CN110494045A - 将无脊椎动物转化为饲料的方法 - Google Patents

Abstract

使用微生物发酵将无脊椎动物转化为饲料的方法及其产物。

Description

将无脊椎动物转化为饲料的方法

技术领域

本发明涉及由无脊椎动物获得一种或多于一种饲料的领域。特别地，本发明涉及一种利用微生物发酵将无脊椎动物转化为一种或多于一种饲料的方法，并且涉及该方法的产物。

背景技术

无脊椎动物作为动物食物来源并用于将废有机生物质转化为无脊椎动物生物质的用途是已知的。出于营养物质转化和/或提取的目的而加工无脊椎动物也是众所周知的。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种将无脊椎动物转化为饲料的方法，包括：

(a)对无脊椎动物进行穿孔和/或提取；

(b)将固体无脊椎动物组分与液体无脊椎动物组分分离；

(c)任选地将液体无脊椎动物组分分离为脂质部分和非脂质部分；

(d)产生一种或多于一种生长培养基，其中所述生长培养基包含固体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂；液体无脊椎动物组分或其部分和任选地一种或多于一种添加剂；或固体和液体无脊椎动物组分和可选的一种或多于一种添加剂；或者所述生长培养基由固体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂组成；由液体无脊椎动物组分或其部分和任选地一种或多于一种添加剂组成；或由固体无脊椎动物组分和液体无脊椎动物组分和可选的一种或多于一种添加剂组成；

(e)使一种或多于一种生长培养基经历微生物发酵；

(f)抑制或终止微生物发酵；

其中微生物发酵作为两步或多于两步的过程进行。

在一些实施方案中，该方法还包括在给无脊椎动物穿孔和/或提取之前，对无脊椎动物进行洗涤、拣选(culling)和巴氏灭菌的一个或多于一个步骤。

在一些实施方案中，使用细菌、真菌和古细菌界的一种或多于一种成员进行微生物发酵。

在一些实施方案中，使用乳杆菌(Lactobacilliale)、芽孢杆菌(Bacilliale)、双歧杆菌(Bifidobacteriale)、红螺菌(Rhodospirillale)、酵母(Saccharomycetale)或散囊菌(Eurotiale)目中的一种或多于一种进行微生物发酵。

在一些实施方案中，使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、枯草芽孢杆菌纳豆变种(Bacillus subtilis var.natto)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)、产朊假丝酵母(Candidautilis)或米曲霉(Aspergillus oryzae)中的一种或多于一种进行微生物发酵。

在一些实施方案中，液体无脊椎动物组分被分离为脂质和非脂质部分。

在一些实施方案中，包含液体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂、或包含液体组分的非脂质部分和任选地一种或多于一种添加剂、或由其组成的生长培养基经历第一发酵步骤，然后经历第二发酵步骤。

在一些实施方案中，使用以下生长培养基进行第一发酵步骤：该生长培养基包含固体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂或由其组成；使用以下生长培养基进行第二发酵步骤：该生长培养基包含液体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂或液体无脊椎动物组分的非脂质部分和任选地一种或多于一种添加剂或由其组成。

在一些实施方案中，将发酵混合物分离为脂质和非脂质部分。

在一些实施方案中，从过程中除去固体无脊椎动物组分、液体无脊椎动物组分的脂质部分、发酵的固体无脊椎动物组分或液体无脊椎动物组分的发酵的脂质部分中的一种或多于一种。在一些这样的实施方案中，洗涤和过滤所除去的发酵的固体无脊椎动物组分，并且在一些实施方案中，滤液返回到过程中，用作或添加到微生物发酵用的生长培养基。

在一些实施方案中，可以将第一发酵混合物和第二发酵混合物或其一个或多于一个部分合并，并且使所得混合物经历一个或多于一个发酵步骤。

在一些实施方案中，使用产酸微生物的种进行最终的发酵步骤。在一些实施方案中，使用醋酸菌或乳杆菌的种进行最终的发酵步骤。

在一些实施方案中，在第二发酵步骤和/或每个后续发酵步骤之前，将一种或多于一种添加剂添加到发酵混合物中。

在一些实施方案中，无脊椎动物是幼体、预蛹或蛹。

在一些实施方案中，无脊椎动物是蜕皮动物(Ectodysozoa)或冠轮动物(Ophotrochozoa)超门的成员。在一些实施方案中，无脊椎动物是黑水虻(Hermetiaillucens)。

根据本发明的第二方面，提供了由根据本发明的第一方面的方法获得的组合物。

附图简要说明

现在将参考附图仅以举例的方式描述本发明的实施方案，其中：

图1是示出了根据本发明的方法的流程图，该方法涉及一个阶段的发酵过程，其中生长培养基包含固体无脊椎动物组分、非脂质液体无脊椎动物组分和添加剂；

图2是示出了根据本发明的方法的流程图，该方法涉及两个阶段发酵过程，其中相继进行第一发酵步骤和第二发酵步骤：使用包含非脂质液体无脊椎动物组分和固体无脊椎动物组分的生长培养基进行第一发酵步骤；然后是第二发酵步骤，其使用包含来自第一发酵步骤的发酵混合物、液体无脊椎动物组分的非脂质部分和添加剂的生长培养基。

图3是示出了根据本发明的方法的流程图，该方法涉及一个阶段的发酵过程，其中生长培养基包含液体无脊椎动物组分或脂质组分的非脂质部分和添加剂；

图4是示出了根据本发明的方法的流程图，该方法涉及两个阶段发酵过程，其中相继进行第一发酵步骤和第二发酵步骤：使用包含液体无脊椎动物组分或液体组分的非脂质部分和添加剂的生长培养基进行第一发酵步骤；然后是第二发酵步骤，其使用包含来自第一发酵步骤的发酵混合物、或来自第一发酵步骤的发酵混合物的非脂质部分和添加剂的生长培养基。

图5是示出了根据本发明的方法的流程图，该方法涉及三个阶段发酵过程，其中平行进行第一发酵步骤和第二发酵步骤：使用包含液体无脊椎动物组分或液体组分的非脂质部分和添加剂的生长培养基进行第一发酵步骤；使用包含固体无脊椎动物组分和添加剂的生长培养基进行第二发酵步骤。然后将第一和第二发酵混合物和/或其一个或多于一个部分(例如液体发酵混合物的发酵的非脂质部分；和/或由固体发酵混合物的洗涤和过滤得到的滤液)合并，使所得混合物经历第三发酵步骤。

图6是SDS-PAGE结果，其示出了根据本发明制备的并经历根据本发明微生物发酵的生长培养基的部分蛋白水解。

详细描述

***粮食及农业组织估计，要养活2050年的全世界人口，同期将需要增加70％的粮食产量。为了满足这一需求，需要在农业领域采取新的方法，挑战包括解决粮食浪费问题；并确保充足和可持续的富含蛋白的动物饲料来源。

每年生产的所有粮食中有超过三分之一被浪费，全球浪费了超过13亿吨的食物，每年造成的价值损失达8000亿英镑。据估计，垃圾填埋场中的食物垃圾通过生成甲烷而贡献了全球温室气体排放量的10％。许多增值(专业术语意指旨在从废物中回收、再利用或再循环有用产品或能源的过程)方法不能从此类废物(例如堆肥)中获取很多价值，而厌氧消化(AD)等方法则依赖前期手续费、政府支持和同类饲料投入才能有效运作。两种方法都不能保留食物垃圾中捕获的营养价值，而是将捕获的能量转换为温室气体(垃圾填埋场)、低价肥料(堆肥，AD)或最好转换为热和电(AD)。

无脊椎动物的生物催化是有吸引力的选择。一些无脊椎动物物种能够消耗各种生物质，包括食物垃圾，并且能够以优异的转化效率将消耗的营养物质转化为无脊椎动物生物质。

此外，因为无脊椎动物，尤其是昆虫富含蛋白和/或脂肪，因此使用无脊椎动物，尤其是昆虫作为食物来源受到关注。但是，许多无脊椎动物的体型较小，需要有效的处理过程才能提取和回收营养物质。

已知为了营养物质转化和/或提取，将加工过的无脊椎动物或昆虫进行进一步处理。WO2013/191548涉及一种涉及压碎或挤压昆虫或蠕虫的方法；使用蛋白酶使浆料经历酶水解；通过加热结束水解步骤；然后将混合物分成几部分，以干燥形式直接用作饲料饲料，或用于进一步加工。然而，酶促水解的使用具有局限性，因为这些酶需要事先在专门的植物中进行合成和能量密集的纯化，这可能是昂贵的，特别是如果需要多种酶的话；酶的储存通常需要特殊的条件，例如低温，这可能将其使用限制在可以进行适当储存的地点例如发达国家，和/或增加成本。另外，酶是不可再生的，因为单个酶不能自身产生新的实体，这意味着需要持续供应新的酶来维持生产。

向动物饲料中添加被认为有助于消化和/或健康的组合物也引起关注，例如益生菌，其被认为例如通过产生次级代谢物或与潜在的病原菌肠道群竞争来改善动物的微生物组。WO2010/033714公开了提供包含枯草芽孢杆菌的组合物。但是，这些组合物没有或几乎没有热值，可能很昂贵，并且将它们添加到饮用水或饲料中可能很耗时。

现已发现，在特定条件下无脊椎动物底物的微生物发酵可产生的动物饲料具有提高的营养特性、化学特性、生物学特性、抗氧化特性、免疫原性和/或益生菌特性中的一种或多于一种。

“饲料”是指动物食物或动物食物的组分。

因此，在本发明的第一方面，提供了一种将无脊椎动物转化为一种或多于一种饲料的方法，包括对无脊椎动物进行穿孔和/或提取；将固体无脊椎动物组分与液体无脊椎动物组分分离；任选地将液体无脊椎动物组分分离为脂质和非脂质部分；产生一种或多于一种生长培养基，其中所述生长培养基包含固体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂；液体无脊椎动物组分或其部分和任选地一种或多于一种添加剂；或固体和液体无脊椎动物组分和任选的一种或多于一种添加剂；或者由固体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂组成；由液体无脊椎动物组分或其部分和任选地一种或多于一种添加剂组成；或由固体无脊椎动物组分和液体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂组成，对一种或多于一种生长培养基进行微生物发酵；抑制或终止微生物发酵；其中微生物发酵以两步或多于两步过程进行。

在一些实施方案中，选择在工业过程中具有使用潜力的无脊椎动物。例如，可以因为在工业过程中易于使用和/或它们能够在短时间内将诸如废弃食物之类的废物转化为生物质而选择无脊椎动物。

