BR112012004699B1 - Métodos, composições e kits para lise química direta - Google Patents

Abstract

métodos, composições e kits para lise química direta uma composição de lise química direta inclui um ensaio de composição de tampão compatível e um ensaio de tensoativo compatível. quando combinado com uma composição de armazenamento de espécime, tais composições impedem modificações indesejáveis para ácido nucleico e proteínas lisadas a partir de células na amostra biológica. ensaios de amostras a partir de tais composições não requerem etapas dispendiosas e demoradas, como processamento em temperatura alta prolongado e centrifugação. a composição de lise química direta da presente invenção permite a extração de ácido nucleico direta a partir das células na amostra biológica sem a necessidade de decantar o meio de transporte ou, de outra forma, trocar o meio de transporte com tampões compatíveis de ensaio. não há necessidade de combinar a amostra com proteinase k ou outra enzima para extrair ácidos nucleicos a partir das células. um método para lisar células para se obter ácido nucleico alvo para ensaio e um kit para combinar a composição de lise química direta com uma amostra são também contemplados.

Description

“MÉTODOS, COMPOSIÇÕES E KITS PARA LISE QUÍMICA DIRETA”

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados [001]Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 61/239.553 depositado em 3 de setembro de 2009, a divulgação do qual sendo incorporada neste documento por referência.

Antecedentes da Invenção [002]A invenção refere-se geralmente a métodos e composições para a condução de testes de diagnóstico em amostras biológicas conservadas e, em particular, à realização de métodos de amplificação e extração de ácido nucleico em tais amostras conservadas.

[003]Nos campos de diagnóstico médico e pesquisa médica, as amostras (por exemplo, tecidos) são tomadas a partir de um paciente ou sujeito (por exemplo, um paciente humano, um sujeito humano, um modelo animal experimental de uma doença humana) para determinar a condição do sujeito no suporte da pesquisa, determinar a condição atual do paciente para fazer um diagnóstico médico, determinar a resposta do paciente para um curso de terapia ou tratamento atual, etc..

[004]As amostras que são obtidas para análise, tanto para a realização de diagnóstico médico quanto para uso na pesquisa científica, são muitas vezes colocadas em um meio de transporte/conservante especial para manter a amostra sem degradação ou decomposição quando removida do sujeito. Assim, a amostra estará tão próxima quanto possível da condição exata em que estava quando removida do sujeito. Isto assegura que a amostra reflete com precisão o estado do paciente ou sujeito no momento da amostragem e, por conseguinte, irá produzir resultados mais precisos em quaisquer estudos subsequentes da amostra. Alguns destes estudos envolverão ácido nucleico (por exemplo, extração e amplificação de ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA)).

[005]A extração de DNA e/ou RNA a partir de amostras biológicas requer, entre

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2/44 outras etapas, a lise da parede celular (no caso de células procarióticas), a lise da membrana celular (no caso de certas células eucarióticas) ou a lise do capsídeo viral (No caso de vírus). A amplificação subsequente requer, em parte, a fixação de iniciadores para sítios específicos dentro do ácido nucleico alvo.

[006]Há uma série de protocolos disponíveis para a amplificação e subsequente extração de ácido nucleico. Alguns desses protocolos utilizam dispositivos de alta produtividade. Os dispositivos de alta produtividade são automáticos no sentido de que uma amostra é colocada dentro do dispositivo, juntamente com os produtos químicos apropriados e as etapaa de extração e amplificação ocorrem sem entrada adicional do operador (por exemplo, Sistema ViperTM XTR por inserção de pacote de Ensaio de DNA amplificado Becton Dickinson® BD ProbeTec Qx, Becton Dickinson 2008). Outros protocolos utilizam equipamentos menos sofisticados e são tipicamente referidos como procedimentos manuais. No entanto, independentemente do protocolo, a necessidade para lisar as células ou capsídeos virais, a fim de liberar o ácido nucleico, a necessidade de fixar o ácido nucleico às partículas, tais como óxido férrico, a fim de extrair o ácido nucleico do resto da amostra, e a necessidade de fixar iniciadores para o ácido nucleico alvo, a fim de amplificar o ácido nucleico permanecem.

[007]O meio de transporte (por exemplo, meio de citologia líquido) contém tipicamente um ou mais constituintes que conservam certas células em uma ou mais formas (por exemplo, impedem o rompimento da parede da célula ou da membrana da célula por lise celular). Além disso, alguns destes constituintes têm o duplo propósito de conservação e descontaminação da amostra. Estes constituintes são conhecidos por interferir com a capacidade de lisar as membranas e paredes celulares, a capacidade dos ácidos nucleicos extraídos para se fixar às partículas utilizadas na extração de ácido nucleico e com a capacidade de amplificar o ácido nucleico alvo.

[008]Os líquidos baseados em composições de citologia tais como solução de SurePath® (Tripath Imaging, Inc., N.C.) ou solução de ThinPrep® PreservCyt®

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3/44 (Hologic Inc., MA), afetam adversamente a capacidade de extrair o ácido nucleico alvo amplificável de amostras expostas ao mesmo. Muitas razões foram sugeridas para explicar este efeito adverso observado incluindo: 1) degradação de ácidos nucleicos por constituintes no meio; 2) alteração química de ácidos nucleicos por constituintes no meio, e 3) inibição do mecanismo de lise de células no tecido, que inibe a liberação de ácidos nucleicos para a extração e amplificação. A fim de evitar os efeitos adversos das composições de citologia líquidas em DNA extraído, as células são extraídas a partir das composições antes da lise. Tipicamente, a extração requer a centrifugação para decantar a composição de citologia líquida a partir das células. As células são então ressuspensas em um tampão e lisadas com uma enzima. Tais etapas extras não são tipicamente compatíveis com muitos dispositivos automáticos de alta produtividade, tais como, por exemplo, o Sistema ViperTM acima mencionado. Mesmo em situações em que a automação não está envolvida, tais etapas são, contudo, demoradas. O tempo adicional requerido por estas etapas pode atrasar a obtenção dos resultados do teste e é preferencialmente evitado.

[009]Um exemplo de um kit de meio para a purificação de ácidos nucléicos é o Kit de meio QIAamp MinElute. Este kit de meio é descrito no Manual de meio QIAmp MinElute de fevereiro de 2004. O procedimento de QIAamp é descrito como tendo 4 etapas: lise, ligação, lavagem e eluição. Neste procedimento, as amostras são lisadas usando proteinase K seguido pela ligação dos ácidos nucleicos para a coluna de QIAmp MinElute pela absorção sobre o lisado de sílica-gel. Embora o procedimento de QIAamp seja um método comprovado, o mesmo é otimizado para a purificação de apenas 250 μΙ_ do meio de citologia líquido e é tanto de trabalho intensivo quanto demorado (isto é, requer 18 etapas que incluem 65 minutos de diferentes temperaturas de incubações, 5 etapas de centrifugação, 2 etapas de filtração a vácuo e várias etapas de mistura). O uso de tais métodos de multietapas, tem sido necessário para purificar ácidos nucleicos com sucesso a partir de amostras fixas, tais como meio de citologia líquido e tecido embebido em parafina. É

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4/44 bem conhecido que a purificação de ácidos nucleicos a partir de meios fixos é mais difícil do que a partir de tecido fresco, porque os fixadores nos meios introduzem modificações químicas indesejáveis das moléculas alvos na amostra. As reações podem ocorrer para reticular ou, de outra forma, modificar os ácidos nucleicos em uma amostra. Outros aditivos nos meios de transporte podem também causar reticulação indesejada. Por exemplo, a reticulação devido à presença de formalina no meio de transporte é descrita em Rai, V.K., et al. , Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic ribonuclease A : I-Structural and functional alterations, Lab. Invest. Vol. 84 (3) : 292-299 (March 2004). O formaldeído também produz a reticulação entre os ácidos nucleicos e proteínas como descrito em Solomon, M.J., Solomon, M.J., Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking : A probe for in vivo chromatin structures, Proc Natl. Acad. Sci. Vol. 82, pp. 64706474 (October 1983). Conforme descrito em Sepp, R., et al . Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR, J. Clin. Pathol. Vol. 47:318-323 (1994), a extração de DNA a partir de células retiradas de cera de parafina fixa em formol tipicamente requer etapas de processamento (por exemplo, de ebulição prolongada) que podem afetar adversamente a quantidade de DNA para amplificação. De acordo com Sepp, R., et al. A ebulição da amostra é necessária para, entre outras coisas, inativar a proteinase K. Além disso, proteinase K é inibida pelos constituintes em muitos fixadores tornando seu uso direto de eficácia limitada na quebra de reticulaçãoes de proteína.

[0010]Portanto, os métodos e composições para a extração de DNA a partir de tecidos e outras células e componentes de células que superam os problemas de reticulação e outras modificações indesejáveis ao ácido nucleico e que ainda não exijam processamento prolongado em temperatura alta que possa afetar adversamente a amostra ou tornem o processo mais dispendioso e demorado continuam a ser procurados.

Sumário da Invenção [0011]Uma composição de lise química direta para combinação com uma

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5/44 composição de armazenamento de espécime inclui uma composição de tampão compatível de ensaio e um tensoativo compatível de ensaio. Tais composições impedem modificações indesejáveis para o ácido nucleico lisado a partir de células na amostra biológica e ensaios de amostras a partir de tais composições não requerem etapas dispendiosas e demoradas, como a centrifugação e processamento prolongado em temperatura alta.

[0012]A composição de lise química direta da presente invenção permite a extração de ácido nucleico direta a partir das células na amostra biológica sem a necessidade de decantar os meios de citologia ou, de outra forma, trocar os meios de citologia com tampões compatíveis de ensaio. A lise celular pode ocorrer diretamente quando a amostra é ainda combinada com a composição de lise química direta. Não há necessidade de combinar a amostra com a proteinase K ou alguma outra enzima para extrair os ácidos nucleicos das células.

[0013]Em uma modalidade, a composição de lise química direta é implementada como um aditivo para uma composição de citologia em base líquida (LBC) que é usada para a diluição da amostra, armazenamento, transporte, etc.. A composição de lise química direta permite a lise da amostra na medida em que a amostra está sendo pré-aquecida ou incubada antes da extração de NA da amostra. Os exemplos de LBC incluem, mas não estão limitados a, SurePath LBC e ThinPrep PreservCyt LBC.

[0014]Em uma modalidade, a composição de lise química direta para a combinação com uma composição de armazenamento de espécime tem uma composição de tampão compatível de ensaio e um tensoativo compatível de ensaio. Em modalidades preferidas, a composição de tampão compatível de ensaio tem um componente de tampão e um componente de sal de metal. Em uma modalidade preferida, o pH da composição de lise química direta está na faixa de cerca de 6,6 a cerca de 10.

