CN110468073A - 一株适合东北地区的抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株适合东北地区的抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用。本发明首先公开了慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17502。本发明进一步提供了包含上述慢生根瘤菌的菌剂及其应用。本发明慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1具有促生特性，并具有很强的适应性，是生物安全菌株，能显著增加不同发育时期的花生株高、根瘤数、地上鲜重等性状，大大提高花生的产量，为中国花生主要种植区之一—东北地区提供了高效固氮和稳定促生的微生物种质资源，有利于促进中国农业绿色健康可持续发展。

Description

一株适合东北地区的抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一株适合东北地区的抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用。
背景技术
花生是中国重要的经济作物和油料豆科作物之一。花生在中国各地均有种植，主要分布在黄淮区域、东北、两广等地区，中国花生生产主要依赖化学肥料，而未利用 花生根瘤菌剂与花生共生固氮这个“天然氮肥工厂”的作用，非常令人痛心。化肥过量 使用的主要原因有以下几点：1.化肥的替代产品落后；2.施肥装备差，肥料损失大； 3.针对豆科作物，完全依赖化学氮肥，造成了极大的浪费；4.针对不同种植体系肥料 减施增效的技术研发滞后，亟需加强技术集成，创新应用模式。因此，发展有机肥料 和生物肥等绿色环保新技术和新肥料，加强技术集成创新与应用是中国实现化肥减施 增效的关键。
根瘤菌是一类与豆科植物共生、形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类革兰氏阴性菌。这种共生体系具有最强的固氮能力。在根瘤内，根瘤菌从豆科植物根 的皮层细胞中吸取碳水化合物、矿质盐类及水分，进行生长和繁殖。同时它们又把空 气中游离的氮通过固氮作用固定下来，转变为植物所能利用的含氮化合物，供植物生 活所需。这样，根瘤菌与根构成了互相依赖的共生关系。根瘤菌在生活过程中分泌一 些有机氮到土壤中，根瘤在植物的生长末期会自行脱落，从而大大提高了土壤的肥力。
虽然根瘤菌剂有诸多优点，但根瘤菌的结瘤和固氮也受土壤环境如水分、pH值、化肥、农药等诸多因素的影响。为保障最大效率的发辉根瘤菌的固氮能力，必须要筛 选具有广泛适应不同生态环境能力的、具有较强的抗逆性、抗药性的高效固氮的根瘤 菌菌株，才能适应中国豆科作用种植范围广、环境差异大、普遍使用杀虫剂、除草剂 和杀菌剂的国情，而未见国内的相关研究报道。
因此，开展抗逆且高效固氮菌株的筛选研究工作极为必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为提供如何进行高效固氮并促进植物生长。
为解决上述问题，本发明首先提供了一株慢生根瘤菌。
本发明慢生根瘤菌为慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17502。
上述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1的16s rDNA序列如序列表中序列 1所示。
本发明所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1为适合东北地区的抗逆固氮的花生慢生根瘤菌。
本发明所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1经血琼脂平板培养法检测，溶血活性为阴性，表明对人畜无害。
本发明所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1经鉴定具有多种功能特征，主要包括：(1)促植物生长的功能：促进植株在不同发育时期的株高、根瘤数、果针 的下针数、果实数、产量、地上鲜重的增加；(2)抗逆性：耐盐浓度为4g/100ml(即 可耐受NaCl的浓度为4g/100ml)；耐酸pH6；耐碱pH11；耐干旱(可耐受浓度为PEG 6000的浓度为30g/100ml，重度干旱)；(3)耐药性：可耐受农业应用中普遍使用的杀 菌剂嘧菌酯(250mg/L)和杀虫剂吡虫啉(58.3mg/L)的最大使用浓度。
本发明进一步提供了一种菌剂。
本发明菌剂含有上述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1。
上述菌剂中，所述菌剂具有下述至少一种特性：
A1)耐盐；
A2)耐酸；
A3)耐碱；
A4)耐干旱；
A5)耐药；
A6)固氮；
