CN102240664A - 一种修复锰污染土壤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种修复锰污染土壤的方法，从锰矿污染区生长的植物蓖麻的根际(根周围2mm)土壤中筛选获得一株高抗锰的菌株，筛选出对锰具有高耐受、吸附能力的菌株后，通过生物发酵技术，制作出菌肥；在碱性锰矿尾渣堆放区种植美洲商陆，播种时先在种植坑内施入菌肥和混合肥料，混合均匀后再播撒美洲商陆种子，种子上覆盖土。这样可以让美洲商陆在锰矿尾渣堆放区快速生长，在短时间内获得大量的植株，第一次人工栽培后，不需再次播种，从而吸附调控锰矿区重金属污染。本技术可应用于矿山退化生态***的生态修复及矿区的绿化等方面。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，特别是，提供了一种修复锰污染土壤的方法。
背景技术
重金属含量高、营养贫乏、酸碱度不适宜和持水力弱等因素造成锰尾矿渣堆存地域植被缺乏，水土流失严重，重金属随雨水与扬尘扩散。锰尾矿渣已成为一种锰矿地区重要的污染源。通过筛选和栽培适宜植物，同时采作辅助措施，可在尾矿渣堆存区短时间内使植物定居，从而重建植被。有些植物能吸收固定重金属在其根部，有的植物能通过其根系分泌物及其凋落物的分解物与重金属结合形成难溶化合物，从而阻控重金属移迁扩散。重建的植被可控制土壤侵蚀和水土流失，增加土壤营养，恢复退化生态***的功能和美化环境。在大面积尾矿渣污染区域重建植被，具有技术可靠、操作简便、成本低、控制污染物有效和对环境友好等多重优势。
在尾矿渣堆放区进行植被重建时，选择的植物应具有吸收污染物能力强或根部吸收能力强，生长快，根系发达，耐旱性强和对重金属耐受性强等特征；选择耐土壤贫瘠的植物，通过植物—微生物的联合修复，增加土壤的营养。目前，很多的锰矿的尾矿库的矿渣堆放区上没有植被，我们通过试验研究发现，尾矿渣堆放区中的矿渣的酸碱度是植物在上面生存的重要限制因子，由于矿渣的碱性和有机质的缺乏，导致了植物不能在尾矿区土壤中生长，因此在植物微生物联合修复时，要采用强化调控措施能促进植物在尾矿上生长。
基于我们的研究结果，在植物修复锰尾矿库时，根据矿渣组成、养分含量和酸碱度，本发明选取对环境友好的植物，通过微生物菌肥促进植物在尾矿渣上生长，从而为快速有效地对锰尾矿污染地进行植物微生物联合修复提供了一种新的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种修复锰污染土壤的方法，该方法成本低，可以使植物美洲商陆在锰尾矿渣上生长从而改良矿山生态环境，控制污染，可广泛用于矿山污染土壤的治理修复。
一种修复锰污染土壤的方法，在碱性锰矿尾渣堆放区种植美洲商陆，其特征是，播种时，先在种植坑内施入菌肥和混合肥料，混合均匀后再播撒美洲商陆种子，种子上覆盖土。
所述菌肥是通过对从蓖麻根际土壤中筛选获得的高抗锰菌株，进行生物发酵制作而成，其制作方法步骤如下：
（1）取蓖麻根际土样、水和数粒玻璃珠，加入已灭菌瓶中，置于转速为150 r/min、温度为27.5℃的摇床中振荡，取悬浮液做浓度梯度分别为10-2、10-3、10-4、10-5的菌悬液，吸取不同浓度的菌悬液于相应的马丁氏培养基中，用涂布棒涂布均匀，28℃培养箱中倒置培养；经72h培养后，观察培养基中微生物的生长情况；
（2）采用平板划线纯化法，选取单菌落接种于Mn2+浓度为5500mg/L的马丁氏固态培养基中，28℃培养箱中倒置培养，反复划线纯化直至获得纯菌株；
