一种与猪总***数性状相关的分子标记及应用
技术领域
本发明属于猪分子标记筛选技术领域,具体涉及一种与猪总***数性状相关的分子标记及应用。所述的分子标记可用于猪总***数性状的标记辅助选择。
背景技术
***数性状是影响母猪繁殖性能和仔猪生存的重要性状(Wang L,etal.Genotyping by sequencing reveals a new locus for pig teat number[J].Animalgenetics,2017,48(4):470-472.)。在传统的猪育种中,对性状的选择多集中于产仔数性状,如窝总产仔数、产活仔数、5天存活仔猪数和21天断奶仔猪数等。在过去的十几年中,传统的选育方法持续对产仔数进行高强度选择,已经使产仔数得到了显著增加。截止2013年,丹麦纯种大白的平均窝产仔数已达到14头(Nielsen B,et al.Selection for increasednumber of piglets at d 5after farrowing has increased litter size and reducedpiglet mortality[J].Journal of animal science,2013,91(6):2575-2582.)。然而,产仔数的提高并没有使***数得到相应的提高,***数的不足可能会影响仔猪的存活率和健康状况,因而有研究者提出,现阶段遗传改良应着力提升猪***数性状,以充分满足仔猪的营养需求(Chalkias H.Genetic and clinical studies of teat traits in the pig[M].2013.)。对美系大白猪总***数性状遗传参数估计的研究表明,该性状遗传力多在0.40~0.43之间,属于中等遗传力的性状。中等的遗传力表明通过选育对美系大白猪总***数性状进行改良具有较大的空间,可以得到比较理想的育种效果。随着高通量测序技术的不断发展,在家畜的全基因组范围内已经检测出大量的遗传标记,这使得以表型数据和基因型数据关联为基础的全基因组关联分析(Genomic wide association study,简称GWAS)在家畜经济性状、疾病抗性等复杂性状遗传研究中得到广泛的应用(王继英等,全基因组关联分析在畜禽中的研究进展[D],2013;尹建良等,猪全基因组关联分析研究进展及展望[J],***业,2017,12(10):32-36.;乔贤等,全基因组关联分析在畜禽重要经济性状中的研究进展[J].家畜生态学报,2017,38(10):1-9.;赵德胜等,家畜全基因组关联分析研究进展[J],中国畜牧兽医,2018,45(02):463-470)。GWAS分析在全基因组范围内寻找与目标性状显著关联的SNP位点,并通过连锁不平衡分析进一步确定候选基因,为解析复杂数量性状的遗传基础提供了有效的分析手段。
目前,对于美系大白猪总***数性状的GWAS分析的研究缺失,仅有少量的非美系大白猪***数的GWAS研究(Tang J,et al.Identification of loci affecting teatnumber by genome-wide association studies on three pig populations[J].Asian-Australasian journal of animal sciences,2017,30(1):1.;Rohrer G A,etal.Genetic analysis of teat number in pigs reveals some developmentalpathways independent of vertebra number and several loci which only affect aspecific side[J].Genetics Selection Evolution,2017,49(1):4.;Tan C,etal.Genome-wide association study and accuracy of genomic prediction for teatnumber in Duroc pigs using genotyping-by-sequencing[J].Genetics SelectionEvolution,2017,49(1):35.;Lopes M S,et al.A genome-wide association studyreveals dominance effects on number of teats in pigs[J].PloS one,2014,9(8):e105867.;Duijvesteijn N,et al.High-resolution association mapping of numberof teats in pigs reveals regions controlling vertebral development[J].BMCgenomics,2014,15(1):542.)。