A7)促植物生长。
上述菌剂中，所述菌剂的活性成分可为上述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1、上述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1的培养物或上述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1的代谢物，所述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分 或/和非生物成分，所述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据本发明实际需要进 行确定。
上述菌剂中，除了含有活性成分外，还含有辅料。所述辅料可根据需要选择。
上述菌剂中，所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1的培养物是将慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1在微生物培养基中培养得到的培养容器内的物质， 如发酵液。
上述菌剂中，所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1的代谢物可从慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1的培养物中获得。
上述菌剂中，所述微生物培养基为YMA液体培养基。
在本发明的一个实施例中，所述菌剂具体为液体菌剂，是通过采用YMA液体培 养基培养所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1获得的；所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1在所述液体菌剂中的浓度为1×1010-11cfu/ml。
本发明进一步公开了上述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1或上述菌剂在制备具有下述至少一种特性的产品中的应用：
A1)耐盐；
A2)耐酸；
A3)耐碱；
A4)耐干旱；
A5)耐药；
A6)固氮；
A7)促植物生长。
上述应用中，所述产品可为微生物肥料。
上述菌剂或应用中，所述耐盐为耐受的NaCl的浓度为4g/100ml；所述耐酸为耐 受的pH为6；所述耐碱为耐受的pH为11；所述耐干旱为耐受的PEG 6000的浓度为 30g/100ml(即重度干旱)；所述耐药性为能耐受农业应用中普遍使用的杀菌剂嘧菌酯 和杀虫剂吡虫啉，具体的所述耐受嘧菌酯的最大使用浓度为250mg/L，所述吡虫啉的 最大使用浓度为58.3mg/L。
本发明进一步还提供了一种菌剂的使用方法。
上述菌剂使用方法，包括如下步骤：
S1)将上述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1的菌液添加微量元素；
S2)将步骤S1)获得添加微量元素的菌液喷洒植物种子表面，阴干；
S3)用羧甲基纤维素钠溶液(保护剂)对步骤S2)阴干的种子进行拌种包衣，阴 干；
S4)播种。
上述菌剂的使用方法中，步骤S1)中，所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1 的菌液可通过采用YM液体培养基培养得到的菌种母液(菌种母液的浓度可达1×1010-11 cfu/ml)通过干净自来水稀释后得到，两者的配比为1体积菌种母液：2体积干净的自来水。
上述菌剂的使用方法中，步骤S1)中，所述微量元素以微量元素液的形式添加到菌液中，所述微量元素液的各组分的含量为：H38O32.86g/L，MnSO41.81g/L， CuSO4·5H2O0.80g/L，ZnSO40.22g/L，H2MoO40.02g/L，溶剂为水；向所述稀释菌液 中添加的所述微量元素液的量可为每3mL菌液添加1μL所述微量元素液。其中，所述 微量元素的作用是增加营养、提高细菌活性和促进根瘤形成和固氮。
上述菌剂的使用方法中，步骤S2)中，所述的菌液的用量以使种子表面湿润即可。
上述菌剂的使用方法中，步骤S3)中，所述羧甲基纤维素钠溶液(保护剂)为终 浓度为10g/L的羧甲基纤维素钠水溶液。配制方法如下：10g羧甲基纤维素钠 (800～1200mPa·s)溶于1L去离子水，在60℃水浴中搅拌溶解至透明糊状胶液。所述 1％的羧甲基纤维素钠溶液(保护剂)的用量可为每kg种子用25mL，其作用是保持菌 剂的附着和种子的湿度。
上述菌剂的使用方法中，步骤S4)中，在进行完所述播种后还可包括浇水的步骤，其作用是保证菌株活性必要的湿度。
上述菌剂的使用方法在促植物生长中的应用也在本发明的保护范围之内。
在本发明中，所述促植物生长具体可体现为如下至少一种：
