CN110464854B - 一种利用光催化原理杀灭霉菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用光催化原理杀灭霉菌的方法,通过可见光辐照具有霉菌亲和性且能被可见光激发的光催化剂,对萌发之后的霉菌孢子进行杀灭或抑制生长。可见光辐照光催化剂,对霉菌孢子无失活作用,但却可以杀灭萌发之后的霉菌。本发明选用具有霉菌亲和性且能被可见光激发的光催化剂,将孢子在基础培养基(MM)中孵育至萌芽状态,其原先孢子外壁进行重新组装,抵御外界环境变化能力减弱,在可见光照射下,经光催化剂作用6h后,萌发孢子的死亡率达到80%以上。黑暗中实验确定光催化剂几乎无毒,4次循环实验发现其稳定性较好。本发明简单、无毒,能较有效杀灭烟曲霉菌萌发之后的孢子,可应用于需要防霉及无菌环境的可见光杀菌。
Description
技术领域
本发明属于微生物杀灭或抑制领域,特别涉及一种利用光催化原理杀灭霉菌的方法。
背景技术
近年来,随着广谱抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤药物及化疗等临床治疗手段技术的使用,以及器官移植的大量开展、艾滋病增加等,导致了日益增多的免疫力受损病人,伴随而来的是日趋增高的真菌感染发病率。全球每年死于侵袭性真菌感染的人数高达150万,其致死率高于50%。从近几年来国内外各种临床报告显示,曲霉菌引起的感染越来越多,有明显上升趋势,尤其是烟曲霉菌引起的肺部感染。在人类病原性真菌中,90%的病原体是烟曲霉菌。
烟曲霉菌等霉菌难于杀灭,一则由于它属于真核生物,与人体细胞类似,抗真菌药物同时会作用于人体细胞,产生毒副作用,因此可选择的药物较少;二则由于霉菌的繁殖器官——孢子,孢子直径2~10μm,细胞壁一般200~500nm,表面疏水,具有小、轻、干、多,休眠期长、抗辐射、抗寒冷与高温等特点,能大量悬浮于空气中,易被吸入支气管或肺泡而不易被清除。当人体抵抗力下降,霉菌孢子便会萌发并迅速生长成菌丝,侵入血液和内部组织、器官,进行更大范围的侵染。
目前,用于霉菌杀灭或抑制的常用手段有紫外光辐射、氯化、臭氧及药物杀菌等。紫外线杀菌很难将孢子彻底杀死,易发生二次菌体自修复,且紫外线可能会造成人体皮肤损伤甚至诱发癌变。氯化、臭氧杀菌虽具备高效性,但不可避免产生有毒的三卤甲烷和溴酸盐等潜在致癌副产物,对人体健康造成一定威胁[5]。而长期使用某种药物杀菌,霉菌表面的生物靶点分子构效会发生改变,就会产生耐药性。
1985年,Matsunaga等发现TiO2光催化剂具有良好的光催化杀菌性能。光催化杀菌因其杀灭性能良好,无二次污染,不易产生耐药性,而且安全无毒等特点而受到人们的重视。光催化杀菌是利用光照条件下材料产生光生空穴(h+)和光生电子(e-),h+可将材料表面吸附的OH-或H2O分子氧化成羟基自由基(·OH),e-则与材料表面吸附的O2发生作用生成超氧自由基(·O2 -),·O2 -进一步反应可生成羟基(·OH)和过氧化氢(H2O2)等活性物质。这些活性物质可以破坏微生物的外层结构和胞内物质,导致其凋亡。然而,利用可见光催化杀灭或抑制霉菌的有少量报道,但是杀灭效果不甚理想。
如前所述,霉菌孢子具有几百纳米的细胞壁,抵御恶劣环境的能力很强,光催化活性物质很难杀灭孢子。但是当孢子开始萌发,孢子的直径增加大约2~3倍,孢子的细胞壁因吸收水分和营养而膨胀变薄,特别是芽管的顶端厚度仅几个纳米厚,使得萌发阶段的孢子抵抗力减弱,容易被杀灭。另外,萌发阶段孢子的新陈代谢作用加剧,局部极化,以及细胞超微结构和生化水平等发生变化。因此,霉菌孢子萌发阶段的这些结构、细胞学变化为光催化杀菌提供了一个可能的突破口。从实际应用来看,未萌发的孢子对人体没有危害,只有它萌发并生长为菌丝才会危害人体。因此将霉菌扼杀在“萌芽”阶段,应该是一个有效的杀菌策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用光催化原理杀灭霉菌的方法,以杀灭处于孢子萌发阶段的霉菌。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种利用光催化原理杀灭霉菌的方法,通过可见光辐照具有霉菌亲和性且能被可见光激发的光催化剂,对萌发之后的霉菌孢子进行杀灭或抑制生长。