美系大白猪群体与其他品系大白猪群体由于驯化历史差异等,其遗传背景可能与其他品系群体存在较大差异,因而影响其总***数性状的重要数量遗传位点(QTL)的分布和频率也可能与其他品系大白猪群体不同。对于美系大白猪总***数性状进行全基因组关联分析,将是实现关键基因的定位,有助于解析美系大白猪总***数性状的遗传基础和分子机制提供研究基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷,筛选得到一种与猪***数性状(或称总***数性状)相关的分子标记及其应用,利用50K的基因芯片对SNP进行分型,并使用GWAS方法筛选与猪(优选为美系大白猪)总***数关联的SNP标记(H3GA0022648),为猪的遗传育种提供了新的分子标记资源和标记辅助选择应用基础。
具体地,本发明利用MVP软件(X Liu et al.Iterative Usage of Fixed andRandom Effect Models for Powerful and Efficient Genome-Wide AssociationStudies[J].Plos Genetics,2016,12(2):e1005767.)和混合线性模型(Mixed linearmodel,MLM)进行GWAS分析,筛选出与总***数显著关联的SNP位点,为美系大白猪***数性状DNA标记辅助选择和全基因组选择的开展提供了新的遗传基础。
本发明的技术方案如下所述:
申请人通过基因分型技术并参阅Ensembl数据库,得到登陆号为H3GA0022648基因(片段)上下游100bp的核苷酸序列,该序列与猪总***数性状关联,可作为分子标记的核苷酸序列如下所示:
ATAATCTATGCAGTTTATTTTATTTATTCATAACCTGTTTATGTGATGTATATTTAACTACAGCTAAAAAACTGGCCCATTAAAAGAGGTCCATTAGGGCR(A/G)TTCCCTGGTCATCCAGTGCTTCAGATTTGGCACTTTCACCACTGTGCCTGGGAACTGAATTTCCACATTAAGCTGCTGCATACTGCTGCCAAAAAAAAAA,
上述序列中第101位碱基处的R是A或G,该等位基因的突变导致上述序列产生了核苷酸多态性。
进一步,当所述序列的第101位的核苷酸为A时,判定猪比核苷酸为G时的序列具有更多的总***数。
作为优选方案,所述的猪品种为美系大白猪。
本发明筛选的分子标记可在猪总***数性状标记辅助选择中的应用。优选应用的猪品种为美系大白猪。
一种筛选与猪总***数性状相关SNP分子标记的方法,包括如下步骤:
①提取美系大白组织样总DNA,并对DNA进行质量检测;
②利用基因芯片技术进行分型;
③美系大白总***数性状需要利用传统的最佳线性无偏估计方法(Best LinearUnbiased Prediction,BLUP),采用场别、年份和季节的联合效应、性别、出生胎次作固定效应,个体作随机效应,计算个体随机效应与残差效应之和,作为校正后表型(Correctedphenotypes,)用于后续GWAS分析。
④利用R统计环境下MVP软件包中的MLM模型进行全基因组关联分析(GWAS)。
⑤对MLM模型筛选出来的显著SNP位点与美系大白总***数进行关联分析。
本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的对猪(优选品种为美系大白猪)相关基因或基因型与美系大白猪总***数的关联分析中。
本发明提供了一个新的分子标记,可用于猪,优选为美系大白猪总***数性状的分子标记辅助选择。
与现有技术相比本发明具有的有益效果:
本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型,作为非诊断目的的评价猪的***数,与目前的PCR-RFLP等方法相比,本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
附图说明
图1:本发明的总体技术流程示意图。
图2:是本发明克隆的H3GA0022648上下游100bp核苷酸序列和本发明分子标记的核苷酸序列。附图标记说明:在图2显示核苷酸序列长度为201bp,在该序列的第101位碱基处存在一个A/G等位基因突变(101bp处的英文字母“R”为突变位点)。
图3:是本发明曼哈顿图。附图标记说明:研究的是美系大白总***数性状,黑色圆圈及箭头指向标记的为本发明筛选的分子标记,该标记位于猪第7号染色体上。
具体实施方式
本发明中的序列信息和全基因组关联分析结果,基于猪基因组11.2版本。
序列表SEQ ID NO:1是本发明筛选的用于猪总***数性状检测的分子标记的核苷酸序列(序列表中序列的第101bp处是突变后的碱基G,如图2所显示序列有差异,但是是同一段序列,其表述形式有不同),在该序列的第101bp处存在一个等位基因的突变(即101A到101G的突变),该突变导致该分子标记所示的核苷酸序列产生了多态性。
实施例1:基因分型检测
