversas enfermedades autoinmunitarias, incluyendo la diabetes tipo 1, artritis reumatoide, lupus, esclerosis múltiple y en el rechazo de injertos exógenos, incluido el rechazo de injertos alógenos y xenógenos. Por lo tanto, los linfocitos T efectores, representan una diana importante para la modulación inmunitaria para prevenir y tratar estas enfermedades. En condiciones fisiológicas normales, los linfocitos T efectores (Tef) se mantienen a raya gracias a otra clase de linfocitos T, denominados linfocitos T reguladores (Treg). Los linfocitos Treg, similar a los linfocitos Tef, siguen las señales inflamatorias y se infiltran en injertos rechazados. Las enormes pruebas científicas demuestran que la alteración del equilibrio fisiológico entre los linfocitos T efectores y los linfocitos T reguladores a favor de los linfocitos T efectores, es una causa subyacente de muchas enfermedades autoinmunitarias y del rechazo de injertos exógenos. Las estrategias que se dirigen tanto a los linfocitos T efectores como a los linfocitos T reguladores tienen un posible significado terapéuti
balanza a favor de los linfocitos T reguladores en caso de rechazo de injerto.
Definiciones
A menos que se definan de otro modo, todos los términos científicos y técnicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto con conocimientos la materia a la que pertenece la materia objeto que se desvela.
Para los fines de la presente solicitud, los siguientes términos tienen estas definiciones:
Como se utiliza en el presente documento "un", "uno" o "una", significa uno(a) o más, a menos que se indique específicamente que se refiere a solo uno(a).
Como se utiliza en el presente documento, el término "administrar" incluye administrar directamente a otro, autoadministrarse y prescribir o dirigir la administración de un agente como se desvela en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, el término "administrar" abarca todos los medios adecuados para proporcionar una sustancia a un paciente. Las vías habituales incluyen la oral, sublingual, transmucosa, transdérmica, rectal, vaginal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intratecal, a través de catéter, a través de implante, etc.
"Paciente" o "sujeto", como se utiliza en el presente documento, incluye cualquier mamífero. En algunas realizaciones, el paciente es un ser humano.
Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" significan la dosis o concentración plasmática, respectivamente, en un sujeto, que proporciona el efecto farmacológico específico para el que se administra el agente activo en un sujeto que necesita dicho tratamiento. Se subraya que una cantidad eficaz de un agente activo no siempre será eficaz para tratar las afecciones/enfermedades descritas en el presente documento, aunque los expertos en la materia consideren que dicha dosificación sea una cantidad terapéuticamente eficaz.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a uno o más agentes activos formulados con un transportador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento la expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuados para su usoin vivosin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
Biomateriales diseñados con FasL
Los biomateriales diseñados con FasL de la invención son biomateriales diseñados para presentar una proteína FasL. Como se utiliza en el presente documento, "FasL" se refiere al ligando (L) Fas. Como se utiliza en el presente documento, "Resto de FasL" significa al menos el resto de FasL que induce apoptosis. En algunas realizaciones, el resto de FasL comprende o consiste en el dominio extracelular de FasL. En algunas realizaciones, el resto de FasL comprende o consiste en una proteína FasL resistente a metaloproteinasas de la matriz (MMP, siglas del inglés). Como se utiliza en el presente documento, la proteína FasL resistente a metaloproteinasas de la matriz (MMP) es una forma de FasL en la que el dominio extracelular de FasL carece de lugares sensibles a MMP. Véase Yolcuet al.,Immunity 17: 795-808 (2002).
Los biomateriales están diseñados para presentar a FasL mediante conjugación a través de biotina con un hidrogel como se define en la reivindicación 1, y pueden utilizarse tecnologías de liberación controlada.
La proteína FasL se presenta en el biomaterial mediante la unión de biotina/avidina o biotina/estreptavidina (SA). De acuerdo con la invención, un hidrogel se biotinila y se une a un conjugado de FasL-estreptavidina (o a una proteína quimérica que comprende una proteína FasL y un resto de estreptavidina o avidina) a través de la unión de estreptavidina-biotina. El ligando de Fas conjugado con SA (SA-FasL) anclado a hidrogeles biotinilados, conserva una fuerte actividad apoptótica. La cantidad de SA-FasL bioactivo suministrada a un sujeto puede controlarse fácilmente utilizando los biomateriales de FasL descritos en el presente documento.
Anteriormente se informó acerca de la construcción de una forma quimérica de FasL con estreptavidina (SA), SA-FasL, en la que el dominio extracelular de FasL, que carece de lugares sensibles a MMP, se clonó a SA en el extremo C, que es útil como agente inmunomodulador eficaz. Véase Yolcuet al.,Immunity17, 795-808 (2002). Esta proteína existe como tetrámeros y oligómeros con una sólida actividad apoptótica en las células que expresan Fas. Es importante destacar, que los islotes pancreáticos, modificados con biotina adherida a la superficie celular, seguido de diseño con SA-FasL, adquirieron un estado inmunitario privilegiado y sobrevivieron indefinidamente en ausencia de inmunosupresión crónica en un modelo murino de trasplante alógeno. Véase Yolcuet al.,J Immunol187, 5901-5909 (2011).
La interacción entre la biotina y la avidina o la estreptavidina ("SA") ofrece varias ventajas en el presente contexto. Por ejemplo, la biotina tiene una afinidad extremadamente alta tanto por la SA (1013 M'1) como por la avidina (1015 M'1). Adicionalmente, tanto la SA como la avidina son polipéptidos tetraméricos que unen, cada uno de ellos, cuatro moléculas de biotina. Por lo tanto, los conjugados que comprenden SA o avidina tienen tendencia a formar tetrámeros y estructuras superiores, y pueden formar complejos con múltiples restos que contienen biotina.
Como se utiliza en el presente documento, "biotina" incluye restos que contienen biotina que son capaces de unirse a superficies, tales como superficies celulares, tales como NHS-biotina y EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce). En el comercio se encuentran disponibles la biotina y las formas de biotina reactivas a las proteínas.
También pueden utilizarse fragmentos de SA o de avidina que conserven actividad de unión sustancial por la biotina, tal como una afinidad de unión de al menos un 50 % o más de la SA o avidina nativas, respectivamente. Dichos fragmentos incluyen "estreptavidina de núcleo" ("CSA,core streptavidin"),una versión truncada del polipéptido de estreptavidina de longitud completa que puede incluir los residuos de estreptavidina 13-138, 14-138, 13-139 o 14-139. Véase, p. ej., Pahleret al.,J. Biol. Chem.,262: 13933-37 (1987). También pueden utilizarse otras formas truncadas de estreptavidina y avidina que conserven una fuerte unión a la biotina. Véase, p. ej., Sanoet al.,J Biol Chem.270(47): 28204-09 (1995) (que describen las variantes 16-133 y 14-138 de estreptavidina de núcleo) (patente estadounidense n ° 6.022.951). También pueden utilizarse mutantes de estreptavidina y formas núcleo de estreptavidina que conserven una actividad de unión sustancial a la biotina o un aumento de actividad de unión a la biotina. Véanse, p. ej., Chilcotiet al.,Proc Natl Acad Sci,92(5): 1754-58 (1995), Rezniket al.,Nat Biotechnol,14(8): 1007-11(1996). Por ejemplo, pueden utilizarse mutantes con inmunogenicidad reducida, tales como mutantes mutados mediante mutagénesis dirigida para eliminar posibles epítopos de linfocitos T o epítopos de linfocitos. Véase Meyeret al.,Protein Sci.,10: 491-503 (2001). Del mismo modo, también pueden utilizarse mutantes de avidina y formas núcleo de avidina que conserven una actividad de unión sustancia a la biotina o un aumento de actividad de unión a la biotina. Véase Hilleret al.,J Biochem, 278: 573-85 (1991); y Livnaet al.,Proc Natl Acad Sci USA90: 5076-80 (1993). Por conveniencia, en la presente exposición, los términos "avidina" y "estreptavidina" (o "SA") abarcan fragmentos, mutantes y formas núcleo de estas moléculas.