[0015]Exemplos de sais de metais adequados incluem cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), acetato de sódio (C2H3NaO2) e sulfato de amônio

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6/44 ((NH4)2SO4). Na modalidade descrita, a concentração de sal de metal na composição de lise química direta é de pelo menos cerca de 0,01 M. Preferencialmente, o sal é NaCl e a concentração de sal está na faixa de cerca de 0,01 M a cerca de 1 M.

[0016]Em modalidades preferidas, a concentração do componente de tampão está na faixa de cerca de 0,2 M a cerca de 2M. Exemplos de componentes do tampão adequados incluem tris(hidroximetil) amino metano e sais de ácido de tris (hidroximetil) amino metano.

[0017]Em certas modalidades, a composição de lise química direta também contém um tensoativo não iônico. Exemplos de tensoativos adequados incluem tensoativos não iônicos baseados em polietileno glicol, tais como polietileno glicol octilfenil éter (disponível comercialmente como Triton® X-100). Exemplos adicionais de tensoativos não iônicos adequados incluem tensoativos de polissorbato tais como o Monolaurato de polioxietileno 20 sorbitano (conhecido comercialmente como polissorbato 20 ou Tween® 20). Tanto o Tween® 20 quanto Triton® x-100 estão disponíveis comercialmente. Em modalidades preferidas, a concentração do tensoativo não iônico está na faixa de cerca de 0,01 a cerca de 2 por cento (v/v).

[0018]Em certas modalidades, a composição de lise química dirigida também inclui glicina.

[0019]Em uma modalidade preferida, composição de lise química direta, de acordo com a reivindicação 10 em que o componente de tampão é o sal de ácido de tris (hidroximetil) amino metano e a concentração do componente de tampão é de cerca de 0,75 M, a concentração de NaCl é de cerca de 0,19 M e a concentração do polietileno glicol octilfenil éter é de cerca de 0,75 por cento (v/v).

[0020]A presente invenção também contempla um método para analisar as amostras armazenadas em uma composição de armazenamento de espécime. No método, uma amostra é combinada com uma composição de lise química direta, tal como descrito acima. Pelo menos uma porção da amostra é removida a partir da composição de armazenamento de espécime juntamente com pelo menos alguma

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7/44 da composição de armazenamento de espécime. A amostra combinada com a composição de armazenamento de espécime é então incubada a uma temperatura de pelo menos 80 °C por um tempo suficiente para lisar pelo menos uma porção das células na porção removida da amostra. O ácido nucleico é extraído a partir da amostra e, em seguida, amplificado. A extração pode ocorrer usando ou um processo manual ou automatizado. Em certas modalidades do ácido nucleico alvo é ou RNA ou DNA.

[0021]Em uma modalidade, a amostra é combinada com uma composição de lise química direta compreendendo a) uma composição de tampão compatível de ensaio; e b) um tensoativo compatível de ensaio. Pelo menos uma porção da amostra é removida a partir da composição de armazenamento de espécime em que a porção removida também inclui a composição de armazenamento de espécime. A porção removida da amostra é incubada a uma temperatura que é de pelo menos 80°C por um tempo suficiente para lisar pelo menos uma porção das células na porção removida da amostra. O ácido nucleico é extraído e amplificado como descrito acima. Nesta modalidade, a porção removida da amostra não é ainda separado do meio de armazenamento espécime antes das etapas de lise e extração. As etapas de extração podem ser manuais ou automatizados.

[0022]Outras modalidades da presente invenção incluem um kit de diagnóstico para a extração, por lise química direta, de ácidos nucleicos a partir de um espécime removido de uma composição de armazenamento de espécime. O kit de diagnóstico inclui a composição de lise química direta descrita acima. A composição de armazenamento espécime é fornecida para conservar uma amostra de tecido.

[0023]Em uma modalidade, o kit de diagnóstico para a extração de ácidos nucleicos inclui uma composição de armazenamento de espécime com uma composição de lise química direta tendo: a) um componente de tampão compatível de ensaio, e b) um tensoativo não iônico, em que o armazenamento de espécime é fornecido para conservar uma amostra de tecido. A composição de tampão compatível de ensaio tem um componente de tampão e um sal de metal. Em uma

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8/44 modalidade, o sal de metal é NaCI e a concentração de NaCI na composição de lise química direta é de pelo menos cerca de 0,01 M e a concentração do componente de tampão está na faixa de cerca de 0,2 M a cerca de 2 M. O pH da composição de lise química direta está na faixa de cerca de 7 a cerca de 9 e a concentração do tensoativo não iônico está na faixa de cerca de 0,01 a cerca de 2 por cento (v/v).

Breve Descrição dos Desenhos [0024]As FIGs. 1A-D ilustram o efeito do pH sobre a eficiência de uma modalidade da composição de lise química direta.

[0025]A FIG. 2 ilustra a detecção de biomarcador de proteína a partir de amostras lisadas usando uma modalidade da composição de lise química direta e método descrito neste documento.

Descrição Detalhada [0026]Antes de explicar, pelo menos, uma modalidade da invenção em detalhe, deve ser entendido que a invenção não está limitada na sua aplicação para os detalhes estabelecidos na descrição que segue ou exemplificada pelos exemplos. A invenção é capaz de outras modalidade ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras. Também, deve ser entendido que a fraseologia e a terminologia empregada neste documento tâm a finalidade de descrição e não devem ser consideradas como limitativas. A seguir, algumas definições de alguns termos usados neste relatório descritivo.

[0027]Uma composição de lise química direta é uma composição que permite a lise dos componentes celulares na amostra para extração de ácido nucleico (NA) da mesma sem a necessidade de etapas de intervenção para separar a composição de lise química da amostra. A composição de lise química direta permite também que o ensaio/detecção de outros constituintes da amostra (por exemplo, biomarcadores de proteínas), sem a necessidade de separar a composição de lise química a partir da amostra antes do ensaio/detecção desses constituintes.

[0028]Exemplos de NA são DNA e RNA de filamento único ou duplo. Outros exemplos de NA que podem ser extraídos pelo método incluem não só o DNA ou

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RNA genômico a partir de animais, plantas, bactérias, vírus, fungos e organismos parasitas, mas também o DNA ou RNA de mitocôndrias ou cloroplastos. Exemplos de outras classes de NA que podem ser extraídas pelo método incluem não apenas RNAm, mas também RNA de transferência, RNA ribossômico, e RNA nuclear pequeno, bem como DNA de plasmídeo. DNA e RNA extraídos pelo método da invenção também podem ser inteiramente ou parcialmente de filamento único ou possuir outro estrutura terciária ou quaternária. Uma amostra contendo NAs é exemplificada por amostras viáveis, tais como células de leucócitos, as cultura de células hospedeiras contendo vetores ou semelhantes que são tipicamente preparadas por tecnologia recombinante genética, as células infectadas com vírus ou fagos, vírus no sangue, e a cultura de uma amostra de micro-organismo. A cultura pode conter micro-organismos, mas o seu sobrenadante individualmente é suficiente. Não apenas a cultura artificial, mas também uma cultura que ocorre naturalmente é aplicável. No caso de uma amostra contendo blocos de microorganismo, a homogeneização ou sonicação pode ser realizada como necessário para alcançar uma boa eficiência de extração.

[0029]Os tipos de amostras alternativas incluem, mas não estão limitados a, espécimes biológicos para o diagnóstico de doenças infecciosas ou não infecciosas, espécimes ambientais, ou amostras de comida ou água. O NA alvo pode ser uma sequência particular ou pode ser uma classe de NA. Uma classe de ácido nucleico é, para um método de ensaio particular, aquelas moléculas de NA cujas propriedades químicas, físicas ou biológicas são tais que podem ser esperadas serem extraídas de forma eficaz em métodos usados para a extração de NA. Tipicamente, mas não necessariamente, os NAs de uma classe são todos análogos de DNA ou DNA u todos os análogos de RNA ou RNA. Outros alvos podem ser sequências de proteínas tais como biomarcadores de proteína.

[0030]Os organismos visados podem incluir, mas não estão limitados a Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Vírus do Pappilloma Humano, Vírus da Imunodeficiência Humana 1/2, vírus da hepatite C, vírus da Hepatite B, vírus da

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10/44 síndrome respiratória aguda grave, Influenza A/B, Vírus 1-6 de Herpes Simplex, Enterovírus, vírus do Nilo Ocidental, vírus da parainfluenza, adenovírus, vírus sincicial respiratório A/B, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium aviumintracellulare, complexo Mycobacterium tuberculosis, citomegalovírus, Streptococcus do grupo B, a Bordetella pertussis, e Bordetella parapertussis.

[0031]Em um aspecto da invenção, o ácido nucleico alvo é um RNA particulares ou de cDNA a partir de uma ou mais das seguintes fontes: patógenos bacterianos, bacterianas não-patógenos, patógenos virais, não-virais patógenos, patógenos fúngicos, fúngicas não -patógenos, agentes patogênicos de leveduras, fungos nãopatogênicos, patógenos parasitas, parasitas não-patogênicos, plantas, produtos animais, alimentos, total de RNA ou cDNA dentro da matriz da amostra, o total de RNA ou cDNA procarióticas, o total de RNA ou cDNA eucarióticas, total ou viral RNA ou cDNA.

[0032]Em um outro aspecto da invenção, o ácido nucleico alvo é um RNA ou cDNA a partir de uma ou mais das seguintes fontes: patógenos bacterianos, bactérias não patogênicas, patógenos virais, vírus não patogênico, patógenos fúngicos, fungos não-patogênicos, patógenos de levedura, levedura não patogênica, patógenos parasitas, parasitas não patogênicos, plantas, produtos animais, alimentos, cDNA ou RNA total dentro da matriz da amostra, cDNA ou RNA procariótico genômico total, cDNA ou RNA eucariótico total, ou cDNA ou RNA viral total.

[0033]Em um outro aspecto da invenção, o alvo é um biomarcador de proteína.

[0034]Uma composição de armazenamento espécime é qualquer composição que é usada para armazenar e/ou transportar uma amostra biológica, antes da extração do ácido nucleico a partir dos componentes celulares da amostra. Como notado acima, as composições de armazenamento de amostras incluem meios de LBC, meios de parafina, etc..

[0035]Ensaio compatível, tal como usado neste documento é qualquer composição que não irá afetar significativamente adversamente o ensaio ao qual as

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11/44 amostras (por exemplo, ácidos nucleicos/ extraídas) são submetidos. Por exemplo, uma composição compatível de ensaio não irá modificar o ácido nucleico extraído na amostra de uma maneira que irá afetar adversamente a capacidade do ensaio a jusante para detectar o ácido nucleico ou outros constituintes da amostra, tais como biomarcadores de proteína.

