CN110468187A - 对宿主中感染的病原微生物在高通量测序前进行富集的方法及试剂盒 - Google Patents

对宿主中感染的病原微生物在高通量测序前进行富集的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种对宿主中感染的病原微生物在高通量测序前进行富集的方法及使用该方法的试剂盒，所述方法包括首先将宿主细胞与免疫磁珠充分结合，然后将结合有宿主细胞的免疫磁珠从待测样本中分离出去，最后将剩余的待测样本进行核酸的提取和高通量测序。本发明方法只是通过简单的抗原抗体结合就可实现高效率地去除人或动物感染样本中的宿主细胞，使得感染样本中的病原微生物的含量比例得到提高。

Description

对宿主中感染的病原微生物在高通量测序前进行富集的方法 及试剂盒
技术领域
本发明涉及高通量测序样本富集领域，特别涉及对宿主中感染的病原微生物在高通量测序检测前进行富集的方法及试剂盒。
背景技术
近十年来在分子检测领域中，高通量测序技术发展迅猛，其一次可以对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，这使得其可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以高通量测序为科学研究做出了巨大贡献，如物种基因组/转录组的测序及鉴定、表观基因组的研究等。高通量测序技术的独特优势，不仅推进了科学研究的进展，而且在临床医学领域也展现出很大的应用价值。2014年《新英格兰医学期刊》发表一篇文章：对一个住院6周未确诊病因的14岁男孩，通过进行脑脊液样本的高通量测序，最后确诊为钩端螺旋体感染，然后对症下药，男孩很快就病愈出院。从此在临床感染领域中进行疑难杂症的诊断时，高通量测序技术开始得到较广泛地关注与应用。
然而对人或者动物样本中低量感染的病原微生物进行测序时，面临着这样一个问题：由于感染样本本身含有大量人或动物宿主自身的基因组，而病原微生物的载量是非常少的，所以需要对感染样本进行超高深度的测序，才能获得低载量的所感染的病原微生物的信息。超高深度测序本身，会导致测序数据量大、测序成本高，且给数据的分析甚至是存储都带来极大不便。这个问题反过来又限制了高通量测序在临床感染诊断中的应用。所以，对人或动物样本中所感染的微生物进行测序时，需要富集样本中的微生物，从而去除宿主基因组的影响是非常关键的。
目前通过捕获并去除宿主基因组达到病原微生物核酸富集的技术，有DNA甲基化技术、差异裂解释放不同核酸的技术等。
DNA甲基化技术原理是依据人或者其它哺乳类动物中大多数的5’-甲基胞嘧啶(5mC)以双核苷酸CpG的形式出现，CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均匀，其中密度较高的区域称为CpG岛，人类50％-60％的基因有CpG岛，并且几乎总是位于基因启动子和(或)外显子周围，正常情况下CpG岛的CpGs总是非甲基化的。通过对非甲化的CpGs进行甲基化处理，然后用多种技术手段实现甲基化基因与非甲基化基因的分离，从而实现将样本中的大部分宿主基因组与病原微生物基因组进行分离的目的，从而富集病原微生物的核酸。此方法只适合大多数细菌这一类型的病原微生物的富集，而病毒这一类型的病原微生物因为其利用宿主的原料进行自身的复制，所以其基因中也有类似的CpGs现象，DNA甲基化时会把病毒的部分基因组也甲基化分离掉，容易造成漏检。所以DNA甲基化富集技术在对感染样本中的宿主基因组进行去除时不具有普适性。
差异裂解释放不同核酸的技术，通过人或者动物细胞膜与病原微生物的外壳(细胞壁或者蛋白外壳)的组分不同，使用特定裂解人或者动物细胞的裂解液将人或者动物的基因组释放出来，然后用硅基磁珠吸附掉或者用酶消化掉人或者动物的基因组DNA，然后使吸附有人或者动物基因组DNA的硅基磁珠从样本中分离出去，最后提取病原微生物的核酸，从而达到富集病原微生物核酸的目的。但因为裂解液很难保证完全不裂解病原微生物，所以此方法会造成病原微生物核酸的损失，进而也会影响后续的分子检测质量。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种对宿主中感染的病原微生物在高通量测序前进行富集的方法，所述方法包括首先将宿主细胞与免疫磁珠充分结合，然后将结合有宿主细胞的免疫磁珠从待测样本中分离出去，最后将剩余的待测样本进行核酸的提取和高通量测序。