La avidina y la estreptavidina están disponibles en proveedores comerciales. Asimismo, se conocen las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la estreptavidina y la avidina y las secuencias de aminoácidos de la estreptavidina y la avidina. Véanse, p. ej., los n.° de registro del GenBank X65082; X03591; NM_205320; X05343; Z21611; y Z21554.
El biomaterial es un hidrogel. Como se utiliza en el presente documento, "hidrogel" se refiere a un material polimérico que se hincha con agua, p. ej., redes poliméricas que se hinchan con agua, con dimensiones mucho mayores que las de una célula (tal como > 500 pm). Como se utiliza en el presente documento, "microgel" se refiere a un hidrogel con dimensiones más pequeñas (tales como del orden de decenas o centenas de pm). El hidrogel puede ser cualquier hidrogel farmacéuticamente aceptable que sea adecuado para su administración al sujeto específico. Un hidrogel normalmente se forma cuando un polímero orgánico (natural o sintético) se reticula mediante enlace covalente, iónico o de hidrógeno para crear una estructura tridimensional de red abierta que atrapa moléculas de agua para formar un gel. Como ejemplos de materiales que pueden utilizarse para formar un hidrogel se incluyen materiales basados en macrómeros (incluidos macrómeros de PEG) ensamblados utilizando diferentes métodos de reticulación (tales como reacciones de adición de tipo Michael, tiol-eno, clic, etc), polisacáridos (como alginato), polifosfazinas y poliacrilatos, o copolímeros de bloque como Pluronics™ o Tetronics™, copolímeros en bloque de óxido de polietilenopolipropilenglicol que están reticulados por temperatura, polimerización por radicales libres, reacciones de clic o pH, respectivamente.
En realizaciones específicas, el biomaterial es un hidrogel o microgel de polietilenglicol (PEG). El hidrogel puede sintetizarse a partir de macrómeros de poli(etilen)glicol de 4 brazos (PEG-4MAL) terminados en maleimida, tal como por polimerización de microfluidos. Véase Headenet al.,Advanced Materials, 26:3003-3008 (2014). La plataforma PEG-4MAL permite la incorporación covalente y estequiométrica de moléculas que contienen tiol y proporciona una mejora de la eficacia de reticulación para la formación de hidrogeles estructuralmente definidos. Véase Phelpset al.,Advanced Materials, 24: 64-70, 62 (2012). PEG-4MAL presenta una toxicidad mínimain vivo,y se excreta rápidamente por la orina, aspectos importantes para las aplicaciones clínicas.
Los hidrogeles o microgeles biotinilados pueden producirse haciendo reaccionar biotina-PEG-tiol con macrómero PEG-4MAL y generando microgeles de 150 pm de diámetro reticulados con ditiotreitol (DTT) mediante polimerización de microfluidos. Véase, p. ej., la Fig. 1A. Los microgeles resultantes muestran biotina anclada de manera covalente capaz de capturar SA con alta afinidad. Véase, p. ej., la Fig. 1B.
El biomaterial puede comprender o formularse(p. ej.,mezclarse o combinarse con) un agente terapéutico adicional, tal como un inmunosupresor. Como ejemplos de fármacos inmunosupresores adecuados se incluyen rapamicina, ciclofosamida con busulfán, fludarabina, metotrexato, sulfasalazina, hidroxicloroquina, azatioprina, tocilizumab, etanercept, adalimumab, anakinra, abatacept, rituximab, certolizumab, golimumab, ciclosporina, dexametasona, metilprednisolona, prednisona, tacrolimus y triamcinolona. En algunas realizaciones, el fármaco inmunosupresor es rapamicina.
Métodos de inducción de tolerancia inmunitaria
El biomaterial de la invención puede aplicarse en métodos para efectuar la inmunomodulación, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesita un biomaterial diseñado con FasL como se describe en el presente documento. El método puede ser para prevenir o reducir los riesgos de rechazo de injertos celulares o tisulares y/o para el tratamiento de diabetes tipo I.
Como se ha indicado anteriormente, los biomateriales de FasL descritos en el presente documento son útiles para inducir inmunosupresión. Por tanto, los biomateriales pueden utilizarse en métodos de inducción de inmunosupresión en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto un biomaterial de FasL en una cantidad eficaz para inducir tolerancia inmunitaria.
Como se ha indicado anteriormente, los biomateriales de FasL descritos en el presente documento también son útiles para inducir tolerancia inmunitaria específica. Por ejemplo, la administración de un biomaterial de FasL junto con un injerto (p. ej., una célula de injerto) puede inducir tolerancia inmunitaria específica a la célula de injerto. Por tanto, de acuerdo con algunas realizaciones, se proporcionan biomateriales para su uso en la inducción de la tolerancia inmunitaria en un sujeto que lo necesite, mediante lo cual al sujeto se le administra un biomaterial de FasL de células de injerto en una cantidad eficaz para inducir tolerancia inmunitaria a la célula de injerto.
Como se usa en el presente documento, "célula de injerto" se refiere a una célula (o tejido u órgano que comprende una célula) donante, que se administra a un sujeto que lo necesite. Los tipos de células de injerto incluyen células de los islotes(p. ej.,células de los islotes pancreáticos, esplenocitos, CMSp , células de médula ósea, células madre mesenquimatosas, células madre hematopoyéticas, células madre, células madre pluripotentes inducidas, productos de células beta humanas, hepatocitos, células dendríticas, macrófagos, células endoteliales, miocitos cardíacos, células vasculares y células inmunitarias, incluyendo linfocitos T,etc.,dependiendo de la afección que se vaya a tratar. De acuerdo con estos métodos, el hidrogel de FasL induce una tolerancia inmunitaria específica a las células de injerto.
A modo ilustrativo, a un sujeto se le pueden administrar células de los islotes pancreáticos para tratar la diabetes. Con objeto de inducir tolerancia inmunitaria específica a las células de los islotes pancreáticos, al sujeto se le puede administrar células de los islotes pancreáticos y un hidrogel diseñado para presentar FasL (un "hidrogel de FasL"). En otro ejemplo, al sujeto se le puede administrar hepatocitos para tratar la insuficiencia hepática aguda o trastornos metabólicos hepáticos. Al sujeto se le pueden administrar hepatocitos y un hidrogel de FasL para inducir tolerancia inmunitaria a los hepatocitos.
La célula de injerto puede administrarse como una preparación de células aisladas o como parte de un tejido u órgano.
La célula de injerto puede ser alógena. La célula de injerto puede ser xenógena. La célula de injerto puede ser de un ser humano, de un primate no humano, un perro, un gato, una vaca, una oveja, un caballo, un conejo, un ratón o una rata.
La célula de injerto puede ser autóloga o autógena (del sujeto que se está tratando). Por ejemplo, una célula de injerto autóloga puede proceder de tejido autólogo mediante pluripotencia inducida y diferenciación de las células pluripotentes inducidas en la célula de injerto autóloga deseada. Las células del sujeto pueden utilizarse para inducir autotolerancia inmunitaria que se ha interrumpido en la enfermedad autoinmunitaria. Como ejemplos de células adecuadas para su uso en estas realizaciones se incluyen células madre hematopoyéticas movilizadas, CMSP, células dendríticas y similares. Las células pueden elegirse entre aquellas que expresan naturalmente autoantígenos que son la diana de la enfermedad autoinmunitaria. Por ejemplo, la diabetes tipo I es una enfermedad autoinmunitaria en donde el cuerpo reacciona y rechaza las células de los islotes (p) pancreáticos. En las primeras etapas de la diabetes, antes de que todas las células de los islotes sean rechazadas, puede ser posible inducir tolerancia a las células de los islotes y así impedir el avance de la diabetes.