[0036]Em uma modalidade, a composição de lise química direta descrita neste documento tem uma composição de tampão compatível de ensaio de dois componente. A composição de tampão compatível de ensaio não irá modificar o ácido nucleico extraído na amostra de uma maneira que irá afetar adversamente a capacidade do ensaio a jusante para detectar o ácido nucleico quer por si só ou em combinação com outros constituintes da composição de lise química ou com os constituintes do ácido nucleico extraído (por exemplo, restos da composição de armazenamento de espécime). O primeiro componente da composição de tampão compatível de ensaio é um tampão compatível de ensaio. Esses tampões são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica e não estão listados exaustivamente neste documento. Exemplos de tampões adequados incluem tris (hidroximetil) amino metano e o sal de ácido de tris (hidroximetil) amino metano (Tris HCl, neste documento). A concentração final de trabalho do tampão na composição de lise química direta está na faixa de cerca de 0,2 M a cerca de 2 M. Preferencialmente, a concentração do componente de tampão é de cerca de 0,5 M a cerca de 1 M. Todas as concentrações deste documento são expressas como concentrações finais de trabalho (isto é, concentrações em que a composição de lise química direta é combinada com a amostra).

[0037]O segundo componente do tampão compatível de ensaio é um sal. Exemplos de sais adequados incluem NaCl, KCl, C2H3NaO2 (acetato de sódio) e (NH4)2SO4 (sulfato de amônio). Em modalidades preferidas, o sal é um sal de metal e, mais preferencialmente, NaCl. A concentração do sal na composição de lise química direta está na faixa de cerca de 0,01 M a cerca de 1 M. Em modalidades preferidas, a concentração do sal de metal é de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M e

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12/44 mais preferencialmente de cerca de 0,1 M a cerca de 0,4 M. A concentração de sal com uma composição de lise química direta particular depende do tampão, pH e tensoativos (se houver) na composição.

[0038]A composição de lise química direta também contém um tensoativo compatível de ensaio. Exemplos de tensoativos adequados incluem o Triton® X-100 descrito acima e Tween® 20 (polissorbato 20). Ensaio compatível é como definido acima. Em uma modalidade preferida, o tensoativo compatível de ensaio é um tensoativo não iônico baseado em polietileno glicol. A concentração do tensoativo não iônico está na faixa de cerca de 0,01 a cerca de 2 por cento (v/v). Em modalidades preferidas, o tensoativo não iônico é o polietileno glicol octilfenil éter. Os tensoativos compatíveis de ensaio são bem conhecidos dos versados na técnica e não são discutidos em detalhe neste documento.

[0039]A composição de lise química direta tem um pH na faixa de cerca de 6,6 a cerca de 10. Em modalidades preferidas, o pH está na faixa de cerca de 7 a cerca de 9.

[0040]A composição de lise química direta aqui descrita neste documento facilita a extração de ácido nucleico a partir de amostras fixas ao meio pela redução da reticulação que ocorre tipicamente entre o NA e os constituintes do meio para fornecer NA que é tanto extraível quanto amplificável. Em uma modalidade, uma amostra é combinada com a lise química direta e incubada a uma temperatura na faixa de cerca de 100 °C até cerca de 130 °C e por um tempo na faixa de cerca de 10 minutos a cerca de 30 minutos para lisar quimicamente pelo menos uma porção das células e, na medida em que a reticulação do NA tenha ocorrido, a desrreticulação do NA. Isto é seguido pela extração de NA a partir da amostra. Em modalidades preferidas, o NA é DNA e a extração de DNA é realizada através de separação magnética do DNA, usando partículas de óxido férrico. Em modalidades preferidas, o protocolo de extração é compatível com a plataforma BD Viper XTRTM. Um tal protocolo fornece a ligação de DNA para as partículas de óxido férrico, lavando o resto da amostra a partir das partículas e eluindo o DNA a partir das

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13/44 partículas. O DNA extraído é o submetido a uma amplificação e ensaio de detecção adequados (por exemplo, PCR em tempo real).

[0041]Em uma outra modalidade, a amostra é analisada para antígenos alvos (por exemplo, os biomarcadores de proteína). Ensaios convencionais para a detecção de antígenos extraídos de uma amostra são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica e não são descritos em detalhe neste documento. Em um exemplo, as moléculas de captura de anticorpos são usadas para ligar e antígenos alvos do ensaio. Métodos de anticorpos para tais capturas são rotineiramente usados em uma variedade de diferentes formatos. Uma das técnicas mais comumente praticadas é o ensaio de imunoabsorção por ligação a enzima (ELISA), que é rotineiramente usado em aplicações de diagnóstico de proteína. Uma característica desejada de métodos de detecção de proteínas é a capacidade de tanto conservar quanto recuperar antígenos a partir de uma célula de tal modo que eles possam ser expostos a anticorpo de captura e também em alguns casos, mantenham a sua forma nativa e permitam que os anticorpos conformacionalmente dependentes se liguem especificamente ao antígeno alvo. Outra característica desejada é a capacidade para permitir a ligação seletiva das moléculas de anticorpo corretas para o alvo e permitir que interações não específicas sejam removidas durante as etapas de lavagem. A detecção de biomarcadores de proteína exige, portanto, que o tampão compatível de ensaio seja compatível com e facilite as interações de ligação de proteína específica. A composição de lise química direta descrita neste documento é suficientemente forte para lisar as células liberando, assim, o teor de proteínas dessas células. A composição de lise química direta não afeta adversamente as proteínas liberadas, e protege as proteínas a partir de enzimas proteolíticas. Finalmente, o tampão compatível de ensaio é compatível com a ligação a anticorpo específica e não interfere com este processo, devido aos efeitos de desnaturação, interações iônicas etc..

[0042]A seguir são fornecidos alguns exemplos para ilustrar especificamente os conceitos descritos acima. Os exemplos a seguir são modalidades altamente

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14/44 específicas da presente invenção e não devem ser entendidos como limitantes da invenção de qualquer maneira, exceto de uma forma consistente com as reivindicações anexas.

Exemplo 1. Extração de DNA de HPV a partir de uma amostra de paciente armazenada em SurePath LBC [0043]Duas soluções foram comparadas para determinar a sua eficácia como composições de lise química direta. O primeiro era um diluente que continha TrisHCl 1M, NaCl 0,5 M, Triton X-100 a 1% e tinha um pH de 9,0 (Diluente 1 aqui). O segundo diluente continha Tris-HCl 330 mM, NaCl 16,67mM e tinha um pH de 7,8 (Diluente 2 aqui). Células de estoque derivadas de paciente foram colhidas e armazenadas em SurePath LBC durante 21 dias. Ambos os diluente 1 e diluente 2 são modalidades da composição de lise química direta da presente invenção.

[0044]Especificamente, as células de estoque derivadas do paciente foram diluídas em SurePath LBC a uma concentração de cerca de 12.500 células/ml. Quarenta e oito tubos de amostra foram preparados para o ensaio em ferramenta tipo Becton Dickinson (BD) ViperTM. Vinte e quatro tubos tinham 0,85 ml de diluente 1 e vinte e quatro tinham a mesma quantidade de diluente 2. As células derivadas de paciente diluídas (0,25 ml) foram adicionadas em cada um dos 48 tubos de amostra. Depois da combinação com as amostras, as concentrações finais de tampão de trabalho foram as seguintes: i) Tris-HCl 0,77 M, NaCl 0,386 M, Triton X-100 0,77% (com um pH de aproximadamente 9,0) no diluente 1, e ii) Tris-HCl 0,255 M, NaCl 0,0129 M (com um pH de aproximadamente 7,8) no diluente 2.

[0045]Oito amostras de cada grupo de vinte e quatro foram incubadas quer em i) temperatura ambiente, ii) 80°C, ou iii) 120°C, todas durante vinte minutos. As amostras foram então resfriadas durante vinte e cinco minutos em temperatura ambiente. As amostras foram então submetidas a um protocolo de extração de DNA tipo ViperTM XTR modificado, usando partículas de óxido de ferro (FeO) e 0,8 ml da amostra incubada ou pré-aquecida foi usado para a extração. O protocolo de extração para ViperTM XTR está comercialmente disponível e não é descrito em

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15/44 detalhes neste documento. Para a extensão a qual o DNA foi extraído, o DNA para a amostra foi eluído em 400 μL de tampão de eluição/neutralização. O eluato (20 pL) foi misturado com 5 μL de mistura principal de PCR, e 20 cópias/ reação de alvos de DNA de plasmídeo de HPV 18 e HPV 45 foram pós-enriquecidos em cada reação 5 para o teste de inibição de PCR. Os ensaios de PCR em tempo real foram usados para a detecção de HPV 16, 18 e 45, e gene HBB de controle endógeno de DNA humano. A detecção de DNA foi determinada pelos valores de limite de ciclo resultante (Ct). Os valores de Ct de menos que cerca de 30 representam fortes reações positivas indicativas de ácido nucleico alvo abundante nas amostras. Os 10 valores de Ct de 30-35 representam reações positivas de moderadas a baixas indicativas de moderadas a baixas quantidades de ácido nucleico alvo na amostra.

Os valores de Ct de 35-45 representam reações fracas que indicam quantidades mínimas de ácido nucleico alvo na amostra. Os valores de Ct acima de cerca de 45 são expressas como sem Ct, indicando que nenhum DNA estava sendo detectado.

Tabela 1

Extração de DNA de HPV de amostras de pacientes armazenadas em meios

SurePath

Diluente 2	Diluente 1
HPV16	RT	80°C	120°C	RT	80°C	120°C
1	sem Ct	sem Ct	32,57	sem Ct	36,97	31,20
2	sem Ct	sem Ct	32,49	sem Ct	sem Ct	30,56
3	sem Ct	sem Ct	32,33	sem Ct	sem Ct	30,40
4	sem Ct	sem Ct	32,55	sem Ct	sem Ct	30,34
5	sem Ct	sem Ct	32,88	sem Ct	sem Ct	30,65
6	sem Ct	sem Ct	32,57	sem Ct	36,99	30,54
7	36,73	sem Ct	32,35	sem Ct	sem Ct	30,94
8	sem Ct	sem Ct	32,64	sem Ct	sem Ct	30,65
Média	32,55	30,65

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Diluente 2	Diluente 1
HPV45	RT	80°C	120°C	RT	80°C	120°C
1	33,88	33,08	32,87	32,90	33,49	33,37
2	33,61	33,34	32,67	32,86	29,31	33,09
3	33,85	34,38	33,92	33,39	32,96	32,80
4	34,14	33,54	33,47	33,46	35,02	33,14
5	34,26	34,11	33,60	32,10	34,39	33,64
6	33,18	33,58	33,64	32,98	33,73	33,71
7	33,39	33,55	34,08	33,11	32,92	33,18
8	33,34	33,86	34,04	33,60	33,92	32,69
Média	33,72	33,66	33,54	33,18	33,22	33,20

