CN110484518B - 一种自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体，所述氟化酶聚集体是通过自组装短肽标签和氟化酶相结合制备得到的。本氟化酶聚集体是一种利用自组装短肽标签的纳米级别的氟化酶，其能够提高催化效率，增强热稳定性以及具有重复使用性，该氟化酶聚集体能够应用在氟化物的生物转化催化剂方面中，同时，该氟化酶聚集体能够与核苷水解酶联用，直接催化底物无机氟离子(F‑)和S‑腺苷‑L‑甲硫氨酸(SAM)，生成5’‑FDR(氟化脱氧核糖)，进而能够潜在应用在制备正电子发射断层扫描的放射性示踪剂中。

Description

一种自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体及应用
技术领域
本发明属于蛋白质与酶工程技术领域，尤其是一种自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体及应用。
背景技术
随着基因组学和蛋白质组学的发展，越来越多的蛋白质通过基因重组技术，使用工程菌种进行表达纯化。所以，廉价、经济的蛋白质纯化方法的开发仍然是一项基本任务，蛋白质纯化也同样是生物技术的核心要求之一。在制药行业中，利用传统的色谱技术如离子交换、亲和色谱、凝胶过滤和反相色谱等纯化分离蛋白质，已经被很好地开发和使用。然而，这些年来，在实验室中，对于许多研究者来说，采用纯化标签来纯化蛋白质变得十分流行。这些标签主要基于亲和力，包括His标签，GST标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签和几丁质结合域(CBD)标签与内含肽介导的切割位点(IMPACT-CN)等。这些纯化标签通常能够使目的蛋白质含量达到约90％或更高的纯度，这样的纯度足以用于许多实验用途，例如测定酶学性质和蛋白质的表征。在这些纯化标签中，His-tag技术是无可争辩最常用的一种预填充镍柱来结合带His标签的靶蛋白，最终达到纯化的目的，这种方法使用很广泛，但是同样，使用镍柱也造成了蛋白纯化费用过高。因此，在近些年间，一类新的自组装短肽标签被用于蛋白质和多肽的无柱分离纯化。这些方法可用于快速地将目标蛋白质或多肽与背景杂质分离，并产生具有与His标签技术相当的产率和纯度的蛋白质或多肽，但不会使用昂贵的镍柱或树脂等，可以大幅度降低纯化蛋白的成本。
自组装短肽标签是具有亲水性残基和疏水性残基序列的一种双亲性短肽，在与目的蛋白结合后，能够促使目的蛋白自组装具有纳米尺寸的蛋白质聚集体。其中原理是具有自组装标签的蛋白质，在表达的过程中，由于标签造成的分子间扩散和一些特定的分子间作用力的改变如范德华力、疏水作用、金属配位键等，从而在这些改变之下，形成了具有稳定结构的自组装蛋白质聚集体。由于这种自组装蛋白质聚集体具有较为良好的性质，所以其在生物工程和技术领域具有十分重要的潜在价值，这也让在近十年间，越来越多的研究人员从事这方面的研究。
随着研究的深入，人们发现了这类自组装短肽标签的特点之后，设计了一类能够诱导蛋白聚集且聚集体的活性不降低、热稳定性提高、易于纯化分离等诸多优点的自组装短肽标签，即ELK16、L6KD和18A等。这一系列短肽标签最先由清华大学林章凛课题组设计及发现，并且ELK16标签是β-片层结构，18A标签为α-螺旋结构，L6KD标签是一种与表面活性剂类似，且不属于β-片层或者α-螺旋的结构。随后，这三种标签被率先应用于脂肪酸酶A、木糖苷酶等工业用酶，并发现这些酶的活性被很好地保留或者有所提高，同时这些自组装蛋白聚集体具有热稳定性更好、能够重复使用以及简化了纯化方法，降低了使用成本等优点，从而受到了人们越来越多的关注。同时，有研究者将标签18A与腈水解酶结合，并将之包埋到藻酸钙包封珠中，制备成固定化颗粒，发现固定化后的腈水解酶仍保留较高的活性，其稳定性能达到天然酶的10倍左右。这些应用都表明了，自组装短肽标签在酶与蛋白质工程中具有巨大的潜力及应用价值。
氟化酶(FIA)作为一种已发现的酶，其能够将无机氟离子(F-)催化到有机分子中形成碳-氟(C-F)键，生成有机氟化物。在2002年，英国David O’Hagan教授的研究小组从Streptomyces cattleya中分离出第一个天然氟化酶FIA(由flA基因编码)。它能够利用无机氟离子(F-)和S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)催化SN2生物亲核反应，生成5’-氟化脱氧腺苷(5’-FDA)和L-蛋氨酸。随着对氟化酶及其代谢通路的研究，从2014年到2016年，在不同菌种中确定了四个新的FIA酶。其中，在Streptomycesxinghaiensis中发现的FIA酶具有最优的酶学性质。这些可以通过它的酶动力学实验数据证明，在Streptomycesxinghaiensis中发现的FIA，其催化效率Kcat值为0.277±0.007min-1，比其他四种氟化酶的催化效率更高；而且酶的特异性常数达到39.5±1.51mM-1min-1，更是远高于其他氟化酶。因此，利用此氟化酶进行分子改造，以求获得性质更加优良的氟化酶，对于它的应用具有十分积极的意义。
正电子发射断层扫描(positron emission tomography，PET)是近年来发展成熟的一项医学成像技术，它能够提供三维和功能运动的图像，是核医学领域最先进的临床检查影像技术。该技术通过扫描检测被注射入或被吸入的放射物，产生人体局部或全身器官图像。因此，PET扫描需要预先制备放射性示踪剂，长久以来临床做常用的放射示踪物为氟-18(18F)标记的氟化葡萄糖(fluoro-D-glucose，FDG)。但是，其使用化学合成方法制备，成本较高，对环境有污染，并且需要严格的设备和熟悉操作的人员。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体及应用，该氟化酶聚集体是一种利用自组装短肽标签的纳米级别的氟化酶，其能够提高催化效率，增强热稳定性以及具有重复使用性，该氟化酶聚集体能够应用在氟化物的生物转化催化剂方面中，同时，该氟化酶聚集体能够与核苷水解酶联用，直接催化底物无机氟离子(F-)和S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)，生成5’-FDR(氟化脱氧核糖)，进而能够潜在应用在制备正电子发射断层扫描的放射性示踪剂中。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体，所述氟化酶聚集体是通过自组装短肽标签和氟化酶相结合制备得到的。
而且，所述氟化酶聚集体为FIA-ELK16，其编码基因的基因序列为SEQ NO.1，其编码基因的氨基酸序列为SEQ NO.2；
或者，所述氟化酶聚集体为FIA-L6KD，其编码基因的基因序列为SEQ NO.3，其编码基因的氨基酸序列为SEQ NO.4；
或者，所述氟化酶聚集体为FIA-18A，其编码基因的基因序列为SEQ NO.5，其编码基因的氨基酸序列为SEQ NO.6。
而且，所述FIA-ELK16、FIA-L6KD、FIA-18A的最适温度分别为40℃、50℃、60℃，最适pH值均为6.0。