在一种实施方式中，选择特异高效结合宿主细胞表面抗原的抗体，然后将所述抗体和磁珠直接包被在一起形成免疫磁珠，将所述免疫磁珠加入到待测的样本中进行孵育，使待测样本中的宿主细胞与免疫磁珠充分结合；或者将所述抗体先与待测样本进行孵育，使待测样本中的宿主细胞与抗体充分结合，然后再加入磁珠孵育，使得结合有宿主细胞的抗体与磁珠进行充分结合。
在一种实施方式中，所述特异高效结合宿主细胞表面抗原的抗体是特异结合宿主所有细胞表面都具有的抗原的抗体。
在一种实施方式中，所述特异高效结合宿主细胞表面抗原的抗体是特异结合宿主具有的特定类别细胞表面抗原的抗体，或者结合宿主样本中主要类型细胞表面抗原的抗体。
在一种实施方式中，所述磁珠与特异高效结合宿主细胞表面抗原的抗体在结合前需进行修饰，修饰处理方式为二者分别偶联可以进行相互结合的受体与配基中的一种。
在一种实施方式中，所述宿主是人或动物。
在一种实施方式中，特异结合人源细胞的抗体，优选地为特异结合人源白细胞表面抗原的抗体和特异结合人源有核细胞表面都具有的HLA-Ⅰ类抗原的抗体。
在一种实施方式中，所述待测样本是血液、胸腹水、呼吸道咽拭子或脑脊液。
在一种实施方式中，本发明提供了在上述方法中使用的试剂盒，所述试剂盒包括与人源宿主细胞进行结合的免疫磁珠。
在一种实施方式中，所述免疫磁珠为特异结合人源白细胞表面CD45抗原的免疫磁珠和特异结合人源有核细胞表面HLA-A\B\C抗原的免疫磁珠的混合免疫磁珠
本发明具有的优点和积极效果是：只是通过简单的抗原抗体结合就可实现高效率地去除人或动物感染样本中的宿主细胞，使得感染样本中的病原微生物的含量比例得到提高。在高通量测序时，病原微生物富集后的样本与富集前的样本相比，在测序数据总Reads数相同的情况下，所感染的病原微生物的Reads数能得到百倍级的提升。该方法的建立有利于医生准确诊断一些低感染量样本中的病原微生物或者监测某些感染疾病在治疗过程中病原微生物数量的变化。该方法操作简便且成本低廉，是一种经济有效地病原微生物富集方式，便于推广使用。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。链霉亲和素标记的人源抗体为自己制备，生物素标记的磁珠购于美国Thermo Fisher公司，荧光PCR扩增试剂购于深圳菲鹏生物股份有限公司，所用引物及探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成。检测样本的总DNA与总RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司。高通量测序在illuminaNextseq500测序仪上进行。
实施例采用本发明方法对人源宿主感染样本富集后进行高通量测序
1.病原微生物的富集
筛选可以特异结合人源白细胞的CD45抗体以及可以特异结合人源所有有核细胞表面抗原的HLA-ABC抗体作为人源宿主细胞的捕获抗体，并将筛选出的抗体各自用链霉亲和素标记后再与生物素标记的磁珠进行包被，形成含有两种抗体的混合免疫磁珠。
吸取200μL登革病毒感染的人源抗凝外周血样本与800μL PBS缓冲液混合，用移液枪将两者吹打混匀；吸取200μL内参质控品与800μL PBS缓冲液混合，用移液枪将两者吹打混匀。向上述两种混匀液中，分别加入50μL的混合免疫磁珠，并在各自的管盖上标明“样本”、“内参”。
①将样本管与内参管置于4℃旋转孵育1h；②孵育完成后，在室温中用磁力架分别吸附样本管与内参管中的免疫磁珠，用移液枪分别吸出样本与内参质控品的剩余液体至一干净的EP管，再分别标明富集样本、富集内参。
2.对富集前后的内参质控品与样本分别进行核酸的提取
1)对富集内参管中的液体与未进行富集的200μL内参质控分别进行总DNA提取。
2)对富集样本管中的液体与未进行富集的200μL登革感染的外周血样本分别进行总RNA提取。
3.荧光PCR验证
1)利用荧光定量PCR，采用人源β-actin基因的DNA检测体系分别对富集后与富集前的内参质控品提取的核酸进行检测；采用大肠杆菌的ITS基因的DNA检测体系分别对富集后与富集前的内参质控品提出的核酸进行检测。