（3）将上述分离纯化得到菌株依次编号为1#、2#、3#……，分批次接种于锰浓度梯度为11000mg/L、16500 mg/L、22000 mg/L、27500 mg/L、33000mg/L的液态培养基中， 置于温度为28℃、转速为150 r/min的摇床中培养，筛选出4#菌为高抗锰的菌株；
（4）将PDA培养基分装于灭菌的试管中，灭菌后摆斜面，待斜面凝固后，无菌操作接种4#菌种，于27.5℃温箱中培养，菌苔表面孢子生长丰满，呈灰绿色，并有露珠，即可取出备用；
（5）采用淀粉、葡萄糖、花生饼粉、蛋白胨、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾和水配制培养基，用10%氢氧化钠调pH值7.2-7.4，用三个锥形瓶分装，高压灭菌，取出降温到40℃不烫手为止，接4#菌种至摇床上振荡培养，直至菌丝形成，获得菌丝；
（6） 采用花生饼粉、蔗糖、硫酸铵、甘薯粉、玉米粉、蛋白胨、碳酸钙配制培养基，将发酵罐消毒灭菌，然后将培养基放入发酵罐，接入菌丝，连续搅拌，保持温度28℃，通气量体积比为1∶0.5，保证发酵罐各阀门严密；培养菌丝至成熟，菌丝体粗壮，菌液黏稠有泡沫。
（7）将稻谷皮、甘薯粉、麸皮、肥土、炉灰和黄豆饼粉进行灭菌，然后采用其中的两种或两种以上的原料配制固体吸附剂，放入采用甲醛和硫磺熏蒸灭菌过的培养室，然后接种菌丝，培养4-5天，35-45℃烘干，得菌粉，即菌肥。
所述步骤（1）中的蓖麻根际土样为根周围2mm的土样；所述步骤（4）中的PDA培养基采用马铃薯200份、蔗糖20份，琼脂 20份和水1000份配制而成；所述步骤二（2）中的培养基采用淀粉2份、葡萄糖1份、花生饼粉2份、蛋白胨0.4份、硫酸铵0.25份、硫酸镁0.025份、磷酸氢二钾0.02份和水1000份配制而成；所述步（4）中的培养基采用花生饼粉3份、蔗糖份、硫酸铵0.25份、甘薯粉2份、玉米粉1份、蛋白胨0.1份和碳酸钙0.5份配制而成。
作为优选方案一，所述步骤（7）中的固体吸附剂采用稻谷皮90份、甘薯粉10份配制而成，所述接种菌丝的重量为固体吸附剂的100%。
作为优选方案二，所述步骤（7）中的固体吸附剂采用麸皮10份、炉灰30份和肥土60份配制而成，所述接种菌丝的重量为固体吸附剂的40%。
作为优选方案三，所述步骤（7）中的固体吸附剂采用黄豆饼粉10份、肥土60份、炉灰20份和麸皮10份配制而成，所述接种菌丝的重量为固体吸附剂的40%。
所述稻谷皮、甘薯粉、黄豆饼粉、麸皮经121℃蒸汽灭菌1h；所述肥土、炉灰在烘炉上160℃灭菌1h。
所述混合肥料采用菜籽饼15份、动物粪便20份、稻田土40份、尿素5份、KH2PO4 10份、(NH4)2SO4 12份、Ca(H2PO4)2 15份和CaSO4 10份配制而成。
本发明的有益效果：美洲商陆是多年生的植物，繁殖方式为种子繁殖，其耐碱性与耐旱性强，在锰矿区是优势植物，根分布在0-70cm深的土壤；由于所述菌肥和混合肥料呈酸性，能减弱碱性尾矿渣的碱性，可以增加碱性尾矿渣中的矿质营养的水溶性，有利于植物吸收营养元素，且供肥持续时间长，所以能使美洲商陆在持水力弱的碱性尾矿渣中生长正常，并且能在短时间内获得大量的植株，在第一次人工栽培后，不需再次播种。美洲商陆根部能大量富集锰等元素，锰元素固定效率高。本发明可用于矿山退化生态***植物微生物联合修复和盐碱地绿化等方面，并且具有操作简单、费用低、阻控锰尾渣中有害金属的扩散效率好和美化环境等优点。
下面结合实施例对本发明进行进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1：