而且，所述FIA-ELK16的尺寸为500-600nm；所述FIA-L6KD和FIA-18A的尺寸均为200-300nm。
而且，所述氟化酶聚集体的底物为S-腺苷-L-甲硫氨酸，即SAM。
而且，所述氟化酶聚集体的催化产物为5’-氟化脱氧腺苷，即5’-FDA。
而且，所述自组装短肽标签为ELK16、L6KD或18A。
如上所述的自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体的制备方法，步骤如下：
⑴通过查阅文献，获得自组装短肽标签的氨基酸序列，将其DNA编码序列经过优化，即根据大肠杆菌对密码子的偏好性，将其DNA编码序列经过优化，并在体外合成；
⑵通过重叠PCR技术，将合成的自组装肽的DNA序列连接到氟化酶的DNA编码序列的下游，即3’末端，氟化酶的DNA序列为SEQ NO.7，构成重组DNA序列；
⑶将重组DNA序列***到有卡那霉素抗性的质粒，构建重组质粒；
⑷重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，放入含50mg/mL卡那霉素的LB培养基、37℃培养直至OD600值为0.6，然后16℃诱导，加入0.05～0.1mM IPTG诱导表达24小时，收集细菌；
⑸再通过菌体破碎，离心收取沉淀，对沉淀物使用缓冲溶液洗脱三次后，将杂质除去，得到目的蛋白质，即为氟化酶聚集体。
如上所述的自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体在氟化物的生物转化催化剂方面中的应用。
如上所述的自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体在制备正电子发射断层扫描的放射性示踪剂中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明氟化酶聚集体是一种利用自组装短肽标签的纳米级别的氟化酶，其能够提高催化效率，增强热稳定性以及具有重复使用性，该氟化酶聚集体能够应用在氟化物的生物转化催化剂方面中和应用在制备正电子发射断层扫描的放射性示踪剂中。
2、本发明方法应用基因工程(genetic engineering)的方法，对可溶氟化酶进行分子改造，利用三种自组装短肽标签，构建能够提高酶的催化效率，增强热稳定性以及使其具有重复使用性的纳米级氟化酶。通过基因克隆方式得到三种质粒，将三种质粒分别转化进入大肠杆菌原核表达***高效异源表达，经过诱导表达与纯化，得到氟化酶聚集体。
3、本发明通过透射电镜的观察，证明所制备的三种氟化酶聚集体都形成了纳米级别的蛋白质颗粒。
4、本发明通过高效液相法测定了三种氟化酶聚集体的酶动力学参数，证明了三种氟化酶聚集体能够催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)，生成5’-氟化脱氧腺苷(5’-FDA)。并且，实验还证明，在三种氟化酶聚集体中FIA-L6KD，相较于可溶氟化酶，具有更高的催化效率，更强的热稳定性，并且可以重复利用。同时，根据构建的核苷水解酶，与氟化酶一起进行两步酶促反应，说明了具有利用同位素标记18F合成5’-18FDR放射性示踪剂(radiotracer)的潜力，从而用于正电子发射断层扫描(positron emission tomography，PET)之中。
利用氟-18(18F)标记的氟离子，通过氟化酶的催化，可生成5’-18FDA，再被一些酶(如：核苷水解酶)催化生成与氟化核糖有相同效果的放射性示踪剂5’-18FDR(5’-fluorodeoxyribose,5’-FDR)。采用这种生物合成的方法，不仅能够降低放射性示踪剂的生产成本，而且更加地绿色环保。所以，利用三种自组装短肽标签，对氟化酶进行分子改造，获得酶学性质更加优良的氟化酶，对PET的应用与推广也具有十分积极的意义。
5、本发明方法通过对酶分子水平的改造，制备纳米级的氟化酶聚集体，以提高酶的催化效率、热稳定性及使其具有重复使用性；该方法是利用自组装短肽标签，构建能够提高酶的催化效率，热稳定性和使其具有重复使用性的纳米级氟化酶聚集体，本发明提供的三种氟化酶聚集体(FIA-ELK16、FIA-L6KD、FIA-18A)在无机氟离子的存在下，能够催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)，生成5’-氟化脱氧腺苷(5’-FDA)。
6、本发明纳米级氟化酶聚集体可以制备成生物催化剂，应用于氟化物的生物转化；纳米级氟化酶聚集体还可以制备用于正电子发射断层扫描(positron emissiontomography,PET)的放射性示踪剂，使用范围广泛。
附图说明
图1为本发明中三种自组装肽标记的氟化酶聚集体FIA-ELK16、FIA-L6KD、FIA-18A可以催化的酶反应示意图；可以看出氟化酶聚集体能够利用无机氟离子(F-)，催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)，生成5’-氟化脱氧腺苷(5’-FDA)和L-蛋氨酸；
图2为本发明中使用透射电镜观察三种氟化酶聚集体FIA-ELK16、FIA-L6KD、FIA-18A的颗粒尺寸大小的结果图；图中表明三种氟化酶聚集体的颗粒尺寸大小在纳米级别；
图3为本发明中使用HPLC/LC-MS检测氟化酶聚集体反应产物的结果图；其中液相色谱图和质谱图对应图1中所列的酶反应产物5'-氟化脱氧腺苷(5’-FDA)，箭头所指为相应的酶反应产物的液相色谱信号，酶反应产物的结构及其分子量被附在质谱图上；
图4为本发明中三种氟化酶聚集体FIA-ELK16、FIA-L6KD、FIA-18A的纯化结果图；其中FIA-ELK16和FIA-L6KD能够有好的纯化，FIA-18A也能够纯化出来；
图5为本发明中三种氟化酶聚集体FIA-ELK16、FIA-L6KD、FIA-18A以S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作为底物得到的米曼氏酶动力学拟合曲线图；
图6为本发明中验证三种氟化酶聚集体FIA-ELK16、FIA-L6KD、FIA-18A具有重复使用性的结果图；
图7为本发明中三种氟化酶聚集体与核苷水解酶(TvNH)两步酶促反应结果图；其中，图7A为本发明中使用高效液相色谱检测两步酶促反应的产物腺嘌呤(AD)的结果图；图7B为本发明中使用液质联用仪检测腺嘌呤的分子量的结果图；图7C为本发明中两步酶促反应的5’-FDR的相对产率结果图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体，所述氟化酶聚集体是通过自组装短肽标签和氟化酶相结合制备得到的。
较优地，所述氟化酶聚集体为FIA-ELK16，其编码基因的基因序列为SEQ NO.1，其编码基因的氨基酸序列为SEQ NO.2；
或者，所述氟化酶聚集体为FIA-L6KD，其编码基因的基因序列为SEQ NO.3，其编码基因的氨基酸序列为SEQ NO.4；
或者，所述氟化酶聚集体为FIA-18A，其编码基因的基因序列为SEQ NO.5，其编码基因的氨基酸序列为SEQ NO.6。
较优地，所述FIA-ELK16、FIA-L6KD、FIA-18A的最适温度分别为40℃、50℃、60℃，最适pH值均为6.0。