在一些实施方案中，可以选择合成或表达特定生物材料的无脊椎动物。例如，蜕皮动物(Ecdysozoa)进化枝的成员通常在内部合成脂质，和/或具有由几丁质组成的角质层或外骨骼。

在一些实施方案中，无脊椎动物是蜕皮动物或冠轮动物(Lophotrochozoa)超门的成员。在一些实施方案中，无脊椎动物是节肢动物或环节动物。在优选实施方案中，无脊椎动物是节肢动物。在优选的实施方案中，无脊椎动物是六足动物亚门的成员。在一些优选的实施方案中，所述无脊椎动物是黑水虻(Hermetia illucens)、黄粉虫(Tenebriomolitor)、蜡螟(Galleria mellonella)、黑菌虫(Alphitobius diaperinus)、大麦虫(Zophobas morio)、Blaberus fusca、Blaptica dubia、家蝇(Musca domestica)、大头金蝇(Chrysomya megacephala)、飞蝗(Locusta migratoria)、沙漠蝗(Schistocercagregaria)、家蟋(Acheta domesticus)或樗蚕(Samia ricini)的一种或多于一种。

术语“无脊椎动物”、“蜕皮动物”、“冠轮动物”、“节肢动物”，“环节动物”和“六足动物”涵盖了这些类别中处于任何发育阶段的生物体，例如成虫、幼体、预蛹或蛹。

在优选的实施方案中，无脊椎动物是幼体、预蛹和/或蛹。在更优选的实施方案中，无脊椎动物是黑水虻(亮斑扁角水虻)幼体、预蛹和/或蛹。

生长

在一些实施方案中，向无脊椎动物提供控制温度和大气的环境。这样的环境有助于最佳的生长和繁殖。在一些实施方案中，为成年无脊椎动物提供合适的环境以用于产卵、卵孵化以及在一些实施方案中化蛹。在一些实施方案中，向无脊椎动物提供食物底物。在一些实施方案中，食物底物是可食用有机废物。在这样的一些实施方案中，废物是农业和/或食物废物。作为实例，可以向成年家蟋提供控制温度和大气的环境和/或食物底物和/或用于产卵和卵孵化的合适环境。作为替代示例，可以为成年的黑水虻提供控制温度和大气的环境和/或用于产卵以及卵孵化和化为蛹的合适环境。可以为所得的幼体提供温度和大气受控的环境和/或食物底物，例如农业废物。

收获

可以在合适的发育阶段收获无脊椎动物。例如，在无脊椎动物的脂质、蛋白质或几丁质组分中的一种或多于一种最佳的阶段。在一些实施方案中，这可以是预蛹或蛹阶段。在一些实施方案中，收获可发生在第五或第六龄期。可以使用任何合适的收获方法，例如自收获；或通过合适的方法例如筛分从化蛹底物分离。

在一些实施方案中，无脊椎动物以连续方式生长和收获，例如，可以仅收获一部分幼体，以留下足够的数量以发育至成年、交配和产卵，从而使该***持续存在。

处理：拣选和/或清洗

在一些实施方案中，例如通过冷冻，例如浸入冷冻水浴中冷冻来拣选收获的无脊椎动物。在一些实施方案中，将无脊椎动物在水溶液中洗涤，以除去碎屑和表面污染物。可以将水溶液作为浴应用于无脊椎动物。在一些实施方案中，水溶液是水、或盐水溶液、或弱消毒溶液例如0.1％至1％的NaClO。水溶液可以具有约-4℃至约100℃的温度或保持在约-4℃至约100℃的温度。可以应用或使用(例如低于8℃的)***液同时拣选和洗涤无脊椎动物。使用具有较高温度或保持在较高温度(例如，至少70℃)的溶液可以帮助无脊椎动物进行巴氏灭菌或部分巴氏灭菌。

在一些实施方案中，对无脊椎动物进行处理以有利于之后的提取。可以使用任何合适的方式来调动无脊椎动物的脂质和/或蛋白含量，例如超声处理/高压处理或脉冲电场处理。该处理可以在拣选和/或洗涤阶段之后或同时进行。

在一些实施方案中，然后将无脊椎动物加热。这可以使用任何合适的方式来实现，例如，使用蒸汽烘箱或巴氏灭菌烘箱，其中使无脊椎动物在传送带上穿过烘箱；使用高压灭菌器或替代的高压技术；或使用热水浴。温度和加热时长取决于期望结果。无脊椎动物的加热可以帮助内部脂肪液化，从而帮助其后续提取。无脊椎动物的加热还可以抑制或防止在后续处理过程中无脊椎动物的一种或多于一种组分的氧化。在一些优选的实施方案中，可以使用加热对无脊椎动物进行巴氏灭菌或灭菌，这是有益的，因为这可以防止或减少微生物污染和/或减少在之后的过程和/或发酵中无脊椎动物或无脊椎动物组分的氧化。在一些实施方案中，将无脊椎动物加热到至少75℃的核心温度。在优选的实施方案中，将无脊椎动物加热到至少95℃的核心温度。

在替代实施方案中，使用其他合适的方式，例如用紫外线和/或γ射线照射，或使用食品加工高压技术，来实现对无脊椎动物的巴氏灭菌或灭菌。

在对收获的无脊椎动物进行巴氏灭菌或灭菌的一些实施方案中，该方法的所有后续阶段均在清洁、食品级或无菌环境中和/或在清洁、食品级或无菌条件下进行。

加工：穿孔和/或提取

在一些实施方案中，无脊椎动物经历穿孔和/或提取步骤。在一些实施方案中，穿孔和/或提取有助于或实现无脊椎动物的液体组分与无脊椎动物的固体组分的分离。

穿孔涉及无脊椎动物外表面或外骨骼的破裂，并有助于提取无脊椎动物的液体组分。可以使用合适的穿孔设备例如大头针机(例如，可从Perforation Machinery有限公司(http：//www.perforationmachinery.com)获得)或对无脊椎动物进行刻划的动叶片来实现穿孔。在一些实施方案中，每个无脊椎动物接受至少一个穿孔。

提取涉及无脊椎动物的液体组分的排出，并且可以通过任何合适的机械方式例如液压机或辊压机来实现。或者，可以通过合适的非机械方式例如使用超临界CO₂或涉及己烷提取的方法来实现提取。

在一些优选的实施方案中，穿孔和提取作为单个步骤进行。在一些实施方案中，提取无脊椎动物的方式也实现了无脊椎动物的穿孔(反之亦然)。可以使用任何合适的方式来实现经组合的穿孔和提取。例如，使用压碎或挤压无脊椎动物的方式来实现外骨骼的破裂和内容物的排出。在一些实施方案中，用于对无脊椎动物穿孔和/或提取的方式实现无脊椎动物的液体组分与无脊椎动物的固体组分的高水平分离。在一些实施方案中，用于穿孔和/或提取无脊椎动物的方式使至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的无脊椎动物的液体组分与无脊椎动物的固体组分分离。在一些实施方案中，用于对无脊椎动物穿孔和/或提取的方式使约80％、85％、90％、95％或98％的无脊椎动物的液体组分与无脊椎动物的固体组分分离。在一些实施方案中，使用压力机例如液压机来实现穿孔和提取的组合。

在一些实施例中，穿孔和/或提取是在无脊椎动物根据加热步骤中仍然温热时进行的，因为这最小化或避免了液体组分的固化。在一些实施方案中，在对无脊椎动物穿孔和/或提取期间的核心温度保持在高于约35℃。在优选的实施方案中，在穿孔和/或提取过程中将无脊椎动物的核心温度保持在高于50℃。

在一些实施方案中，穿孔和/或提取对于包含大量脂肪含量和/或大量几丁质含量的无脊椎动物是有用的。例如，黑水虻幼体或粉虫。对于一些较低的脂肪和/或几丁质含量的无脊椎动物(例如蟋蟀)的穿孔和/或提取可以是任选的。

在一些实施方案中，将提取的无脊椎动物的液体组分与固体无脊椎动物组分分离并对其进行收集。

固体组分通常包括无脊椎动物的几丁质外骨骼、以及尚未提取的任何残留的蛋白和/或油。在一些实施方案中，残留的蛋白和/或油含量小于固体组分的约30％。在优选的实施方案中，残留的蛋白和/或油含量小于固体组分的约15％。在一些实施方案中，残留的油含量小于固体组分的约20％。在优选的实施方案中，残留的油含量小于固体组分的约10％。

在一些实施方案中，然后使用任何合适的方式，例如均化器、搅拌器或切碎机，将固体组分均质化。在一些实施方案中，均质化使固体组分的粒度小于约20mm、小于约15mm、小于约10mm、小于约5mm、小于约3mm、小于约2mm、或小于1mm。

在一些实施方案中，将固体组分从过程中除去，例如用于替代过程中。这可能是有益的，因为发酵微生物倾向于在包含高几丁质含量的底物上表现不佳。在一些这样的实施方案中，可以通过例如巴氏灭菌、灭菌、煮沸或干燥的热机械方式；通过进一步减小粒度；或通过化学手段，例如酶促、酸或碱水解进一步加工除去的固体组分。

液态无脊椎动物组分通常包含血淋巴、油和残余的几丁质。“血淋巴”是本领域已知的术语，是指在无脊椎动物体内循环的流体。它通常包括液体血浆、蛋白、血细胞、氨基酸、无机盐和代谢终产物。

在一些实施方案中，液体组分被分离成部分。在一些实施方案中，液体组分被分离为脂质和非脂质部分。这可以通过任何合适的方式来完成，例如通过使用重力和/或温度，例如使用离心机；或温度辅助重力分离，例如，可以将液体组分冷冻，直到其沉降成之后可以被分离的部分(脂质部分通常会凝固，而非脂质部分仍为液体，可以将其除去)。液体组分的非脂质部分通常包含血淋巴和残留的几丁质。

在无脊椎动物的脂肪含量高(高于大约10％脂肪(干物质重量)；例如，黑水虻幼体)的一些实施方案中，在穿孔和/或提取期间，由于脂肪乳化的可能性很高，因此将液体组分分离成多个部分可能具有挑战性。在一些这样的实施方案中，可以在一个或多于一个发酵步骤之后，通常当分离由于液体无脊椎动物组分的非脂质部分的部分水解而更容易时，将液体无脊椎动物组分分离成部分。

在一些实施方案中，将液体组分的一个或多于一个部分浓缩和/或干燥。在一些实施方案中，将液体组分的非脂质部分浓缩和/或干燥。在一些实施方案中，可以除去液体无脊椎动物组分的脂质部分以用于替代方法中，这可能是有益的，因为发酵微生物倾向于在脂肪底物上表现得较差。