(1)利用磁珠法基因组提取试剂盒自动提取美系大白猪(来源于华中农业大学实验猪场)组织样总DNA,具体步骤为:
(1)取适量组织样至1.5mL离心管中;
(2)向离心管中加入500μL裂解液和5μL蛋白酶K(20mg/mL),振荡混匀30秒后,置于65℃烘箱或金属浴中,裂解30分钟~1小时;
(3)裂解完成后,取全部上清转移至深孔板(标记为①号),并向每个样孔中加入350μL异丙醇;
(4)将①号深孔板,置于核酸提取仪工位1上,将装有磁珠、洗涤液①、洗涤液②和③以及洗脱液的深孔板分别置于工位2~6上。打开仪器电源,待仪器完成自检后,按表1所示,设置仪器参数;
表1参数设计
(5)运行程序,程序结束后,仪器会自动停止,并且工位6会进入4℃保存程序,暂时保存样品;
(6)DNA样品可以直接用于下游试验,或封装后于4℃短暂保存数日。若要长时间保存,可以封装或转移至新的容器中,并置于-20℃冰箱中做长期保存。
(2)SNP基因型的判定及质量控制
使用GeneSeek Porcine 50K SNP芯片进行分型,用PLINK v1.9对获得的基因型数据进行质量控制,剔除检出率<90%、次等位基因频率(minor allele frequency,MAF)<0.05、偏离哈代温伯格(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)<10-7的SNP标记和检出率<90%的个体,最终获得1793个个体和34613个SNP用于GWAS。
实施例2:H3GA0022648分子标记分型方法在美系大白猪总***数性状关联分析中的应用
(1)美系大白总***数性状表型预处理
美系大白猪总***性状需要利用混合线性模型(Mixed Linear Model,MLM),具体步骤为:采用场别、出生年份和出生季节的联合效应以及性别、出生胎次作固定效应,个体效应作随机效应,将模型估计出的有表型记录个体的估计育种值(Estimated breedingvalues,EBV)与对应的估计残差(residuals)加和,作为这些个体的校正后表型值(Corrected phenotypes,),用于后续GWAS分析。利用DMU统计环境下DMUAI模块进行约束最大似然估计(Restricted Maximum Likelihood,REML)和BLUP分析,系谱中包含10060个个体。具体模型如下:
yijklm=μ+HYSi+Sexj+Parityk+IDl+εijklm#
其中,yijklm是第个个体总***数性状原始表型值;μ是群体均值;HYSi是出生场别、出生年份和出生季节联合效应(固定效应);Sexj是性别效应(固定效应);Parityk是出生胎次效应(固定效应);IDl是个体加性效应(随机效应),模型有如下假定:个体效应服从正态分布:,表示个体加性遗传效应方差,表示个体间亲缘关系矩阵;εijklm是模型残差效应,假定服从正态分布:,表示残差方差,为相应的单位关联矩阵。
(2)美系大白猪总***数全基因组关联分析(GWAS)
用于基因型与总***数性状关联分析所用的试验猪群是美系大白猪(来源于华中农业大学实验猪场)。基因分型所用的DNA由纯种美系大白猪组织样中提取。基于多标记关联模型的方法,利用R统计环境下MVP软件包中的MLM模型进行GWAS分析。具体的模型如下:
其中,是根据混合线性模型计算出的有基因型个体的校正后表型;1表示元素为1的向量;是整体均数;表示SNP含量矩阵(0表示AA型,1表示AB型,2表示BB型);表示SNP标记加性效应向量;表示多基因效应关联矩阵;表示多基因效应,假定服从正态分布:,表示个体加性效应方差,表示基于基因型信息的基因组关系矩阵;是残差效应,假定服从正态分布:,表示残差方差,为单位关联矩阵。
(3)H3GA0022648分子标记分型结果与总***数关联分析
使用混合线性模型(MLM)进行H3GA0022648分子标记与美系大白猪总***数的关联分析。具体模型如下:
yijlmn=μ+Gi+HYSj+Sexk+Parityl+IDm+9ijklmn
其中,yijklmm是第个个体总***数性状原始表型值;μ是群体均值;Gi是H3GA0022648分子标记基因型效应(固定效应);HYSk是出生场别、出生年份和出生季节联合效应(固定效应);Sexk是性别效应(固定效应);IDm是个体加性效应(随机效应),假定服从正态分布: 表示个体效应方差,A表示个体间亲缘关系矩阵;εijklmno是模型残差效应,服从正态分布: 表示残差方差,I为相应的单位关联矩阵。使用F检验对总***数性状在三种基因型个体间的差异进行显著性分析,分析结果见表2。
表2 H3GA0022648的多态性以及不同基因型对美系大白猪总***数性状的影响
表2说明:P<0.05为差异显著;P<0.01为差异极显著。
由表2可知,对于美系大白猪总***性状,基因型为AA的个体总***数性状极显著高于AG个体,基因型为AA的个体总***数性状显著高于GG个体,基因型为AG的个体总***数显著高于GG个体。
因此可以认为,A基因是有利于猪(优选为美系大白猪)总***数性状增加的等位基因。