（1）取蓖麻根际土样10g加到含90ml水和数粒玻璃珠的已灭菌250ml三角瓶中，置于摇床中（设定为150 r/min，温度27.5℃）振荡20min，取悬浮液做浓度梯度各为10-2、10-3、10-4、10-5，(吸取悬浮液1ml于含9ml水试管（已灭菌）中，此时菌悬液浓度为10-1，从该浓度菌悬重复上述步骤，得浓度为10-2的菌悬液，依此类推，得浓度分别为10-3、10-4、10-5的菌悬液)；各自吸取0.1 ml不同浓度的菌悬液于相应的马丁氏培养基中，用涂布棒涂布均匀，28℃培养箱中倒置培养；经72h培养后，观察平板培养基中微生物的生长情况。
（2）采用平板划线纯化法，选取单菌落接种于Mn2+浓度为5500mg/L的马丁氏固态培养基中，28℃培养箱中倒置培养，反复划线纯化直至获得纯菌株。
（3）将上述分离纯化得到菌株依次编号为1#、2#、3#……，分批次接种于锰浓度梯度为11000mg/L、16500 mg/L、22000 mg/L、27500 mg/L、33000mg/L的液态培养基中（28℃，150 r/min钟摇床培养3天），结果4#菌株能在27500 mg/L培养基中大量生长，而在33000mg/L培养基中微量生长，其它菌株均不能在27500 mg/L培养基中生长。由此筛选出4#菌种为高抗锰的菌株。
（4）采用马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂 20g 和水1000ml 配制PDA培养基，pH自然；配制方法：马铃薯切块，水煮过滤，滤液与其他成分一起煮沸溶解琼脂，定容至1000ml即可。取PDA培养基100ml，分装于经烘箱170℃灭菌的试管中，塞上棉塞，上面用两层牛皮纸包扎好，121℃灭菌20min。取出后摆斜面，待斜面凝固后，无菌操作接种4#菌种，于27.5℃温箱中培养4天，菌苔表面孢子生长丰满，呈灰绿色，并有露珠，即可取出备用。
（5）采用淀粉2g、葡萄糖1g、花生饼粉20g、蛋白胨4g、硫酸铵2.5g、硫酸镁2.5g、磷酸氢二钾2g和水1000ml配制培养基，然后用10%氢氧化钠调pH值7.2-7.4，用1000ml锥形瓶分装，每瓶300ml，经121℃高压灭菌20min，取出降温到40℃不烫手为止，接4#菌种至摇床上振荡培养。从孢子萌发到菌丝形成的开始阶段，菌龄大约24-36h。在这个发育过程中受营养、pH值的影响所左右。在此阶段接入种子罐、发酵罐内，在正常情况下菌体生长良好。放罐后观察，菌液黏稠，有微量泡沫，呈微红色，有冰片香味。
（6）采用花生饼粉3g、蔗糖1g、硫酸铵0.25g、甘薯粉2g、玉米粉1g、蛋白胨0.1g和碳酸钙0.5g配制培养基，将发酵罐消毒灭菌，罐温28℃，通气量1∶0.5(体积比)连续搅拌，经常注意各阀门是否严密，否则使蒸汽水进入罐内造成菌的生长不良。放罐指标，镜检菌丝量多，菌丝体粗壮，菌丝体生长至成熟阶段，菌液黏稠有泡沫成为红色，一般培养48h即可放罐。
（7）采用稻谷皮90g，甘薯粉10g配制固体吸附剂。配制时，将稻谷皮、甘薯粉在烘炉上经160℃灭菌1h后取出，放在培养室内（经甲醛和硫磺熏蒸灭菌），待料降温到40℃左右接种。菌液与固体吸附剂按1:1比例接种，接种放入通风池内培养后，含菌量可达130-200×108个/g。
（8）培养4-5天，将菌粉装入烘干池20-40cm，烘干过程中翻动数次，烘干时间12-24h，烘干温度在35-45℃，即得菌肥，备用；
（9）采用菜籽饼15kg、动物粪便20kg、稻田土40kg、尿素5kg、KH2PO4 10kg、(NH4)2SO4 12kg、Ca(H2PO4)2 15kg和CaSO4 10kg配制混合肥料，备用；
（10）锰矿尾渣自然风干，磨碎过0.5 mm 孔径筛，得纯锰矿尾渣，备用。将纯锰尾矿渣、菌肥和混合肥料按质量比例3∶1∶1进行混合，得改良锰矿尾渣。选6个花盆，3个装改良锰矿尾渣，3个装纯锰尾矿渣，装填量为3kg/盆，装好后每盆浇水600ml，花盆下面放有不漏水的盘子，置于自然环境中，作为对照。