在一些实施方案中，可将液体无脊椎动物组分的一个或多于一个部分加回到固体无脊椎动物组分中；或者可以将固体无脊椎动物组分添加到液体无脊椎动物组分的一个或多于一个部分中。在一些实施方案中，将液体组分的非脂质部分加回到固体组分中，或将固体无脊椎动物组分添加到液体组分的非脂质部分中。

然后一种或多于一种无脊椎动物组分可以在发酵过程中使用。

发酵

本文中的“发酵”是指生长培养基的微生物转化。

生长培养基包含无脊椎动物底物和任选地一种或多于一种添加剂或由其组成。

“无脊椎动物底物”是指由上述任何加工步骤得到的一种或多于一种产物。例如，无脊椎动物底物可以包括以下组分或由以下组分组成：收获的无脊椎动物；收获并拣选的无脊椎动物；收获、拣选和清洗的无脊椎动物；进一步进行了巴氏灭菌步骤、穿孔和/或提取步骤中的一个或多于一个的收获、拣选和清洗的无脊椎动物；固体无脊椎动物组分；液体无脊椎动物组分；液体无脊椎动物组分的一个或多于一个部分；或其任何组合。

在一些实施方案中，无脊椎动物底物包含固体无脊椎动物组分、脂质无脊椎动物组分或非脂质液体无脊椎动物组分或其组合，或由其组成。在一些实施方案中，无脊椎动物底物包含巴氏灭菌的固体无脊椎动物组分、巴氏灭菌的液体无脊椎动物组分或巴氏灭菌的非脂质液体无脊椎动物组分或其组合，或由其组成。在一些优选的实施方案中，无脊椎动物底物包含液体无脊椎动物组分或由其组成。在一些优选的实施方案中，无脊椎动物底物包含巴氏灭菌液体无脊椎动物组分或由其组成。

在一些实施方案中，无脊椎动物底物以特定比例包含不同的无脊椎动物组分或由其组成。例如，可以将一定量的固体无脊椎动物组分加入到一定量的液体无脊椎动物组分中，或液体组分的非脂质部分中，反之亦然。在一些实施方案中，可以将一定量的固体无脊椎动物组分添加到主要由液体无脊椎动物组分或液体组分的非脂质部分组成的无脊椎动物底物中。在一些实施方案中，无脊椎动物底物包含无脊椎动物组分的固体：液体或非脂质部分的比例为约0.1％：99.9％(固体组分：液体或液体无脊椎动物组分的非脂质部分)至5％：95％(固体组分：液体或液体部分的非脂质部分)；或为约2.5％：97.5％的无脊椎动物组分的固体组分：液体或非脂质部分至1％：99％的液体无脊椎动物组分的固体组分：液体或非脂质部分。

添加剂

在一些实施方案中，生长培养基还包含一种或多于一种添加剂。可以使用被认为或已证明不对人类、动物和/或环境构成健康或安全威胁的添加剂。

可以出于特定目的或为了实现特定结果或产品而选择添加剂。例如，可以选择在特定方向上驱动发酵的添加剂。例如，可以将包含一种或多于一种简单糖(例如蔗糖、葡萄糖和/或糖蜜)的添加剂添加到将要添加乳杆菌的无脊椎动物底物中，以通过用作乳杆菌的营养来源来帮助快速启动乳酸产生。或者或另外，可以选择添加剂以优化发酵过程和/或定制所得产物，例如根据产物的营养价值或其他益处选择添加剂。例如，一些无脊椎动物底物的碳水化合物含量低，特别是构成优选的微生物发酵底物的碳水化合物例如淀粉或糖含量低。添加富含碳水化合物的添加剂可以增强发酵：富含碳水化合物的添加剂可以充当微生物的营养源；可以构成微生物发酵的优选底物；可以刺激微生物产生分解碳水化合物的酶，例如淀粉酶；和/或可以包含蛋白，因此可以作为生长培养基/最终产物中蛋白的额外来源(例如小麦胚芽)。在一些实施方案中，添加剂可以是一种或多于一种简单糖(例如，蔗糖、葡萄糖、糖蜜)；和/或一种或多于一种复杂碳水化合物的来源(例如麸、谷物细粉、米糠或小麦胚芽)。

在一些实施方案中，选择可以增强发酵过程的添加剂，例如维生素，例如维生素B。在一些实施方案中，添加剂可以提供限速微生物水解反应的一种或多于一种组分的来源。在一些实施方案中，添加剂可包含化学诱导物，其在包含于生长培养基中的转基因微生物中表达转基因基因座。

添加剂可以按无脊椎动物底物的约5重量％至约85重量％的量添加到无脊椎动物底物中。在一些实施方案中，将添加剂以无脊椎动物底物的约5重量％、约7.5重量％、约10重量％、约15重量％、约20重量％、约25重量％、约30重量％、约40重量％、约45重量％、约50重量％、约55重量％、约60重量％、约65重量％、约70重量％、约75重量％或约80重量％的量添加至无脊椎动物底物中。

在一些实施方案中，一种或多于一种添加剂是水合的。在一些实施方案中，添加剂水合至约10体积/重量％至80体积/重量％；约20体积/重量％至80体积/重量％；约30体积/重量％至75体积/重量％；约40体积/重量％至75体积/重量％；优选约50体积/重量％至70体积/重量％，更优选约50体积/重量％的总水合度。例如，将10ml流体添加到10g干添加剂中将产生50％的水合添加剂。可以使用水和/或营养溶液例如液体无脊椎动物组分或液体无脊椎动物组分的非脂质部分实现水合。

在一些实施方案中，使用液体无脊椎动物组分的非脂质部分实现水合；在一些优选的实施方案中，使用液体无脊椎动物组分实现水合。液体无脊椎动物组分或其非脂质部分的使用可能是有益的，因为其可以减少从期望具有低的或最小水分含量的所得最终产品中除去水的需求。

在一些实施方案中，用于水合的液体是经巴氏灭菌的或无菌的。在一些实施方案中，添加剂是经巴氏灭菌的或无菌的。在优选的实施方案中，用于水合的液体和添加剂是经巴氏灭菌的或无菌的。添加剂可以以预先灭菌的形式从商业来源获得，或通过任何合适的方式灭菌，例如通过蒸汽烘箱或高压釜灭菌。

可以使用任何合适的方式混合生长培养基。

pH

在一些实施方案中，确定生长培养基的pH。通常，包含无脊椎动物底物，例如包含黑水虻幼体的一种或多于一种组分的昆虫底物的生长培养基的pH为弱碱性(例如7.6至8.3)。

生长培养基的pH会影响发酵过程：一些微生物在碱性条件下表现更好，而一些微生物在酸性条件下表现更好。例如，对于使用枯草芽孢杆菌纳豆变种的芽孢杆菌属的种的发酵，弱碱性条件(例如7.5至8.9)是优选的。相反，已显示出酸性条件(5.5至6.9)已经显示出刺激使用乳杆菌的种例如植物乳杆菌的乳酸发酵。此外，一些微生物在不同的酸度/碱度条件下会产生不同的酶，例如米曲霉在酸性和碱性条件下均能发挥良好的功能，但在不同的pH条件下会产生不同的蛋白酶(Salihi,A.等人Int.J.Biological Macromolecules.(2017).94(B):827-835；De Castro,Ruann J.S和Sato,Hélia,H；J.Food Processing.(2014).Article ID:372352(http://dx.doi.org/10.1155/2014/372352)。

在一些实施方案中，改变生长培养基的pH。在一些实施方案中，根据要添加的微生物和/或根据发酵过程的期望结果来改变生长培养基的pH。例如，对于使用枯草芽孢杆菌纳豆变种的芽孢杆菌属的种进行发酵，可将生长培养基的pH调节至约7.5至约8.9；为了使用诸如植物乳杆菌的乳杆菌种发酵，可以将pH调节至约5.5至约6.9。可以通过添加任何合适的碱和/或酸，例如食品级酸如乙酸、乳酸或柠檬酸来调节pH。

微生物

将微生物添加到生长培养基中。可以使用用于实现期望的发酵结果的任何合适的微生物，并且可以将任何数量的微生物用于任何发酵步骤，例如，可以将单个微生物用于任何单个发酵步骤；例如，可以将单个微生物用于任何单个发酵步骤；或多于一种微生物(例如共培养物)可用于任何单个发酵步骤。可以根据获得特定结果或产物的能力来选择添加到生长培养基中的微生物。例如，添加枯草芽孢杆菌纳豆变种通常会导致聚谷氨酸(PGA)的产生。PGA可用作动物饲料中的絮凝剂和/或形成水合凝胶的材料，并且PGA已显示出可帮助动物吸收营养(Ho,G-H.等人,J.Chinese Chem.Soc.2006.53:1363-1384)。作为进一步的实例，添加乳杆菌的种通常通过产生有机酸(乳酸)来酸化由发酵产生的产物，其可以抑制产物内的病原体生长并减少分解和变质，从而延长产物的保存期限。

另外或或者，可以选择以下微生物来添加到生长培养基中，该微生物产生可以增强所得产物的营养物质含量的酶和/或产生能够提高所得产品营养含量的营养物和/或酸存在的发酵条件。例如，源自具体微生物的特定酶或酸可通过使饲料中的营养组分更易于获取和消化，从而提高其中将发酵产生的产物并入动物饲料中的饲料转化率。作为实例，曲霉属的种，尤其是米曲霉，产生消化酶例如蛋白酶、植酸酶、几丁质酶和淀粉酶，以及代谢物例如柠檬酸。作为另一个实例，酵母的种能够合成B族维生素。

可以使用野生型、转基因(GM)和/或重组微生物菌株。在使用GM微生物的实施方案中，可以选择与野生型微生物相比提供一种或多于一种益处，或克服与野生型相关的一种或多于一种缺点的GM微生物。例如，可以使用基因组经过改变以产生高价值营养物质的微生物，例如ω-3脂肪酸，如二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA)(Amiri-Jamie等人Appl Microbiol Biotechnol.2014.98(7):3071-80)。具有一定特性的微生物可通过对其基因组进行修饰来增强，以实现其他酶的分泌。例如，如上所述，典型地酸化发酵产物的乳杆菌的种可通过修饰其基因组来增强以实现一种或多于一种酸性外切蛋白酶的分泌而被增强。因此，这种GM微生物可以执行多种生物体的功能，从而减少需要添加到生长培养基中的微生物的数量。

可以使用被认为或已被证明对人类、动物和/或环境不构成健康或安全威胁的微生物(例如，被认证为公认安全(GRAS)的微生物，例如被认证为符合FDA规定的公认安全(GRAS)的微生物；或符合EFSA规定的合格安全推定(QPS))；和/或被认为对人类、动物或环境提供或产生有益作用的微生物。