主要参考文献:
1.Wang L,Zhang Y,Zhang T,et al.Genotyping by sequencing reveals a newlocus for pig teat number[J].Animal genetics,2017,48(4):470-472。
2.Nielsen B,Su G,Lund M S,et al.Selection for increased number ofpiglets at d 5after farrowing has increased litter size and reduced pigletmortality[J].Journal of animal science,2013,91(6):2575-2582。
3.Chalkias H.Genetic and clinical studies of teat traits in the pig[M].2013。
4.王继英等,全基因组关联分析在畜禽中的研究进展[D],2013。
5.乔贤等,全基因组关联分析在畜禽重要经济性状中的研究进展[J],家畜生态学报,2017,38(10):1-9。
6.赵德胜等,家畜全基因组关联分析研究进展[J],中国畜牧兽医,2018,45(02):463-470。
7.Tang J,et al.Identification of loci affecting teat number bygenome-wide association studies on three pig populations[J].Asian-Australasian journal of animal sciences,2017,30(1):1。
8.Rohrer G A,et al.Genetic analysis of teat number in pigs revealssome developmental pathways independent of vertebra number and several lociwhich only affect a specific side[J].Genetics Selection Evolution,2017,49(1):4。
9.Tan C,et al.Genome-wide association study and accuracy of genomicprediction for teat number in Duroc pigs using genotyping-by-sequencing[J].Genetics Selection Evolution,2017,49(1):35。
10.Lopes M S,et al.A genome-wide association study reveals dominanceeffects on number of teats in pigs[J].PloS one,2014,9(8):e105867。
11.Duijvesteijn N,et al.High-resolution association mapping of numberof teats in pigs reveals regions controlling vertebral development[J].BMCgenomics,2014,15(1):542。
12.Liu X,Huang M,Fan B,et al.Iterative Usage of Fixed and RandomEffect Models for Powerful and Efficient Genome-Wide Association Studies[J].Plos Genetics,2016,12(2):e1005767.v。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种与猪总***数性状相关的分子标记及应用
<141> 2019-09-04
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 201
<212> DNA
<213> 猪(sus scrofa)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(201)
<220>
<221> mutation
<222> (101)..(101)
<400> 1
ataatctatg cagtttattt tatttattca taacctgttt atgtgatgta tatttaacta 60
cagctaaaaa actggcccat taaaagaggt ccattagggc gttccctggt catccagtgc 120
ttcagatttg gcactttcac cactgtgcct gggaactgaa tttccacatt aagctgctgc 180
atactgctgc caaaaaaaaa a 201