较优地，所述FIA-ELK16的尺寸为500-600nm；所述FIA-L6KD和FIA-18A的尺寸均为200-300nm。
较优地，所述氟化酶聚集体的底物为S-腺苷-L-甲硫氨酸，即SAM。
较优地，所述氟化酶聚集体的催化产物为5’-氟化脱氧腺苷，即5’-FDA。
较优地，所述自组装短肽标签为ELK16、L6KD或18A。
如上所述的自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体的制备方法，步骤如下：
⑴通过查阅文献，获得自组装短肽标签的氨基酸序列，将其DNA编码序列经过优化，即根据大肠杆菌对密码子的偏好性，将其DNA编码序列经过优化，并在体外合成；
⑵通过重叠PCR技术，将合成的自组装肽的DNA序列连接到氟化酶的DNA编码序列的下游，即3’末端，氟化酶的DNA序列为SEQ NO.7，构成重组DNA序列；
⑶将重组DNA序列***到有卡那霉素抗性的质粒，构建重组质粒；
⑷重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，放入含50mg/mL卡那霉素的LB培养基、37℃培养直至OD值为0.6，然后16℃诱导，加入0.05～0.1mM IPTG诱导表达24小时，收集细菌；
⑸再通过菌体破碎，离心收取沉淀，对沉淀物使用缓冲溶液洗脱三次后，将杂质除去，得到目的蛋白质，即为氟化酶聚集体。
如上所述的自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体能够应用在氟化物的生物转化催化剂方面中。
如上所述的自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体能够应用在制备正电子发射断层扫描的放射性示踪剂中。
具体地，如上所述的自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体的制备方法，具体制备过程如下：
(1)通过查阅文献，获得三种自组装短肽标签ELK16、L6KD和18A的氨基酸序列，将其DNA编码序列经过优化，即根据大肠杆菌对密码子的偏好性，将其DNA编码序列经过优化，并在体外合成。
(2)通过重叠PCR技术，将合成的三种自组装肽的DNA序列分别连接到氟化酶的DNA编码序列的下游，即3’末端，氟化酶的DNA序列为SEQ NO.7，构成重组DNA序列。
(3)将重组DNA序列***到有卡那霉素抗性的质粒，构建重组质粒。
(4)重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，放入含50mg/mL卡那霉素的LB培养基、37℃培养直至OD600值为0.6，然后16℃诱导，加入0.05～0.1mM IPTG诱导表达24小时，收集细菌。
(5)再通过菌体破碎，离心收取沉淀，对沉淀物使用缓冲溶液洗脱三次后，将杂质除去，得到目的蛋白质，即为氟化酶聚集体，结果如图4所示，图中表明可溶氟化酶及三种氟化酶聚集体可以表达并纯化出来。
(6)氟化酶聚集体尺寸大小的研究：利用透射电镜观察所纯化的氟化酶聚集体，结果如图2所示，可以得到三种氟化酶聚集体都具有纳米级尺寸。
(7)酶学性质研究：对三种氟化酶聚集体进行酶学研究，发现其在KF(氟化钾)存在下，能够催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)，生成5’-氟化脱氧腺苷(5’-FDA)和L-蛋氨酸，结果如图1所示。利用高效液相法测定了三种氟化酶聚集体的酶学动力学参数，结果如图3所示，证明了三种氟化酶聚集体与可溶氟化酶相比，其中FIA-L6KD的催化效率更高。
(8)通过对三种氟化酶聚集体和可溶氟化酶进行热稳定性和可重复性实验，结果如图6所示，证明三种氟化酶聚集体中FIA-L6KD具有更强的热稳定性；并且三种氟化酶聚集体可以重复使用，九次以内仍有50％以上催化活性。
最后，利用所构建的核苷水解酶与氟化酶氟化酶聚集体进行两步酶促反应，揭示了具有利用同位素标记18F合成5’-18FDR放射性示踪剂的潜力。
更为具体的操作过程如下：
1.三种氟化酶聚集体序列的测定
三种自组装肽的基因序列，通过重叠PCR技术，分别连接到氟化酶序列下游，得到如序列1、3、5所述的基因，三种氟化酶聚集体氨基酸序列如下：
FIA-ELK16:
MSADPTQRPIIGFMSDLGTTDDSVAQCKGLMHSICPGVTVIDVCHSMTPWDVEEGARYIVDLPRFFPEGTVFATTTYPATGTETRSVAVRIKQAAKGGARGQWAGSAGGFERAEGSYIYVAPNNGLLTTVLEEHGYIEAYEVSSTKVIPERPEPTFYSREMVAIPAAHLAAGFPLSEVGRPLEDSEIVRYQPPQVEISGDTLTGVVSAIDHPYGNVWTNIHRTHLEKAGIGYGKRIKIILDDVLPFEQTLVPTFADAGEIGGVAAYLNSRGYLSLARNLASLAYPFNLKAGLKVRVETNPTPPTTPTPPTTPTPTPLELELKLKLELELKLK
FIA-L6KD:
MSADPTQRPIIGFMSDLGTTDDSVAQCKGLMHSICPGVTVIDVCHSMTPWDVEEGARYIVDLPRFFPEGTVFATTTYPATGTETRSVAVRIKQAAKGGARGQWAGSAGGFERAEGSYIYVAPNNGLLTTVLEEHGYIEAYEVSSTKVIPERPEPTFYSREMVAIPAAHLAAGFPLSEVGRPLEDSEIVRYQPPQVEISGDTLTGVVSAIDHPYGNVWTNIHRTHLEKAGIGYGKRIKIILDDVLPFEQTLVPTFADAGEIGGVAAYLNSRGYLSLARNLASLAYPFNLKAGLKVRVETNPTPPTTPTPPTTPTPTPLLLLLLKD
FIA-18A：
MSADPTQRPIIGFMSDLGTTDDSVAQCKGLMHSICPGVTVIDVCHSMTPWDVEEGARYIVDLPRFFPEGTVFATTTYPATGTETRSVAVRIKQAAKGGARGQWAGSAGGFERAEGSYIYVAPNNGLLTTVLEEHGYIEAYEVSSTKVIPERPEPTFYSREMVAIPAAHLAAGFPLSEVGRPLEDSEIVRYQPPQVEISGDTLTGVVSAIDHPYGNVWTNIHRTHLEKAGIGYGKRIKIILDDVLPFEQTLVPTFADAGEIGGVAAYLNSRGYLSLARNLASLAYPFNLKAGLKVRVETNPTPPTTPTPPTTPTPTPEWLKAFYEKVLEKLKELF。
2.三种氟化酶聚集体的质粒构建，过表达和纯化
将得到的三种氟化酶聚集体的DNA编码序列，通过双酶切，将基因***到质粒载体上，构建重组质粒。
重组质粒应用热休克方法转化入大肠杆菌BL21(DE3)。具体为将三种氟化酶聚集体的质粒和大肠杆菌转化态细胞分别混合均匀，42℃加热90秒进行转化。将分别含有三种氟化酶聚集体质粒的BL21(DE3)细胞放入含50mg/mL卡那霉素的LB培养基直至在600nm(OD600)的吸光度值达到0.6左右。将其冷却到室温，加入终浓度为0.05mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside，IPTG)，16℃培养24小时。