Diluente 2	Diluente 1
HBB	RT	80°C	120°C	RT	80°C	120°C
1	sem Ct	sem Ct	37,91	sem Ct	42,51	34,85
2	sem Ct	sem Ct	38,68	sem Ct	41,67	35,48
3	sem Ct	sem Ct	37,48	sem Ct	sem Ct	34,34
4	sem Ct	sem Ct	37,25	sem Ct	sem Ct	34,95
5	sem Ct	sem Ct	37,16	sem Ct	sem Ct	34,90
6	sem Ct	sem Ct	37,88	sem Ct	sem Ct	35,48
7	sem Ct	sem Ct	39,14	sem Ct	sem Ct	35,22
8	sem Ct	sem Ct	36,99	sem Ct	sem Ct	34,99
Média	37,80	35,03

Diluente 2	Diluente 1
HPV18	RT	80°C	120°C	RT	80°C	120°C
1	34,55	34,77	34,78	34,37	34,08	34,03
2	33,73	34,12	34,25	34,60	34,33	33,82
3	34,59	33,97	34,00	34,05	33,77	33,44

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4	34,47	34,53	33,78	33,78	34,68	33,52
5	34,84	34,87	33,86	34,36	34,17	33,41
6	33,99	33,63	34,82	33,61	33,86	34,74
7	33,39	34,68	34,00	34,05	33,47	33,42
8	33,34	34,24	34,11	34,57	34,79	33,99
Média	33,72	34,35	34,20	34,17	34,14	33,80

[0046]Incubação no diluente 1 a 120°C reduziu o valor de Ct de HPV 16 e HBB por 1,90 e 2,77, respectivamente, quando comparado com a incubação no diluente 2 a 120°C. A incubação em temperatura ambiente ou 80°C em ambos os diluentes não deu nenhuma amplificação para HPV16 e HBB. A detecção de HPV 45 e HPV 18 enriquecidos confirmou que o ensaio em si funcionou mas que HPV16 e HBB não foram detectados a temperaturas mais baixas de incubação, indicando que a lise, extração, ou a detecção não ocorreu nessas amostras.

Exemplo 2. Extração de DNA de HPV a partir de SurePath usando diferentes diluentes e componentes de diluente individuais.

[0047]As células de estoque derivadas de paciente foram diluídas em SurePath LBC a 12500 células/ml. Quarenta e oito tubos de amostra BD Viper foram preparados. Havia oito tubos em cada grupo, com seis grupos (a-f) no total.

[0048]Em cada grupo 0,85ml de um dos seguintes tampões foram adicionados:

a. Tris 1M, (pH 9,0) apenas;

b. NaCl 0,5 M;

c. Triton X-100 a 1%;

d. a + b + c;

[0049]As células do paciente diluídas (0,25 ml) foram adicionadas a cada um dos 48 tubos de amostra. Depois da combinação com as amostras, as concentrações finais do tampão de trabalho foram as seguintes: Tris-HCl 0,77M no grupo a; NaCl 0,386M para o grupo b; Triton X-100 a 0,77% no grupo c; e Tris-HCl 0,77M, NaCl 0,386M, e Triton X-100 a 0,77% no grupo d (a combinação dos

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18/44 tampões a, b, e c). Todos os tubos de amostra foram incubados a 120 °C por 20min.

As amostras foram então resfriadas por 25 minutos em temperatura ambiente. As amostras foram então carregadas na ferramenta BD ViperTM XTR e 0,8 ml foi usado para a extração como descrito acima. O DNA foi eluído a partir das amostras em 400 5 μΙ_ de tampão de eluição/neutralização. O eluato (20 pL) foi misturado com 5 μΙ_ de mistura principal de PCR. Vinte cópias/reação de alvos de DNA de plasmídeo de

HPV 18 e HPV 45 foram pós-enriquecidos em cada reação como um controle para testar a inibição de PCR. Os ensaios de PCR em tempo real foram usados para a detecção de HPV 16, 18 e 45, e gene HBB de controle de DNA humano endógeno.

Tabela 2

Extração de DNA de HPV de meio LBC SurePath usando diluentes de HPV e tampão de componente individual

HPV16	Tris 1 M (a)	NaCl 0,5 M (b)	Triton 1% (c)	a + b + c
1	35,27	35,86	34,56	32,43
2	37,07	36,62	36,55	31,03
3	34,27	sem Ct	36,68	31,30
4	34,52	sem Ct	35,65	30,95
5	sem Ct	sem Ct	34,37	31,62
6	35,90	sem Ct	33,71	31,21
7	34,26	sem Ct	34,46	31,20
8	34,09	35,66	35,12	30,80
Média	35,05	36,05	35,14	31,33

HPV45	Tris 1 M (a)	NaCl 0,5 M (b)	Triton 1% (c)	a + b + c
1	33,47	34,61	34,19	35,22
2	33,76	34,17	33,90	33,39

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3	34,01	33,56	34,01	33,69
4	33,80	31,61	34,29	33,98
5	33,01	32,86	33,23	33,57
6	32,59	33,49	33,44	33,43
7	33,37	32,56	33,44	33,05
8	32,75	33,25	35,33	33,92
Média	33,35	32,26	33,98	33,78

HBB	Tris 1 M (a)	NaCl 0,5 M (b)	Triton 1% (c)	a + b + c
1	sem Ct	sem Ct	sem Ct	42,35
2	sem Ct	sem Ct	44,25	41,29
3	sem Ct	sem Ct	43,81	40,94
4	sem Ct	sem Ct	sem Ct	40,38
5	sem Ct	sem Ct	sem Ct	41,67
6	43,34	sem Ct	42,17	40,63
7	44,52	sem Ct	44,87	41,02
8	sem Ct	sem Ct	sem Ct	40,70
Média	43,93		43,78	41,12

HPV18	Tris 1 M (a)	NaCl 0,5 M (b)	Triton 1% (c)	a + b + c
1	34,99	34,94	34,05	34,34
2	33,94	34,56	33,84	34,18
3	34,80	34,68	34,65	34,27
4	33,97	34,52	33,80	33,74
5	33,95	35,75	33,89	34,25
6	35,17	33,90	34,27	34,35
7	34,39	34,56	34,41	33,64
8	33,87	34,94	34,03	34,32

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Média

34,38

34,73

34,12

34,14

[0050]Os tipos de HPV 16, 18 e 45 foram detectados usando d) acima com incubação a 120 °C. Os outros componentes de diluente individuais (Tris 1M, NaCl 0,5 M e Triton a 1%) não fornecem a detecção de DNA consistente, independentemente do tipo de HPV. Cada componente individual contribuiu para melhorar a extração de DNA. O melhor resultado foi obtido quando os componentes a, b, c foram combinados em conjunto.

Exemplo 3. Comparação de extração de DNA a partir de SurePath LBC usando diluente 1 a 120 °C e diluente 2 com incubação em temperatura ambiente [0051]Trinta e seis amostras de SurePath foram coletadas e extraídas de acordo com os dois seguintes protocolos.

[0052]1) O experimento sem calor. Trinta e seis tubos de amostra BD ViperTM foram preparados por adição de 0,85ml do Diluente 2 descritos no Exemplo 1. A amostra clínica SurePath (0,25 ml) foi adicionada em cada tubo. Após a combinação com as amostras, as concentrações finais do tampão de trabalho foram as seguintes: Tris-HCl 0,255 M, NaCl 0,0129 M (com um pH de aproximadamente 7,8) para o diluente 2. Os tubos trinta e seis foram carregados no ViperTM BD e 0,8 ml da amostra foi usado para a extração. O DNA foi eluído a partir da amostra em 400 pL de tampão de eluição/neutralização. O eluato (20 pL) foi misturado com 5 pL de mistura principal de PCR. Um ensaio de PCR em tempo real foi usado para detectar a presença de HPV 16, 18 e 45, e gene HBB de controle de DNA humano endógeno.

[0053]2) O experimento com calor. Trinta e seis tubos de amostra BD ViperTM foram preparados para o qual foram adicionados 0,85ml do diluente 1 descrito no Exemplo 1. A amostra clínica SurePath (0,25 ml) foi adicionada em cada tubo. Depois de combinar o diluente com as amostras, as concentrações finais do tampão de trabalho foram as seguintes: Tris-HCl 0,77 M, NaCl 0,386 M, e Triton X-100 a 0,77% (com um pH de aproximadamente 9,0) no diluente 1. Todos os tubos de

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21/44 amostra foram incubados a 120 °C durante 20 min e depois resfriados por 25 min para a temperatura ambiente. Os trinta e seis tubos foram carregados no BD

ViperTM e 0,8 ml da amostra foi usado para a extração. O DNA foi eluído a partir da amostra em 400 μΙ_ de tampão de eluição/neutralização. O eluato (20 pL) foi 5 misturado com 5 pL de Mistura principal de PCR. Um ensaio de HPV de PCR em tempo real foi usado para detectar a presença de HPV 16, 18 e 45, e gene HBB de controle de DNA humano endógeno. HPV 45 e HPV 18 não foram detectados.

Tabela 3

Comparação de Extração de DNA: i) usando Diluente 1 com 120 °C de incubação, e ii Diluente 2 com incubação em temperatura ambiente.

	HPV16	HBB
	sem calor	calor	sem calor	calor	ACt
1	sem Ct	sem Ct	25,28	23,97	1,31
2	sem Ct	sem Ct	32,25	28,30	3,95
3	sem Ct	sem Ct	31,78	27,92	3,86
4	sem Ct	sem Ct	34,78	29,83	4,95
5	sem Ct	sem Ct	34,69	29,74	4,95
6	sem Ct	41,09	37,51	31,31	6,20
7	sem Ct	sem Ct	32,24	26,82	5,42
8	sem Ct	sem Ct	31,93	26,88	5,05
9	sem Ct	sem Ct	31,74	28,88	2,86
10	sem Ct	sem Ct	28,88	25,59	3,29
11	sem Ct	sem Ct	29,41	24,93	4,48
12	sem Ct	sem Ct	35,21	29,66	5,55
13	sem Ct	sem Ct	28,54	25,23	3,31
14	sem Ct	sem Ct	30,66	27,54	3,12
15	sem Ct	35,16	32,31	26,86	5,45
16	sem Ct	sem Ct	36,29	29,39	6,90
17	25	21,07	32,54	28,00	4,54

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22/44

18	sem Ct	sem Ct	35,46	29,89	5,57
19	sem Ct	34,90	32,18	29,19	2,99
20	sem Ct	sem Ct	28,83	24,56	4,27
21	sem Ct	sem Ct	31,64	26,72	4,92
22	sem Ct	sem Ct	28,14	24,40	3,74
23	sem Ct	sem Ct	26,67	25,68	0,99
24	sem Ct	31,33	29,38	25,09	4,29
25	sem Ct	sem Ct	32,74	31,56	1,18
26	sem Ct	sem Ct	32,91	26,57	6,34
27	sem Ct	sem Ct	32,96	28,30	4,66
28	sem Ct	sem Ct	35,79	29,64	6,15
29	sem Ct	sem Ct	29,96	27,84	2,12
30	sem Ct	sem Ct	32,76	28,77	3,99
31	sem Ct	sem Ct	31,37	24,60	6,77
32	sem Ct	sem Ct	32,79	29,07	3,72
33	sem Ct	42,28	30,9	27,83	3,07
34	sem Ct	sem Ct	34,58	30,51	4,07
35	sem Ct	sem Ct	36,73	28,06	8,67
36	36,36	32,38	22,78	21,22	1,56

[0054]Em média, o protocolo de Diluente 1 / incubação aquecida encurtou por

4,29 Ct, a detecção de HBB em comparação com o protocolo usando o Diluente 2 com incubação em temperatura ambiente. As amostras que tinham o DNA de HPV tipo 16 (todas as amostras são presumidas como tendo o DNA de controle de HBB 5 considerando que nem todas as amostras terão HPV de um ou mais tipos) exibiram detecção com valores de Ct reduzidos e, portanto, tornaram-se mais detectáveis quando usando-se o protocolo com incubação aquecida e Diluente 1 em comparação com o uso de incubação em temperatura ambiente e Diluente 2.