B1)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的株高增加；
B2)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的果实数增加；
B3)促进所述植物的根瘤数增加；
B4)促进所述植物的下针数增加；
B5)促进所述植物的地上鲜重增加；
B6)促进所述植物的产量增加；
所述不同发育时期为盛花期(约播种后60天)和/或成熟收获期(约播种后120天)。
上述应用中，所述促植物生长可体现为在氮胁迫的土壤中促植物生长。在本发明的一个实施例中，所述氮胁迫的土壤具体为中国东北地区(具体如吉林省四平市梨树 县临海镇)的土壤。
进一步地，所述氮胁迫是氮肥施用量为常规施肥量的60％，磷肥和钾肥不变。所述常规施肥量为：N：P(P2O5)：K(K2O)＝9.6Kg·ha-1：16Kg·ha-1：12Kg·ha-1。 在本发明中，所述氮肥具体为尿素。
在本发明中，所述植物可为粮食作物，具体可为花生，如白沙308。
本发明针对东北地区花生生产及土壤现状，测定从东北地区分离的高效固氮花生根瘤菌的环境适应性等能力，从花生根瘤分离选育出慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1，该菌株适应于东北地区，具有促生特性，并具有很强的适应性如耐干旱、耐 受农药和耐酸碱等，是生物安全菌株。在减少常规氮肥施用量40％的情况下，田间施 用该菌剂比未施用对照可显著增加不同发育时期的花生株高、根瘤数、地上鲜重等性 状，花生产量比常规施肥的处理提高了11.2％。
本发明为中国花生主要种植区之一-东北地区提供了高效固氮和稳定促生的微生物种质资源，有利于促进中国农业绿色健康可持续发展。利用慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1菌株，可减少氮肥的投入和减轻过量施用氮肥对环境造 成的污染，符合中国可持续绿色农业发展的需要和低碳、环保、生态农业的要求。本 发明扩大了中国粮食作物促生菌种质资源，为研发高效稳定的微生物肥料以及应用技 术提供基础。
生物材料信息
菌种名称：慢生根瘤菌DBPB1
拉丁文名：Bradyrhizobium sp.DBPB1
分类命名：慢生根瘤菌Bradyrhizobium sp.
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
保藏编号：CGMCC NO.17502
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
附图说明
图1为菌株DBPB1在YMA固体培养基上的菌落形态。
图2为菌株DBPB1的革兰氏染色结果图。
图3为菌株DBPB1在pH6的酸性固体培养基菌落图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无 特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中用到的使用的培养基及其制备方法如下：
TY培养基(TY固体培养基和TY液体培养基)
胰蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，CaCl2 0.6g，去离子水1L，pH 6.8-7.2；121℃灭菌20min。琼脂15g-20g(固体培养基加)。
YMA培养基(YMA固体培养基和YMA液体培养基)
甘露醇10.0g，K2HPO4 0.25g，KH2PO4 0.25g，MgSO4 0.1g，NaCl 0.1g，酵母粉 3.0g，去离子水1L，pH 6.8-7.0，121℃灭菌20min；琼脂15g-20g(固体培养基加)。
血琼脂培养基
蛋白胨18g，酵母粉1g，NaCl5g，琼脂15g-20g，去离子水1L，pH6.8-7.2。121℃ 灭菌20min后，待培养基冷却至50℃添加5％(5ml/100ml)脱纤维羊血，混匀后倒平 板。
含盐固体培养基
配置TY固体培养基，向温热的3份TY固体培养基分别加入1g、4g和8g的NaCl， 然后倒平板，得到盐浓度为1g/100ml，4g/100ml和8g/100ml的含盐固体培养基；121℃ 灭菌20min。
酸碱培养基
配置TY固体培养基，用无菌的0.1M HCl和NaOH调节灭菌后温热的5份TY 固体培养基pH分别至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，然后倒平板，得到pH5.0、6.0、7.0、 8.0、9.0的酸碱固体培养基(其中，pH5.0、6.0为酸性固体培养基，pH 7.0为中性固 体培养基，pH8.0、9.0碱性固体培养基)；121℃灭菌20min。
配置TY液体培养基，用无菌的0.1M HCl和NaOH调节灭菌后温热的5份TY 液体培养基pH分别至3.0、4.0、7.0、10.0、11.0，然后分装于无菌试管中，得到pH 3.0、 4.0、7.0、10.0、11.0的酸碱液体培养基(其中，pH3.0、4.0为酸性液体培养基，pH 7.0 为中性液体培养基，pH10.0、11.0碱性液体培养基)；121℃灭菌20min。
