CN110478381A

CN110478381A - 柳叶腊梅的醇提取物在制备抗生素调节剂中的应用

Info

Publication number: CN110478381A
Application number: CN201910844041.1A
Authority: CN
Inventors: 王文君; 王宁; 欧阳克蕙; 李景恩; 刘鑫; 张清峰; 安琪; 郑国栋; 韩艺
Original assignee: Jiangxi Agricultural University
Current assignee: Jiangxi Agricultural University
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2019-09-06
Publication date: 2019-11-22
Also published as: AU2020102144A4

Abstract

本发明提供了柳叶腊梅的醇提取物在制备抗生素调节剂中的应用，涉及植物源抗生素调节剂技术领域。本发明提供的柳叶腊梅的醇提取物在制备抗生素调节剂中的应用。本发明提供的柳叶腊梅的醇提物中总黄酮纯度达70％以上，其与抗生素协同联用，抑菌效率高，绿色安全，细菌不易产生耐药性，降低抗生素的用量，节约成本。

Description

柳叶腊梅的醇提取物在制备抗生素调节剂中的应用

技术领域

本发明涉及植物源抗生素调节剂技术领域，具体涉及柳叶腊梅的醇提取物在制备抗生素调节剂中的应用。

背景技术

由于处方不当、农用抗生素滥用和新型抗生素更新慢，所有的抗生素最终都要面临耐药性危机。传统抗生素易产生细菌耐药性的问题。

植物成分与传统抗生素协同联用，安全高效，不仅能克服天然产物抑菌性低的缺点，且细菌不易产生耐药性，延长抗生素的时效性。植物资源丰富，价廉易得。植物成分与抗生素协同联用，抑菌效率高，绿色安全；植物成分提取操作简便，不污染环境；植物成分丰富，各成分协同作用，不易使细菌产生耐药性；降低抗生素用量，节约成本，降低对人体的代谢毒性。将植物成分开发为抗生素调节剂具有药用价值和经济价值。但现有技术中还未发现有关将柳叶腊梅的醇提物开发为抗生素调节剂的有关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供柳叶腊梅的醇提取物在制备抗生素调节剂中的应用。本发明提供的柳叶腊梅的醇提取物与抗生素具有极好的协同效果，抑菌效率高，细菌不易产生耐药性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了柳叶腊梅的醇提取物在制备抗生素调节剂中的应用。

优选地，所述柳叶腊梅的醇提取物的制备方法包括以下步骤：将柳叶腊梅的叶粉碎后，将得到的粉碎物用乙醇溶液进行超声提取，得到提取液；将所述提取液浓缩后，得到浓缩液；将所述浓缩液经吸附树脂进行分离纯化，得到柳叶腊梅的醇提取物。

优选地，所述粉碎物的粒径≤250μm。

优选地，所述提取液的制备方法包括：将所述粉碎物用乙醇溶液进行超声提取、过滤，得到第一滤渣和第一滤液；将所述得到的第一滤渣用乙醇溶液进行超声提取、过滤，得到第二滤渣和第二滤液；将所述第一滤液和第二滤液混合后，得到提取液。

优选地，所述粉碎物的质量与乙醇溶液的体积比为1g:(12～24)mL；所述第一滤渣的质量与乙醇溶液的体积比为1g:(5～10)mL；所述乙醇溶液的体积分数为50％～60％。

优选地，所述超声提取的条件包括：所述超声提取的温度为50～60℃，所述超声提取的时间为30～60min，所述超声提取的功率为160～240W。

优选地，所述所述浓缩液占提取液体积的15％～25％。

优选地，所述浓缩液经吸附树脂进行分离纯化使用的解析液为乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积分数为40％～95％；所述浓缩液的质量和解析液的体积比为1g:(12～20)mL。

本发明提供了柳叶腊梅的醇提取物在制备抗生素调节剂中的应用。本发明提供的醇提物中总黄酮纯度达70％以上，其与抗生素协同联用，抑菌效率高，绿色安全，细菌不易产生耐药性，降低抗生素的用量，节约成本。

具体实施方式

在本发明中，所述柳叶腊梅的醇提取物的制备方法优选包括以下步骤：将柳叶腊梅的叶粉碎后，将得到的粉碎物用乙醇溶液进行超声提取，得到提取液；将所述提取液浓缩后，得到浓缩液；将所述浓缩液经吸附树脂进行分离纯化，得到柳叶腊梅的醇提取物。

本发明对所述柳叶腊梅的叶的粉碎的方法没有特殊限定，采用常规粉碎的方法即可。在本发明中，所述柳叶腊梅的叶优选洗净晾干，晒成干叶后进行粉碎。在本发明中，所述粉碎物的粒径优选为≤250μm。在本发明中，将柳叶腊梅叶粉碎成粉末，能够增加原料的比表面积，使其能够与乙醇溶液充分接触，提高提取效率。