Por tanto, el sujeto puede necesitar tolerancia inmunitaria en una célula de injerto, y la tolerancia inmunitaria puede inducirse administrando un hidrogel de FasL como se describe en el presente documento y la célula de injerto, y la célula de injerto se selecciona basándose en la afección a tratar. Por ejemplo, cuando el sujeto necesite tratamiento o prevención de la diabetes tipo 1, la célula de injerto pueden ser células de los islotes pancreáticos. Cuando el sujeto necesite tratamiento o prevención de rechazo de aloinjerto, la célula de injerto pueden ser células del donante del aloinjerto, tal como células de médula ósea del aloinjerto, miocitos cardíacos del aloinjerto y células vasculares del aloinjerto, u otras células del donante del aloinjerto como se ha indicado anteriormente. Cuando el sujeto necesite tratamiento o prevención de rechazo de xenoinjerto, la célula de injerto pueden ser células del donante del xenoinjerto, tal como células de médula ósea del xenoinjerto, miocitos cardíacos del xenoinjerto y células vasculares del xenoinjerto, u otras células del donante del xenoinjerto como se ha indicado anteriormente. Cuando el sujeto necesite tratamiento o prevención de rechazo autólogo, la célula de injerto pueden ser células autólogas, tales como células procedentes de tejido autólogo mediante pluripotencia inducida y diferenciación de las células pluripotentes inducidas.
Por tanto, el sujeto puede necesitar tolerancia inmunitaria en una célula de injerto. La célula de injerto puede seleccionarse de CMSP, células de médula ósea, células madre hematopoyéticas, células madre, células madre mesenquimatosas, células dendríticas, células dendríticas pulsadas con autoantígenos, productos de células beta humanas y esplenocitos. Por ejemplo, cuando el sujeto necesite tratamiento o prevención de la diabetes tipo 1, la célula de injerto pueden ser células de los islotes pancreáticos, o además o como alternativa, otras células como se ha indicado anteriormente. Cuando el sujeto necesite tratamiento o prevención de rechazo de aloinjerto, las células de injerto pueden ser células del donante del aloinjerto, tales como células seleccionadas del grupo que consiste en células de médula ósea de aloinjerto, miocitos cardíacos del aloinjerto y células vasculares del aloinjerto, u otras células del donante del aloinjerto como se ha indicado anteriormente. Cuando el sujeto necesite tratamiento o prevención de rechazo de xenoinjerto, las células de injerto pueden ser células del donante del xenoinjerto, tales como células seleccionadas del grupo que consiste en células de médula ósea del xenoinjerto, miocitos cardíacos del xenoinjerto y células vasculares del xenoinjerto, u otras células del donante del xenoinjerto como se ha indicado anteriormente. Cuando el sujeto necesite tratar o prevenir la autoinmunidad, las células de injerto pueden ser (i) una célula que exprese el autoantígeno (ii) una célula que lleve el autoantígeno y (iii) una célula dendrítica pulsada con el autoantígeno.
Para su uso en estos métodos, el biomaterial de FasL (tal como un hidrogel de FasL) y la célula de injerto pueden administrarse en la misma composición o pueden administrarse por separado. El biomaterial de FasL puede encapsular la célula de injerto. Por ejemplo, la célula de injerto puede quedar atrapada dentro del biomaterial de hidrogel o microgel. El biomaterial de FasL (tal como un hidrogel de FasL) y la célula de injerto pueden administrarse en el mismo lugar en el sujeto, tal como por inyección local en aproximadamente el mismo lugar. El biomaterial de FasL (tal como un hidrogel de FasL) y la célula de injerto, pueden trasplantarse al sujeto en el mismo lugar (p. ej., cotrasplante). Los métodos pueden lograr una inmunosupresión específica prolongada en el lugar del injerto.
Por tanto, de acuerdo con algunas realizaciones, la administración es por trasplante. La aceptación del injerto alógeno de islotes puede lograrse mediante un simple cotrasplante de islotes no modificados y biomateriales que presenten FasL sin inmunosupresión prolongada.
En algunas realizaciones, el biomaterial de FasL (tal como un hidrogel de FasL) se administra con un fármaco inmunosupresor, tal rapamicina o cualquiera de los otros mencionados anteriormente. En dichas realizaciones, el biomaterial de FasL (tal como un hidrogel de FasL) y el fármaco inmunosupresor pueden formularse conjuntamente (p. ej., el hidrogel puede comprender el fármaco inmunosupresor), o pueden administrarse en composiciones distintas, de forma simultánea o secuencial en cualquier orden. Es posible que se requiera un ciclo más corto de fármaco inmunosupresor que cuando no se administra ningún biomaterial de FasL.
Los biomateriales de FasL (como los hidrogeles de FasL) que comprenden un fármaco inmunosupresor pueden proporcionar una liberación controlada del fármaco. Los biomateriales de FasL (como los hidrogeles de FasL) que comprenden un fármaco inmunosupresor pueden proporcionar una liberación controlada del fármaco dentro del microambiente del injerto, o contener el injerto en forma de una cápsula diseñada con estas moléculas inmunomoduladoras (FasL).
La administración de un biomaterial de FasL (tal como un hidrogel de FasL), como se describe en el presente documento, con un fármaco inmunosupresor, puede lograr un efecto inmunosupresor sinérgico. Por ejemplo, el fármaco inmunosupresor (como la rapamicina) puede funcionar en sinergia con FasL para eliminar específicamente los linfocitos T efectores patógenos mientras expande linfocitos T reguladores, inclinando así la balanza de la respuesta inmunitaria hacia la protección. Sin quedar ligados a teoría alguna, este efecto sinérgico puede lograrse mediante la apoptosis extrínseca mediada por el receptor de muerte que activa el resto de FasL en linfocitos T efectores, mientras que el fármaco inmunosupresor (como la rapamicina) activa la apoptosis intrínseca mediada por mitocondrias. Véase, p. ej., Juet al.,Nature 373(6513): 444-448 (1995); y Yellenet al.,Cell Cycle,10(22): 3948-3956 (2011).
La administración de un biomaterial de FasL (tal como un hidrogel de FasL), como se describe en el presente documento, con un fármaco inmunosupresor, puede no alterar la respuesta inmunitaria sistémica y puede aumentar la proporción de linfocitos T reguladores con respecto a linfocitos T auxiliares. Los linfocitos T reguladores desempeñan un papel importante en la modulación de las respuestas inmunitarias y las señales inflamatorias y se infiltran en injertos rechazados.
Como se ha indicado anteriormente, el biomaterial de FasL (tal como un hidrogel de FasL) puede administrarse en una cantidad eficaz para inducir inmunosupresión o inducir tolerancia inmunitaria específica. Las cantidades eficaces de FasL variarán dependiendo del sujeto que se esté tratando, de la vía de administración y de la naturaleza y gravedad de la afección que se va a tratar. Las cantidades de FasL utilizadas en los siguientes ejemplos son ilustrativas y pueden convertirse en dosis para otros sujetos según la siguiente tabla:
Sólo como ilustración, una dosis eficaz de FasL puede ser de menos de aproximadamente 0,2 pg/kg/día a al menos aproximadamente 10 pg/kg/día, o mayor, en función del resto de FasL. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento pueden llevarse a cabo usando dosis diarias de FasL en cantidades inferiores a aproximadamente 0,2 pg/kg/día, aproximadamente 0,2 pg/kg/día, aproximadamente 0,5 pg/kg/día, aproximadamente 1 pg/kg/día, aproximadamente 1,5 pg/kg/día, aproximadamente 2 pg/kg/día, aproximadamente 2,5 pg/kg/día, aproximadamente 3 pg/kg/día, aproximadamente 3,5 pg/kg/día, aproximadamente 4 pg/kg/día, aproximadamente 4,5 pg/kg/día, aproximadamente 5 pg/kg/día, o más.
Diabetes Tipo 1
La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por la pérdida de masa de células p productoras de insulina y, por tanto, del control glucémico, debido a una respuesta inmunitaria coordinada contra antígenos específicos de células p que requiere linfocitos T CD4+. El restablecimiento de la masa de células p mediante el trasplante alógeno de islotes es actualmente la intervención clínica preferida para mejorar el control glucémico en pacientes con inestabilidad glucémica grave. No obstante, la longevidad de los injertos alógenos no está únicamente limitada a las respuestas inmunitarias del hospedador, sino también por el fracaso secundario del injerto debido a los efectos tóxicos de la inmunosupresión crónica necesaria para controlar el rechazo. Los linfocitos T efectores (Tef) patógenos son los principales culpables de la destrucción del aloinjerto de islotes. Por lo tanto, una estrategia prometedora para aumentar la longevidad funcional de los aloinjertos de islotes sin la necesidad de inmunosupresión prolongada comprende terapias novedosas dirigidas a linfocitos Tef para su eliminación, mitigando su función patógena.