（11）3月上旬把美洲商陆（Droopraceme Pokeweed）的种子播入6个花盆内，播种后浇水3次。10天后统计美洲商陆种子的发芽率，发现纯锰矿尾渣发芽率虽然低于改良锰矿尾渣，但二者没有显著差异。
（12）4月统计美洲商陆幼苗的成活率，发现改良锰尾矿渣的平均成活率为90.0%，而纯锰尾矿渣植株成活率仅为10%。
（13）9月，测定土壤pH值，有机质的含量，见表1，改良锰尾矿渣中的有机质明显高于对照组，pH值下降，更利于植物的生存。改良锰尾矿渣上的美洲商陆长势良好，并能产生大量的种子。
表1 土壤中的有机质和pH值
| 有机质(g/kg) | pH | |
| 对照 | 1.83±0.09 | 8.40±0.22 |
| 改良锰尾矿渣 | 5.76±0.12 | 6.57±0.34 |
实验表明，利用本发明提供的方法，可以使植物能够在锰矿尾渣上成活和生长良好，并且能够自然繁殖，修复锰污染土壤。
实施例2
在实施例1的步骤（7）中，采用麸皮10g，炉灰30g，肥土60g配制固体吸附剂。配制时，麸皮经121℃蒸汽灭菌1h，肥土、炉灰在烘炉上经160℃灭菌1h后取出，放在培养室内（经甲醛和硫磺熏蒸灭菌），待料降温到40℃左右接种。菌液与固体吸附剂按2:5比例接种。其它同实施例1
实施例3
在在实施例1的步骤（7）中，采用黄豆饼粉10g，肥土60g，炉灰20g，麸皮10g配制固体吸附剂，配制时，黄豆饼粉、麸皮经121℃蒸汽灭菌1h，肥土、炉灰在烘炉上经160℃灭菌1h后取出，放在培养室内（经甲醛和硫磺熏蒸灭菌），待料降温到40℃左右接种。菌液与固体吸附剂按2:5比例接种。其它同实施例1。
实施例 4
（1）按实施例1或实施例2或实施例3所述制备方法制备好菌肥，备用。
（2）采用菜籽饼150kg、动物粪便200kg、稻田土400kg、尿素50kg、KH2PO4 100kg、(NH4)2SO4 120kg、Ca(H2PO4)2150kg和CaSO4100kg配制混合肥料，备用；
（3）3月，在碱性锰矿尾渣堆放区平整样地，挖好种植坑，种植坑的规格为：40-60 cm、宽30-50 cm、深20-30 cm；
（4）每个种植坑中施入菌肥5.0kg-8.0kg，混合肥料A 4.0-5.0kg，并把二者混匀。
（5）3月下旬，每个种植坑中播种美洲商陆（Droopraceme Pokeweed）种子，种子播在混匀后的混合肥料上面，覆盖土约2.5-3.5cm，浇水2-3次。
（6）4月，统计每一沟中种子繁殖的幼苗数，结果发现，每一种植坑平均繁殖的幼苗数为32株，美洲商陆植株能够在锰矿尾渣堆放区定居并能快速繁殖后代。
（7）8-9月份收割美洲商陆的地上部分，将收割的植物覆盖在植物基部。
实践结果表明，利用本发明提供的方法，可以使植物美洲商陆在锰矿尾渣上成活和生长，并且能够自然繁殖，有效地改良锰污染土壤。
Claims (10)
1.一种修复锰污染土壤的方法，在碱性锰矿尾渣堆放区种植美洲商陆，其特征是，播种时，先在种植坑内施入菌肥和混合肥料，混合均匀后再播撒美洲商陆种子，覆土浇水。
2.根据权利要求1所述的修复锰污染土壤的方法，其特征是，所述菌肥是通过对从蓖麻根际土壤中筛选获得的高抗锰菌株，进行生物发酵制作而成，其制作方法步骤如下：
（1）取蓖麻根际土样、水和数粒玻璃珠，加入已灭菌瓶中，置于转速为150 r/min、温度为27.5℃的摇床中振荡，取悬浮液做浓度梯度分别为10-2、10-3、10-4、10-5的菌悬液，吸取不同浓度的菌悬液于相应的马丁氏培养基中，用涂布棒涂布均匀，28℃培养箱中倒置培养；经72h培养后，观察培养基中微生物的生长情况；