随后将细胞收集、裂解、离心，收集沉淀，用裂解缓冲液清洗三次，获得三种聚集体。随后纯化的蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析，随后以氟化酶为对照，通过灰度分析软件imageJ对聚集体定量。
3.高效液相仪(HPLC)和液质联用仪(LC-MS)检测酶反应产物
HPLC/LC-MS被用来检测三种氟化酶聚集体催化底物产生的酶反应产物。该反应在20mM，pH 7.8的磷酸盐缓冲液中进行。包含有氟化酶聚集体(0.5mg/mL)，KF(200mM)和底物SAM(200μM)，反应30分钟。反应结束后，向体系中加入质量浓度为10％的三氟乙酸以终止反应，再离心(12000rpm，10min)除去蛋白，上清液用于分析。
4.测定三种氟化酶聚集体的结构形态与尺寸大小
通过透色电镜(TEM)对三种氟化酶聚集体进行观察，以确定聚集体结构状态与尺寸大小。取10μL终浓度为0.5mg/mL的三种氟化酶聚集体以及其对照组可溶氟化酶，随后，分别移液到辉光放电的碳涂覆的铜网上，并在室温下(25℃)孵育60秒并用滤纸吸干。再将网格置于一滴磷钨酸(PTA，2％v/v，pH 7.0)上50秒。除去过量的PTA，用透射电子显微镜(TEM)观察样品。
5.三种氟化酶聚集体的酶动力学实验
通过高效液相法检测酶反应产物，以确定三种氟化酶聚集体的各自活性和酶动力学常数。酶反应由加入的氟化酶聚集体(终浓度为0.5mg/mL)激活。反应体系为磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7.8)，其中加入200mM KF，底物浓度为0μM到800μM。随后，在同一底物下，取不同时间点的反应产物，使用高效液相仪检测。
通过检测所得，绘制不同底物浓度下的酶反应曲线，以确定在不同浓度下，酶反应的最初速度(以5’-FDA的生成速度计)，制作米曼氏酶动力学曲线。最终得Vmax、Km、Kcat和特异性常数(specificity constant)这些酶动力学常数，结果如图5所示。
表1为三种氟化酶聚集体和可溶氟化酶以S-腺苷-L-甲硫氨酸作为底物得到的米曼氏酶动力学参数
6.测定三种氟化酶聚集体的热稳定性和可重复使用性
通过测定三种氟化酶聚集体的半衰期(t1/2)，以确定其在不同温度下的热稳定性。在不同温度下，将三种包涵体氟化酶分别保存相应时间，然后进行酶促反应。反应体系为磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7.8)，包含包含有氟化酶聚集体(0.5mg/mL)，KF(200mM)和底物SAM(200μM)，反应30分钟。随后，经过高效液相色谱仪检测反应产物，确定产物浓度，绘制酶活性曲线，再根据公式t1/2＝ln2/kd计算可得三种氟化酶聚集体在不同温度下的半衰期时间。
由于三种氟化酶聚集体在酶促反应结束后，可通过高速离心使其与反应产物分离，从而达到可重复使用的目的。
表2为三种氟化酶聚集体和可溶氟化酶的半衰期(t1/2)。
此外，氟化酶聚集体的反应产物5’-FDA能够作为底物，在核苷水解酶的作用下，经酶促反应生成5’-FDR，和其他下游物质(如多肽，抗体，亲和体分子等)进行生物共轭交联(bio-conjugation)，以此具有引入同位素标记18F的潜在能力。此18F标记物可以作为放射示踪物(radiotracer)用于正电子发射断层扫描(positron emission tomography,PET)。
7. 5’-FDR的生物合成
将三种氟化酶聚集体分别置于其各自最适温度下，按照上述酶促反应体系，进行反应60min，反应结束后，通过95℃，5min对体系中的酶灭活，通过离心(13000r/min，10min)，收集反应液。取反应液200μL，向其中加入终浓度为0.5mg/mL的Trypanosoma vivax核苷水解酶(TvNH)，加水定容至400μL，37℃反应60min后，通过95℃，5min对体系中的酶灭活，通过离心(13000r/min，10min)，收集反应液，用于HPLC和LC/MS的检测。
SAM在氟化酶的催化下生成5’-FDA，然后其在TvNH的催化下，生成两种反应产物5’-FDR和腺嘌呤(AD)，且两种产物的比例为1：1。由于5’-FDR不具有紫外吸收，而AD在260nm处有较强的紫外吸收，所以利用检测AD的含量，即可知5’-FDR的生成量。结果如图7A所示，AD标准品的保留时间在6min左右，四种氟化酶的反应产物与标准品保留时间一致，说明四种氟化酶与TvNH经过两步酶促反应，能够产生5’-FDR。为了进一步验证反应产物中有AD，经过LC-MS检测，如图7B所示，该处的[M+H]+＝136.1，而AD的相对分子质量为M＝135.1，理论计算[M+H]+＝136.1，与检测结果一致。因此，再次说明TvNH能够催化5’-FDA生成5’-FDR。
同时，利用HPLC对反应产物AD定量，即为5’-FDR的产量，以可溶氟化酶FIA为对照，四种氟化酶和TvNH通过两步酶促反应生成5’-FDR的相对产率如图7C所示。由图可得，在一定的时间里，由于FIA-18A的最大反应速率较高，所以其产生的5’-FDA最多，导致5’-FDR的相对产率较高；FIA-L6KD的最大反应速率与FIA相近，所以两者5’-FDR的相对产率基本相同。这一实验，也表明了可以直接利用SAM，经过两步酶促反应，直接产生5’-FDR。验证了利用氟化酶，能够潜在的生成[18F]-氟化物，应用于PET的可行性。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列
所述氟化酶聚集体为FIA-ELK16，其编码基因的基因序列为SEQ NO.1：
atgtctgcggacccgacccagcgcccgatcattggcttcatgtctgacctgggcactaccgacgactccgtggcgcagtgcaaaggtctgatgcactctatctgcccgggtgttaccgttatcgacgtttgccacagcatgaccccgtgggacgttgaagaaggtgctcgttacatcgttgacctgccgcgcttcttcccggagggcactgttttcgcgaccaccacctacccggcgaccggtactgaaacccgtagcgttgcggttcgcatcaaacaggcggcgaaaggcggtgcgcgtggccagtgggcgggttccgcgggtggtttcgaacgtgcggaaggttcttacatctacgttgcaccgaacaacggcctgctgaccaccgttctggaggagcacggctacatcgaagcgtacgaagtttcttctaccaaagttatcccggaacgtccggaaccgactttctattctcgtgaaatggttgcgatcccggcagcgcacctggcagctggtttcccgctgtctgaagttggtcgtccgctggaagattctgaaatcgttcgttatcagccgccgcaggtggaaatcagcggtgacaccctgaccggtgttgtttctgcgatcgaccatccgttcggtaacgtttggaccaacatccaccgtacccacctggaaaaagcgggtatcggttacggtaaacgtatcaaaatcatcctggacgacgttctgccgtttgagcagaccctggttccgaccttcgcggatgctggtgaaattggcggcgtggcagcgtatctgaactctcgtggttacctgtctctggcgcgtaacgcggcatccctggcgtatccgtttaacctgaaggcgggtctgaaagttcgtgttgaaaccaacccgacaccacctactacaccgacgccgcctaccacgccaaccccgactcctctggaattggaactgaaactgaaattagaacttgaattaaaacttaaataa