微生物可以从商业来源获得和/或重新分离并表征。可以在任何合适的培养基上培养微生物，例如确定的微生物生长培养基，例如Luria肉汤(LB)；de Man、Rogosa和Sharpe培养基(MRS)；或酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基(YPD)。

在一些实施方案中，微生物是细菌、真菌和古细菌界中的一种或多于一种的成员。

在一些实施方案中，微生物是细菌。在一些实施方案中，微生物是乳杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌或红螺菌目中的一个或多于一个成员。在一些优选的实施方案中，细菌是枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌纳豆变种、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌或两歧双歧杆菌中的一种或多于一种。表A提供了可用于本发明的细菌的一些实例。

在一些实施方案中，微生物是真菌，包括酵母。在一些实施方案中，真菌是酵母菌目和散囊菌目的一个或多于一个成员。在优选的实施方案中，真菌是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母、红发夫酵母、产朊假丝酵母或米曲霉中的一种或多于一种。表B提供了可用于本发明的真菌和酵母的一些实例。

在一些实施方案中，可以使用微生物的组合。使用组合的目的可能是实现发酵方面的特定结果。例如，使用高度蛋白水解的菌株，例如枯草芽孢杆菌纳豆变种或米曲霉与植物乳杆菌一起会产生酸性、富含蛋白酶的发酵环境，这将产生保质期延长的富含蛋白质的稳定的发酵产物。

在一些实施方案中，将粉末和/或丸状形式的微生物添加至生长培养基。或者或另外，可以将微生物的活性培养物添加至生长培养基。

可以根据期望的发酵速度来选择添加到生长培养基中的微生物的浓度。与在相同条件下，与使用较低补充率进行的发酵相比，初始接种物的较高补充率(例如，每克生长培养基的浓度为1×10⁵至1×10⁶微生物)通常可在更短的时间内实现期望发酵结果。

在其中使用活性微生物培养物进行接种的一些实施方案中，可以使用0.01重量/重量％至10重量/重量％(0.1g/kg至100g/kg的生长培养基)的补充率。在使用浓度为每克约1×10⁷至约1×10¹⁰的细菌、真菌或古细菌的浓缩粉末、团粒或孢子的情况下，可以使用的补充率为0.01重量/重量％至1重量/重量％(0.1g/kg至10g/kg生长培养基)。

在将液体细菌或真菌原液以每克约1×10⁵个细胞/cfu至约1×10⁸个细胞/cfu的浓度添加至生长培养基的实施方案中，可以使用约1重量/重量％至约10重量/重量％的补充率。

在一些实施方案中，可以将先前的培养物添加至生长培养基(例如，先前在发酵过程中或用于发酵过程的培养物，其已经被繁殖和/或保持——类似于面包师保存母酵母培养物的方式)。这种培养物的微生物含量可以根据储存条件以及用于初始培养物的微生物的类型和数量而变化。在一些这样的实施方案中，可以使用5重量/重量％至10重量/重量％的补充率(每kg生长培养基50g至100g的母培养物)。

在优选的实施方案中，使用的补充率导致每g生长培养基的微生物浓度为约1×10²个至约1×10⁶个微生物。

在一些实施方案中，将微生物培养物在添加至生长培养基之前进行离心，例如以从微生物接种物生长培养基中分离微生物生物质。

在优选的实施方案中，将生长培养基和微生物混合。

发酵条件

任何合适的容器均可用于发酵，例如由不锈钢、塑料、玻璃或木材制成的反应桶；或加湿室。合适的容器可以取决于发酵的物理状态。例如，当发酵包含液体的底物，例如包含液体无脊椎动物组分或由其组成的生长培养基时，可以使用由不锈钢、塑料或玻璃制成的反应桶和/或袋；然而，当发酵固体或基本上固体的底物，例如包含固体无脊椎动物组分或由其组成的生长培养基时，可以在加湿室中使用由不锈钢、塑料、玻璃或木材制成的容器。

选择的发酵类型取决于生长培养基的性质、所使用的发酵微生物和/或发酵过程的期望结果。

在生长培养基是固体或基本固体的实施方案中，发酵可以是固态发酵。在生长培养基是液体或基本上液体的实施方案中，发酵可以是液态(或液体浸没)发酵。

在一些实施方案中，选择的发酵类型取决于要使用的发酵微生物。例如，一些微生物(例如米曲霉)在固态发酵中表现更好，而其他微生物(例如乳杆菌的种)在液态发酵中表现更好。“表现更好”是指微生物在较短的时间内达到期望的发酵结果。

在发酵开始时，待进行发酵的容器的内容物包括生长培养基和微生物。发酵开始后，容器还将包括一种或多于一种发酵产物。

如本文所用，术语“发酵混合物”是指发酵过程中容器的内容物。

为了优化发酵过程和/或定制最终产物，例如，根据产物的营养价值或其他好处，可以选择和/或控制发酵条件。在一些实施方案中，可以选择和/或控制以下一种或多于一种条件：温度、发酵混合物的pH、厌氧/好氧条件、孵育时间和发酵的抑制或终止。在一些实施方案中，可以在整个孵育过程中控制条件。在替代实施方案中，可以在孵育开始时选择特定条件。

在一些实施方案中，在孵育开始时，发酵混合物的温度为约4℃至约60℃。在一些实施方案中，在孵育过程中发酵混合物的温度保持为约4℃至约60℃。如果孵育时间较长，例如一周或长于一周，则可以使用低温，例如约4℃至16℃。

在一些实施方案中，可以根据所使用的微生物来选择在孵育开始时和/或在孵育期间所保持的发酵混合物的温度。表1提供了给定微生物的发酵混合物的优选温度范围的一些实例。

表1

在一些实施方案中，控制发酵容器的湿度。在一些实施方案中，相对湿度(RH)保持在高于约80％、高于约85％或高于约90％。

在一些实施方案中，孵育在有氧条件或微需氧条件下进行。在替代实施方案中，孵育在厌氧条件下进行。在一些实施方案中，可以根据所用微生物和/或期望的发酵产物来选择厌氧或有氧条件。例如，特定微生物，例如乳杆菌的种，优选厌氧条件。其他微生物，例如米曲霉和芽孢杆菌的种，优选有氧条件。这些条件的调节可以通过标准方法来实现，例如发酵混合物的通气(好氧)，或从反应器中排除空气和/或补充CO₂和/或氮气(厌氧)。

孵育时间取决于无脊椎动物底物的性质和类型、添加到生长培养基中的微生物以及发酵所得产物的期望特性。

在一些实施方案中，孵育时间为6小时至14天；更优选为6小时至7天。在一些实施方案中，发酵过程中包含作为微生物的米曲霉，孵育时间为约2天至5天。在一些实施方案中，发酵过程中包含作为微生物的乳杆菌的种，孵育时间为约12小时至3天。在一些实施方案中，仅作为发酵过程中的微生物使用枯草芽孢杆菌纳豆变种，孵育时间为72小时或少于72小时，更优选为48小时或少于48小时。在一些实施方案中，其中使用芽孢杆菌纳豆变种和米曲霉的组合作为发酵过程中的微生物，孵育时间可能为约24小时至108小时；或更优选约48小时至约96小时。

在一些实施方案中，监测发酵以建立以下的一种或多于一种：发酵混合物的温度或pH；蛋白水解程度；酶活性的程度；微生物数量；或代谢物含量。这些参数可以通过任何合适的方法来测量，例如可以使用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)；胃蛋白酶可消化性；酶活性测定(例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶)；基于HPLC的代谢物图谱(蛋白质、肽、氨基酸)；基于GC/MS的代谢物分析(脂肪酸、挥发性有机酸)；依赖培养物和不依赖培养物的微生物学方法(CFU平板计数、16S/基因特异性PCR、qPCR、测序)中的一种或多于一种来确定蛋白水解程度。

在一些实施方案中，在孵育过程中混合发酵混合物。在一些实施方案中，混合是连续的或基本上连续的。在替代的实施方案中，可以不时地搅拌发酵混合物，例如每小时搅拌一次或两次，例如每小时搅拌30秒。可以使用任何合适的混合方式，例如自适应连续混合器或用于液态发酵的叶片搅拌器。

一个阶段与两个或多于两个阶段的发酵过程

在一些实施方案中，发酵过程作为“一个阶段”过程进行，其中发酵在单个步骤中进行。例如，可以使用所有期望的微生物和/或包括所有期望的无脊椎动物组分的生长底物进行单个发酵步骤。在一些这样的实施方案中，生长培养基包括无脊椎动物底物，其包含固体无脊椎动物组分；液态无脊椎动物组分，或液态无脊椎动物组分的非脂质部分中的一种或多于一种或由其组成。在一些实施方案中，生长培养基包含无脊椎动物底物，其包含固体无脊椎动物组分和非脂质液体无脊椎动物组分或由其组成。

在替代实施方案中，发酵过程作为“两个或多于两个阶段”过程进行，其中进行两个或多于两个发酵步骤。在一些这样的实施方案中，使用不同的微生物和/或条件的发酵可以单独进行。或者或另外，不同生长培养基的发酵可以单独进行。例如，可以使生长培养基经历第一发酵步骤(例如使用特定的一种或多于一种微生物，和/或在特定条件下)，然后进行第二发酵步骤(使用例如不同的微生物或条件)。作为替代实例，可以将含有包含固体无脊椎动物组分或由其组成的无脊椎动物底物的生长培养基的发酵，与含有包含液体无脊椎动物底物或液体无脊椎动物组分的一种或多于一种部分或由其组成的无脊椎动物底物的生长培养基的发酵分开进行。可以顺序进行单独的发酵步骤(例如，可以对生长培养基进行第一发酵步骤，然后进行第二发酵步骤)。或者或另外，可以平行进行单独的发酵步骤，因为单独的发酵步骤可以在相同的时间或大约相同的时间开始或进行(例如，可以对包含特定无脊椎动物底物的生长培养基进行发酵步骤；同时可以使用包含替代的无脊椎动物底物的生长培养基进行单独的发酵步骤)。在“两个或多于两个阶段”的过程中，发酵混合物可以在发酵开始后的任何阶段合并。

一个或两个或多于两个阶段的发酵过程的选择可以取决于发酵混合物中包括的微生物的性质和类型以及所得产物的期望性质。例如，在期望使用优选有氧发酵条件的微生物和优选厌氧条件的微生物的情况下，可以使用两个或多于两个阶段的过程，涉及单独的厌氧和有氧发酵过程。例如，可以首先使用米曲霉或枯草芽孢杆菌纳豆变种对生长培养基进行有氧发酵；然后使用乳杆菌的种进行厌氧发酵。作为替代实例，可以使用米曲霉对包含无脊椎动物底物的生长培养基进行有氧发酵，所述无脊椎动物底物包含固体无脊椎动物组分或由其组成；可以使用乳杆菌的种对含有无脊椎动物底物的生长培养基单独进行厌氧发酵，所述无脊椎动物底物包括液态无脊椎动物组分或液态无脊椎动物组分的一个或多于一个部分或由其组成。两种发酵混合物可以在任何合适的点合并。