Una vez activados, los linfocitos T regulan positivamente Fas y se vuelven sensibles a la apoptosis mediada por FasL, un proceso que desempeña un papel fundamental en la muerte celular inducida por activación (AICD,activationinduced cell death)y la tolerancia a los autoantígenos. La deficiencia de Fas o FasL provoca una linfoproliferación masiva y patologías autoinmunitarias en roedores y seres humanos, demostrando la falta de mecanismos compensatorios y la importancia de esta ruta para la regulación inmunitaria. Reconociendo el potencial inmunomodulador de esta ruta, varios grupos han utilizado con éxito la terapia génica con FasL para mitigar las respuestas inmunitarias alógenas para la aceptación de injertos en modelos animales experimentales. Aunque estas intervenciones muestran eficacia, el perfil de seguridad desconocido de la expresión ectópica sostenida de FasL en tejidos diana, así como los desafíos técnicos y normativos de la terapia génica, limitan su potencial clínico. Adicionalmente, FasL solo contribuye a la AICD en su forma oligomérica unida a la membrana. Las metaloproteinasas de matriz (MMP) pueden escindir FasL en una forma soluble extracelular que inhibe la apoptosis y actúa como quimioatrayente para los neutrófilos, acelerando la destrucción de los aloinjertos.
El trasplante de islotes es una terapia prometedora para la diabetes tipo 1. No obstante, la inmunosupresión crónica para controlar el rechazo de injertos alógenos de islotes induce morbilidades y altera la función de los islotes.
Los linfocitos T efectores son responsables del rechazo de aloinjerto de islotes y expresan el receptor de muerte de Fas después de la activación, volviéndose sensibles a la apoptosis mediada por Fas. No obstante, la inmunomodulación localizada utilizando microgeles que presentan una forma apoptótica del ligando Fas (SA-FasL) como se describe en el presente documento, da como resultado una supervivencia prolongada de los injertos alógenos de islotes, como se muestra en ratones diabéticos. Además, un ciclo corto de tratamiento con rapamicina puede reforzar la eficacia inmunomoduladora de los microgeles de SA-FasL, dando como resultado la aceptación y función de todos los aloinjertos durante un período de tiempo prolongado, tal como de 200 días en el experimento que se expone más adelante. Además, los sujetos tratados pueden exhibir respuestas sistémicas normales a antígenos donantes, lo que implica privilegio inmunitario del injerto y aumento de linfocitos T reguladores CD4+CD25+FoxP3+ en el injerto y ganglios linfáticos de drenaje. En el experimento que se comunica a continuación, la deleción de linfocitos T reguladores provocó un rechazo agudo de aloinjertos de islotes establecidos.
Estos resultados son congruentes con el papel establecido de FasL en el privilegio inmunitario fisiológico de tejidos seleccionados, como la cámara anterior del ojo y los testículos. Zeiseret al.,Blood 111(1): 453-462 (2008); Battagliaet al.,Blood,105(12): 4743-4748 (2005); Basuet al.,J Immunol180(9): 5794-5798 (2008). La protección observada contra el rechazo requirió linfocitos Treg y se localizó en el injerto, ya que los receptores a largo plazo generaron una respuesta sistémica normal a los antígenos de donantes, lo que implica privilegio inmunitario. Esto es congruente con un estudio que demuestra que los mioblastos primarios transfectados para expresar FasL conferían privilegio inmunitario a injertos alógenos de islotes cotrasplantados. Juet al.Nature373(6513): 444-448 (1995). Por otro lado, anteriormente, los autores de la invención han demostrado que los injertos alógenos de islotes diseñados para presentar la proteína SA-FasL en su superficie bajo una pequeña protección de tratamiento con rapamicina, superaron el rechazo induciendo tolerancia localizada en el injerto y privilegio inmunitario, mantenido por los linfocitos Treg. Por tanto, la estrategia inmunomoduladora localizada basada en biomateriales descrita en el presente documento puede proporcionar una alternativa a la inmunosupresión crónica para el trasplante clínico de islotes.
Por tanto, en el presente documento se describen biomateriales diseñados con FasL en donde FasL conjugado con estreptavidina (SA-FasL) se presenta en un material biocompatible, es decir, un hidrogel, tal como un hidrogel de polietilenglicol (PEG). Los biomateriales diseñados con SA-FasL, son útiles, por ejemplo, para la inmunomodulación, tal como para prevenir o reducir los riesgos de rechazo de injertos celulares o tisulares, tal como para prevenir o reducir los riesgos de rechazo de injertos exógenos, para prevenir o reducir los riesgos de rechazo del trasplante de islotes pancreáticos, y/o para prevenir o reducir los riesgos de rechazo de células madre, productos de células beta pancreáticas humanas (tales como los que pueden utilizarse para el tratamiento de la diabetes tipo 1), y junto con otros tratamientos y/o el tratamiento de otros trastornos que pueden beneficiarse de los injertos celulares o tisulares. Por tanto, por ejemplo, los biomateriales diseñados con SA-FasL descritos en el presente documento son útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, tales como la diabetes tipo I, la prevención del rechazo de injertos celulares y tisulares, tales como células madre, islotes pancreáticos, células madre hematopoyéticas, hepatocitos, células madre mesenquimatosas, células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, productos de células beta humanas derivados de células madre, y en conjunto con el tratamiento de diversos trastornos hematopoyéticos y de inmunodeficiencia mediante el uso de células madre.
La construcción del ligando de Fas (FasL) conjugado con estreptavidina (SA-FasL), utilizada en las realizaciones específicas descritas en el presente documento, se ha descrito de por sí, y se ha demostrado que impide el rechazo de injertos alógenos de islotes pancreáticos bajo un corto ciclo de tratamiento con rapamicina. En el contexto de realizaciones específicas de la presente invención, se ha demostrado que los hidrogeles de PEG diseñados para presentar la proteína SA-FasL en su superficie, son eficaces para prevenir el rechazo de islotes pancreáticos cotrasplantados cuando se usan junto con un ciclo corto de rapamicina, un fármaco inmunosupresor, en ratones químicamente diabéticos. En conjunto, estos estudios demuestran la utilidad del uso de biomateriales diseñados con SA-FasL para tratar el rechazo de injertos exógenos y la autoinmunidad.
En el contexto de la presente invención, SA-FasL tiene mecanismos de acción exclusivos que pueden aprovecharse al máximo utilizando hidrogeles como vehículo de suministro. Dado el papel fundamental de FasL en la autotolerancia y que no existen mecanismos compensatorios cuando es deficiente, esta molécula tiene ventajas sobre otros productos biológicos y fármacos inmunosupresores utilizados para tratar la autoinmunidad y el rechazo de injerto. Por ejemplo, cuando los linfocitos T autorreactivos y alorreactivos se activan, regulan positivamente el receptor Fas y, como tal, se convierte en la diana directa de SA-FasL. Por lo tanto, SA-FasL tiene el potencial de eliminar específicamente los linfocitos T auto y alorreactivos, sin que se sepa el repertorio de linfocitos T con respecto a la especificidad antigénica. Esta ruta no se ha utilizado con fines terapéuticos y, como tal, es exclusiva. Por otro lado, este concepto tiene eficacia y especificidad sobre las tecnologías actuales utilizadas por la industria para el tratamiento de la autoinmunidad y el rechazo de injertos, que no sólo son ineficaces sino que también tienen diversos efectos secundarios, por ejemplo, los asociados a la inmunosupresión estándar utilizada para la autoinmunidad y el rechazo de injerto.