Exemplo 4. Comparação de extração de DNA de SurePath e ThinPrep

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23/44

PreservCyt LBC com ou sem calor [0055]As células de estoque derivadas de pacientes foram diluídas em um dentre os espécimes clínicos negativos de SurePath ou ThinPrep a 12500 células/ml. Trinta e dois tubos de amostra BD ViperTM foram preparados para o qual foram adicionados 0,85 ml de Diluente de 1. SurePath enriquecido com células do paciente (0,25 ml) foi adicionado a 16 tubos de amostra e ThinPrep enriquecido com células do paciente (0,25 ml) foi adicionado aos outros 16 tubos de amostra. Depois de combinar o diluente com as amostras, as concentrações finais do tampão de trabalho foram como indicadas no Exemplo 1. Oito tubos de amostra de cada grupo foram incubados em temperatura ambiente e oito foram incubados a 120 °C por 20 minutos. Os tubos aquecidos foram resfriados por 25 minutos em temperatura ambiente. Os tubos de amostra foram então carregado na plataforma BD ViperTM e 0,8 ml das amostras foram usados para a extração do DNA. O DNA foi então eluído em 400 pL de tampão de eluição/neutralização. O eluato (20 pL) foi misturado com 5 pL de mistura principal de PCR. Vinte cópias / reação de Alvos de DNA de plasmídeo de HPV18 e HPV45 foram pós-enriquecidos em cada amostra para testar a inibição por PCR. Os ensaios de PCR em tempo real foram usados para a detecção de HPV 16, 18 e 45, e gene HBB de controle de DNA humano endógeno.

Tabela 4

Extração de DNA a partir de SurePath e ThinPrep PreservCyt LBC com ou sem calor

HPV16	ThinPrep	SurePath
Rep	sem calor	calor	sem calor	calor
1	31,24	31,99	sem Ct	31,64
2	30,89	31,37	sem Ct	31,63
3	30,98	31,66	sem Ct	32,16
4	31,39	31,58	sem Ct	31,71
5	31,02	31,15	sem Ct	31,16

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24/44

6	31,26	31,44	sem Ct	31,16
7	31,44	31,16	sem Ct	31,48
8	31,85	31,33	sem Ct	31,58
média	31,26	31,46		31,57

HPV45	ThinPrep	SurePath
Rep	sem calor	calor	sem calor	calor
1	32,25	32,22	32,67	32,56
2	32,42	32,24	32,06	32,89
3	33,2	33,15	32,54	31,91
4	32,13	32,06	32,44	31,97
5	32,48	33,03	32,19	32,85
6	31,63	33,36	32,47	32,07
7	33,65	32,17	32,69	31,53
8	32,43	32,96	32,60	32,20
média	32,52	32,65	32,46	32,25

HBB	ThinPrep	SurePath
Rep	sem calor	calor	sem calor	calor
1	27,73	27,52	33,33	29,02
2	27,99	27,09	33,63	28,88
3	28,08	27,17	33,43	29,25
4	28,21	26,89	33,28	28,71
5	28,12	26,98	33,38	28,37
6	27,98	27,04	34,3	28,36
7	27,99	27,02	34,07	28,29
8	28,43	27,38	33,96	27,84
média	28,07	27,14	33,67	28,59

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25/44

HPV18	ThinPrep	SurePath
Rep	sem calor	calor	sem calor	calor
1	33,68	33,94	34,97	33,88
2	33,38	33,86	33,87	33,88
3	34,32	34,72	34,84	33,58
4	33,35	34,11	34,22	33,81
5	33,89	34,16	34,55	33,97
6	33,40	32,88	32,96	33,68
7	34,44	34,20	34,02	33,61
8	33,82	34,10	33,96	34,83
média	33,79	34,00	34,17	33,91

[0056]A incubação das amostras a 120 °C no Diluente 1 significativamente encurtou o valor de Ct de HBB tanto para amostras de ThinPrep quanto de SurePath. A redução (em comparação com a incubação a temperatura ambiente) foi de 0,93 Ct para as amostras de ThinPrep e 5,08 Ct, para as amostras de SurePath.

O calor não teve nenhum efeito estatisticamente significativo sobre a detecção de HPV 16 a partir de ThinPrep, mas melhorou significativamente a detecção de HPV 16 a partir de SurePath.

Exemplo 5. Extração de DNA a partir de SurePath usando Diluente 1 a pH, temperatura e tempo variados [0057]O protocolo de incubação a 114 °C durante 10 minutos foi usado em conjunto com o Diluente 1 descrito no Exemplo 1 (isto é, Tris 1M, NaCl 0,5 M e Triton X100 a 1%). As amostras com diferentes pHs (9,0 e 7,8) foram usadas e testadas a tempos e temperaturas de incubação diferentes. Os diferentes pHs foram também avaliados contra o Diluente 2 do Exemplo 1 (NaCl 16,67 mM e Tris 330 mM).

[0058]As células de estoque derivadas de pacientes foram diluídas em SurePath a uma concentração de 12500 células/ml. Cinquenta e seis tubos de

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26/44 amostra foram preparados para uso em platforma BD Viper XTRTM. Havia oito amostras em cada um de sete grupos. Cada um dos seguintes tampões (0,85ml) foi adicionado em um dos sete grupos:

a. Diluente 1, pH 9,0 (incubação a 120 °C, 20 min)

b. Diluente 1, pH 9,0 (incubação a 120 °C, 10 min)

c. Diluente 1, pH 9,0 (incubação a 114 °C, 20 min)

d. Diluente 1, pH 9,0 (incubação a 114 °C, 10 min)

e. Diluente 1, pH 7,8 (incubação a 120 °C, 20 min)

f. Diluente 2, pH 7,8 (incubação a 120 °C, 20 min)

g. Diluente 2, pH 9,0 (incubação a 120 °C, 20 min) [0059]As alíquotas (0,25 ml) das amostras de pacientes diluídas foram adicionadas em cada tubo de cada grupo. Depois de combinar o diluente com as amostras, as concentrações finais de tampão de trabalho são tal como estabelecidas no Exemplo 1. Cada grupo foi incubado em sua temperatura e tempo especificado acima. Todos os tubos foram então resfriados por 25 minutos em temperatura ambiente. Os tubos foram então carregados para o BD Viper XTRTM e 0,8 ml foi usado para extração de DNA a partir das amostras. O DNA foi eluído em 400 μΙ_ de tampão de eluição/neutralização. O eluato (20 μ_) de cada um foi misturado com 5 μ_ de mistura principal de PCR. Vinte cópias/reação de alvos de DNA de plasmídeo de HPV18 e HPV45 foram pós-enriquecidas em cada reação para testar a inibição por PCR. Os ensaios de PCR em tempo real foram usados para a detecção de HPV 16, 18 e 45, e gene HBB de controle de DNA humano endógeno.

Tabela 5

Extração de DNA a partir de SurePath usando o Diluente 1 com diferentes pH e em temperaturas e tempos diferentes

HPV16	Diluente 1	Diluente 2
	120°C	114°C	120°C	120°C
	pH 9,20' pH	pH, 9, 20'	pH7,8, 20'	pH 7,8, 20'

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27/44

	9,10'	pH9,10'		pH9, 20'
1	32,36 33,57	33,4 sem Ct	30,79	33,5 35,21
2	31,29 33,24	33,11 sem Ct	30,56	32,79 33,11
3	31,18 33,23	34,02 34,84	30,55	33,05 37,78
4	31,31 32,75	32,73 sem Ct	30,96	33,48 34,43
5	32,09 31,98	33,92 sem Ct	30,58	34,90 35,15
6	31,37 32,68	32,69 sem Ct	30,67	34,53 34,32
7	30,74 32,31	32,4 sem Ct	30,31	34,43 35,81
8	31,91 33,02	32,65 36,58	30,85	33,12 nenhun Ct
média	31,53 32,85	33,12 35,42	30,66	33,73 35,12

HPV45	Diluente 1	Diluente 2
	120°C	114°C	120°C	120°C
	pH 9,20' pH 9,10'	pH, 9, 20' pH9,10'	pH7,8, 20'	pH 7,8, 20' pH9, 20'
1	33,2 34,66	34,08 34,1	33,71	34,41 33,97
2	33,35 34,31	33,56 33,71	34,03	34,18 34,5
3	34,32 33,32	33,05 34,50	34,47	33,42 34,92
4	34,56 32,84	33,71 34,28	32,21	33,81 34,09
5	33,22 34,63	34,48 33,43	34,61	33,89 33,72
6	34,11 34,8	34,11 33,98	33,47	34,15 33,99
7	34,65 31	34,45 34,53	34,12	34,47 33,59
8	34,8 34,38	33,98 33,47	32,24	34,23 34,09
média	34,03 33,87	33,93 34,00	33,61	34,07 34,11

HBB	Diluente 1	Diluente 2
	120°C	114°C	120°C	120°C

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28/44

	pH 9,20' pH 9,10'	pH, 9, 20' pH9,10'	pH7,8, 20'	pH 7,8, 20' pH9, 20'
1	32,52 36,54	33,5 37,33	31,38	33,61 36,89
2	32,27 34,4	34,54 sem Ct	31,23	32,89 35,48
3	31,97 33,51	33,66 36,54	31,23	33,39 36
4	32,42 32,79	33,87 sem Ct	31,83	34,63 35,84
5	33,12 32,97	32,88 35,12	31,64	35,88 36,94
6	32,86 34,05	34,01 sem Ct	31,42	36,71 36,63
7	31,79 33,53	33,41 37,14	31,33	34,26 sem Ct
8	32,79 34,22	34,13 31,23	31,80	34,41 sem Ct
média	32,47 34,00	33,75 35,47	31,48	34,47 36,30