其编码基因的氨基酸序列为SEQ NO.2：
MSADPTQRPIIGFMSDLGTTDDSVAQCKGLMHSICPGVTVIDVCHSMTPWDVEEGARYIVDLPRFFPEGTVFATTTYPATGTETRSVAVRIKQAAKGGARGQWAGSAGGFERAEGSYIYVAPNNGLLTTVLEEHGYIEAYEVSSTKVIPERPEPTFYSREMVAIPAAHLAAGFPLSEVGRPLEDSEIVRYQPPQVEISGDTLTGVVSAIDHPYGNVWTNIHRTHLEKAGIGYGKRIKIILDDVLPFEQTLVPTFADAGEIGGVAAYLNSRGYLSLARNLASLAYPFNLKAGLKVRVETNPTPPTTPTPPTTPTPTPLELELKLKLELELKLK；
所述氟化酶聚集体为FIA-L6KD，其编码基因的基因序列为SEQ NO.3：
atgtctgcggacccgacccagcgcccgatcattggcttcatgtctgacctgggcactaccgacgactccgtggcgcagtgcaaaggtctgatgcactctatctgcccgggtgttaccgttatcgacgtttgccacagcatgaccccgtgggacgttgaagaaggtgctcgttacatcgttgacctgccgcgcttcttcccggagggcactgttttcgcgaccaccacctacccggcgaccggtactgaaacccgtagcgttgcggttcgcatcaaacaggcggcgaaaggcggtgcgcgtggccagtgggcgggttccgcgggtggtttcgaacgtgcggaaggttcttacatctacgttgcaccgaacaacggcctgctgaccaccgttctggaggagcacggctacatcgaagcgtacgaagtttcttctaccaaagttatcccggaacgtccggaaccgactttctattctcgtgaaatggttgcgatcccggcagcgcacctggcagctggtttcccgctgtctgaagttggtcgtccgctggaagattctgaaatcgttcgttatcagccgccgcaggtggaaatcagcggtgacaccctgaccggtgttgtttctgcgatcgaccatccgttcggtaacgtttggaccaacatccaccgtacccacctggaaaaagcgggtatcggttacggtaaacgtatcaaaatcatcctggacgacgttctgccgtttgagcagaccctggttccgaccttcgcggatgctggtgaaattggcggcgtggcagcgtatctgaactctcgtggttacctgtctctggcgcgtaacgcggcatccctggcgtatccgtttaacctgaaggcgggtctgaaagttcgtgttgaaaccaacccgacccctccaaccacacctacaccgcctacgacaccgacgccaacgccgttactgctgttattactgaaagattaa
其编码基因的氨基酸序列为SEQ NO.4：
MSADPTQRPIIGFMSDLGTTDDSVAQCKGLMHSICPGVTVIDVCHSMTPWDVEEGARYIVDLPRFFPEGTVFATTTYPATGTETRSVAVRIKQAAKGGARGQWAGSAGGFERAEGSYIYVAPNNGLLTTVLEEHGYIEAYEVSSTKVIPERPEPTFYSREMVAIPAAHLAAGFPLSEVGRPLEDSEIVRYQPPQVEISGDTLTGVVSAIDHPYGNVWTNIHRTHLEKAGIGYGKRIKIILDDVLPFEQTLVPTFADAGEIGGVAAYLNSRGYLSLARNLASLAYPFNLKAGLKVRVETNPTPPTTPTPPTTPTPTPLLLLLLKD；
所述氟化酶聚集体为FIA-18A，其编码基因的基因序列为SEQ NO.5：
atgtctgcggacccgacccagcgcccgatcattggcttcatgtctgacctgggcactaccgacgactccgtggcgcagtgcaaaggtctgatgcactctatctgcccgggtgttaccgttatcgacgtttgccacagcatgaccccgtgggacgttgaagaaggtgctcgttacatcgttgacctgccgcgcttcttcccggagggcactgttttcgcgaccaccacctacccggcgaccggtactgaaacccgtagcgttgcggttcgcatcaaacaggcggcgaaaggcggtgcgcgtggccagtgggcgggttccgcgggtggtttcgaacgtgcggaaggttcttacatctacgttgcaccgaacaacggcctgctgaccaccgttctggaggagcacggctacatcgaagcgtacgaagtttcttctaccaaagttatcccggaacgtccggaaccgactttctattctcgtgaaatggttgcgatcccggcagcgcacctggcagctggtttcccgctgtctgaagttggtcgtccgctggaagattctgaaatcgttcgttatcagccgccgcaggtggaaatcagcggtgacaccctgaccggtgttgtttctgcgatcgaccatccgttcggtaacgtttggaccaacatccaccgtacccacctggaaaaagcgggtatcggttacggtaaacgtatcaaaatcatcctggacgacgttctgccgtttgagcagaccctggttccgaccttcgcggatgctggtgaaattggcggcgtggcagcgtatctgaactctcgtggttacctgtctctggcgcgtaacgcggcatccctggcgtatccgtttaacctgaaggcgggtctgaaagttcgtgttgaaaccaacccaacccctccgacaacaccgacgccaccgaccacgcctacacctacgccggaatggctgaaagcattttatgaaaaagtgct ggaaaaattaaaagaactgttttaa