在涉及两个或多于两个阶段发酵过程的一些实施方案中，可以在一个或多于一个发酵步骤开始之前将添加剂或另外的添加剂加入发酵混合物中。可以出于特定目的或为了实现特定结果或产物来选择添加剂。例如，可以选择的添加剂能为微生物，特别是在之后的发酵步骤中使用的微生物提供营养源；刺激或增强微生物，特别是之后的发酵步骤中使用的微生物的生长；在之后的发酵步骤中刺激特定微生物代谢物的产生；和/或产生优选的发酵条件，特别是对于之后的发酵步骤中使用的微生物。在一些实施方案中，添加剂可以是一种或多于一种简单糖(例如，蔗糖、葡萄糖、糖蜜)；和/或一种或多于一种复杂碳水化合物来源(例如麸、谷类细粉、米糠或小麦胚芽)。

例如，可以使用米曲霉和生长培养基进行第一发酵步骤，所述生长培养基包含固体无脊椎动物组分、非脂质无脊椎动物组分和包含复杂碳水化合物的添加剂(例如麸、谷物细粉、米糠和/或小麦胚芽)或由其组成。第二发酵步骤可使用乳杆菌和生长培养基进行，所述生长培养基包含非脂质液体无脊椎动物组分和包含一种或多于一种简单糖(例如蔗糖、葡萄糖和/或糖蜜)的添加剂或由其组成。再例如，可以使用米曲霉和生长培养基进行第一发酵步骤，所述生长培养基包含固体无脊椎动物组分和包含复杂碳水化合物的添加剂(例如麸、谷物细粉、米糠和/或小麦胚芽)或由其组成。第二发酵步骤可使用乳杆菌和生长培养基进行，所述生长培养基包含液体无脊椎动物组分和包含一种或多于一种简单糖(例如蔗糖、葡萄糖和/或糖蜜)的添加剂或由其组成。在这些实例中，通过将糖用作乳杆菌的营养源，糖的存在有助于第二发酵步骤中乳酸产生的快速启动。

作为替代实例，可以选择一种或多于一种诱导特定微生物基因表达的添加剂。例如，可以选择刺激转基因构建体在GM微生物中表达的添加剂，从而产生期望的营养物质(例如ω-3脂肪酸)。

在发酵是两个或多于两个阶段的发酵过程的实施方案中，可以在任何合适的点合并两种或多于两种发酵混合物。然后可以对合并的混合物进行一个或多于一个其他发酵步骤，添加或不添加其他添加剂。在一些实施方案中，可以进行多个发酵步骤。例如，可以对由第一阶段发酵过程和第二阶段发酵过程产生的合并的发酵混合物进行多个发酵步骤，任选地在每个步骤开始之前添加一种或多于一种添加剂。

在一些实施方案中，使用产酸微生物的种进行最终的发酵步骤。在一些实施方案中，最后的发酵步骤是使用醋酸菌和/或乳杆菌的种进行的。这可能是有利的，因为使用这些种进行的发酵会酸化发酵混合物，从而延长任何所得发酵产物或与发酵产物合并的任何产物的保存期限。例如，可以使用米曲霉和生长培养基进行第一发酵步骤，所述生长培养基包含固体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂或由其组成。可以使用纳豆芽孢杆菌和生长培养基进行第二发酵步骤，所述生长培养基包含液体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂或由其组成。然后可以使用乳杆菌的种和生长培养基进行第三和最后的发酵步骤，所述生长培养基包含合并的由第一和第二阶段发酵过程产生的发酵混合物和任选地一种或多于一种添加剂。这样的实施方案可能是有利的，因为第一发酵步骤导致酶的产生，所以第二发酵步骤(其生长培养基是GRAS的培养基)通常快速发生(即，迅速达到期望的发酵结果)；第三发酵步骤导致混合物酸化，从而延长任何所得产物的保存期限。

使用两个或多于两个阶段的发酵过程可能是有利的。例如，固体无脊椎动物组分主要包含无脊椎动物几丁质，其是葡糖胺聚合物且对于大多数动物而言消化性较差。由于几丁质的组成，它不是微生物发酵的优选底物，微生物发酵中存在更有利的底物，例如氨基酸、糖或淀粉。然而，当没有其他更有利的底物可用时，主要由几丁质组成的底物将发生微生物发酵，导致其部分水解。这样，与异质生长培养基的发酵相比，异质生长培养基例如既包含固体无脊椎动物组分又包含液体无脊椎动物组分或液体无脊椎动物组分的任何部分的生长培养基，单独的发酵过程使得(仅)对包含无脊椎动物的固体组分的生长培养基进行发酵，这可以导致几丁质的更多和/或更快的水解。增强的几丁质水解有助于减少几丁质(纤维)，通常认为它们对动物例如鱼类是不易消化的和/或抗营养的，并产生更容易获得的营养物质，例如氨基葡萄糖。

在一些实施方案中，可以将一种或多于一种发酵混合物分离成部分。在一些实施方案中，将发酵混合物分离为脂质和非脂质部分。这可以通过任何合适的方式来完成，例如通过使用重力和/或温度，例如使用离心机；或温度辅助重力分离，例如，可以将液体组分冷冻，直到其沉降成可以分离的部分(脂质部分通常会凝固，而非脂质部分仍为液体，可以将其除去)。

在一些实施方案中，在与发酵混合物的非脂质组分分离之后，将发酵混合物的脂质部分(“发酵的脂质部分”)从过程中除去。这可能是有益的，因为水解后脂质和非脂质部分的分离会更容易。除此之外，发酵会导致脂质的脂肪酸谱和/或抗氧化特性发生变化，这在一些动物饲料产品中可能是有益的。

在一些实施方案中，发酵混合物的发酵固体组分(“发酵的固体副产物(富含几丁质)”)在发酵后从过程中除去。在一些实施方案中，可以用合适的溶剂，例如食品级溶剂，例如水或磷酸盐缓冲盐水，来洗涤发酵的固体组分，以辅助或实现酶(例如可溶性酶)和/或营养物质的提取，然后过滤，得到包含溶剂和任何提取的物质的滤液以及滤渣。在一些实施方案中，过滤器可以具有合适的形式和/或孔径，以从滤液中排除提取的物质的一种或多于一种组分，例如发酵过程中使用的一种或多于一种微生物。然后可以将滤液返回到过程中，以用作或添加至用于微生物发酵的生长培养基。这可能是有益的，因为滤液中的酶和/或营养物质可以帮助发酵。直接从发酵过程获得的，或洗涤和过滤后残留的发酵的固体组分，可以直接或在热机械和/或化学过程之后用于替代过程。

给出使用上述三个阶段发酵方法进行这种分离的益处的一个实施例(即，使用米曲霉和生长培养基的第一发酵，该生长培养基包含固体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂或由其组成；使用芽孢杆菌纳豆变种和生长培养基的第二发酵步骤，该生长培养基包含液体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂或由其组成；以及使用乳杆菌种和生长培养基的第三发酵步骤，该生长培养基包含合并的由第一和第二阶段发酵过程得到的发酵混合物以及任选地一种或多于一种添加剂或由其组成)：可以在第一发酵步骤之后除去发酵混合物的发酵固体部分，例如用水洗涤并过滤，用具有防止米曲霉进入滤液的形式或孔径的过滤器来收集滤液。然后可以将滤液添加到用于第三发酵步骤的生长培养基中(如图5所示)。这种安排可能是有益的，因为当前的QPS(欧洲)和GRAS(美国)法规直接限制了产品中丝状真菌的使用，但是丝状真菌例如米曲霉通常非常擅长合成酶和各种辅助因子，并且因此有利于在根据本发明的发酵步骤中使用。丝状真菌产生菌丝体，可以很容易地通过过滤将其排除。因此，在以上给出的实例中，真菌可有益地用于第一发酵步骤，但其排除在最终发酵产物之外，从而避免了与法规要求相关的潜在困境以及避免了由于包含丝状真菌的发酵产物的营养状况的不期望的变化。

终止或抑制发酵

可以在期望的点终止或抑制发酵。在一些实施方案中，当发酵速率不再是最佳时，例如，当微生物计数表明微生物生长曲线基本上在指数期末或在静止期时；或当蛋白质水解程度或酶活性量达到预定点时，可以终止或抑制发酵。可以监测发酵以建立期望的终止点或抑制点。可以使用任何合适的方法进行监测，例如通过测量发酵混合物的温度或pH；蛋白质水解程度；酶活性的程度；微生物数量；或代谢物含量。可以通过任何合适的方法来测量这些参数，例如SDS PAGE；胃蛋白酶可消化性；分光光度酶活性测定；基于HPLC的代谢物分析和定量，基于GC/MS的代谢物分析和定量；或依赖培养物和不依赖培养物的微生物学方法(CFU平板计数、16S/基因特异性PCR、qPCR、测序)。

在一些实施方案中，终止发酵。“终止发酵”是指杀死发酵混合物中的所有或基本上所有微生物，或使发酵混合物中的所有或基本上所有微生物不存活。

在一些实施方案中，用于终止发酵的方法杀死发酵混合物内的所有或基本上所有活性物质或使发酵混合物内的所有或基本上所有活性物质不存活。“活性物质”是指发酵混合物中存在的微生物和酶。在这样的实施方案中，所得发酵混合物被认为是经巴氏灭菌的。

可以通过任何合适的方法或方法的组合来终止发酵。在一些实施方案中，通过升高发酵混合物的温度来终止发酵。实现终止所需的温度可以根据发酵混合物中的微生物和/或活性物质而变化。在一些实施方案中，将发酵混合物的温度升高至高于约60℃、高于约65℃、高于约70℃、高于约75℃、高于约80℃、高于约85℃、高于约90℃或高于约95℃。在一些实施方案中，温度保持在低于约130℃。在一些实施方案中，将发酵混合物的温度持续升高至少3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟或15分钟。在优选的实施方案中，将发酵混合物的温度升高到至少80℃、90℃或95℃至少5分钟。