检测结果如下表所示，内参质控品富集后的人源β-actin基因的扩增Ct值与富集前的扩增Ct值相差为4.37，即富集后的内参质控品中人源基因组为富集前的1/24.37，从而富集后的内参质控品中人源基因组的量减少了93.75％，这显示试剂盒里的免疫磁珠是有效的。内参质控品富集后的大肠杆菌的ITS基因的扩增Ct值与富集前的扩增Ct值相差为0.11，即富集后内参质控品中大肠杆菌基因组为富集前的1/20.11，从而富集后的内参质控品中大肠杆菌的基因组的量只减少了7.41％。大肠杆菌(模拟病原微生物)基因组减少量与宿主基因组的减少量相比，大肠杆菌的基因组总量几乎不受影响，说明本发明中的方法在通过去除宿主细胞来富集病原微生物时，病原微生物本身不会损失。
内参状态 人源β-actin基因Ct 大肠杆菌ITS基因Ct
富集前 21.62 21.04
富集后 25.99 21.15
2)利用荧光定量PCR，采用人源β-actin基因的RNA检测体系分别对富集后与富集前的样本提出的核酸进行检测。
检测显示，富集后样本的人源β-actin基因的扩增Ct值为24.27，富集前样本的人源β-actin基因的扩增Ct值为20.38，二者的差值为3.89，即富集后的样本中人源基因组为富集前的1/23.89，从而富集后的样本中人源基因组的量减少了93.26％，达到了去除人源宿主而提高病原体在样本中含量比例的目的。
4.高通量测序
按高通量测序对核酸质量与总量的要求，准备好富集后与富集前的样本提出的总RNA，在符合要求后，分别按照标准文库的建库流程进行建库，然后进行高通量测序，对测序结果简要概括如下表所示：
从上表中可看出，在同样的测序数据总Reads数时，登革病毒感染样本富集后的测序数据中得到的登革病毒的Reads数是富集前的285倍，病原体Reads数得到了百倍级的提升；富集前后的测序数据中得到的登革病毒的Reads数在总数据中的占比从每万条Reads中不足一条提高至每万条Reads中有十条左右，可看出该方法在对实际临床样本进行病原微生物富集时可取得很好的富集效果。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (10)

1.一种对宿主中感染的病原微生物在高通量测序前进行富集的方法，其特征在于，所述方法包括首先将宿主细胞与免疫磁珠充分结合，然后将结合有宿主细胞的免疫磁珠从待测样本中分离出去，最后将剩余的待测样本进行核酸的提取和高通量测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，选择特异高效结合宿主细胞表面抗原的抗体，然后将所述抗体和磁珠直接包被在一起形成免疫磁珠，将所述免疫磁珠加入到待测的样本中进行孵育，使待测样本中的宿主细胞与免疫磁珠充分结合；或者将所述抗体先与待测样本进行孵育，使待测样本中的宿主细胞与抗体充分结合，然后再加入磁珠孵育，使得结合有宿主细胞的抗体与磁珠进行充分结合。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述特异高效结合宿主细胞表面抗原的抗体是特异结合宿主所有细胞表面都具有的抗原的抗体。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述特异高效结合宿主细胞表面抗原的抗体是特异结合宿主具有的特定类别细胞表面抗原的抗体，或者结合宿主样本中主要类型细胞表面抗原的抗体。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磁珠与特异高效结合宿主细胞表面抗原的抗体在结合前需进行修饰，修饰处理方式为二者分别偶联可以进行相互结合的受体与配基中的一种。
6.根据权利要求1-5任一所述到的方法，其特征在于，所述宿主是人或动物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，特异结合人源细胞的抗体，优选地为特异结合人源白细胞表面抗原的抗体和特异结合人源有核细胞表面都具有的HLA-Ⅰ类抗原的抗体。
8.根据权利要求1-5任一所述到的方法，其特征在于，所述待测样本是血液、胸腹水、呼吸道咽拭子或脑脊液。
9.在权利要求1-8中任一项所述方法中使用的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括与人源宿主细胞进行结合的免疫磁珠。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠为特异结合人源白细胞表面CD45抗原的免疫磁珠和特异结合人源有核细胞表面HLA-A\B\C抗原的免疫磁珠的混合免疫磁珠。
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