干旱培养基
配置YMA液体培养基，向温热的4份YMA培养基分别加入0g、10g、20g和30g 的PEG6000，使得PEG 6000的浓度(单位为g/100ml)分别为：0、10、20和30， 得到四种PEG 6000浓度分别为0g/100ml(阳性对照)、10g/100ml(轻度干旱)、20g/100ml (中度干旱)和30g/100ml(重度干旱)的干旱培养基，其对应的水势分别为：0，-0.185， -0.559，-1.122MPa；121℃灭菌20min。
农药培养基
选取花生常用除草剂、杀菌剂、杀虫剂，根据农药说明书上的制剂用药量计算出每种农药在实际应用中的最大稀释倍数和最小稀释倍数，在此区间内确定合适的稀释 梯度，向灭菌后的温热的TY培养基中，快速注入不同体积的农药并混合均匀，倒平 板，得到以配制相应稀释梯度的农药固体培养基。
表1所用农药的浓度及相应农药含量
实施例1、花生慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1的功能分析
一、菌株DBPB1的分离
本发明从东北地区采集花生植株，从花生植株的根瘤中分离纯化菌株，鉴定，得到菌株DBPB1。
将菌株DBPB1培养在YMA固体培养基中，菌落形态：菌落白色，圆形，表面光 滑不透明(图1)，革兰氏染色为阴性，菌体杆状，无芽孢(图2)。
二、菌株DBPB1分析
1、安全性检测
将菌株DBPB1接种于血琼脂平板培养基中，37℃培养7d，观察有无溶血圈。有 溶血圈出现代表菌株有溶血活性，对人畜有潜在威胁，则菌株应禁止应用于微生物肥 料；若无溶血圈出现代表菌株无溶血活性，为安全菌种，可作为微生物肥料应用菌种。
菌株DBPB1在血琼脂平板上不出现溶血圈，溶血活性为阴性。
2、抗逆性检测
1)耐盐检测
将OD600值约0.3的菌株DBPB1菌液分别接种于上述盐浓度为1g/100ml，4g/100ml和8g/100ml的含盐固体培养基上，接种量为10μL，每个处理重复三次，置于28℃ 恒温箱培养，观察记录各浓度梯度含盐固体培养基上的菌株DBPB1的生长情况。
结果表明菌株DBPB1能在盐浓度为1g/100ml，4g/100ml的含盐固体培养基生长，在盐浓度为8g/100ml的含盐固体培养基上不生长，说明菌株DBPB1最高耐盐浓度为 4g/100ml(如表2所示)，说明菌株DBPB1的耐盐能力很强。
2)耐酸碱检测
将OD600值约0.3的菌株DBPB1菌液分别接种于上述pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的酸碱固体培养基上，其中pH7.0的培养基为阳性对照组，接种量为10μL，每个处 理重复三次，置于28℃恒温箱培养，待阳性对照组的菌株DBPB1生长情况良好时， 观察记录各梯度酸碱固体培养基上的菌株DBPB1的生长情况。
将OD600值约0.6的菌株DBPB1菌液接入pH3.0、4.0、7.0、10.0、11.0的酸碱液 体培养基中，其中pH7.0的培养基为阳性对照组，接种量为150μL(3％v/v接种量)， 每个处理重复三次，28℃、180r/min摇床培养7d，然后混匀取样，在600nm下测定 各酸碱液体培养基中菌株DBPB1的OD值，以OD值的大小评价菌株DBPB1的生长 繁殖状况。
结果表明菌株DBPB1在pH6-9的酸碱固体培养基上都能良好生长(pH6酸性固 体培养基菌株DBPB1生长情况如图3所示)，菌落生长和阳性对照组的菌落相似，在 pH 3-5的酸性液体培养基和酸性固体培养基上不生长(即OD600＝0)，在pH 7.0、10.0 和11.0的中性液体培养基和碱性液体培养基上生长的菌液吸光度(OD600)值相似， 分别是1.75、1.35和1.75，说明该菌株DBPB1能在pH6-11范围良好生长，具有一定 的耐酸性和较强的耐碱性(如表2)。
3)耐干旱检测
采用聚乙二醇(PEG 6000)调节水势人工模拟干旱条件进行耐干旱菌株鉴定。将OD600值约0.6的菌株DBPB1分别接种于0g/100ml(阳性对照)、10g/100ml(轻度干 旱)、20g/100ml(中度干旱)和30g/100ml(重度干旱)的干旱培养基中，每个处理重 复三次，28℃、180r/min摇床培养7d，测定菌液的吸光度(OD600)，平均吸光度值 相似，分别是5.0、5.2、4.5和4.3。菌株DBPB1能在三种干旱强度的培养基上生长， 且和阳性对照相似，说明菌株DBPB1能耐受重度干旱，即能耐受PEG 6000的浓度为 30g/100ml(如表2)。
表2菌株DBPB1的抗逆性鉴定结果
注：+表示菌株生长。
综上，菌株DBPB1的抗逆性为耐盐浓度为4g/100mlNaCl；耐酸性为pH6；耐碱 性为pH11；耐干旱浓度为30g/100mlPEG 6000，重度干旱。