HPV18	Diluente 1	Diluente 2
	120°C	114°C	120°C	120°C
	pH 9,20' pH 9,10'	pH, 9, 20' pH9,10'	pH7,8, 20'	pH 7,8, 20' pH9, 20'
1	32,2 34,35	35,13 34,31	33,57	33,16 34,19
2	33,16 33,21	32,69 33,33	33,08	34,32 33,96
3	34,08 33,40	33,22 33,1	33,66	33,29 34,91
4	31,86 33,99	33,92 33,15	34,12	33,72 34,48
5	33,14 33,91	33,53 33,36	33,35	32,72 33,18
6	33,46 34,18	33,28 33,27	33,3	33,3 34,49
7	33,37 33,50	33,39 33,42	33,3	34,92 33,51
8	33,46 34,47	35,07 32,68	33,71	34,84 33,35
média	33,09 33,88	33,78 33,33	33,51	33,78 34,01

[0060]O protocolo de incubação (114°C, 10 minutos) não rendeu o grau de detecção de HPV 16, que foi obtido quando o protocolo de alto calor foi usado. No entanto, o mesmo grau de detecção foi obtido para o HPV 45 e HPV 18

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29/44 enriquecidos, independentemente do protocolo de incubação que foi usado. A partir disso, concluiu-se que o protocolo de incubação a 114°C forneceu um menor grau de extração de DNA do que o protocolo a 120 °C. Do mesmo modo, a incubação a 120 °C por 10 minutos não foi tão eficaz para a extração de DNA de HPV 16, tal como a incubação a 120 °C por 20 minutos. A extração e detecção de DNA de HPV 16 usando o Diluente 1 a pH 7,8 mostraram uma melhoria de quase 1 Ct em comparação com a extração e detecção usando o Diluente 1, com um pH 9,0 (para incubação a 120 °C por 20 minutos). A extração após a incubação a 120 °C em Diluente 1 resultou em uma redução significativa na variabilidade do ensaio tal como medido pelo desvio padrão em repetições de PCR detectadas.

Exemplo 6. Efeito do pH sobre a eficácia do Diluente [0061]As células de estoque derivadas de pacientes foram diluídas em meio SurePath LBC a 12500 células/ml. Quarenta tubos de amostra foram preparados para a plataforma BD Viper XTRTM. Elas foram separadas em cinco grupos. O Diluente 1, tal como descrito no Exemplo 1 (0,85ml) com um pH diferente foi adicionado aos tubos em cada grupo. Os diluentes usados foram:

a. Diluente 1, pH 6,6;

b. Diluente 1, pH 6,7;

c. Diluente 1, pH 7,3;

d. Diluente 1, pH 8,0;

e. Diluente 1, pH 9,0; e

f. Diluente 1, pH 10,0.

[0062]As células de estoque de paciente diluídas (0,25 ml) foram adicionadas a cada tubo de cada grupo. Cada grupo foi incubado a 120 °C por 20 minutos, e depois resfriado por 25 minutos em temperatura ambiente. As amostras foram então carregadas no BD Viper XTRTM e 0,8 ml das amostras foi usado para a extração. O DNA foi eluído a partir das amostras em 400 μΙ_ de tampão de eluição/neutralização e 20 μ_ do eluato foi misturado com 5 μ_ de mistura principal de PCR. Vinte cópias de alvos de DNA de plasmídeo de HPV18 e HPV45 foram pós-enriquecidas em cada

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30/44 amostra para testar a inibição por PCR. Os ensaios de PCR em tempo real foram usados para a detecção de HPV 16, 18 e 45, e gene HBB de controle de DNA humano endógeno.

Tabela 6

Efeito de pH na Eficácia do Diluente 1

HPV16 Rep	pH 6,6	pH 6,7	pH 7,3	pH 8,0	pH 9,0	pH 10
1	33,64	33,46	31,47	31,21	33,79	35,68
2	34,06	34,96	31,67	31,36	31,86	34,32
3	34,58	33,10	32,33	31,70	31,99	36,30
4	33,66	33,15	32,40	31,49	31,61	35,73
5	33,46	34,90	32,32	31,85	32,00	34,36
6	34,41	33,14	32,12	31,61	31,96	34,51
7	34,66	34,93	32,25	31,58	32,12	35,15
8	34,15	34,18	32,27	31,57	32,36	35,83
média	34,08	33,98	32,10	31,55	32,21	35,24

HPV45 Rep	pH 6,6	pH 6,7	pH 7,3	pH 8,0	pH 9,0	pH 10
1	33,78	32,88	33,38	33,28	34,09	33,35
2	34,56	32,95	34,40	33,41	32,83	33,56
3	34,08	33,69	34,69	32,90	33,41	33,84
4	33,15	33,45	33,65	34,41	34,11	34,64
5	35,39	33,27	33,59	33,74	33,45	33,70
6	33,21	32,51	35,39	33,77	34,14	34,38
7	34,19	32,77	32,93	33,59	33,49	33,21
8	34,6	33,92	34,24	33,58	34,29	33,89
média	34,12	33,18	34,03	33,59	33,73	33,82

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31/44

HBB Rep	pH 6,6	pH 6,7	pH 7,3	pH 8,0	pH 9,0	pH 10
1	33,21	35,08	33,56	32,84	35,69	38,28
2	35,82	35,28	33,79	33,93	34,51	sem Ct
3	35,37	34,87	34,25	33,41	34,29	36,61
4	35,38	35,00	34,23	33,61	34,47	37,64
5	35,64	35,12	34,21	33,96	34,45	37,68
6	35,50	36,04	34,15	33,70	34,80	37,98
7	35,58	35,16	34,70	33,34	34,53	38,37
8	35,80	36,08	34,42	33,56	35,01	40,15
média	35,66	35,33	34,16	33,54	34,72	38,10

HPV18 Rep	pH 6,6	pH 6,7	pH 7,3	pH 8,0	pH 9,0	pH 10
1	34,18	33,19	34,10	33,69	34,70	33,59
2	33,87	33,36	34,28	34,07	34,78	34,36
3	32,54	34,17	34,01	33,42	34,05	34,17
4	33,42	34,36	34,77	34,02	31,75	34,96
5	34,50	34,64	34,37	33,96	34,51	34,08
6	33,58	33,89	35,73	34,28	33,82	35,70
7	34,22	34,27	34,16	34,31	34,49	33,20
8	34,63	34,83	34,11	35,42	34,33	34,55
média	33,87	34,09	34,44	34,15	34,05	34,33

[0063]Referindo-se aos resultados nas FIGs. 1A-D, o Diluente 1 com um pH na faixa de cerca de 7,3-9 fornece os melhores resultados em termos do grau de detecção de HPV a partir da amostra. Isto indica que a extração do DNA a partir da amostra é melhor quando o diluente tendo um pH nesta faixa é usado. Uma vez que

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32/44 a detecção de HPV 18 e 45 enriquecidos foi basicamente o mesmo em todos os pH's a melhoria na detecção de HPV16 e HBB é atribuída à melhor extração de DNA obtida em pH's na faixa de 7,3 e 9,0.

[0064]Exemplo 7. Comparação dos protocolos de extração de DNA [0065]As células derivadas de paciente foram colhidas e separadas em dois grupos iguais. Uma metade foi armazenada em ThinPrep e a outra metade de SurePath LBC. Ambos os grupos apresentaram uma concentração de 1,14 x 107 células/ml. Um estoque com uma concentração de células de 2,5 x 104 células/ml foi preparado a partir de 1,14 x 107 células/ml de estoque em meio SurePath. Este estoque foi usado para os seguintes protocolos de extração. Todos os protocolos de extração foram seguidos por extração de DNA, usando a plataforma BD Viper XTR TM.

[0066]No primeiro protocolo, oito amostras de 226 pL de estoque SurePath foram centrifugadas por 5 minutos a uma força de 13.000 g. O sobrenadante resultante foi decantado e ressuspenso em 1 ml do Diluente 2 (descrito no Exemplo 1) que também continha uma proteinase K em uma concentração de 2mg/ml. As oito amostras foram transferidas para tubos de amostra para uso com a plataforma BD Viper XTRTM e incubadas a 70°C por 1 hora. Isto foi seguido por extração na plataforma BD Viper XTRTM como descrito abaixo.

[0067]No segundo protocolo, oito amostras (226 pL) do estoque de SurePath foram diluídas (1:4) pela adição às amostras de 774 pL de Diluente 2, que também continha uma proteinase K na concentração de 2mg/ml. As oito amostras foram transferidas para tubos de amostra para uso com a plataforma BD Viper XTRTM e incubadas a 70 °C durante 1 hora. Isto foi seguido por extração na Plataforma BD Viper XTRTM como descrito abaixo.

[0068]No terceiro protocolo, oito amostras (250 pL) de estoque de SurePath foram combinadas com 850 pL do Diluente 2 (descrito no Exemplo 1). As oito amostras foram transferidas para tubos de amostra para uso com a plataforma BD Viper XTRTM e incubadas a 120 °C por 20 minutos. Isto foi seguido por extração na

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33/44 plataforma BD Viper XTRTM como descrito abaixo.

[0069]No quarto protocolo, oito amostras (250 pL) de estoque de SurePath foram combinadas com 850 μL de Diluente 1 (descrito no Exemplo 1). As oito amostras foram transferidas para tubos de amostra para uso com a plataforma BD 5 Viper XTRTM e incubadas a 120°C por 20 minutos. Isto foi seguido por extração na plataforma BD Viper XTRTM como descrito abaixo.

[0070]Para um controle negativo, oito alíquotas de 850 μL de Diluente 2 foram combinadas com 250 μL de meio SurePath limpo. Isto foi seguido por extração na plataforma BD Viper XTRTM como descrito abaixo [0071]Todas as amostras foram carregadas no BD Viper XTRTM e 0,8 ml das amostras foi usado para a extração. O DNA foi eluído a partir das amostras em 400 μL de tampão de eluição/neutralização e 20 μL de eluato foi misturado com 5 μL de mistura principal de PCR. Os ensaios de PCR em tempo real foram usados para a detecção de HPV 16 e gene HBB de controle de DNA humano endógeno.