作为优选技术方案,所述光催化剂和霉菌处于液相环境,除此之外,同样适用于气相环境,如发霉的衣服、木材、墙体等。
作为优选技术方案,所述光催化剂在液相环境中的最小浓度为0.1g/L。
作为优选技术方案,所述光催化剂具有霉菌亲和性且能被可见光激发,优选g-C3N4/Bi4O7。
作为优选技术方案,所述霉菌为处于萌发阶段的孢子,优选为孵育8~10h的孢子。
作为优选技术方案,所述霉菌在液相环境中的浓度小于108CFU/mL。
作为优选技术方案,所述霉菌为烟曲霉菌、黄曲霉菌、青曲霉菌或白色念珠菌,本发明以烟曲霉菌为例。
作为优选技术方案,所述可见光采用氙灯光源,光源波长为420nm~780nm,功率为100~300W,光催化剂与光源距离10~15cm,辐照时间为2~10h。
有益效果:本发明选用具有可见光激发活性的光催化剂(例如g-C3N4/Bi4O7),可见光辐照下促使光生电子-空穴在催化剂表面反应生成羟基自由基(·OH)与超氧自由基(·O2 -)等活性物质(ROS)。对于烟曲霉菌孢子而言,因其外壁具有黑色素等特殊物质,赋予其强的抵御外界环境变化的能力,很难将其在可见光下杀灭。而将孢子在基础培养基(MM)中孵育8~10h至萌芽状态,其原先孢子外壁进行重新组装,抵御外界环境变化能力减弱,在可见光照射下,经光催化剂作用6h后,萌发孢子的死亡率达到80%以上,黑暗中实验确定光催化剂几乎无毒,4次循环实验发现其稳定性较好。此外,该光催化剂因本身无毒、循环性能较好、杀菌彻底且不易使菌进行二次自修复等特点,可广泛应用于需要防霉及无菌环境的可见光杀菌。
附图说明
图1为实施例1、2、3、4中空白对照与光催化剂杀烟曲霉菌2、4、6h后,再生长的菌落对比图;
其中:(a)为无光照、无光催化剂生长;(b)为光催化2h后的菌落数;(c)为光催化4h后的菌落数;(d)为光催化6h后的数。
具体实施方式
本发明的一种利用光催化原理杀灭霉菌的方法,通过可见光辐照具有霉菌亲和性且能被可见光激发的光催化剂,对萌发之后的霉菌孢子进行杀灭或抑制生长。其中,光催化剂和霉菌处于液相环境,除此之外,同样适用于气相环境,如发霉的衣服、木材、墙体等。
光催化剂在液相环境中的最小浓度为0.1g/L。
光催化剂具有具有霉菌亲和性且能被可见光激发,在可见光(420~760nm)激发下能够促进光生电子-空穴对产生羟基自由基(·OH)与超氧自由基(·O2 -)等活性物质(ROS)。本发明优选g-C3N4/Bi4O7。
霉菌为处于萌发阶段的孢子,优选为孵育8~10h的孢子;霉菌在液相环境中的浓度小于108CFU/mL。
霉菌为烟曲霉菌、黄曲霉菌、青曲霉菌或白色念珠菌,本发明以烟曲霉菌为例。
可见光采用氙灯光源,光源波长为420nm~780nm,功率为100~300W,光催化剂与光源距离10~15cm,辐照时间为2~10h。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
下述实施例以本发明技术方案为前提进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述实施例,仅对保护进行具体阐述。例如,收集孢子不仅可以用0.002%的吐温80,也可以用0.1%的吐温20。光催化液相环境及菌液稀释时不仅可以用PBS溶液,还可以使用无菌水、生理盐水等。
g-C3N4/Bi4O7光催化杀灭芽管期烟曲霉菌方性能测试有普通光学显微镜、扫描电子显微镜(SEM)、荧光共聚焦显微镜。其中,普通光学显微镜可观察烟曲霉菌在光催化剂作用下的长度变化,以确认某时间菌丝受到催化剂限制,不再生长。SEM可以清楚地观察芽管期及后期菌丝形貌变化,以确认催化剂对菌的破损程度。荧光共聚焦显微镜则是通过对活/死细胞染色,观察细胞的活/死情况。
实施例1
步骤1,以g-C3N4/Bi4O7作为光催化剂;
步骤2,收集分生孢子:将烟曲霉菌种子液划在YAG培养基中培养2天并用0.002%的吐温80收集分生孢子,离心洗干净孢子后,用血球计数板计算孢子浓度;其中,离心参数为:转速为9000rpm/min,时间为3min,次数为3次;