3、耐药性检测
将OD600值约0.6的菌株DBPB1菌液分别接于表1的装有农药培养基的培养皿中， 每个处理重复三次，28℃恒温培养箱中培养，7-10d后观察菌株DBPB1生长情况。 结果如表3所示，菌株DBPB1在含除草剂的培养基上均不能生长，在含吡虫啉的培 养基上均能生长，在含中低浓度嘧菌酯的培养基上能生长，但在含最高浓度的培养基 上不能生长。
表3菌株DBPB1的耐药性鉴定结果
注：+表示菌株生长；-表示菌株未生长。
综上，结果显示菌株DBPB1的耐药性为可耐受农业应用中普遍使用的杀菌剂嘧菌酯(250mg/L)和杀虫剂吡虫啉(58.3mg/L)的最大使用浓度。
4、16s rDNA序列测序鉴定
利用TreliefTM Plant Genomic DNA kit(TsingKe)试剂盒提取菌株DBPB1的DNA，并利用正向引物16s rDNA P1和反向引物16s rDNA P6(表4和序列表中序列2和3) 对16srDNA序列进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；其中，扩增反应条件为：95℃ 5min；94℃1min，60℃30s，72℃90s，进行30个循环；最后72℃终延伸10min。PCR 扩增产物检测合格后送至北京美吉桑格生物医药科技有限公司进行测序。
表4引物信息
双端测序序列用DNAMAN软件进行拼接，共得到1262bp的16s rDNA序列，其 核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，得到的16s rDNA序列在NCBI网站进行BLAST比 对，结果显示该菌株与Bradyrhizobiumottawaense OO99相似性最高，同源性为100％。
鉴于以上对菌株DBPB1菌落形态和测序鉴定结果，确定菌株DBPB1为慢生根瘤 菌(Bradyrhizobium sp.)。该菌株DBPB1于2019年3月29日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.17502。 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2、花生慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1的田间应用研究
一、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1的田间应用方法
1、菌株活化及扩大培养：将保藏于-80℃冰箱的慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.) DBPB1菌种采用划线方式活化于YMA固体培养基，放于28℃恒温培养箱培养，分 离单菌落。将单菌落用无菌接种环挑至YMA液体培养基中扩大培养，放于28℃， 180转/分的摇床振荡培养7天左右至菌液浓度为1×1010-11cfu/ml左右(OD600＝1.2左 右)，获得菌剂母液；
2、使用前将菌剂母液加干净自来水稀释至三倍体积得到菌液并混匀，然后再向菌液中滴加微量元素液(向所述稀释菌液中添加的所述微量元素液的量为每3mL菌液添 加1μL所述微量元素液)并混匀，得到慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1液体 菌剂。
其中，所述微量元素液各组分的含量如下：H3BO32.86g/L，MnSO41.81g/L， CuSO4·5H2O 0.80g/L，ZnSO40.22g/L，H2MoO40.02g/L，将以上组分依次加入适量水 中全部溶解后，用去离子水补足1L。
3、包菌剂：将慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1液体菌剂均匀喷在花生 种子表面至种子表面湿润即可，放在阴凉处阴干；
4、包保护剂：阴干的种子用羧甲基纤维素钠溶液(终浓度为10g/L的羧甲基纤维素钠水溶液，配制方法：10g羧甲基纤维素钠(800～1200mPa·s)溶于lL去离子水， 在60℃水浴中搅拌溶解至透明糊状胶液)拌种包衣(25ml/kg)，保持菌剂附着和湿度， 阴干；
5、人工或机器播种：播前造墒浇水或雨后湿度合适时播种，保证菌株必要的湿度利于生存。
二、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1田间应用实例