Tabela 7

Comparação do protocolo de tratamento com proteinase K (PK) e tratamento térmico

Protoco lo	1	2	3	4	3
Condiç	Centrifugação,	Sem		120°C em	120°C em	Controles
ão	PK,		centrifugação	Diluente 2	Diluente 2	Não-alvos
	70°C em	PK,
	Diluente 2	70°C em
			Diluente 2
Alvo	HBB	HPV16	HBB	HPV	HBB	HPV	HBB	HPV	HB	HPV1
				16		16		16	B	6
Rep 1	31,3	29,49	sem	32,8	32,19	29,9	29,94	28,0	se	sem
	8		Ct	5		7		1	m	Ct

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34/44

									Ct
Rep 2	31,3	29,48	32,85	32,8	31,30	29,3	29,45	27,7	se	sem
	8			5		5		5	m	Ct
									Ct
Rep 3	31,0	28,92	32,26	31,2	31,62	29,8	29,83	27,9	se	sem
	0			1		8		6	m	Ct
									Ct
Rep 4	30,5	28,66	32,39	30,4	31,01	29,0	29,72	27,5	se	sem
	5			0		2		6	m	Ct
									Ct
Rep 5	30,1	28,37	32,16	30,6	31,88	29,6	30,16	28,2	se	sem
	2			6		1		6	m	Ct
									Ct
Rep 6	30,6	28,86	32,15	30,0	31,62	29,4	29,79	27,8	se	sem
	8			6		9		3	m	Ct
									Ct
Rep 7	31,0	28,9	32,26	30,1	31,56	29,5	29,95	28,2	se	sem
	9			5		1		2	m	Ct
									Ct
Rep 8	30,5	28,66	32,26	30,2	31,61	29,3	30,19	28,5	se	sem
	5			3		2		7	m	Ct
									Ct
Média	30,8	28,92	32,33	30,7	31,60	29,5	29,88	28,0
	4			4		2		2

[0072]A incubação no Diluente 1 a 120 °C rendeu os valores de CT mais baixos em média para o HPV 16. Isto indica que, dos protocolos testados, a incubação em Diluente 1 forneceu a melhor extração de DNA a partir da amostra. O protocolo que usou o Diluente 2 com incubação a 120°C produziu um resultado melhor do que o

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35/44 resultado da incubação de proteinase K a 70°C sem centrifugação. Especificamente, o Diluente 1 reduziu o valor de Ct médio de HPV 16 por 0,90, 2,72 e 1,5, respectivamente, e reduziu o valor de Ct médio de HBB por 0,97, 2,45 e 1,72, respectivamente, quando comparado com i) tratamento com proteinase K (após 5 centrifugação) a 70 °C; ii) tratamento comproteinase K (sem centrifigação), e iii) incubação a 120 °C em Diluente 2.

Exemplo 8. Extração de amostras enriquecidas com sangue [0073]Os espécimes clínicos negativos de SurePath e ThinPrep agrupados foram combinadas com o sangue total. As amostras tinham 1%, 2%, 5% e 10% 10 (volume de sangue por volume de amostra). Todas as amostras foram incubadas a 120°C em Diluente 1 descrito no Exemplo 1 por 20 minutos. Isto foi seguido por extração na plataforma BD Viper XTRTM, usando o protocolo descrito nos exemplos anteriores. Todas as amostras foram carregadas no BD Viper XTRTM e 0,8 ml das amostras foi usado para a extração. O DNA foi eluído a partir das amostras em 400 15 μΙ_ de tampão de eluição/neutralização e 20 μΙ_ de eluato foi misturado com 5 μΙ_ de mistura principal de PCR. O ensaio de HPV em PCR em tempo real foi usado para a detecção de gene HBB de controle de DNA humano endógeno.

T abela 8A: Efeito de Sangue no Ensaio (SurePath)___________

Meio	SurePath
Sangue (%)	0	1	2	5	10
1	28,62	28,66	28,97	38,66	sem Ct
2	30,02	28,99	29,34	29,76	28,78
3	28,63	28,65	28,63	28,73	28,52
4	28,34	28,43	28,81	28,61	28,28
5	27,92	28,69	28,90	29,10	28,06
6	28,24	28,97	28,67	28,98	28,64
7	28,08	29,13	28,09	28,61	28,76
8	28,48	28,92	29,46	28,15	28,73
média	28,54	28,81	28,86	28,83	28,54

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Tabela 8B: Efeito de Sangue no Ensaio (ThinPrep PreservCyt)

Meio	ThinPrep PreservCyt
Sangue (%)	0	1	2	5	10
1	31,99	30,99	31,16	30,75	30,38
2	32,08	31,67	30,28	30,40	29,98
3	31,92	31,62	31,02	30,19	30,34
4	31,65	31,31	31,12	30,20	30,16
5	31,55	31,43	30,79	30,10	30,06
6	31,90	31,04	30,63	30,14	30,49
7	31,31	31,40	30,53	30,29	29,96
8	31,45	31,34	30,85	29,84	29,88
média	31,73	31,35	30,80	30,24	30,16

[0074]O ensaio não foi afetado pela alta concentração de sangue total, uma substância frequentemente encontrada em espécimes de LBC e conhecidos como inibidores de reações de PCR. Este método de extração de DNA fornece DNA 5 adequado para amplificação por PCR, mesmo com concentração elevada de sangue total presente nas amostras clínicas.

Exemplo 9. Extração de DNA a partir de pedaços de tecido embebidos em parafina, fixada em formalina [0075]Pedaços de tecidos de biopsia cervical embebidos em parafina, fixada em 10 formalina foram incubados a 120°C em 2 ml de Diluente 1 descrito no Exemplo 1 por 25 minutos. As amostras foram, em seguida, resfriadas até para temperatura ambiente. Após resfriamento, as amostras foram submetidas ao protocolo de extração descrito anteriormente na plataforma de BD Viper XTRTM. Todas as amostras foram carregadas no BD Viper XTRTM e 0,8 ml das amostras foi usado 15 para a extração. O DNA foi eluído a partir das amostras em 400 pL de tampão de eluição/neutralização e 50 pL de eluato foi adicionado em mistura principal de PCR

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37/44 seca. Os ensaios de PCR em tempo real foram usados para a detecção de subtipos de HPV 16, 18, 45, 31, 51,52, 59, (33,58,56,66), (39,68,35) e gene HBB de controle de DNA humano endógeno .

Tabela 9

Extração de DNA de Viper a partir de pedaços de tecido embebidos em parafina, fixada em formalina

ID da amostra	Grau de patologia Câncer/pré-câncer	Resultado de Beta globina	Resultado de HPV
DH0727	Carcinoma de células escamosas	Positivo	HPV16
DH0847	Carcinoma de células escamosas	Positivo	HPV16
DH0848	Carcinoma pobremente diferenciado	Positivo	HPV 18, 52
DH0856	Carcinoma de células escamosas	Positivo	HPV 18, 31
DH0867	Neoplasia Intraepitelial Cervical (CIN) III	Positivo	HPV16
DH0869	Neoplasia Intraepitelial Cervical (CIN) III	Positivo	HPV de alto risco negativo
DH0870	Neoplasia Intraepitelial Cervical (CIN) III	Negativo	HPV indeterminado
DH0873	Neoplasia Intraepitelial Cervical (CIN) III	Positivo	HPV16
DH0874	Neoplasia Intraepitelial Cervical (CIN) III	Positivo	HPV16
DH0880	Neoplasia Intraepitelial Cervical (CIN) III	Positivo	HPV16
DH0892	Carcinoma de células escamosas	Positivo	HPV16
DH0896	Carcinoma de células escamosas	Positivo	HPV (33,58,56,66)
DH0898	Carcinoma de células escamosas	Positivo	HPV16,45

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DH0900	Carcinoma de células escamosas	Positivo	HPV45
DH0902	Carcinoma de células escamosas	Positivo	HPV16

ID da amostra	Grau de patologia Câncer/pré-câncer	Resultado de Beta globina	Resultado de HPV
DH0903	Carcinoma de células escamosas	Positivo	HPV16
DH0904	Carcinoma de células escamosas	Positivo	HPV16
DH0905	Carcinoma de células escamosas	Positivo	HPV 16, 59
DH0910	Neoplasia Intraepitelial Cervical (CIN) III	Positivo	HPV 16
DH0911	Neoplasia Intraepitelial Cervical (CIN) III	Positivo	HPV16
DH1408	Neoplasia Intraepitelial Cervical (CIN) III	Positivo	HPV 16, 59

[0076]Em 20 das 22 amostras individuais, alguns subtipos de DNA de HPV foram detectados com sucesso. O gene de beta-globina humano endógeno foi detectado em 21 das 22 amostras. Os iniciadores específicos de subtipo de HPV e 5 PCR em tempo real e iniciadores específicos de beta-globina para HBB foram usados. Os resultados de beta globina indicam que não houve nenhuma inibição de PCR óbvia associada com o método de extração de DNA atual. A falha na detecção do sinal de beta globina em uma amostra e tanto sinal de beta globina quanto de HPV em um segundo pode ter sido devido à falta de células alvo suficientes na 10 seção processada para a extração de DNA.

Exemplo 10. Extração de DNA de HPV de células derivadas de paciente armazenadas em meio de SurePath e ThinPrep LBC usando diluente 1 para lise química direta [0077]As células de estoque derivadas de pacientes foram diluídas em 15 SurePath e LBC ThinPrep em 5000 células/ml. Dezasseis tubos de cada tipo de

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39/44 amostra tinham 0,50 ml dos seguintes diluentes: T ris 1,5 M, NaCI 0,386M e T riton X100 a 1,5% (v/v). O diluente tinha um pH de 7,9. As células derivadas de paciente diluídas (0,5 ml) em SurePath e ThinPrep foram adicionadas em cada um dos tubos de amostra com o diluente. Após a combinação com as amostras, as concentrações finais do tampão de trabalho foram as seguintes: Tris-HCl 0,75 M, NaCl 0,193M, e Triton X-100 a 0,75% (v/v) (com um pH de aproximadamente 7,9). A solução combinada foi incubada a 120°C por 20 minutos como lise química direta. Após a incubação, as amostras foram preparadas para a extração sobre a plataforma BD Viper XTRTM. O protocolo de extração descrito anteriormente foi usado. Isto é, todas as amostras foram carregadas no BD Viper XTRTM e 0,8 ml das amostras foi usado para a extração. Metade das amostras foi com a etapa de lise durante a extração e metade das amostras não foi. O DNA foi eluído a partir das amostras em 400 μΙ_ de tampão de eluição/neutralização e 20 μΙ_ de eluato foi misturado com 5 μΙ_ de mistura principal de PCR. Vinte cópias de alvos de DNA de plasmídeo de HPV18 e HPV45 foram pós-enriquecidas em cada amostra para testar a inibição por PCR. Os ensaios de PCR em tempo real foram usados para a detecção de HPV 16, 18 e 45, e gene HBB de controle de DNA humano endógeno. Os resultados dos ensaios são fornecidos abaixo.