El rechazo de injerto exógeno y diversas enfermedades autoinmunitarias, como la diabetes tipo I (DT1), son el resultado final de un desequilibrio entre los linfocitos T efectores (Tef) patógenos y los linfocitos T reguladores (Treg) protectores. Por lo tanto, las estrategias que cambian de manera eficaz el equilibrio de los linfocitos Tef patógenos a favor de los Treg tienen la posibilidad de impedir y neutralizar la autoinmunidad, así como impedir el rechazo de injerto exógeno. Los linfocitos T patógenos que reconocen antígenos propios o de trasplante se activan y regulan positivamente el receptor de Fas en su superficie. Estos linfocitos son resistentes a la apoptosis gracias al ligando de Fas (FasL) debido a la expresión de diversos genes antiapoptóticos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Producción de microgeles biotinilados que pueden capturar Estreptavidina-FasL
Los microgeles biotinilados pueden producirse haciendo reaccionar biotina-(polietilenglicol (PEG))-tiol con macrómero de polietilenglicol de 4 brazos (PEG-4MAL) terminado en maleimida y generando microgeles de 150 |jm de diámetro reticulados con ditiotreitol (DTT) mediante polimerización de microfluidos (FIG. 1A). Los microgeles resultantes presentan biotina anclada de manera covalente capaz de capturar estreptavidina (SA) con alta afinidad (FIG. 1B). La captura de SA específica de biotina en los microgeles varió linealmente con la concentración de SA en la solución de anclaje hasta una concentración saturante de 150 jg/m l(FIG. 1C),lo que demuestra un control dependiente de la dosis de la presentación de SA en la superficie del microgel. Como se esperaba, la captura de SA-FasL en los microgeles biotinilados obedeció a una relación similar dependiente de la dosis(FIG. 7).Es importante destacar, que la presentación de SA-FasL en los microgeles indujo apoptosis dependiente de la dosis en células A20(FIG. 1D),que son sensibles a la apoptosis mediada por FasL. En cambio, el acoplamiento covalente directo de SA-FasL al macrómero de PEG-4MAL eliminó la actividad apoptótica de SA-FasL(FIG. 8),lo que demuestra la importancia de la inmovilización con biotina para la presentación de SA-FasL bioactivo. Estos resultados muestran que SA-FasL anclado a microgeles biotinilados conserva una fuerte actividad apoptótica y que utilizando esta estrategia, puede controlarse fácilmente la cantidad de SA-FasL bioactivo que se suministra.
Para examinar si el material funcionalizado afectaba a la salud y al funcionamiento normal de los islotes, durante 24 horas se cultivaron islotes de rata con microgeles presentadores de SA-FasL (proporción de islote a microgel de 1:2). No hubo diferencias entre los islotes cocultivados con microgeles presentadores de SA-FasL y los islotes libres (control) en lo que respecta a la actividad metabólica(FIG. 10A),secreción de insulina estimulada por glucosa(FIG. IOB) ,tinción de células muertas-vivas(FIG. 10D),o patrones de expresión de insulina y glucagón(FIG. 10E).
Curiosamente, los islotes cocultivados con microgeles presentadores de SA-FasL tuvieron una secreción reducida de citocinas proinflamatorias MIP1a e IL-6, pero no de MCP-1, en compararon con los islotes libres como control(FIG. IOC) .En conjunto, estos datos demuestran que los microgeles presentadores de SA-FasL no afectan negativamente a la salud o la función de los islotes.
Ejemplo 2: La presentación de SA-FasL en microgeles prolonga el suministro local de SA-FasL en los lugares del injerto.
También se investigó la retención de SA-FasL presentado en microgelesin vivo.SA-FasL, marcado con un colorante fluorescente del infrarrojo cercano, se inmovilizó en microgeles biotinilados, que se implantaron debajo de la cápsula renal de ratones. Durante 21 días, se realizó un seguimiento longitudinal de SA-FasL marcado en un sistema de obtención de imágenesin vivo.Las imágenes de la señal fluorescente muestran una señal concentrada localizada en la zona alrededor de los riñones en ratones que reciben microgeles presentadores de SA-FasL marcados, mientras que la señal fluorescente es difusa en ratones que reciben SA-FasL libre marcado sin el portador de microgel(FIG.
2A).En ratones que recibieron únicamente SA-FasL marcado, sin el vehículo de suministro de microgel, la proteína se eliminó rápidamente del lugar del trasplante, con una reducción del 60 % en la señal el día 1 después de la implantación y una señal insignificante el día 7 después de la implantación(FIG. 2B).En cambio, los ratones que recibieron microgeles presentadores de SA-FasL mostraron niveles significativamente más altos de SA-FasL a lo largo del tiempo con niveles elevados comparables a los de la señal del día 0 en el lugar de implantación durante los 7 días posteriores al trasplante. El análisis de los perfiles de retención utilizando únicamente ajustes de curvas de desintegración exponencial mostró tiempos de retención significativamente más largos para los microgeles presentadores de SA-FasL en comparación con los de SA-FasL libre (semivida de 3,0 ± 0,8 días frente a 0,70 ± 0,40 días, p<0,0001).Por otro lado, los cálculos del área bajo la curva demostraron mayor retención de SA-FasL para las proteínas ancladas al microgel frente a las proteínas libres (5,25 ± 0,87 frente a 1,98 ± 0,14,p<0,007).LaFIG. 11muestra que en el lugar del implante, pudieron observarse claramente microgeles el día 21, según lo determinado por histología. Este resultado confirma la conclusión de que la pérdida de señal de fluorescencia de los microgeles de SA-FasL surge de la desunión de SA-FasL del microgel biotinilado y no de la degradación de los microgeles. Por lo tanto, esta estrategia con biomaterial para el suministro prolongado y local de SA-FasL en lugares de injerto, mejora significativamente los efectos locales al tiempo que minimiza los riesgos de efectos sistémicos de esta fuerte proteína inmunomoduladora. Esperamos que esta estrategia con biomaterial para el suministro prolongado y local de SA-FasL en lugares de injerto, mejore significativamente los efectos locales al tiempo que minimice los riesgos de efectos sistémicos de esta fuerte proteína inmunomoduladora.
Ejemplo 3: El cotrasplante de injertos alógenos de islotes y microgeles diseñados con SA-FasL restablece el control glucémico prolongado sin el uso de inmunosupresión crónica ni modificación de los islotes.
La eficacia inmunomoduladora de los microgeles presentadores de SA-FasL se probó en un entorno de trasplante alógeno de islotes. Se mezclaron injertos alógenos de islotes no modificados (Balb/c) con microgeles y la mezcla resultante se trasplantó debajo la cápsula renal de ratones C57BL/6 diabéticos tratados con estreptozotocina. Los ratones que recibieron islotes no modificados y microgeles biotinilados de control rechazaron intensamente todos los injertos (tiempo medio de supervivencia (TMS) = 15 días;FIG. 3A),mientras que los islotes cotrasplantados con microgeles diseñados con SA-FasL tuvieron una supervivencia significativamente prolongada (TMS = 31 días) y aproximadamente el 25 % de los sujetos sobrevivieron más de 200 días antes del sacrificio.(FIG. 3A).
Perceptiblemente, >90 % (12/13) de los injertos funcionaron y sobrevivieron durante toda la ventana de observación de 200 días en ratones cotrasplantados con islotes no modificados y microgeles presentadores de SA-FasL cuando los sujetos se trataron con un ciclo corto de rapamicina (0,2 mg/ kg diarios comenzando el día 0 posterior al trasplante durante 15 dosis;FIG. 3A).La inmunotinción del lugar del implante de receptores con injertos funcionales a los 200 días reveló estructuras positivas a insulina que recordaban a los islotes en estrecha asociación con microgeles, mientras que no se observaron estructuras positivas a insulina en receptores con injertos rechazados(FIG. 3B).Las pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal demostraron una función equivalente de estos injertos prolongados en comparación con los ratones sin tratamiento previo(FIG. 3C);los análisis del área bajo la curva no mostraron diferencias entre los injertos sin tratamiento y con tratamiento prolongado(P=0,20).Muy al contrario, el mismo protocolo con inyecciones de rapamicina pero sin microgeles diseñados con SA-FasL, produjo un rechazo intenso (TMS = 36 días) con un rendimiento similar al del grupo tratado con microgeles presentadores de SA-FasL(FIG. 3A).