试验地点设在吉林省四平市梨树县临海镇；所选用花生品种为当地普遍使用的品种白沙308；播种日期为2018年5月23日，播前浇水；试验田分为二个区：正常施 肥区(以常规施肥量施氮肥、磷肥和钾肥)和减氮区(减氮40％但以常规施肥量施磷 肥和钾肥)，各小区面积为60平方米，每个小区重复三次。施氮肥为尿素(有效成分 含量为46％N)，磷肥为磷酸二铵(有效成分含量为18％N+46％P2O5)，钾肥为硫酸钾 (有效成分含量为50％K2O)；常规施肥量为：N：P(P2O5)：K(K2O)＝9.6Kg·ha-1：16Kg·ha-1：12Kg·ha-1，肥料混匀后作为基肥一次性施入土壤，具体施肥用量如表5 所示；正常施肥区播种不进行处理的花生种子作为阳性对照组(CK)，减氮区播种步 骤一得到的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1处理后的花生种子作为处理组， 观察花生盛花期生物量和花生收获期生物量。
花生盛花期生物量如表6所示，处理组与阳性对照组(CK)比，花生盛花期植株 株高和地上部鲜重显著提高，总下针数(即包括果实数与未形成果实的下针数的总和) 和果实数也有提高。
花生收获期生物量如表7所示，处理组比阳性对照组(CK)的根瘤数显著提高， 株高和果实数有所提高。处理组的花生果实亩产量463kg，比阳性对照组(CK)增产 约11.3％。
表5正常施肥区和减氮区每小区肥料用量表
注：实际肥料用量中减氮处理中磷肥也减少了8％。
表6花生盛花期生物量(播种后60天)
注：不同小写字母表示在0.05水平上差异显
表7花生收获期生物量(播种后120天)
注：不同小写字母表示在0.05水平上差异显著
田间实验结果得出慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1在花生不同生长发育阶段可提高花生植株的生物量、根瘤数和总产量，该菌促生效果显著高于阳性对照组， 表明此慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)DBPB1可作为开发稳定高效的微生物肥料菌 种资源，适合于环境条件类似的地区。也可能并不限于环境类似的地区。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨 和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较 宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发 明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本 发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的 改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一株适合东北地区的抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用
<130> GNCFY191573
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1262
<212> DNA
<213> 慢生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）
<400> 2
gggaacatac cttttggttc ggaacaacac agggaaactt gtgctaatac cggataagcc 60
cttacgggga aagatttatc gccgaaagat tggcccgcgt ctgattagct agttggtgag 120
gtaatggctc accaaggcga cgatcagtag ctggtctgag aggatgatca gccacattgg 180
gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggg 240
gcaaccctga tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ctagggttgt aaagctcttt 300
tgtgcgggaa gataatgacg gtaccgcaag aataagcccc ggctaacttc gtgccagcag 360
ccgcggtaat acgaaggggg ctagcgttgc tcggaatcac tgggcgtaaa gggtgcgtag 420
gcgggtcttt aagtcagggg tgaaatcctg gagctcaact ccagaactgc ctttgatact 480
gaagatcttg agttcgggag aggtgagtgg aactgcgagt gtagaggtga aattcgtaga 540
tattcgcaag aacaccagtg gcgaaggcgg ctcactggcc cgatactgac gctgaggcac 600
gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat 660
gccagccgtt agtgggttta ctcactagtg gcgcagctaa cgctttaagc attccgcctg 720
gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 780
agcatgtggt ttaattcgac gcaacgcgca gaaccttacc agcccttgac atgtccagga 840
ccggtcgcag agatgtgacc ttctcttcgg agcctggaac acaggtgctg catggctgtc 900
gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cccgtcctta 960
gttgctacca tttagttgag cactctaagg agactgccgg tgataagccg cgaggaaggt 1020
ggggatgacg tcaagtcctc atggccctta cgggctgggc tacacacgtg ctacaatggc 1080
ggtgacaatg ggatgctaag gggcgaccct tcgcaaatct caaaaagccg tctcagttcg 1140
gattgggctc tgcaactcga gcccatgaag ttggaatcgc tagtaatcgt ggatcagcac 1200
gccacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagttggt 1260
tt 1262
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
agagtttgat cctggctcag aacgaacgct 30
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
tacggctacc ttgttacgac ttcacccc 28

Claims (10)

1.一株慢生根瘤菌，其特征在于：所述慢生根瘤菌为慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)DBPB1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.17502。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂包含权利要求1所述的慢生根瘤菌。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂具有下述至少一种特性：
A1)耐盐；
A2)耐酸；
A3)耐碱；
A4)耐干旱；
A5)耐药；
A6)固氮；
A7)促植物生长。
4.权利要求1所述的慢生根瘤菌或权利要求2所述的菌剂在制备具有下述至少一种特性的产品中的应用：
A1)耐盐；
A2)耐酸；
A3)耐碱；
A4)耐干旱；
A5)耐药；
A6)固氮；
A7)促植物生长。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述产品为微生物肥料。
6.一种菌剂的使用方法，其特征在于，所述菌剂的使用方法包括如下步骤：
S1)将权利要求1所述的慢生根瘤菌的菌液添加微量元素；
S2)将步骤S1)获得添加微量元素的菌液喷洒植物种子表面，阴干；
S3)用羧甲基纤维素钠溶液对步骤S2)阴干的种子进行拌种包衣，阴干；
S4)播种。
7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于：步骤S1)中，所述微量元素以微量元素液的形式添加到菌液中，所述微量元素液的各组分的含量为：H3BO32.86g/L，MnSO4 1.81g/L，CuSO4·5H2O 0.80g/L，ZnSO40.22g/L，H2MoO40.02g/L，溶剂为水；
和/或所述羧甲基纤维素钠溶液为终浓度为10g/L的羧甲基纤维素钠水溶液。
8.权利要求6或7所述的使用方法在促植物生长中的应用。
9.根据权利要求4或5或8所述的应用，或，权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于：所述促植物生长体现为如下至少一种：
B1)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的株高增加；
B2)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的果实数增加；
B3)促进所述植物的根瘤数增加；
B4)促进所述植物的下针数增加；
B5)促进所述植物的地上鲜重增加；
B6)促进所述植物的产量增加；
所述不同发育时期为盛花期和/或成熟收获期。
10.根据权利要求4或5或8所述的应用，或，权利要求2或3所述的菌剂，或，权利要求6或7所述的使用方法，其特征在于：所述植物为粮食作物。
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