在一些实施方案中，通过其他合适的方式终止发酵，例如用紫外线和/或γ射线照射发酵混合物或使用高压技术。

在替代实施方案中，抑制发酵。“抑制发酵”是指发酵混合物中的部分或全部活性物质可逆地失去活性。

在一些这样的实施方案中，通过提高发酵混合物的温度来实现对发酵的抑制。在一些这样的实施方案中，选择的温度在抑制发酵的同时避免或最小化发酵终止和/或保留发酵混合物的营养品质。在一些实施方案中，发酵混合物的温度升高至约35℃至55℃。在一些实施方案中，发酵混合物的温度升高至约35℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃或46℃。在优选的实施方案中，发酵混合物的温度升高至约37℃。在一些实施方案中，将发酵混合物的温度升高至少3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟或15分钟。

在一些实施方案中，通过干燥发酵混合物来抑制发酵。在一些这样的实施方案中，将发酵混合物从发酵容器转移到合适的干燥环境中。可以使用任何合适的方法干燥发酵混合物。例如，可将喷雾干燥用于干燥液体发酵混合物；或使用流化床干燥机、脱水机例如低温脱水机或脱水烘箱，或自由干燥。在整个干燥过程中，可以保持清洁/食品级或无菌条件。在一些实施方案中，经干燥的发酵混合物的水分含量小于约15％、小于约12％、小于约10％、小于约9％、小于约8％或小于约7％。在优选的实施方案中，发酵混合物的水分含量小于约6％。

在一些实施方案中，通过其他合适的方式抑制发酵，例如冷却(至低于4℃)或冷冻发酵混合物；或在合适的环境条件(例如惰性气体或高压)下包装发酵混合物。

终止发酵还是抑制发酵取决于所用发酵过程的类型、生长培养基的性质、所用发酵微生物和/或期望产物。在一些实施方案中，优选确保例如在期望由发酵产生的产物不含或基本上不含微生物和/或活性物质的情况下，杀死发酵混合物中的所有或基本上所有微生物和/或活性物质或使发酵混合物中的所有或基本上所有微生物和/或活性物质不存活。打算将产品归类为饲料的情况可能就是这种情况，因为这可以减少产品进入市场所需的监管步骤。或者，在一些实施方案中，其中添加到生长培养基中的微生物被认为不对人类、动物或环境表现出健康、安全或致病风险；和/或被认为和/或被证明对人、动物或环境提供或对人、动物或环境产生有益作用，可以抑制发酵，以在抑制被逆转时提供具有活性微生物组分的产物。

在下文中，术语“发酵产物”用于指终止或抑制发酵后的发酵混合物。

因此，在本发明的第二方面，提供了由根据本发明的第一方面的方法获得的组合物。

发酵后加工

在一些实施方案中，包装发酵产物。包装可能在清洁、食品级或无菌条件下进行。在抑制发酵之后包装发酵产物的实施方案中，可以在限制或阻止进一步发酵的条件下提供被包装的产物，或被包装的产物保持在限制或阻止进一步发酵的条件下。例如，包装可以防止水分进入。

在替代实施方案中，进一步处理发酵产物。在一些这样的实施方案中，可以干燥或进一步干燥发酵产物。在一些这样的实施方案中，通过升高发酵产物的温度来实现干燥。在一些实施方案中，将发酵产物从发酵容器转移至合适的干燥环境。可以使用任何合适的方式干燥发酵产物。例如，使用流化床干燥器、脱水器，例如低温脱水器(温度小于约45℃；小于约40℃；更优选小于约37℃)；或自由干燥。在一些实施方案中，干燥的发酵混合物的水分含量小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％或小于约5％。在优选的实施方案中，发酵混合物的水分含量小于6％或小于5％。

在一些实施方案中，使用合适的方式例如锤磨机或旋转盘均化器来破碎或粉化发酵产物。

在一些实施方案中，可以将一种或多于一种添加剂添加到发酵产物中。此类添加剂包括已知或认为对一种或多于一种动物有益或增强动物健康和/或福利的材料或物质，和/或已知或认为对一种或多于一种动物具有免疫原性的材料或物质，因为其刺激和/或促进免疫应答和/或引发或刺激先天免疫***。例如，已知对肠道微生物群有积极作用的物质。这些添加剂包括抗氧化剂；微量营养素；益生元，例如不可消化的纤维，例如菊糖或低聚果糖；益生菌，例如益生细菌、酵母、真菌，例如乳杆菌和糖酵母的干培养物和/或孢子。添加剂可以是任何合适的形式，例如粉末或液体形式。

因此，在本发明的第三方面，提供了一种组合物，其包含10％至70％的蛋白，其中20％至100％是源自无脊椎动物的蛋白；1％至40％的脂肪，其中5％至100％是源自无脊椎动物的脂肪；1％至30％的纤维，其中5％至100％是源自无脊椎动物的纤维；和1％至30％的碳水化合物，其中5％至100％是源自无脊椎动物的碳水化合物。

“纤维”是指不易消化的复杂碳水化合物。

在一些优选的实施方案中，根据本发明第三方面的组合物包含10％至70％的蛋白，其中50％至100％是源自无脊椎动物的蛋白；1％至40％的脂肪，其中5％至100％是源自无脊椎动物的脂肪；1％至30％的纤维，其中5％至100％是源自无脊椎动物的纤维；和1％至30％的碳水化合物，其中5％至100％是源自无脊椎动物的碳水化合物。

因此，本发明的一些实施方案提供了用于将无脊椎动物转化为饲料的方法。在一些实施方案中，该过程增强了无脊椎动物底物的营养特性、化学特性、抗氧化特性、生物学特性和/或益生菌特性中的一种或多于一种：在发酵过程中，发酵微生物产生一系列不同的酶，并与生长培养基在多种水平相互作用，这可能使生长培养基发生复杂的物理化学修饰(例如通过肌醇六磷酸消化或纤维蛋白溶解；或产生ω-3脂肪酸；有机酸例如乳酸；抗氧化剂或色素；和/或丝氨酸蛋白酶，如纳豆激酶)。这可使所得发酵产物中营养物质的可消化性和生物利用率提高；为产品的消费者提供免疫原性和/或健康和福利益处；和/或通过产生酸来降低产物的pH，从而减少或防止腐败食物的微生物的生长并延长保质期，并且避免添加抗微生物化合物的需求。此外，此类酸可能是一些动物的营养来源或具有其他益处，例如已经发现乳酸可以替代动物饲料中的抗生素或抗微生物添加剂(Panel和Feedap.EFSAjournal；2015；13(12)4198)。相比之下，酶促水解限于添加到生长培养基中的酶的类型，并且实现相同水平的生长培养基修饰复杂性在经济上是不可行的。

此外，本发明的一些实施方案提供了一种由无脊椎动物获得饲料的灵活方法，其允许定制所得产品，例如以提供具有特定营养特征、化学特征、生物学特征、免疫原性和/或益生菌特征的产品。在本发明的一些实施方案中，这是通过选择和使用以下一个或多于一个参数来实现的，例如无脊椎动物的加工；选择具体的无脊椎动物底物作为微生物发酵的生长培养基；在生长培养基中包含一种或多于一种添加剂；选择具体的微生物；选择具体的发酵过程和发酵条件；和选择终止或抑制发酵。通过仔细选择这些参数，本发明的一些实施方案提供了将无脊椎动物转化为用于特定牲畜物种的优化饲料的机会。

在一些实施方案中，对无脊椎动物进行加工并选择特定的无脊椎动物底物作为生长培养基允许无脊椎动物以营养最佳的方式使用。例如，可以分离和除去脂质无脊椎动物组分，从而允许制备包含固体和/或非脂质液体无脊椎动物部分的生长培养基，因为许多发酵微生物倾向于在脂肪底物上表现不佳或不太理想。作为另一个实例，因为一些发酵微生物倾向于在包含高几丁质含量的底物上表现不佳，所以可以将液体无脊椎动物组分与固体无脊椎动物组分单独进行加工。

在一些实施方案中，用添加剂补充生长培养基可以用于增强和/或优化发酵过程。

在一些实施方案中，可以选择微生物和发酵条件以实现特定的发酵结果。如上所述，不同的微生物产生不同的酶并以不同的方式影响生长培养基，这可以在一些实施方案中用于产生定制的产物。

一个阶段或两个阶段发酵过程的选择允许将最合适的微生物和发酵条件应用于每种生长培养基。

发酵的终止或抑制可以控制发酵产物的微生物和活性物质含量。例如，抑制发酵产生了在重构时含有被认为可以改善消费者健康和/或消化的微生物和/或活性物质的产物。就消费者食品的转化率和生长而言，这可以产生有利的影响。此外，发酵产物中微生物抗原和益生菌的存在可以刺激消费者的先天免疫***。

本发明的一些实施方案提供了由无脊椎动物获得饲料的方法，该方法避免了酶的直接添加。这可能与发展中国家的情况特别相关，在发展中国家中，对低成本、高营养价值的动物饲料的需求可能很高，并且提供酶的存储***既困难又昂贵，特别是期望使用多种不同的酶。

本发明的一些实施方案提供了一种由无脊椎动物获得饲料的方法，该方法是自我延续的，不需要昂贵的存储设备，并且仅需要基本的微生物繁殖知识。例如，冰箱和-80℃的冷库足以无限期地有效地存储根据本发明的发酵过程所需的微生物储备。作为自我复制的实体，这类微生物不需要外部补充；微生物培养物可以在发酵过程之间繁殖和保存(类似于面包师保存母酵母培养物的方式)。在工业过程中，此类培养物将在发酵过程之间进行冷藏，并在超低温(-80℃)下存储一定比例以保持储备。

本发明的一些实施方案提供了一种方法，该方法产生了用作一种或多于一种饲料的产物。本发明的一些实施方案提供了一种方法，该方法产生用作水产养殖、家禽和养猪业以及宠物的饲料的产物。

本发明的一些实施方案提供了一种方法，该方法产生了用作具有健康和/或福利改善和/或免疫原性性质的饲料的产物。本发明的一些实施方案提供了一种方法，该方法产生了具有增强的抗氧化剂含量的用作饲料的产物。本发明的一些实施方案提供了一种方法，该方法产生了具有延长的保存期限的用作饲料的产物。

本发明的一些实施方案提供了用作一种或多于一种饲料的产物。本发明的一些实施方案提供了用作水产养殖、家禽和养猪业以及宠物的饲料的产物。本发明的一些实施方案提供了具有增强的营养特性的产物。本发明的一些实施方案提供了具有延长的保存期限的产物。

本发明的一些实施方案提供了具有增强的化学特性、生物学特性、免疫原性、抗氧化特性和/或益生菌特性的产物。此类产品被称为“功能性饲料”，这意味着它们除了营养组分外，还为消费者提供一种或多于一种特殊益处。如果通过一种或多于一种其他产物以其他方式向动物的主要食物提供特定益处，则此类产品可能是有益的，因为提供功能性饲料可以更便宜、更容易，对于产品具有增强的益生菌特征的实施方案而言，可能对细菌耐药性发展的贡献较小。