Para establecer además que el cotrasplante de islotes y del SA-FasL diseñado daba como resultado la neutralización de la diabetes, se midieron los niveles de glucemia a lo largo del tiempo en los receptores del injerto. Los niveles representativos de glucemia a lo largo del tiempo para los receptores del injerto con microgeles presentadores de SA-FasL rapamicina o microgeles de control rapamicina se muestran en laFIG. 9.La nefrectomía en ratones diabéticos que recibieron islotes y microgeles presentadores de SA-FasL rapamicina el día 200 después del trasplante, restableció rápidamente la hiperglucemia(FIG. 12),demostrando que, en estos sujetos, la neutralización de la diabetes se debía al injerto. Aumentar 10 veces la densidad superficial de SA-FasL en los microgeles no tuvo ninguna mejora significativa en la supervivencia del injerto(FIG. 13).También se comparó el rendimiento funcional de los microgeles presentadores de SA-FasL con los islotes presentadores de SA-FasL, ya que anteriormente se demostró que esta estrategia fue eficaz para promover la aceptación del injerto. Yolcuet al.,J Immunol187(11): 5901-5909 (2011). No observamos diferencias en los efectos de SA-FasL, con o sin administración de rapamicina, entre SA-FasL presentado en la superficie de islotes o microgeles(FIG. 14).No obstante, una ventaja importante y significativa de la presentación de SA-FasL basada en microgel es que evita la modificación química de los islotes, que puede superar un posible impacto negativo sobre la viabilidad y función de los islotes, y también proporcionar una mejor estrategia traducible como producto disponible en el comercio. En conjunto, estos resultados muestran que el simple cotrasplante de injertos alógenos de islotes y microgeles diseñados con SA-FasL, restablece el control glucémico prolongado sin el uso de inmunosupresión crónica o modificación de los islotes.
Ejemplo 4: Los receptores de microgeles diseñados con SA-FasL conservan la competencia inmunitaria sistémica.
Debido a la naturaleza localizada de la inmunomodulación, evaluamos la respuesta sistémica de los receptores del injerto a los antígenos de donantes en un ensayo de proliferaciónin vitro.Tanto los linfocitos T CD4+ como los CD8+ de receptores de injertos de islotes prolongados (> 200 días) tratados con microgeles diseñados con SA-FasL, mostraron respuestas proliferativas a antígenos de donantes y de terceros(FIG. 4AyFIG. 14). Las respuestas observadas fueron de magnitudes similares a las obtenidas utilizando linfocitos T de ratones rechazadores que recibieron microgeles no modificados y rapamicina. Este resultado indica que los ratones que reciben microgeles diseñados con SA-FasL mantienen la competencia inmunitaria sistémica y que la protección brindada por los microgeles diseñados con SA-FasL permanece localizada en el injerto.
Para dilucidar mejor el mecanismo de aceptación del injerto, poblaciones de células inmunitarias extraídas del bazo, de ganglios linfáticos (GL) que drenan el injerto y del injerto, se analizaron mediante citometría de flujo en un estudio de evolución temporal, con especial atención a los linfocitos Tef y T reguladores (Treg) como dianas de la inmunomodulación mediada por FasL, como se muestra en laFIG. 15.Observamos una tendencia general en la disminución del número de linfocitos Tef CD4+ y CD8+ en tejidos de ratones que recibieron microgeles diseñados con SA-FasL rapamicina en comparación con el grupo de control que recibió microgeles no modificados solos o junto con rapamicina, como se muestra en laFIG. 16.El grupo tratado con microgeles no modificados y rapamicina mostró una tendencia hacia un mayor número de linfocitos Treg que alcanzó significación en los linfocitos infiltrantes del injerto el día 7 después del trasplante. Los ratones que recibieron microgeles diseñados con SA-FasL y rapamicina tuvieron una mayor proporción de linfocitos Treg con respecto a los Tef CD4+ y CD8+ en el injerto(p<0,05para Treg: Tef CD8+) y en los GL que drenan el injerto (p <0,05en ambas poblaciones de Treg:Tef) en comparación con ratones de control que recibieron microgeles no modificados solos o junto con rapamicina(FIG. 4B).
Además, dada la tendencia al aumento de la proporción de linfocitos Treg con respecto a los Tef, realizamos un estudio de empobrecimiento para evaluar directamente el papel de los linfocitos Treg en la aceptación del injerto observada en nuestro modelo. Para estos estudios, se trasplantaron injertos alógenos de islotes BALB/c en ratones transgénicos C57BL/6 que expresaban el receptor de la toxina diftérica (Dt ) humana bajo el control de Foxp3. En estos ratones que expresaban FoxP3/DTR (receptor de la toxina diftérica bajo el control de Foxp3), la administración de la DT empobrece los linfocitos Treg de manera transitoria durante varios días antes de volver a los niveles normales(FIG. 17A).Es importante destacar, que la administración de la DT no tiene efectos sobre los niveles de glucemia de ratones FoxP3/DTR(FIG. 17B).Ratones transgénicos químicamente diabéticos trasplantados con injertos alógenos de islotes y microgeles diseñados con SA-FasL bajo la protección transitoria de tratamiento con rapamicina, establecieron la aceptación del injerto, como se ha observado anteriormente en receptores C57BL/6, con ratones que mantienen la función del injerto el día 50 después del trasplante(FIG. 4C).El empobrecimiento de linfocitos Treg mediante la administración de DT el día 50, produjo un rechazo de todos los injertos el día 82(FIG. 4C,TMS = 72 días). Muy al contrario, los ratones de control sin tratamiento con DT mantuvieron la función del injerto durante un periodo de observación experimental de 200 días. Estos resultados demuestran el papel dominante de los linfocitos Treg en la aceptación del injerto en ratones que reciben microgeles presentados con SA-FasL.
Ejemplo 5: La estrategia de microgel de SA-FasL mejora la función de los islotes trasplantados sin inmunosupresión crónica en un lugar de trasplante clínicamente pertinente.
La cápsula renal es un lugar de trasplante conveniente desde un punto de vista experimental para estudiar el suministro de células, pero tiene limitaciones para la adopción clínica. Por lo tanto, examinamos el trasplante alógeno de islotes en el panículo adiposo epididimario. El panículo adiposo epididimario de los ratones es análogo al epiplón de los seres humanos. Es importante destacar, que el epiplón representa un lugar de trasplante de islotes clínicamente pertinente. Véanse Baidalet al.,N Engl J Med376(19): 1887-1889 (2017); y Bermanet al.,Diabetes,65(5): 1350-1361 (2016). Para conservar los islotes en este lugar, los injertos se suministraron dentro de un hidrogel de PEG degradable por proteasas con liberación controlada de VEGF(vascular endothelial growth factor,factor de crecimiento endotelial vascular) que mejora el prendimiento del injerto de los islotes. Véase Weaveret al.,Sci Adv,3(6): e1700184 (2017). De acuerdo con nuestros resultados con respecto al lugar de la cápsula renal, los injertos alógenos de islotes cotrasplantados con microgeles de SA-FasL bajo una breve protección de tratamiento con rapamicina, mostraron una supervivencia significativamente mejorada en ratones diabéticos en comparación con los controles(p<0,0008,FIG.
6A).En este modelo, los injertos de islotes también normalizaron los niveles de glucemia, demostrando su función(FIG. 18).La inmunotinción del lugar del trasplante en ratones con injertos de islotes funcionales en el grupo tratado con microgeles presentadores de SA-FasL rapamicina, reveló que muchas estructuras se teñían positivamente con respecto a la insulina y al glucagón.(FIG. 6B),mientras que no se encontraron estructuras con tinción positiva con respecto a la insulina y al glucagón en ratones que recibieron islotes con microgeles de control. Finalmente, como evaluación inicial de la posible toxicidad del tratamiento con microgel de SA-FasL, se midieron los niveles séricos de enzimas hepáticas y se realizó histología de hígado y riñón en receptores a largo plazo (> 60 días)(FIG. 6C).Los niveles de enzimas hepáticas estaban dentro del intervalo normal y no hubo diferencias entre los microgeles presentadores de SA-FasL y los controles. De manera similar, no hubo diferencias en la estructura macroscópica del tejido hepático o renal. En conjunto, estos resultados demuestran que la estrategia con microgel de SA-FasL mejora la función de los islotes trasplantados sin inmunosupresión crónica en un lugar de trasplante clínicamente pertinente con un perfil de seguridad aceptable.