其编码基因的氨基酸序列为SEQ NO.6：
MSADPTQRPIIGFMSDLGTTDDSVAQCKGLMHSICPGVTVIDVCHSMTPWDVEEGARYIVDLPRFFPEGTVFATTTYPATGTETRSVAVRIKQAAKGGARGQWAGSAGGFERAEGSYIYVAPNNGLLTTVLEEHGYIEAYEVSSTKVIPERPEPTFYSREMVAIPAAHLAAGFPLSEVGRPLEDSEIVRYQPPQVEISGDTLTGVVSAIDHPYGNVWTNIHRTHLEKAGIGYGKRIKIILDDVLPFEQTLVPTFADAGEIGGVAAYLNSRGYLSLARNLASLAYPFNLKAGLKVRVETNPTPPTTPTPPTTPTPTPEWLKAFYEKVLEKLKELF。
氟化酶的DNA序列为SEQ NO.7：
Atgtctgcggacccgacccagcgcccgatcattggcttcatgtctgacctgggcactaccgacgactccgtggcgcagtgcaaaggtctgatgcactctatctgcccgggtgttaccgttatcgacgtttgccacagcatgaccccgtgggacgttgaagaaggtgctcgttacatcgttgacctgccgcgcttcttcccggagggcactgttttcgcgaccaccacctacccggcgaccggtactgaaacccgtagcgttgcggttcgcatcaaacaggcggcgaaaggcggtgcgcgtggccagtgggcgggttccgcgggtggtttcgaacgtgcggaaggttcttacatctacgttgcaccgaacaacggcctgctgaccaccgttctggaggagcacggctacatcgaagcgtacgaagtttcttctaccaaagttatcccggaacgtccggaaccgactttctattctcgtgaaatggttgcgatcccggcagcgcacctggcagctggtttcccgctgtctgaagttggtcgtccgctggaagattctgaaatcgttcgttatcagccgccgcaggtggaaatcagcggtgacaccctgaccggtgttgtttctgcgatcgaccatccgttcggtaacgtttggaccaacatccaccgtacccacctggaaaaagcgggtatcggttacggtaaacgtatcaaaatcatcctggacgacgttctgccgtttgagcagaccctggttccgaccttcgcggatgctggtgaaattggcggcgtggcagcgtatctgaactctcgtggttacctgtctctggcgcgtaacgcggcatccctggcgtatccgtttaacctgaaggcgggtctgaaagttcgtgttgaaaccaac。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 999
<212> DNA/RNA
<213> 氟化酶聚集体为FIA-ELK16的编码基因的基因序列(Unknown)
<400> 1
atgtctgcgg acccgaccca gcgcccgatc attggcttca tgtctgacct gggcactacc 60
gacgactccg tggcgcagtg caaaggtctg atgcactcta tctgcccggg tgttaccgtt 120
atcgacgttt gccacagcat gaccccgtgg gacgttgaag aaggtgctcg ttacatcgtt 180
gacctgccgc gcttcttccc ggagggcact gttttcgcga ccaccaccta cccggcgacc 240
ggtactgaaa cccgtagcgt tgcggttcgc atcaaacagg cggcgaaagg cggtgcgcgt 300
ggccagtggg cgggttccgc gggtggtttc gaacgtgcgg aaggttctta catctacgtt 360
gcaccgaaca acggcctgct gaccaccgtt ctggaggagc acggctacat cgaagcgtac 420
gaagtttctt ctaccaaagt tatcccggaa cgtccggaac cgactttcta ttctcgtgaa 480
atggttgcga tcccggcagc gcacctggca gctggtttcc cgctgtctga agttggtcgt 540
ccgctggaag attctgaaat cgttcgttat cagccgccgc aggtggaaat cagcggtgac 600
accctgaccg gtgttgtttc tgcgatcgac catccgttcg gtaacgtttg gaccaacatc 660
caccgtaccc acctggaaaa agcgggtatc ggttacggta aacgtatcaa aatcatcctg 720
gacgacgttc tgccgtttga gcagaccctg gttccgacct tcgcggatgc tggtgaaatt 780
ggcggcgtgg cagcgtatct gaactctcgt ggttacctgt ctctggcgcg taacgcggca 840
tccctggcgt atccgtttaa cctgaaggcg ggtctgaaag ttcgtgttga aaccaacccg 900
acaccaccta ctacaccgac gccgcctacc acgccaaccc cgactcctct ggaattggaa 960
ctgaaactga aattagaact tgaattaaaa cttaaataa 999
<210> 2
<211> 332
<212> PRT
<213> 氟化酶聚集体为FIA-ELK16的编码基因的氨基酸序列(Unknown)
<400> 2
Met Ser Ala Asp Pro Thr Gln Arg Pro Ile Ile Gly Phe Met Ser Asp
1 5 10 15
Leu Gly Thr Thr Asp Asp Ser Val Ala Gln Cys Lys Gly Leu Met His
20 25 30
Ser Ile Cys Pro Gly Val Thr Val Ile Asp Val Cys His Ser Met Thr
35 40 45
Pro Trp Asp Val Glu Glu Gly Ala Arg Tyr Ile Val Asp Leu Pro Arg
50 55 60
Phe Phe Pro Glu Gly Thr Val Phe Ala Thr Thr Thr Tyr Pro Ala Thr
65 70 75 80
