CN103222486A

CN103222486A - 对柑桔病原菌有抑制作用的植物提取物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN103222486A
Application number: CN2013101953946A
Authority: CN
Inventors: 何开泽; 张卫星; 蒲蔷
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2013-05-23
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2033-05-23
Also published as: CN103222486B

Abstract

本发明公开一种从核桃青皮中提取对柑桔病原菌有抑制作用的提取物的制备方法及其在由该病原菌引起的植物病害防治上的用途。

Description

对柑桔病原菌有抑制作用的植物提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种一种对柑桔病原菌有抑制作用的植物提取物及其制备方法。本发明属于植物提取物及其抗菌活性领域。

背景技术

柑桔青霉病和绿霉病分别是由意大利青霉菌(Penicillium italium)和绿霉菌(Penicillium digitaum)引起的植物病害。据统计，柑桔果实在贮运过程中因烂果造成的损失以柑桔青霉病和绿霉病为主，占90%以上。目前，生产上广泛应用的柑桔病害的防治措施是采用化学杀菌剂如噻菌灵、抑霉唑、邻苯基苯酚钠(SOPP)等，这些药剂作为柑橘防腐剂使用已有多年历史。然而，由于人们对化学药物的不合理使用和药物本身固有的缺点，致使化学农药在使用中产生了环境污染、人畜中毒、农药残留等问题，随着人们生活质量的提高和环保意识的增强，公众对限制化学杀菌剂的呼声越来越高。为了寻求有可能代替化学杀菌剂的新方法，人们把目光转向了安全、稳定、无污染、高效的天然药物。

方才君（1989）研究发现，香叶油、香茅油对柑桔青霉菌有明显的抑制作用，次为留兰香油，香莆油的抑菌力最弱。供试精油对柑桔绿霉的抑菌活性仍以香叶油和香茅油最强，留兰香油较前两者低得多，香蕾油则更低。席玙芳等（1993）研究发现，大蒜、洋葱、生姜的汁液对柑桔青、绿霉菌均有抑制和杀灭作用，其中大蒜韵抑菌作用性能最强，洋葱次之，生姜则较差。徐齐云等（2006）研究发现，银杏叶乙醇浸提物、石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物和水萃取物4种提取物对柑桔青霉病菌均有一定抑制效果,但只有石油醚萃取物对柑桔青霉病菌抑菌效果好。丘麒等（2008）研究发现，油茶籽、海芋、山菅兰、水茄、上海叶冬青、桃花心木、侧柏、深山含笑等的提取物对柑橘青绿霉菌有一定的抑菌活性。胡军华等（2010）研究发现，川芎、侧柏、苍耳和五加皮的提取物对柑桔青霉菌的抑制作用较强，抑菌率均在97%以上；五加皮和侧柏的提取物对柑桔绿霉菌抑制作用较强。曾荣等（2010）研究发现，11种植物提取液对意大利青霉显现出不同程度的抑制效果,其中以凤仙透骨草、广藿香、青蒿、水菖蒲等植物的提取液抑制作用较为明显。另外，曹婷婷等（2008）研究了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZK菌株发酵产物捷安肽素对柑桔青绿霉菌的抑制作用，证明捷安肽素在PDA平板上对柑桔绿霉菌比青霉菌对捷安肽素敏感。

上述研究从植物提取物、微生物发酵产物等方面研究了抗柑桔青绿霉菌的活性，也发现了具有一定抗菌活性的提取物，但是提取物的抗菌效果并不理想，并且所用提取材料多是经济或药用物种。能否找到一种既具有良好抗菌活性又更为廉价的材料，进而获取更具有实用价值的抗菌活性物质以及提取方法？

基于以上背景，发明人以通常作为废弃物的核桃青皮为原料，开展了具有抑制柑橘青、绿霉菌提取物的提取方法和抑菌作用的研究。以下为本发明的具体内容。

发明内容

本发明目的是提供一种对柑桔病原菌有抑制作用的植物提取物及其制备方法。

为实现上述目的，本发明包括以下技术方案：

本发明首先提供一种核桃青皮提取物的提取方法，该方法包括：将核桃青皮置于50℃烘箱内烘干至恒重并粉碎，过90目筛，称取核桃青皮粉以无水甲醇为提取溶剂，料液比为1:15，65℃下回流提取3次，每次2h，合并提取液减压浓缩成浸膏状至恒重。然后，用丙酮-水（1:1）溶解完全，依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，经减压浓缩后获得甲醇提取物各萃取相提取物。

本发明还提供另一种核桃青皮提取物的提取方法，该方法包括：核桃青皮置于50℃烘箱内烘干至恒重并粉碎，过90目筛，称取核桃青皮粉以石油醚为提取溶剂，料液比为1:15，65℃下回流提取3次，每次2h，合并提取液减压浓缩成浸膏状至恒重。

其中，上述提取方法中提到的料液比1:15为质量/体积比（w/v)，即1克材料用15毫升溶剂；上述方法中提到的丙酮-水（1：1）为体积/体积比（v/v)，即1毫升丙酮与1毫升水混合。

其中，上述提取方法中所得石油醚提取物即为具有抗菌活性作用的提取物。

上述第二种方法直接由石油醚抽提浓缩，省去了甲醇抽提、溶剂萃取等步骤，简单易行。

其次，本发明还提供一种核桃青皮提取物，该提取物为按照上述两种提取方法获得的石油醚提取物分别经减压浓缩获得的石油醚膏状物。

另外，本发明还提供上述核桃青皮提取物在作为抗菌剂中的用途。

优选地，所述用途为将上述核桃青皮提取物作为抗菌剂的有效成分用于由意大利青霉菌(Penicillium italium)和/或绿霉菌(Penicilliumdigitaum)引起的植物病害防治产品上。