提供以下实施例以说明本发明，而不应解释为对本发明的限制。

实施例1：无脊椎动物加工和用于发酵的无脊椎动物底物的制备

在冷水浴中(5℃)洗涤黑水虻(Hermetia illucens)幼体和/或蛹，然后在高压灭菌釜(121℃)中对其进行巴氏灭菌。然后使用机械针辊对幼体和/或蛹进行穿孔，然后立即使用加热的不锈钢液压机压制。对于每1kg压制的幼体/蛹，提取约450g液体，剩下约550g压制的饼形式的固体。收集液体。使用工业搅拌器将压制的饼(固体无脊椎动物组分)均质化，以将粒径减小至约小于2.5mm。

收集的液体组分由脂质部分和包含一些固体(最多占非脂质部分的5重量％)的非脂质部分组成。使用重力(沉降或离心)分离各部分，产生约75g至100g的未精制脂肪(无脊椎动物液体组分的脂质部分)和约350g至375g的非脂质部分(液体无脊椎动物组分的非脂质部分)。

实施例1a：生长培养基的制备

将225g水和/或来自实施例1的液体无脊椎动物组分的非脂质部分添加到100g干麦麸中并混合以使麸成胶状。通过高压灭菌(121℃)对该混合物进行巴氏灭菌/灭菌。

将550g来自实施例1的均质化的固体无脊椎动物组分与325g成胶状的麸混合。确定混合物的pH为弱碱性(7.6至8.2)。任选地进行第二巴氏灭菌/灭菌步骤。

实施例2：无脊椎动物加工和无脊椎动物发酵底物的制备

在冷水浴中(5℃)洗涤黑水虻幼体和/或蛹，然后在高压灭菌釜(121℃)中对其进行巴氏灭菌。然后使用加热的液压机对幼体和/或蛹进行穿孔和提取。对于每1kg压制的幼体/蛹，提取约450g液体，剩下约550g压制的饼形式的固体。收集液体。使用工业搅拌器将压制的饼(固体无脊椎动物组分)均质化，以将粒径减小至约小于2.5mm。

收集的液体组分由脂质部分和包含一些固体(最多占非脂质部分的5重量％)的非脂质部分组成。使用重力(离心)任选地分离脂质和非脂质部分，产生约75g至100g的未精制脂肪(液体无脊椎动物组分的脂质部分)和约350g至375g的非脂质部分(液体无脊椎动物组分的非脂质部分)。

实施例2a：生长培养基的制备

根据实施例2制备液体无脊椎动物组分。该组分未分离为脂质和非脂质部分。向每千克液体无脊椎动物组分中加入10克葡萄糖。通过高压灭菌(121℃)对该混合物进行巴氏灭菌/灭菌。确定混合物的pH为弱碱性(7.6至8.2)。

实施例3：一个阶段的发酵

该实施例涉及利用两种食品工业微生物对碱性生长培养基进行有氧发酵：枯草芽孢杆菌纳豆变种(“BSN”，从大豆纳豆菜中分离)和米曲霉(“AO”，从市售味噌发酵剂中分离出来)。

准备微生物接种物。在35℃的振荡液体培养基(例如Luria肉汤)中将在低温保存的培养物中的BSN培养过夜。经过3天的时间，AO在麸上生长过度，然后在37℃下干燥，并使用真菌孢子收集器收集孢子。

将50mL的BSN培养物(＞1×10⁸个细胞/mL)和2.5g的AO孢子加入到2升发酵桶中的根据实施例1a制备的1kg生长培养基中并充分混合。将空气(通过0.22μm膜过滤以除去污染物)供应到发酵混合物中以促进有氧发酵。将发酵混合物在28℃下孵育48小时，每小时混合30秒以确保均质化。

然后抑制发酵。将发酵混合物转移至低温干燥烘箱(≤40℃)中，并干燥至最终水分含量<6％。作为替代方案，通过在烘箱中将发酵混合物加热至80℃持续15分钟来终止发酵，然后使用干燥烘箱(≤70℃)干燥至水分含量小于6％。在每种情况下，每千克湿发酵产物产生300g至400g干发酵产物。

使用锤磨机将干燥的发酵产物加工成细粉。

表2显示了无脊椎动物饲料原料(黑水虻，A)和发酵前的生长培养基(B)，以及BSN和AO混合发酵(C)引起的营养组分变化的比较。

表2

对所有样品进行三次重复分析。通过在70℃下干燥4小时之前/之后称量样品确定水分含量。使用干燥的样品(水分<10％)确定其他值。使用LECO TruMac分析仪确定蛋白含量。纤维含量确定为样品在10％NaOH中消化后的剩余质量。使用己烷萃取确定脂质含量。

图6显示了包含80％无脊椎动物底物(3：1固体无脊椎动物组分：液体无脊椎动物组分的非脂质部分)/20％成胶状的麦麸的生长培养基的SDS-PAGE，使用枯草芽孢杆菌纳豆变种和米曲霉(28℃，有氧条件，初始pH：8.0/最终pH：7.2)进行了微生物发酵，持续48小时。结果表明，与泳道A(发酵前)的对照相比，泳道B(发酵后)中平均蛋白尺寸(kDa)(主要消失的蛋白条带表示为α、β、γ)减小说明部分蛋白水解。

实施例4：一个阶段的发酵

此实施例涉及利用一种食品工业微生物对碱性生长培养基进行有氧发酵：枯草芽孢杆菌纳豆变种(“BSN”，从大豆纳豆菜中分离)。

首先制备微生物接种物。在35℃的振荡液体培养基(例如Luria肉汤)中将在低温保存的培养物中的BSN培养过夜。将50mL的BSN培养物(＞1×10⁸个细胞/mL)加入到2升发酵桶中的根据实施例2a制备的1kg生长培养基中并充分混合。将空气(通过0.22μm膜过滤以除去污染物)供应到发酵混合物中以促进有氧发酵。将发酵混合物在28℃下孵育48小时，连续混合以确保均质化和良好的生长培养基曝气。

然后抑制发酵。将发酵混合物转移至低温干燥烘箱(≤40℃)中，并干燥至最终水分含量<6％。作为替代方案，通过在烘箱中将发酵混合物加热至80℃持续15分钟来终止发酵，然后使用干燥烘箱(≤70℃)干燥至水分含量小于6％。在每种情况下，每千克湿发酵产物产生200g至300g干发酵产物。

使用锤磨机将干燥的发酵产物加工成细粉。

实施例5：两个阶段的发酵过程

该实施例涉及利用两种食品工业微生物的有氧发酵和厌氧发酵的两个阶段：米曲霉(“AO”，从市售味噌发酵剂中分离)用于第一阶段有氧发酵步骤；然后将植物乳杆菌(“LP”，从人类益生菌补充剂中分离)用于第二阶段厌氧发酵步骤。

根据实施例1，对黑水虻幼体和/或蛹进行洗涤、穿孔和提取。根据实施例1将固体无脊椎动物组分均质化，根据实施例1将液体无脊椎动物组分分离为脂质和非脂质部分。

将225g水加到100g干麦麸中并混合以使麸成胶状。通过高压灭菌(121℃，1.5巴)对该混合物进行巴氏灭菌/灭菌。将550g的均质化的固体无脊椎动物组分与325g成胶状的麸混合。确定混合物的pH为弱碱性(7.6至8.2)。任选地进行第二巴氏灭菌/灭菌步骤。这构成了“第一阶段生长培养基”。

准备微生物接种物。在35℃的振荡液体培养基(例如de Man、Rogosa和Sharpe肉汤)中将在低温保存的培养物中的LP过夜培养。经过3天的时间，使AO在麸上过度生长，然后在37℃下干燥，并使用真菌孢子收集器收集孢子。

第一阶段发酵：将2.5gAO孢子加入到1kg的第1阶段生长培养基中并充分混合，然后放入2升发酵桶中。将空气(通过0.22μm膜过滤以除去污染物)供应到发酵混合物中以促进有氧发酵。将混合物在28℃下孵育48小时，每小时混合底物30秒以确保均质化。

第二阶段发酵：在第1阶段发酵完成前24小时，将500g液体无脊椎动物组分的非脂质部分/kg的第1阶段发酵混合物放入3升的第二发酵桶中。将添加剂(葡萄糖、蔗糖和/或糖蜜)以约20g/L的量添加到桶中。通过添加食品级酸(乙酸和/或柠檬酸)将pH调节至低于pH7。在第二发酵桶中，对于每kg物质，添加50ml的LP培养物(>1×10⁸个细胞/mL)。从发酵桶中排除空气以达到厌氧条件。将混合物在35℃下孵育最多24小时，每小时混合30秒以确保均质化。

在完成第1阶段发酵之后，将第1阶段发酵混合物从第1阶段发酵桶转移到第2阶段发酵桶中并充分混合。排除空气以达到厌氧条件，并且将合并的混合物在35℃下孵育12小时至24小时或直至pH低于4.5，每小时混合30秒以确保均质化。

然后抑制发酵。将发酵混合物转移至低温干燥烘箱(≤40℃)中，并干燥至最终水分含量<6％。作为替代方案，通过在烘箱中将发酵混合物加热至80℃持续15分钟来终止发酵，然后使用干燥烘箱(≤70℃)干燥至水分含量小于6％。在每种情况下，每kg湿发酵产物产生200g至350g干发酵产物。

使用锤磨机将干燥的发酵产物加工成细粉。

表3示出了通过NaOH消化确定的平均几丁质含量的减少(每种处理测量的平均几丁质/样品的平均干重)，其通过生长底物的(仅)米曲霉发酵而实现。

准备三种处理(A、B和C)。每组处理由三组30只幼体样品组成，每组样品总计5.750g(+/-0.050g)。对于处理A和B，根据实施例1对幼体进行巴氏灭菌、穿孔和提取，以产生固体和液体无脊椎动物组分，并且根据实施例1将液体组分分离为脂质和非脂质部分。样品A由固体无脊椎动物部分组成。样品B由固体无脊椎动物部分和液体无脊椎动物组分的非脂质部分组成。样品C(对照)由整个幼体组成，将其收获并保存在冰箱中直至加工。

用100mg的2.5％米曲霉孢子(与淀粉混合)接种样品A和B，并在28℃下孵育2天。然后将所有样品在70℃下干燥直至达到恒重，并用研钵和研棒均质化以达到细粉稠度。然后将样品在过量的10％NaOH溶液中消化，然后在95℃下孵育24小时，然后过滤并用去离子水洗涤三次。然后将样品在70℃下干燥并称重。最终重量代表未消化的部分(几丁质)，其以干样品重量的百分比表示(1.850g+/-0.033g)。