Gly Thr Glu Thr Arg Ser Val Ala Val Arg Ile Lys Gln Ala Ala Lys
85 90 95
Gly Gly Ala Arg Gly Gln Trp Ala Gly Ser Ala Gly Gly Phe Glu Arg
100 105 110
Ala Glu Gly Ser Tyr Ile Tyr Val Ala Pro Asn Asn Gly Leu Leu Thr
115 120 125
Thr Val Leu Glu Glu His Gly Tyr Ile Glu Ala Tyr Glu Val Ser Ser
130 135 140
Thr Lys Val Ile Pro Glu Arg Pro Glu Pro Thr Phe Tyr Ser Arg Glu
145 150 155 160
Met Val Ala Ile Pro Ala Ala His Leu Ala Ala Gly Phe Pro Leu Ser
165 170 175
Glu Val Gly Arg Pro Leu Glu Asp Ser Glu Ile Val Arg Tyr Gln Pro
180 185 190
Pro Gln Val Glu Ile Ser Gly Asp Thr Leu Thr Gly Val Val Ser Ala
195 200 205
Ile Asp His Pro Tyr Gly Asn Val Trp Thr Asn Ile His Arg Thr His
210 215 220
Leu Glu Lys Ala Gly Ile Gly Tyr Gly Lys Arg Ile Lys Ile Ile Leu
225 230 235 240
Asp Asp Val Leu Pro Phe Glu Gln Thr Leu Val Pro Thr Phe Ala Asp
245 250 255
Ala Gly Glu Ile Gly Gly Val Ala Ala Tyr Leu Asn Ser Arg Gly Tyr
260 265 270
Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Ala Ser Leu Ala Tyr Pro Phe Asn Leu
275 280 285
Lys Ala Gly Leu Lys Val Arg Val Glu Thr Asn Pro Thr Pro Pro Thr
290 295 300
Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Leu Glu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Lys Leu Lys Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys
325 330
<210> 3
<211> 975
<212> DNA/RNA
<213> 氟化酶聚集体为FIA-L6KD的编码基因的基因序列(Unknown)
<400> 3
atgtctgcgg acccgaccca gcgcccgatc attggcttca tgtctgacct gggcactacc 60
gacgactccg tggcgcagtg caaaggtctg atgcactcta tctgcccggg tgttaccgtt 120
atcgacgttt gccacagcat gaccccgtgg gacgttgaag aaggtgctcg ttacatcgtt 180
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<210> 4
<211> 324
<212> PRT
<213> 氟化酶聚集体为FIA-L6KD的编码基因的氨基酸序列(Unknown)
<400> 4
Met Ser Ala Asp Pro Thr Gln Arg Pro Ile Ile Gly Phe Met Ser Asp
1 5 10 15
Leu Gly Thr Thr Asp Asp Ser Val Ala Gln Cys Lys Gly Leu Met His
20 25 30
Ser Ile Cys Pro Gly Val Thr Val Ile Asp Val Cys His Ser Met Thr
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180 185 190
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Asp Asp Val Leu Pro Phe Glu Gln Thr Leu Val Pro Thr Phe Ala Asp
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260 265 270
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<400> 5
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195 200 205
Ile Asp His Pro Tyr Gly Asn Val Trp Thr Asn Ile His Arg Thr His
210 215 220
Leu Glu Lys Ala Gly Ile Gly Tyr Gly Lys Arg Ile Lys Ile Ile Leu
225 230 235 240
Asp Asp Val Leu Pro Phe Glu Gln Thr Leu Val Pro Thr Phe Ala Asp
245 250 255
Ala Gly Glu Ile Gly Gly Val Ala Ala Tyr Leu Asn Ser Arg Gly Tyr
260 265 270
Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Ala Ser Leu Ala Tyr Pro Phe Asn Leu
275 280 285
Lys Ala Gly Leu Lys Val Arg Val Glu Thr Asn Pro Thr Pro Pro Thr
290 295 300
Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Glu Trp Leu Lys
305 310 315 320
Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu Leu Phe
325 330
<210> 7
<211> 897
<212> DNA/RNA
<213> 氟化酶的DNA序列(Unknown)
<400> 7
atgtctgcgg acccgaccca gcgcccgatc attggcttca tgtctgacct gggcactacc 60
gacgactccg tggcgcagtg caaaggtctg atgcactcta tctgcccggg tgttaccgtt 120