本发明的抗菌活性采用抑菌圈测定法（牛津杯法），阳性对照药物为两性霉素B。

附图说明

图1是核桃青皮石油醚提取物对青霉菌抑制能力图；其中Am B是阳性对照，A1-A5是浓度在100-3.13mg/mL时的抑菌效果。

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例1：

核桃青皮于50℃烘箱内烘干至恒重并粉碎，过90目筛，称取核桃青皮粉以无水甲醇为提取溶剂，料液比为1:15，65℃下回流提取3次，每次2h，合并提取液减压浓缩成浸膏状至恒重。然后，用丙酮-水（1:1）溶解完全，依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，经减压浓缩后获得甲醇提取物各萃取相提取物。

采用牛津杯法测定样品抑菌活性。称取一定量不同萃取物样品，用适当溶剂配成50mg/mL，取25μL培养好的细菌悬液与20mL冷却至50℃的培养基充分混匀，倒入9cm培养皿中制成带菌的平板，带菌平板含菌浓度约10⁶个/mL。将直径为0.8cm的牛津杯平放在带菌平板上，加入待测样品150μL，重复3次。置于25℃培养箱内培养72h（真菌），用十字交叉法测量抑菌圈直径。用相应溶剂作为空白对照。

实验结果：在供试样品质量浓度为50mg/mL时，核桃青皮甲醇提取物各萃取相对几种有害真菌的抑制效果见表1和图1。

表1核桃青皮甲醇提取物各萃取相抑制能力

其中：无抑菌活性（-），抑菌圈直径<0.8cm；弱抑菌活性（+），抑菌圈直径0.8-1.0cm；中等抑菌活性（++），抑菌圈直径1.0～1.2cm；高抑菌活性（+++），抑菌圈直径1.2～1.4cm；强抑菌活性（++++），抑菌圈直径1.4～1.6cm；较强抑菌活性（+++++），抑菌圈直径﹥1.6cm；标准偏差±0.5mm。

由表1可以看出，核桃青皮石油醚相、氯仿相在50mg/mL时对意大利青霉菌、柑桔绿霉菌均具有一定的抑菌活性，其中，石油醚相对意大利青霉菌、柑桔绿霉菌抑菌效果最好；氯仿相也有微弱抑菌活性，但远不如石油醚相，其他提取相均未检测出抑菌活性。可见，对柑桔青霉菌和绿霉菌有抑制活性的成分主要分布在核桃青皮的石油醚提取相中。

同时，以两性霉素B作为阳性对照，发现25mg/mL石油醚提取物的抑菌能力与200μg/mL两性霉素B相当。

实施例2：

各提取物的制备方法同实施例1，采用牛津杯法测定最低抑菌浓度。称取一定量各提取物，用相应溶剂配置成为100mg/mL，倍比稀释成100、50、25、12.5、6.25、3.13mg/mL。按照试验实例1步骤配置带菌平板，分别吸取150μL，重复3次。置于25℃培养箱内培养72h，刚好无抑菌圈的即为最低抑菌浓度。用相应溶剂作为空白对照。

表2核桃青皮甲醇提取物各萃取相最低抑菌浓度

由表2可以看出，核桃青皮石油醚提取物对意大利青霉菌和柑桔绿霉菌均有较好的抑菌效果，石油醚提取物对意大利青霉菌、柑桔绿霉菌的抑菌能力MIC分别为3.125、6.25mg/mL。

实施例3

核桃青皮置于50℃烘箱内烘干至恒重并粉碎，过90目筛，称取核桃青皮粉直接以石油醚为提取溶剂，料液比为1:15，65℃下回流提取3次，每次2h，合并提取液减压浓缩成浸膏状至恒重。对该提取物进行抗菌活性测定（测定方法除倍比稀释起始浓度为80mg/mL外，同实验实例2），结果如表3所示。

表3核桃青皮石油醚提取物的抑菌活性

上述结果表明，即使省去了甲醇抽提、溶剂萃取等步骤，直接用石油醚抽提、浓缩获得的提取物仍具有与实验实例1和2相当的效果，经过优化后提取制备方法更为简单易行。

Claims

1.一种核桃青皮提取物的提取方法，该方法包括：将核桃青皮置于50℃烘箱内烘干至恒重并粉碎，过90目筛，称取核桃青皮粉以无水甲醇为提取溶剂，料液比为1:15，65℃下回流提取3次，每次2h，合并提取液减压浓缩成浸膏状至恒重。然后，用1:1的丙酮-水溶解完全，依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，经减压浓缩后获得甲醇提取物各萃取相提取物；

其中，上述提取方法中提到的料液比1:15为质量/体积比（w/v)，即1克材料用15毫升溶剂；上述方法中提到的1：1的丙酮-水为体积/体积比（v/v)，即1毫升丙酮与1毫升水混合。

2.根据权利要求1所述的核桃青皮提取物的提取方法，该方法包括：核桃青皮置于50℃烘箱内烘干至恒重并粉碎，过90目筛，称取核桃青皮粉以石油醚为提取溶剂，料液比为1:15，65℃下回流提取3次，每次2h，合并提取液减压浓缩成浸膏状至恒重；

其中，上述提取方法中提到的料液比1:15为质量/体积比（w/v)，即1克材料用15毫升溶剂。

3.一种核桃青皮提取物，其特征在于，所述提取物为按照权利要求1或2的方法获得的石油醚提取物经减压浓缩获得的石油醚膏状物。

4.权利要求3所述的核桃青皮提取物在作为抗菌剂中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途为将上述核桃青皮提取物作为抗菌剂的有效成分用于由意大利青霉菌(Penicillium italium)和/或绿霉菌(Penicillium digitaum)引起的植物病害防治产品上。