表3

实施例6：三个阶段发酵过程

该实施例涉及利用两种食品工业微生物的三个阶段的有氧发酵和厌氧发酵过程。简言之：米曲霉(“AO”，从市售味噌发酵剂中分离)用于第一阶段的固体有氧发酵步骤，该步骤使用包含固体无脊椎动物组分的生长培养基；将植物乳杆菌(“LP”，从人类益生菌补充剂中分离)用于第二阶段的液体厌氧发酵步骤，该步骤使用包含液体无脊椎动物组分的生长培养基进行。第三阶段包括将阶段1和阶段2的发酵混合物混合，并使所得混合物经历短的液体厌氧发酵步骤。

根据实施例2，对黑水虻幼体和/或蛹进行洗涤、巴氏灭菌和穿孔和提取。

然后以以下方式制备用于第一发酵步骤的生长培养基(“第1阶段生长培养基”)：使用厨房搅拌机将固体无脊椎动物组分均质化。没有使用添加剂。确定混合物的pH为中性至弱碱性(7.1至7.8)。然后对培养基进行高压灭菌。

根据实施例2a制备用于第二发酵步骤的生长培养基(“第2阶段生长培养基”)。

准备微生物接种物。在35℃的振荡液体培养基(例如de Man、Rogosa和Sharpe肉汤)中将在低温保存的培养物中的LP过夜培养。经过3天的时间，使AO在麸上过度生长，然后在37℃下干燥，并使用真菌孢子收集器收集孢子。

第1阶段发酵：将2.5g AO孢子加入到1kg的第1阶段生长培养基中并充分混合，然后在5升发酵容器中形成2cm的片。将空气(通过0.22μm膜过滤以除去污染物)供应到发酵容器中以促进有氧发酵。使混合物在28℃下孵育72小时，不搅拌。

第2阶段发酵：在5升发酵桶中，对于每kg的第2阶段发酵生长培养基，添加50ml的LP培养物(>1×10⁸个细胞/mL)。从发酵桶中排除空气以达到厌氧条件。将混合物在35℃下孵育最多24小时，每小时混合30秒以确保均质化和更好的混合物酸化。

第3阶段发酵：在第1阶段发酵完成后，将第1阶段发酵混合物以无菌方式从第1阶段发酵容器转移到第2阶段发酵桶中：对于每kg第2阶段发酵混合物，添加50g第1阶段发酵混合物。排除空气以达到厌氧条件，并将混合物在35℃下孵育12小时，直到pH低于4.5，每小时混合30秒以确保均质化。

然后抑制发酵。将所得发酵混合物转移至低温干燥烘箱(≤40℃)中，并干燥至最终水分含量<6％。作为替代方案，通过在烘箱中将发酵混合物加热至80℃持续15分钟来终止发酵，然后使用干燥烘箱(≤70℃)干燥至水分含量小于6％。在每种情况下，每kg湿发酵产物产生200g至350g干发酵产物。

使用锤磨机将干燥的发酵产物加工成细粉。

为了解决各种问题并提高本领域的技术水平，本公开的全部内容通过举例说明的方式示出了可以实践所要求保护的发明的各种实施方案，并且提供了用于将无脊椎动物转化为饲料的过程的优良方法。本公开的优点和特征仅以实施方案为代表性示例，而不是穷举的和/或排他的。提供实施方案仅是为了帮助理解和教导要求保护的特征。应当理解的是，本公开的优点、实施方案、实施例、功能、特征、结构和/或其他方面不应被视为对由权利要求限定的本公开的限制或与权利要求等同的限制，并且在不脱离本公开的范围和/或精神的情况下，可以利用其他实施方案并且可以进行修改。各种实施方案可以适当地包括所公开的要素、组分、特征、部分、步骤、方式等的各种组合，由其组成或基本上由其组成。此外，本公开包括当前未要求保护但可能在未来要求保护的其他发明。

条款：

以下条款不是权利要求，而是表示本发明的不同实施方案：

1、一种用于将无脊椎动物转化为饲料的方法，其包括：

(a)对无脊椎动物进行穿孔和/或提取；

(b)将固体无脊椎动物组分与液体无脊椎动物组分分离；

(c)任选地将液体无脊椎动物组分分离为脂质和非脂质部分；

(d)制备生长培养基，其包含固体无脊椎动物组分、液体无脊椎动物组分的非脂质部分、或固体无脊椎动物组分和液体无脊椎动物组分的非脂质部分；以及任选地一种或多于一种添加剂；或由固体无脊椎动物组分、液体无脊椎动物组分的非脂质部分、或固体无脊椎动物组分和液体无脊椎动物组分的非脂质部分；以及任选地一种或多于一种添加剂组成；

(e)使生长培养基经历微生物发酵；

(f)抑制或终止微生物发酵。

2、根据条款1所述的方法，其中使用细菌、真菌和古细菌界的一种或多于一种成员进行微生物发酵。

3、根据条款1或条款2所述的方法，其中使用乳杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、糖酵母或散囊菌目中的一种或多于一种成员进行微生物发酵。

4、根据条款1至3中任一项所述的方法，其中使用枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌纳豆变种、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、红发夫酵母、产朊假丝酵母或米曲霉中的一种或多于一种进行微生物发酵。

5、根据条款1至4中任一项所述的方法，其中以一步过程进行微生物发酵。

6、根据条款1至4中任一项所述的方法，其中以两步或多于两步过程进行微生物发酵。

7、根据条款6所述的方法，其中第一发酵步骤使用包含固体无脊椎动物组分和液体无脊椎动物组分的非脂质部分的生长培养基进行；第二发酵步骤使用包含液体无脊椎动物组分的非脂质部分的生长培养基进行。

8、根据条款6或条款7所述的方法，其中在第二发酵步骤和/或每个后续发酵步骤之前，将一种或多于一种添加剂添加到发酵混合物中。

9、根据条款1至8中任一项所述的方法，其中无脊椎动物是幼体、预蛹或蛹。

10、根据条款1至9中任一项所述的方法，其中无脊椎动物是蜕皮动物或冠轮动物超门的成员。

11、根据条款1至10中任一项所述的方法，其中无脊椎动物是黑水虻。

12、一种组合物，其由根据条款1至11中任一项所述的方法获得。

13、一种组合物，其包含10％至70％的蛋白，其中20％至100％是源自无脊椎动物的蛋白；1％至40％的脂肪，其中5％至100％是源自无脊椎动物的脂肪；1％至30％的纤维，其中5％至100％是源自无脊椎动物的纤维；和1％至30％的碳水化合物，其中5％至100％是源自无脊椎动物的碳水化合物。

14、根据条款13所述的组合物，其包含10％至70％的蛋白，其中50％至100％是源自无脊椎动物的蛋白。

15、一种用于将无脊椎动物转化为饲料的方法，其包括：

(a)对无脊椎动物进行穿孔和提取；

(b)将固体无脊椎动物组分与液体无脊椎动物组分分离；

(c)将液体无脊椎动物组分分离为脂质和非脂质部分；

(d)制备包含固体无脊椎动物组分的生长培养基和包含液体无脊椎动物组分的非脂质部分的生长培养基；

(e)使生长培养基经历微生物发酵；

(f)抑制或终止微生物发酵；

其中微生物发酵以两步或多于两步的过程进行，其中第一发酵步骤使用包含固体无脊椎动物组分的生长培养基进行，第二发酵步骤使用包含液体无脊椎动物组分的非脂质部分的生长培养基进行。

Claims (20)

1.一种用于将无脊椎动物转化为饲料的方法，其包括：

(a)对无脊椎动物进行穿孔和/或提取；

(b)将固体无脊椎动物组分与液体无脊椎动物组分分离；

(c)任选地将液体无脊椎动物组分分离为脂质部分和非脂质部分；

(d)制备一种或多于一种生长培养基，其中所述生长培养基包含固体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂；液体无脊椎动物组分或其部分和任选地一种或多于一种添加剂；或固体无脊椎动物组分和液体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂；或者所述生长培养基由固体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂组成；由液体无脊椎动物组分或其部分和任选地一种或多于一种添加剂组成；或由固体无脊椎动物组分和液体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂组成；

(e)使一种或多于一种生长培养基经历微生物发酵；

(f)抑制或终止微生物发酵；

其中以两个或多于两个步骤的过程进行微生物发酵。

2.根据权利要求1所述的方法，其还包括在对无脊椎动物进行穿孔和/或提取之前，对无脊椎动物进行洗涤、拣选和巴氏灭菌中的一个或多于一个的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用细菌、真菌和古细菌界的一种或多于一种成员进行微生物发酵。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中使用乳杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、红螺菌、酵母或散囊菌目中的一种或多于一种成员进行微生物发酵。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中使用枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌纳豆变种、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、红发夫酵母、产朊假丝酵母或米曲霉中的一种或多于一种进行微生物发酵。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中将液体无脊椎动物组分分离为脂质部分和非脂质部分。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中使生长培养基经历第一发酵步骤，然后经历第二发酵步骤，所述生长培养基包含液体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂；或液体组分的非脂质部分和任选地一种或多于一种添加剂；或由其组成。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中第一发酵步骤使用包含固体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂或由其组成的生长培养基进行；第二发酵步骤使用包含液体无脊椎动物组分和任选地一种或多于一种添加剂，或液体无脊椎动物组分的非脂质部分和任选地一种或多于一种添加剂或由其组成的生长培养基进行。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将发酵混合物分离为脂质和非脂质部分。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中从过程中除去固体无脊椎动物组分、液体无脊椎动物组分的脂质部分、发酵的固体无脊椎动物组分或发酵的液体无脊椎动物组分的脂质部分的一种或多于一种。

11.根据权利要求10所述的方法，其中洗涤和过滤所除去的发酵的固体无脊椎动物组分。

12.根据权利要求11所述的方法，其中将滤液返回到过程中以用作或添加到用于微生物发酵的生长培养基中。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其还包括合并第一发酵混合物和第二发酵混合物或其一个或多于一个部分，并使所得混合物经历一个或多于一个发酵步骤。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中最终发酵步骤使用产酸微生物种进行。

15.根据权利要求14所述的方法，其中最终发酵步骤使用醋酸菌或乳杆菌的种进行。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中在第二发酵步骤和/或每个后续发酵步骤之前，将一种或多于一种添加剂添加到发酵混合物中。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述无脊椎动物是幼体、预蛹或蛹。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述无脊椎动物是蜕皮动物或冠轮动物超门的成员。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述无脊椎动物是黑水虻。

20.一种组合物，其由根据权利要求1至19中任一项所述的方法获得。