atcgacgttt gccacagcat gaccccgtgg gacgttgaag aaggtgctcg ttacatcgtt 180
gacctgccgc gcttcttccc ggagggcact gttttcgcga ccaccaccta cccggcgacc 240
ggtactgaaa cccgtagcgt tgcggttcgc atcaaacagg cggcgaaagg cggtgcgcgt 300
ggccagtggg cgggttccgc gggtggtttc gaacgtgcgg aaggttctta catctacgtt 360
gcaccgaaca acggcctgct gaccaccgtt ctggaggagc acggctacat cgaagcgtac 420
gaagtttctt ctaccaaagt tatcccggaa cgtccggaac cgactttcta ttctcgtgaa 480
atggttgcga tcccggcagc gcacctggca gctggtttcc cgctgtctga agttggtcgt 540
ccgctggaag attctgaaat cgttcgttat cagccgccgc aggtggaaat cagcggtgac 600
accctgaccg gtgttgtttc tgcgatcgac catccgttcg gtaacgtttg gaccaacatc 660
caccgtaccc acctggaaaa agcgggtatc ggttacggta aacgtatcaa aatcatcctg 720
gacgacgttc tgccgtttga gcagaccctg gttccgacct tcgcggatgc tggtgaaatt 780
ggcggcgtgg cagcgtatct gaactctcgt ggttacctgt ctctggcgcg taacgcggca 840
tccctggcgt atccgtttaa cctgaaggcg ggtctgaaag ttcgtgttga aaccaac 897

Claims (3)

1.一种自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体，其特征在于：所述氟化酶聚集体是通过自组装短肽标签和氟化酶相结合制备得到的；
所述氟化酶聚集体为FIA-ELK16，其编码基因的基因序列为SEQ NO.1，其编码基因的氨基酸序列为SEQ NO.2；
或者，所述氟化酶聚集体为FIA-L6KD，其编码基因的基因序列为SEQ NO.3，其编码基因的氨基酸序列为SEQ NO.4；
或者，所述氟化酶聚集体为FIA-18A，其编码基因的基因序列为SEQ NO.5，其编码基因的氨基酸序列为SEQ NO.6；
所述FIA-ELK16、FIA-L6KD、FIA-18A的最适温度分别为40℃、50℃、60℃，最适pH值均为6.0；
所述FIA-ELK16的尺寸为500-600nm；所述FIA-L6KD和FIA-18A的尺寸均为200-300nm；
所述氟化酶聚集体的底物为S-腺苷-L-甲硫氨酸，即SAM；
所述氟化酶聚集体的催化产物为5’-氟化脱氧腺苷，即5’-FDA；
所述自组装短肽标签为ELK16、L6KD或18A；
所述的自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体的制备方法，步骤如下：
⑴通过查阅文献，获得自组装短肽标签的氨基酸序列，将其DNA编码序列经过优化，即根据大肠杆菌对密码子的偏好性，将其DNA编码序列经过优化，并在体外合成；
⑵通过重叠PCR技术，将合成的自组装肽的DNA序列连接到氟化酶的DNA编码序列的下游，即3’末端，氟化酶的DNA序列为SEQ NO.7，构成重组DNA序列；
⑶将重组DNA序列***到有卡那霉素抗性的质粒，构建重组质粒；
⑷重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，放入含50mg/mL卡那霉素的LB培养基、37℃培养直至OD600值为0.6，然后16℃诱导，加入0.05～0.1mM IPTG诱导表达24小时，收集细菌；
⑸再通过菌体破碎，离心收取沉淀，对沉淀物使用缓冲溶液洗脱三次后，将杂质除去，得到目的蛋白质，即为氟化酶聚集体；
所述氟化酶聚集体能够利用无机氟离子F-，催化S-腺苷-L-甲硫氨酸SAM，生成5’-氟化脱氧腺苷5’-FDA)和L-蛋氨酸；
所述FIA-ELK16、FIA-L6KD、FIA-18A以S-腺苷-L-甲硫氨酸作为底物得到的米曼氏酶动力学参数为：
所述FIA-ELK16、FIA-L6KD、FIA-18A的半衰期(t1/2)为：
所述FIA-ELK16、FIA-L6KD、FIA-18A能够重复使用。
2.如权利要求1所述的自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体在氟化物的生物转化催化剂方面中的应用。
3.如权利要求1所述的自组装短肽标签标记的氟化酶聚集体在制备正电子发射断层扫描的放射性示踪剂中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104755502A (zh) * 2012-10-12 2015-07-01 清华大学 多肽的产生和纯化方法
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104755502A (zh) * 2012-10-12 2015-07-01 清华大学 多肽的产生和纯化方法
CN108570439A (zh) * 2017-03-13 2018-09-25 浙江京新药业股份有限公司 氧化还原酶的融合蛋白、基因工程菌及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Self-assembled nano-aggregates of fluorinases demonstrate enhanced enzymatic activity, thermostability and reusability;Chunhao Tu等;《Biomater. Sci》;20191125;全文 *
海洋链霉菌Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674中氟化酶的研究;李玉峰;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20170715;正文第6-7、16、25、60页 *
自组装氟化酶聚集体的表达纯化及催化活性研究;屠春浩;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20200715;全文 *
自组装短肽诱导酶活性聚集体的分离纯化及其稳定性研究;徐天旺;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20190115;摘要 *

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