（2）采用平板划线纯化法，选取单菌落接种于Mn2+浓度为5500mg/L的马丁氏固态培养基中，28℃培养箱中倒置培养，反复划线纯化直至获得纯菌株；
（3）将上述分离纯化得到菌株依次编号为1#、2#、3#……，分批次接种于锰浓度梯度为11000mg/L、16500 mg/L、22000 mg/L、27500 mg/L、33000mg/L的液态培养基中， 置于温度为28℃、转速为150 r/min的摇床中培养，筛选出4#菌为高抗锰的菌株；
（4）将PDA培养基分装于灭菌的试管中，灭菌后摆斜面，待斜面凝固后，无菌操作接种4#菌种，于27.5℃温箱中培养，菌苔表面孢子生长丰满，呈灰绿色，并有露珠，即可取出备用；
（5）采用淀粉、葡萄糖、花生饼粉、蛋白胨、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾和水配制培养基，用10%氢氧化钠调pH值7.2-7.4，用三个锥形瓶分装，高压灭菌，取出降温到40℃不烫手为止，接4#菌种至摇床上振荡培养，直至菌丝形成，获得菌丝；
（6） 采用花生饼粉、蔗糖、硫酸铵、甘薯粉、玉米粉、蛋白胨、碳酸钙配制培养基，将发酵罐消毒灭菌，然后将培养基放入发酵罐，接入菌丝，连续搅拌，保持温度28℃，通气量体积比为1∶0.5，保证发酵罐各阀门严密；培养菌丝至成熟，菌丝体粗壮，菌液黏稠有泡沫；
（7）将稻谷皮、甘薯粉、麸皮、肥土、炉灰和黄豆饼粉进行灭菌，然后采用其中的两种或两种以上的原料配制固体吸附剂，放入采用甲醛和硫磺熏蒸灭菌过的培养室，然后接种菌丝，培养4-5天，35-45℃烘干，得菌粉，即菌肥。
3.根据权利要求2所述的修复锰污染土壤的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的蓖麻根际土样为根周围2mm的土样；所述步骤（4）中的PDA培养基采用马铃薯200份、蔗糖20份，琼脂 20份和水1000份配制而成；所述步骤二（2）中的培养基采用淀粉2份、葡萄糖1份、花生饼粉2份、蛋白胨0.4份、硫酸铵0.25份、硫酸镁0.025份、磷酸氢二钾0.02份和水1000份配制而成；所述步（4）中的培养基采用花生饼粉3份、蔗糖份、硫酸铵0.25份、甘薯粉2份、玉米粉1份、蛋白胨0.1份和碳酸钙0.5份配制而成。
4.根据权利要求2所述的修复锰污染土壤的方法，其特征在于：所述步骤（7）中的固体吸附剂采用稻谷皮90份、甘薯粉10份配制而成。
5.根据权利要求2所述的修复锰污染土壤的方法，其特征在于：所述步骤（7）中的固体吸附剂采用麸皮10份、炉灰30份和肥土60份配制而成。
6.根据权利要求2所述的修复锰污染土壤的方法，其特征在于：所述步骤（7）中的固体吸附剂采用黄豆饼粉10份、肥土60份、炉灰20份和麸皮10份配制而成。
7.根据权利要求4或5或6所述的修复锰污染土壤的方法，其特征在于：所述稻谷皮、甘薯粉、黄豆饼粉、麸皮经121℃蒸汽灭菌1h；所述肥土、炉灰在烘炉上160℃灭菌1h。
8.根据权利要求4所述的修复锰污染土壤的方法，其特征在于：所述接种菌丝的重量为固体吸附剂的100%。
9.根据权利要求5或6所述的修复锰污染土壤的方法，其特征在于：所述接种菌丝的重量为固体吸附剂的40%。
10.根据权利要求1所述的修复锰污染土壤的方法，其特征是，所述混合肥料采用菜籽饼15份、动物粪便20份、稻田土40份、尿素5份、KH2PO4 10份、(NH4)2SO4 12份、Ca(H2PO4)2 15份和CaSO4 10份配制而成。
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