本发明将所述粉碎物用乙醇溶液进行超声提取，得到提取液。在本发明中，所述提取液的制备方法优选包括：将所述柳叶腊梅粉碎物用乙醇溶液进行超声提取、过滤，得到第一滤渣和第一滤液；将所述得到的第一滤渣用乙醇溶液进行超声提取、过滤，得到第二滤渣和第二滤液；将所述第一滤液和第二滤液混合后，得到提取液。本发明优选采用两次超声提取的目的是为了获得最佳的提取率。

在本发明中，所述乙醇溶液的体积分数优选为50％～60％，更优选为55％。在本发明中，所述粉碎物的质量与乙醇溶液的体积比优选为1g:(12～24)mL，更优选为1g:(15～20)mL；所述第一滤渣的质量与乙醇溶液的体积比优选为1g:(5～10)mL，更优选为1g:(6～8)mL。

在本发明中，所述超声提取的条件优选包括：所述超声提取的温度为50～60℃，优选为55℃；超声提取的时间为30～60min，优选为40～50min，更优选为45min；超声提取的功率为160～240W，优选为180～220W，更优选为200W。在本发明中，利用超声辅助乙醇溶液提取柳叶腊梅的叶的有效成分，超声波强烈的空化效应、机械振动、破碎作用，可以使柳叶腊梅的叶细胞壁形成较多的小孔，增强细胞膜的通透性，利于柳叶腊梅的叶细胞内物质的溶出；超声波产生的热效应、湍动效应，使柳叶腊梅的叶粉末与乙醇溶液充分接触，加速有效成分的溶出，提高提取效率，节约时间；溶液中有效成分的大量溶出，使提取物的抑菌活性显著增加。

本发明将所述提取液浓缩后，得到浓缩液。本发明对所述浓缩的方法没有特殊限定采用本领域常规浓缩方法即可。在本发明中，所述浓缩液优选占提取液体积的15％～25％，更优选为20％。

本发明将所述浓缩液经吸附树脂进行分离纯化，得到柳叶腊梅的醇提取物。在本发明中，所述吸附树脂优选为聚酰胺树脂，聚酰胺树脂是缩聚型的高分子化合物，耐酸碱、有机溶剂；黄酮类化合物富含酚羟基，通过分子中的酚羟基与聚酰胺分子中的酰胺基形成氢键缔合产生吸附；聚酰胺柱层析法工艺操作简单，并且树脂可循环使用，成本不高，设备较简单；聚酰胺柱层析法极大地提高有效成分的得率和纯度，提高了提取物的抑菌活性。

在本发明中，所述浓缩液经吸附树脂进行分离纯化使用的解析液优选为乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积分数优选为40％～95％，更优选为50％～90％；所述浓缩液的质量和解析液的体积比优选为1g:(12～20)mL，更优选为1g:(15～18)mL。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

柳叶腊梅的醇提取物提取方法包括粉碎、乙醇浸提、纯化、干燥，具体步骤为：

1)粉碎：取柳叶腊梅的叶，洗净晾干，晒成干叶，放入粉碎机中5min，粉碎后过60目筛；

2)乙醇浸提：取粉碎后的柳叶腊梅叶粉末，按料液比为1：24(g/mL)加入乙醇溶剂，超声时间为60min；待超声完成，抽滤，再按料液比为1：5(g/mL)向滤渣中加入乙醇溶剂超声30min，抽滤，合并两次滤液，浓缩至两次滤液总体积的1/5；提取溶剂为52％乙醇溶液；超声提取温度是55℃，超声功率为200W；

3)纯化：按料液比1：15(g/mL)将浓缩液加入吸附树脂中，经水层(WE)、30％(30％EE)、50％(50％EE)、70％(70％EE)、95％(95％EE)乙醇溶液解析，解析液浓缩回收乙醇，冷冻干燥得粉末样品；吸附树脂为聚酰胺树脂，水洗用量为1BV，流速为1BV/h；

4)干燥：采用真空冷冻干燥设备进行干燥。

实施例2

采用实施例1提取的柳叶腊梅的醇提物进行抑菌性试验：

最小抑菌浓度(The minimum inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(The minimumbacterial concentration，MBC)的测定根据美国临床实验室标准委员会指导方针。细菌和酵母在适宜条件下培养至对数期，用麦氏比浊法调整菌液浓度为1×10⁶CFU/mL。黑曲霉和指状青霉制成孢子悬液，通过平板划线法计数并稀释成相应的数量级，培养温度是28℃。柳叶腊梅叶醇提物溶于二甲基亚矾(Dimethylsulfoxide，DMSO)制成浓度为90μg/μL的母液。在无菌的96孔板中，100μL醇提物加入100μL菌悬液，使醇提物的终浓度为0.35到45μg/μL。混合样品在相应温度下孵育18h。分别把不接种菌悬液、不加黄酮的样品作为阳性和阴性对照。孵育后，所有样品孔加入20μL质量分数为0.05％的刃天青溶液，再孵育1h。从颜色上判定每个样品孔是否长菌：若孔洞从蓝色变为紫色或粉色视为长菌；最高稀释度的样品仍旧保持蓝色，该样品终浓度被认为是MIC值。对仍旧保持蓝色的样品孔进行平板划线，细菌在适宜条件下培养1d，真菌培育2～3d，无细菌生长的最高稀释度视为MBC值。DMSO的浓度在非致毒性范围内。所有实验重复3次。结果见表1。