Tabela 10

Uso de pré-aquecimento em diluente como lise química direta seguido por Extração de DNA com e sem lise

HPV16	SurePath	ThinPrep
Rep	Sem lise	Lise	Sem lise	Lise
1	31,77	32,15	31,67	32,06
2	31,83	31,43	32,04	31,68
3	31,55	31,95	31,76	31,93
4	31,76	32,35	31,86	32,00
5	32,05	32,19	31,67	32,36

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6	31,73	32,02	31,46	31,55
7	31,95	31,96	31,64	32,28
8	32,18	32,30	31,85	31,41
média	31,85	32,04	31,74	31,94

HPV45	SurePath	ThinPrep
Rep	Sem lise	Lise	Sem lise	Lise
1,00	33,26	32,82	33,12	32,83
2,00	33,10	33,03	32,92	32,61
3,00	32,45	31,90	32,49	33,06
4,00	31,89	32,99	32,40	33,17
5,00	33,47	31,92	32,63	32,13
6,00	33,38	32,66	32,89	31,66
7,00	32,53	32,32	32,04	32,48
8,00	32,98	32,95	32,23	33,47
média	32,88	32,57	32,59	32,69

HBB	SurePath	ThinPrep
Rep	Sem lise	Lise	Sem lise	Lise
1	31,63	32,10	31,50	32,11
2	30,37	31,64	31,16	31,67
3	31,57	31,75	31,24	31,93
4	31,69	31,68	31,48	31,77
5	31,49	31,99	31,06	31,87
6	32,08	31,15	31,45	31,45
7	31,95	31,37	31,50	31,02
8	32,05	32,06	31,94	31,38
média	31,60	31,72	31,42	31,65

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HPV18	SurePath	ThinPrep
Rep	Sem lise	Lise	Sem lise	Lise
1	33,93	34,21	34,17	33,91
2	34,06	33,53	33,41	33,20
3	33,00	33,05	33,71	33,47
4	33,99	33,40	33,64	33,15
5	33,77	33,45	30,55	33,40
6	33,69	29,50	33,40	32,60
7	33,23	32,77	33,65	33,62
8	33,57	33,43	33,79	33,58
média	33,66	32,92	33,29	33,37

[0078]O rendimento de DNA tanto para o DNA extraído (isto é, HPV 16 e HBB) quanto para o DNA enriquecido (isto é, HPV 45 e HPV 18) é aproximadamente o mesmo para tanto para lise quanto para sem lise durante a extração de NA (isto é, lise química direta usando um exemplo da composição e método descritos neste 5 documento. Isto se manteve verdadeiro tanto para o meio ThinPrep (TP) quanto para SurePath (SP). Isto indica que a composição e método descritos neste documento servem como uma lise química direta das células na amostra sem necessidade de outras etapas de lise enzimática ou química.

Exemplo 11. Capacidade de extração de DNA de Viper a partir de células 10 derivadas de pacientes armazenados em meio de SurePath LBC usando Diluente para lise química direta [0079]As células C33A que tinham sido armazenadas em SurePath LBC por um mês foram diluídas a 108, 107, 106, 105, 104, 103, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 células/ml. Quatro (4) repetições foram incluídas em cada concentração. 0,25 ml de 15 cada concentração de estoques de células SurePath (0,25 ml de cada concentração) foram misturados com 0,75ml de um diluente de HPV (Tris 1,0 M, NaCl 0,257M, e Triton X-100 a 1,0% (v/v), pH de 7,9). Triton X-100 (v/v); pH de 7,9). Depois que o

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42/44 diluente foi combinado com as amostras, a concentração final de trabalho da composição de lise química direta foi T ris-HCl 0,75 M, NaCl 0,193M, e T riton X-100 a 0,75% (v/v) (com um pH de aproximadamente 7,9). As amostras no diluente foram pré-aquecidas a 120°C por 20 minutos e, em seguida, resfriadas até a temperatura 5 ambiente. Estas amostras (0,8 ml) foram extraídas usando o instrumento Viper XTR e eluídas em 400 μΙ_ de volume final. O eluato de DNA (20 pL) foi misturado com mistura principal de PCR (5 pL) em PCR em tempo real para quantificar o número de cópias de DNA de HBB extraído. O DNA genômico humano purificado foi adicionado a PCR em 100.000, 10.000, 1000, 100, 10, 1 cópia/reação e usado para a 10 quantificação de DNA da amostra. A eficiência da extração foi calculada a partir da razão de cópias de HBB extraídos quantificadas por PCR em tempo real e de cópias de HBB total com base no número de células de entrada.

Tabela 11

Capacidade de extração de DNA de Viper usando lise química direta seguido por Extração de DNA

Contagem de células de entrada	Eficiência extração	de
2 x 107	0,440
2 x 106	0,322
2 x 105	0,526
2 x 104	0,809
2 x 103	0,731
200	0,967
100	0,499
50	0,656
25	0,614
12,5	0,511
6,25	0,345

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média

0,584

[0080]A capacidade de extração a partir do meio SurePath é ilustrada na Tabela 11 usando o diluente descrito acima. A Tabela 11 indica que a lise química direta seguida por extração de DNA produz mais do que 6 logs de faixa dinâmica linear com uma eficiência média de 58% usando a linhagem de células de carcinoma cervical humano em meio SurePath como um sistema de modelo.

[0081]Exemplo 12. Compatibilidade de Diluente de HPV de Lise Química Direta com detecção de Biomarcador de proteínas por ensaio de imunoabsorção de ligação à enzima (ELISA)

Células SiHa foram ressuspensas em temperatura ambiente em diluente de HPV a uma concentração de trabalho de 6,7 x 106 células/ml e foram usadas sem diluição e serialmente duas vezes em albumina de soro bovino a 1% (BSA) em Tween a 0,1 % com salina tamponada com fosfato. O antígeno alvo foi detectado em um ensaio de imunoabsorção de ligação a enzima (ELISA) padrão em sanduíche. O antígeno alvo foi ligado à superfície de placas de micropoços usando um anticorpo primário, antes de ser detectado usando um anticorpo secundário conjugado com estreptavidina e peroxidase de horseradish e um substrato quimioluminescente. A FIG. 2 mostra os resultados para cada um dos quatro analitos alvos (p16lNK4a, HPV16, E1E4, MCM2 e MCM6), onde o antígeno alvo foi facilmente detectado. A integridade do antígeno foi confirmada por imunoblotting para dois dos antígenos alvos (MCM2 e MCM6) onde ambas as proteínas alvos foram verificadas como sendo de comprimento completo (cerca de 100 Quilodaltons), sem produtos de degradação significativos (dados não mostrados). Estes resultados demonstram que o tampão de diluente de HPV é compatível com a recuperação e detecção de biomarcadores de proteína e poderia ser usado para a detecção de ácido nucleico primário seguida por ou precedida com a detecção de biomarcador de proteína para adicionalmente melhorar ou refinar a detecção de doenças.

[0082]Todas as referências citadas neste documento são incorporadas aqui por

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44/44 referência na sua totalidade e para fins na mesma extensão como se cada publicação individual ou patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.

[0083]Muitas modificações e variações da presente invenção podem ser feitas sem se afastar do seu espírito e escopo, como será evidente para os versados na técnica. As modalidade específicas descritas neste documento são oferecidas a título de exemplo apenas, e a invenção deve ser limitada apenas pelos termos das reivindicações anexas, juntamente com o escopo total de equivalentes aos quais 10 essas reivindicações são intituladas.

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma composição de lise química direta em combinação com uma amostra de citologia em base líquida de uma amostra embebida em parafina e fixada em formalina, a composição de lise química direta compreendendo:

   a) uma composição de tampão compreendendo um componente tampão e um componente de sal de metal, em que o componente de sal de metal é selecionado do grupo que consiste de cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), acetato de sódio (C2H3NaO2) e sulfato de amônio ((NH4)2SO4), em que a concentração do componente tampão está na faixa de 0,2 M a 2 M e a concentração do componente de sal de metal está na faixa de 0,01 M a 1 M; e

   b) um tensoativo não iônico, em que a concentração do tensoativo não iônico está na faixa de 0,01 a 2 por cento (v/v); no qual quando uma amostra biológica é armazenada na composição de citologia em base líquida ou na composição embebida em parafina e fixada em formalina e combinada com a composição de lise química direta, a composição de lise química direta é capaz de lisar células a partir da amostra biológica diretamente da composição de citologia em base líquida ou da composição embebida em parafina e fixada em formalina.
2. 2. Método para a análise de amostras biológicas armazenadas em uma composição de armazenamento de espécime, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

   combinar uma amostra biológica com uma combinação de uma composição de citologia em base líquida ou uma composição embebida em parafina e fixada em formalina e uma composição de lise química direta, em que a composição de lise química direta compreende a composição de lise química direta conforme definida na reivindicação 1;

   remover pelo menos uma porção da amostra a partir da combinação de uma

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   2/4 composição de citologia em base líquida ou de uma composição embebida em parafina e fixada em formalina e uma composição de lise química direta, em que a porção removida também inclui a composição de citologia em base líquida ou composição embebida em parafina e fixada em formalina;

   incubar a porção removida da amostra a uma temperatura que é pelo menos de 80°C por um tempo suficiente para lisar pelo menos uma porção das células na porção removida da amostra;

   extrair um alvo a partir da porção removida da amostra; e examinar o alvo na porção removida da amostra.
3. 3. Kit de diagnóstico para a extração de moléculas alvos a partir de componentes celulares, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a composição de lise química direta conforme definida na reivindicação 1, em que o kit adicionalmente compreende uma amostra biológica combinada com uma composição de citologia em base líquida ou uma composição embebida em parafina e fixada em formalina, em que a composição de citologia em base líquida ou composição embebida em parafina e fixada em formalina é fornecida para conservar uma amostra de tecido.
4. 4. Composição de lise química direta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição de lise química direta compreende ainda um componente de tampão e um componente de sal de metal.
5. 5. Composição de lise química direta, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o pH está na faixa de 6,6 a 10.
6. 6. Composição de lise química direta, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente de sal de metal é selecionado a partir do grupo consistindo em cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), acetato de sódio (C2H3NaO2) e sulfato de amônio ((NH4)2SO4) e a concentração de sal de metal na composição de lise química direta está na faixa de 0,01 M a 1 M.

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   3/4
7. 7. Composição de lise química direta, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a concentração do componente de tampão está na faixa de 0,2 M a 2 M.
8. 8. Composição de lise química direta, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente de sal de metal é NaCl e a concentração de NaCl está na faixa de 0,01 M a 1 M.
9. 9. Composição de lise química direta, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o tensoativo não iônico é um tensoativo não iônico baseado em polietileno glicol.
10. 10. Composição de lise química direta, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que a concentração do tensoativo não iônico está na faixa de 0,01 a 2 por cento (v/v).
11. 11. Composição de lise química direta, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente de tampão é o sal de ácido de tris (hidroximetil) amino metano e a concentração do componente de tampão é de 0,75 M, a concentração de NaCl é de 0,19 M e a concentração de polietileno glicol octilfenil éter é de 0,75 por cento (v/v).
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o alvo é um ácido nucleico alvo e o ensaio é um ensaio de amplificação para o ácido nucleico alvo.
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de sangue ou células selecionadas a partir do grupo consistindo em células vaginais, células cervicais, células endocervicais, células anais, células esfoliadas, células orais, células de garganta e células peritoneais.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de citologia em base líquida ou composição embebida em

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    4/4 parafina e fixada em formalina tem pelo menos um constituinte selecionado a partir do grupo consistindo em formaldeído, ácido fórmico, metanol, etanol, formalina tamponada, EDTA, polipeptídeos, poliaminoácidos, e polissacarídeos.
15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção removida da amostra não é adicionalmente separada da composição de citologia em base líquida ou composição embebida em parafina e fixada em formalina antes das etapas de lise e extração.