Materiales y métodos
Síntesis y caracterización de microgel.Durante 15 min se hizo reaccionar en PBS una solución precursora de microgel que contenía PEG-4MAL (20 kDa, Laysan Bio) al 5 % p/v y biotina-PEG-tiol (1 kDa, Nanocs) 1,0 mM. Esta solución precursora se dispersó en gotitas y posteriormente se reticuló en aceite mineral (Sigma) que contenía SPAN80 (Sigma) al 2 % y una emulsión 1:15 de 30 mg/ml de ditiotreitol (Sigma) en una microplaca de microfluidos, como se ha descrito anteriormente. Véase Headenet al.,Advanced Materials,26: 3003-3008 (2014). Utilizando este protocolo, también se sintetizaron microgeles de control que no contenían biotina-PEG-tiol. Después de lavar los microgeles 5 veces mediante centrifugación en seroalbúmina bovina al 1 % (Sigma) en PBS, se incubaron 104 microgeles con diversas concentraciones de un conjugado de estreptavidina-AlexaFluor488 durante 30 minutos en 500 pl de PBS y se lavaron 5 veces mediante centrifugación para eliminar el SA no unido. Los microgeles de cada muestra se colocaron en una placa de 96 pocillos y se midió la fluorescencia en un lector de placas (Perkin Elmer HTS 7000). También se sintetizaron microgeles de biotina y de control con un conjugado de péptido unido de manera covalente (GRGDSPC)-AlexaFluor594 para la visualización de la cápsula, y se obtuvieron imágenes fluorescentes para confirmar la inmovilización de SA específica de biotina.
Bioactividad in vitro de SA-FasL.Durante 30 min se coincubaron 104 microgeles, con o sin biotina, en 500 pl de PBS con seroalbúmina bovina al 1 % que contenía diversas concentraciones de SA-FasL. Los microgeles se lavaron 8 veces mediante centrifugación para eliminar el SA-FasL no unido y se incubaron con 106 células A20 en medios de 1,0 ml. Después de 18 h, las células se tiñeron con marcadores de apoptosis temprana y tardía (anexina V-APC y yoduro de propidio, BD Biosciences). Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo (citómetro de flujo Accuri C6) y se consideró que las células con tinción positiva para cualquier marcador eran apoptóticas. Se realizaron tres copias independientes de este experimento.
Citocompatibilidad in vitro de microgeles conjugados con SA-Fas-L.Se aislaron islotes pancreáticos de rata de ratas macho Lewis donantes y se cultivaron durante la noche antes de realizar el experimento. Después de 24 h, durante 24 h más, se cocultivaron 500 IEQ en 300 pl de CMRL completo con 1000 microgeles conjugados con SA-FasL. Después, se analizó la actividad metabólica de los islotes mediante MTT (Promega); Las muestras de células vivas/muertas se visualizaron utilizando el kit de viabilidad/citotoxicidad (Invitrogen) y un microscopio confocal invertido Zeiss LSM 710. Para evaluar la secreción de insulina de los islotes después del cocultivo, se utilizó un ensayo estático de liberación de insulina estimulada por la glucosa (GSIR,glucose-stimulated insulin release),estimulando con tampón de Krebs a baja (3 mM) y alta (11 mM) concentración durante 1 h cada una. Durante 1 h más, se realizó una segunda exposición en condiciones basales. Se utilizó un ELISA de insulina de rata para cuantificar muestras GSIR (Mercodia, Inc., Winston Salem, NC). Las citocinas inflamatorias del sobrenadante del cocultivo se analizaron mediante un kit de detección de anticuerpos basado en perlas magnéticas de multiplexación (panel de citocinas de rata Milliplex con IFNg, IL-1b, IL-6, IL-17A, MCP-1, MIP-1a) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se analizaron cincuenta microlitros de sobrenadante de tres pocillos independientes utilizando un Magpix con programa informático de análisis Analyst (Milliplex@ 5.1, Merck, USA). Las curvas patrón de cada analito se generaron utilizando patrones proporcionados por el fabricante. El análisis de inmunotinción de insulina y glucagón se realizó después del cocultivo fijando muestras de islotes en formol al 10% durante 1 h. Se tiñeron muestras completas en suspensión para detectar insulina (Dako A0564, 1:100), glucagón (Abcam ab10988, 1:50) y DAPI (Invitrogen, 1:500). Se obtuvieron imágenes de muestras completas montadas para detectar insulina (amarillo), glucagón (fucsia) y DAPI (azul).
Seguimiento de SA-FasL in vivo.SA-FasL se marcó con éster NHS conjugado con AlexaFluor750 (Thermo Fisher) y el colorante libre se eliminó tres veces mediante desalinización en una columna Zeba (MWCO de 7k, Thermo Fisher). Se inmovilizaron 3,0 |jg de SA-FasL marcado sobre 2000 microgeles de biotina mediante incubación durante 30 minutos seguido de 5 etapas de lavado. Se implantaron microgeles presentadores de SA-FasL o SA-FasL libre debajo de la cápsula renal de receptores C57Bl/6 (n = 8 ratones/grupo), y la intensidad y distribución de la señal se controlaron longitudinalmente utilizando un sistema de obtención de imágenes IVIS SpectrumCT. Las mediciones de intensidad se normalizaron a los valores del día 0. Se realizaron ajustes de curvas no lineales en GraphPad Prism y el tiempo de retención se comparó utilizando una prueba de la t. Adicionalmente, se calculó el área bajo la curva en cada grupo y se utilizó la prueba de la t de Welch para comparar los grupos.
Trasplante de islotes.Los islotes pancreáticos BALB/c se aislaron utilizando Liberase TL como enzima digestiva (Roche Life Science) y se purificaron mediante un gradiente de densidad de Ficoll publicado anteriormente. Véase Yolcuetal.,Immunity17: 795-808 (2002). Para biotinilar los islotes, los islotes cultivados durante la noche se incubaron en EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 5 jM (Thermo Scientific) durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron extensamente con PBS para eliminar la solución de biotina no unida. Los islotes y microgeles biotinilados se diseñaron con SA-FasL (~150 ng/500 islotes y 1-10 jg/1000 microgeles). Aproximadamente, se cotrasplantaron 500 islotes con 1000 microgeles en receptores diabéticos tratados con estreptozotocina (200 mg/kg i.p., diabetes (> 250 mg/dl) confirmada en dos días consecutivos) C57BL/6 o B6.129(Cg)-Foxp3tm3DTR/GFP-,Ay7J (C57B<l>/6.F<ox>P3egfp/dtr), según se indica. Para el empobrecimiento de Treg, los receptores de injertos de islotes recibieron una inyección i.p. de toxina diftérica (50 jg/kg de peso corporal) y el empobrecimiento se confirmó 3 días después en linfocitos de sangre periférica mediante citometría de flujo. Los grupos seleccionados también se trataron con rapamicina a razón de 0,2 mg/kg de inyección i.p. diaria durante 15 dosis a partir del día del trasplante. Como controles, se utilizaron islotes BALB/c no modificados cotrasplantados con geles de PEG no modificados. Se controló la glucemia de los animales y se consideró que los niveles de glucemia > 250 mg/dl durante dos mediciones diarias consecutivas, debían rechazarse. El ETGIP (ensayo de tolerancia a glucosa intraperitoneal) se realizó el día 200 después del trasplante después de un ayuno de 6 h utilizando 2 g/kg de solución de glucosa (25 %). Los niveles de glucemia se evaluaron mediante punción en la cola antes de la inyección y 10, 20, 30, 60, 90, 120 minutos después de la inyección. Los datos se representaron gráficamente utilizando GraphPad Prism y para determinar la significación estadística entre los grupos, se utilizó la prueba del orden logarítmico, se consideró quep<0,05era un valor significativo.