表1实施例1的柳叶腊梅的醇提物的抑菌性

注：A-E：在同一行中，标志着不同上标的均值代表差异显著，P<0.001。

由表1可知，柳叶腊梅的醇提物所含黄酮纯度范围为6.24％～90.49％。样品的MIC和MBC值越小，表示微生物对其越敏感。柳叶腊梅的醇提物的抑菌活性(MIC)变化范围从0.35到45μg/μL，杀菌活性(MBC)变化范围从2.81到>45μg/μL，表明该醇提物对所有的微生物都具有较好的抑菌效果。

实施例3

测定柳叶腊梅的叶50％、70％和95％乙醇洗脱物各成分。

柳叶腊梅的叶筛选3个活性组分溶于甲醇，配置其浓度为10mg/mL。柳叶腊梅的醇提物和流动相过0.22μm的有机滤膜，并超声除气。柳叶腊梅叶醇提物化学成分通过与标准品比对进行定性，制作标准品曲线对样品中各成分进行定量计算。LOD(检测限)和LOQ(定量限)分别定义为3.3和10δ/S，δ代表标曲响应值的偏差，S代表各标准曲线的斜率。所有实验过程重复3次。结果见表2。

表2柳叶腊梅的醇提物黄酮含量

结果表示为(mean±S.D)，LOD:检测限，LOQ:定量限。具有不同上标的均值具有显著性差异，P<0.001。***P<0.001表示与50％EE相比。

由表2可知，柳叶腊梅的叶50％、70％、95％乙醇洗脱物中的主要成分是黄酮糖苷和黄酮苷元。

实施例4

测定柳叶腊梅的50％、70％和95％醇提物对传统抗生素的调节作用。

采用棋盘法测定三个组分对三类抗生素的活性调节作用。柳叶腊梅叶醇提物、抗生素和菌悬液按1:1:2比例加入到36个无菌样品孔中，总体积为200μL。提取物沿着X轴进行连续二倍稀释，抗生素沿着Y轴进行稀释，使他们的终浓度都为0～1MIC。所有的组合都进行实验。该混合物在适宜的条件下过夜培养，刃天青作为指示剂判定是否有菌体生长。

部分抑菌浓度指数ΣFIC(The fractional inhibitory concentration index)的计算公式和标准。柳叶腊梅叶醇提物和抗生素的结合效果根据以下标准：ΣFIC≤0.5，二者为协同作用；0.5<ΣFIC≤1，二者为叠加作用；1<ΣFIC≤2，二者无相互作用；ΣFIC>2，二者为拮抗作用。结果见表3。ΣFIC的计算公式如下：

表3柳叶腊梅的醇提物对传统抗生素的调节作用

注:协同作用表示为数字加粗(ΣFIC≤0.5)；叠加作用表示为数字下面画横线(0.5<ΣFIC≤1)；无相互作用未作标记(1<ΣFIC≤2)；无抗菌活性表示为-，即拮抗作用(ΣFIC>2)。

由表3结果可知，在抑制常见食源性致病菌时，三种柳叶腊梅的醇提物对三类抗生素具有不同的调节作用，而柳叶腊梅50％醇提物与抗生素展示了最好的协同作用。此外，氨基糖苷类抗生素链霉素被证明跟筛选活性组分具有最好的协同效果。结果表明，柳叶腊梅叶醇提物可以作为氨基糖苷类抗生素的调节剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.柳叶腊梅的醇提取物在制备抗生素调节剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述柳叶腊梅的醇提取物的制备方法包括以下步骤：将柳叶腊梅的叶粉碎后，将得到的粉碎物用乙醇溶液进行超声提取，得到提取液；将所述提取液浓缩后，得到浓缩液；将所述浓缩液经吸附树脂进行分离纯化，得到柳叶腊梅的醇提取物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述粉碎物的粒径≤250μm。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提取液的制备方法包括：将所述粉碎物用乙醇溶液进行超声提取、过滤，得到第一滤渣和第一滤液；将所述第一滤渣用乙醇溶液进行超声提取、过滤，得到第二滤渣和第二滤液；将所述第一滤液和第二滤液混合后，得到提取液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述粉碎物的质量与乙醇溶液的体积比为1g:(12～24)mL；所述第一滤渣的质量与乙醇溶液的体积比为1g:(5～10)mL；所述乙醇溶液的体积分数为50％～60％。

6.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述超声提取的条件包括：所述超声提取的温度为50～60℃，所述超声提取的时间为30～60min，所述超声提取的功率为160～240W。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述浓缩液占提取液体积的15％～25％。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分离纯化使用的解析液为乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积分数为40％～95％；所述浓缩液的质量和解析液的体积比为1g:(12～20)mL。