Monitorización inmunitaria.El bazo, los riñones y los ganglios linfáticos que drenan los riñones, se extirparon de ratones rechazadores y de largo plazo (> 200 días). Mediante dispersión mecánica suave, se prepararon células individuales procedentes del bazo y de los ganglios linfáticos y mediante digestión con colagenasa se prepararon las procedentes del riñón que albergaba islotes. Las células se tiñeron usando anticuerpos (Ab) contra marcadores de la superficie celular (Ab CD4-Alexa 700, Ab CD8-APC-Cy7, Ab CD25-PE-Cy7 de Pharmingen, BD y Ab CD44-eFlour 450 y Ab CD62L-PerCP-Cy5.5 de eBioscience). La tinción intracelular de FoxP3 se llevó a cabo en células fijadas/permeabilizadas utilizando el conjunto de tampones de tinción del factor de transcripción FoxP3 (eBioscience). Los datos se recopilaron utilizando BD LSR II y se analizaron utilizando el programa informático Diva. Los datos se representaron gráficamente utilizando GraphPad Prism y para determinar la significación estadística entre los grupos, se utilizó la prueba t de Welch, se consideró quep<0,05era un valor significativo.
Ensayo de proliferación.Los esplenocitos recogidos de un grupo de receptores de trasplante seleccionado, se marcaron con CFSE y se usaron como respondedores a esplenocitos irradiados (2000 cGy) procedentes de ratones C3H donantes o de terceros en un ensayoin vitrode proliferación estándar. Véase E. S. Yolcuet al.,J Immunol,187: 5901-5909 (2011). Después de 4 días en cultivo, las células se tiñeron con 7AAD y Ab (anticuerpos) conjugados con fluorescencia contra CD4 y CD8, y se analizaron para determinar la dilución de CFSE seleccionando células vivas usando BD LSR II. Los datos se analizaron utilizando el programa informático Diva. Los datos se representaron gráficamente utilizando GraphPad Prism y para determinar la significación estadística entre los grupos, se utilizó la prueba t de Welch, se consideró quep<0,05era un valor significativo.
Microscopía confocal.Tras el período de observación de 200 días, los riñones portadores de islotes a largo plazo se congelaron instantáneamente en un compuesto de OCT (Sakura Tissue-Tek) sumergiéndolos en metilbutano (Sigma) sobre nieve carbónica. Los tejidos se cortaron en cortes histológicos de 10 jm de grosor utilizando un criomicrotomo Bright OTF5000 (Rose Scientific) y para teñirlos se colocaron en portaobjetos esmerilados. Los portaobjetos se fijaron en paraformaldehído al 4 %, se incubaron en Triton X-100 al 0,5 % y se bloquearon en seroalbúmina bovina al 0,1 %, suero de cabra al 5%y anticuerpo CD16/CD32 de rata anti-ratón (BD Pharmingen). La tinción se realizó utilizando, como anticuerpos primarios, anticuerpo monoclonal (mAb) anti-glucagón de conejo (Cell Signaling) y anticuerpo policlonal anti-insulina de conejillo de indias (Dako), seguido de lavado y tinción con anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con AlexaFluor-647 (Life Technologies) y anticuerpo anti-conejillo de indias conjugado con AlexaFluor-555 (Invitrogen). Para teñir el ADN, se utilizó Hoechst 33342 (Molecular Probes). Las imágenes fluorescentes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal Leica TCS SP5 con un aumento de 10X.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un biomaterial diseñado para presentar una proteína FasL, en donde el biomaterial es un hidrogel, en donde el hidrogel comprende una proteína FasL quimérica que comprende un resto de FasL y un resto de estreptavidina o avidina conjugado al hidrogel a través de biotina.
2. El biomaterial de la reivindicación 1, en donde el hidrogel es un microgel.
3. El biomaterial de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el hidrogel es un microgel de polietilenglicol (PEG) diseñado para presentar un resto de biotina.
4. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el resto de FasL es una proteína FasL resistente a metaloproteinasas de la matriz.
5. El biomaterial de la reivindicación 1, en donde el biomaterial comprende además un fármaco inmunosupresor.
6. El biomaterial de la reivindicación 5, en donde el fármaco inmunosupresor es rapamicina.
7. El biomaterial de la reivindicación 1, en donde el biomaterial comprende además una célula de injerto.
8. El biomaterial de la reivindicación 7, en donde la célula de injerto está encapsulada por el biomaterial.
9. El biomaterial de la reivindicación 7, en donde la célula de injerto no está encapsulada por el biomaterial.
10. Un biomaterial diseñado para presentar una proteína FasL según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en la inducción de la tolerancia inmunitaria en un sujeto que lo necesite.
11. El biomaterial para su uso según la reivindicación 10, en donde el hidrogel se trasplanta al sujeto.
12. El biomaterial para uso según la reivindicación 10 junto con un fármaco inmunosupresor, opcionalmente en donde el fármaco inmunosupresor es rapamicina.
13. El biomaterial para su uso según la reivindicación 10, en donde el sujeto es un ser humano, un primate no humano, un cerdo, un perro, un gato, una vaca, una oveja, un caballo, un conejo, un ratón o una rata.
14. El biomaterial para su uso según la reivindicación 10, en donde el sujeto necesita tolerancia inmunitaria en una célula de injerto, opcionalmente en donde al sujeto se le administra una célula de injerto, opcionalmente en donde el biomaterial comprende además la célula de injerto, opcionalmente en donde la célula de injerto está encapsulada por el biomaterial, opcionalmente en donde la célula de injerto se selecciona de PBMC, células de médula ósea, células madre hematopoyéticas, células madre, células madre mesenquimatosas, células dendríticas, células dendríticas pulsadas con autoantígenos, productos de células beta humanas y esplenocitos.
15. El biomaterial para su uso según la reivindicación 10, en donde el sujeto necesita tolerancia inmunitaria en una célula de injerto, opcionalmente en donde al sujeto se le administra una célula de injerto en donde la célula de injerto no está encapsulada por el biomaterial, opcionalmente en donde la célula de injerto se selecciona de PBMC, células de médula ósea, células madre hematopoyéticas, células madre, células madre mesenquimatosas, células dendríticas, células dendríticas pulsadas con autoantígenos, productos de células beta humanas y esplenocitos.
16. El biomaterial para su uso según la reivindicación 10, en donde el sujeto necesita tratamiento para la diabetes tipo 1, opcionalmente en donde al sujeto se le administran células de los islotes pancreáticos.
17. El biomaterial para su uso según la reivindicación 10, en donde el sujeto necesita tratamiento o prevención de rechazo de aloinjerto, opcionalmente en donde al sujeto se le administran células de un donante de aloinjerto.
18. El biomaterial para su uso según la reivindicación 10, en donde el sujeto necesita tratamiento o prevención de rechazo de xenoinjerto, opcionalmente en donde al sujeto se le administran células de un donante de xenoinjerto, opcionalmente en donde el donante del xenoinjerto es un ser humano, un primate no humano, un cerdo, un perro, un gato, una vaca, una oveja, un caballo, un conejo, un ratón o una rata.
19. El biomaterial para su uso según la reivindicación 10, en donde el sujeto necesita tratamiento o prevención de rechazo de autoinjerto, opcionalmente en donde al sujeto se le administran células de injerto autólogas, opcionalmente en donde las células de injerto autólogas se obtienen mediante pluripotencia inducida.
20. El biomaterial para su uso según la reivindicación 10, en donde el sujeto necesita tratamiento o prevención de autoinmunidad, opcionalmente en donde al sujeto se le administra un autoantígeno presentado en una célula seleccionada de (i) una célula que expresa el autoantígeno (ii) una célula que lleva el autoantígeno y (iii) una célula dendrítica pulsada con el autoantígeno.
21. Un método para fabricar un biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende poner en contacto un biomaterial biotinilado con una proteína FasL quimérica que comprende un resto de FasL y un resto de estreptavidina o avidina.
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