步骤3,制备萌芽期烟曲霉菌菌株:将步骤2中分生孢子在MM培养基中孵育9小时,即得到萌芽期烟曲霉菌;
步骤4,不对萌芽时期的烟曲霉菌做任何处理,稀释后进行涂板,并培育1.5天。
对实施例1步骤4得到的菌落数计数后,作为空白对照,以便观察对萌芽时期烟曲霉菌做不同处理后的变化情况。
实施例2
步骤1,以g-C3N4/Bi4O7作为光催化剂;
步骤2,收集分生孢子:将烟曲霉菌种子液划在YAG培养基中培养2天并用0.002%的吐温80收集分生孢子,离心洗干净孢子后,用血球计数板计算孢子浓度;其中,离心参数为:转速为9000rpm/min,时间为3min,次数为3次;
步骤3,制备萌芽期烟曲霉菌菌株:将步骤2中分生孢子在MM培养基中孵育10小时,即得到萌芽期烟曲霉菌;
步骤4,取9.9mL PBS溶液+0.1mL菌液+50mg催化剂在烧杯中,拿到300W氙灯光源下照射,当光照时间为2h时,取出100μL,涂在YAG培养基中,并培育1.5天,对菌落进行计数。
对实施例2步骤4得到的菌落数计数后,与空白对照进行对比,得到光照2h时催化剂对芽管期烟曲霉菌的杀灭率。如图1所示,该条件下光催化剂杀菌率在20%左右。
实施例3
步骤1,以g-C3N4/Bi4O7作为光催化剂;
步骤2,收集分生孢子:将烟曲霉菌种子液划在YAG培养基中培养2天并用0.002%的吐温80收集分生孢子,离心洗干净孢子后,用血球计数板计算孢子浓度;其中,离心参数为:转速为9000rpm/min,时间为3min,次数为3次;
步骤3,制备萌芽期烟曲霉菌菌株。将步骤2中分生孢子在MM培养基中孵育8小时,即得到萌芽期烟曲霉菌;
步骤4,取9.9mL PBS溶液+0.1mL菌液+50mg催化剂在烧杯中,拿到300W氙灯光源下照射,当光照时间为4h时,取出100μL,涂在YAG培养基中,并培育1.5天,对菌落进行计数。
对实施例3步骤4得到的菌落数计数后,与空白对照进行对比,得到光照4h时催化剂对芽管期烟曲霉菌的杀灭率。如图1所示,该条件下光催化剂杀菌率在60%左右。
实施例4
步骤1,以g-C3N4/Bi4O7作为光催化剂;
步骤2,收集分生孢子:将烟曲霉菌种子液划在YAG培养基中培养2天并用0.002%的吐温80收集分生孢子,离心洗干净孢子后,用血球计数板计算孢子浓度;其中,离心参数为:转速为9000rpm/min,时间为3min,次数为3次;
步骤3,制备萌芽期烟曲霉菌菌株:将步骤2中分生孢子在MM培养基中孵育9小时,即得到萌芽期烟曲霉菌;
步骤4,取9.9mL PBS溶液+0.1mL菌液+50mg催化剂在烧杯中,拿到300W氙灯光源下照射,当光照时间为6h时,取出100μL,涂在YAG培养基中,并培育1.5天,对菌落进行计数。
对实施例4步骤4得到的菌落数计数后,与空白对照进行对比,得到光照6h时催化剂对芽管期烟曲霉菌的杀灭率。如图1所示,该条件下光催化剂杀菌率在81%。
综上,本发明利用可见光辐照光催化剂,从而杀灭萌发之后的烟曲霉菌。光催化剂被可见光(420~760nm)激发后产生的羟基自由基(·OH)与超氧自由基(·O2 -)等活性物质(ROS)能够在液相环境中破坏一定浓度的芽管期烟曲霉菌。上述实施例表面,将9.9mL PBS溶液+0.1mL菌液+50mg g-C3N4/Bi4O7催化剂体系在可见光下照射6h,芽管期的烟曲霉菌死亡率达到80%以上,并且黑暗中实验确定光催化剂几乎无毒,4次循环实验发现其稳定性能较好。因此,此光催化原理杀菌可广泛应用于需要防霉及无菌环境的可见光杀菌。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种利用光催化原理杀灭霉菌的方法,其特征在于:通过可见光辐照具有霉菌亲和性且能被可见光激发的光催化剂,对萌发之后的霉菌孢子进行杀灭或抑制生长;
所述光催化剂在液相环境中的最小浓度为0.1 g/L;
所述霉菌为烟曲霉菌、黄曲霉菌、青曲霉菌或白色念珠菌;
所述霉菌为处于萌发阶段的孢子;
所述霉菌孢子在液相环境中的浓度小于108 CFU/mL;
所述可见光采用氙灯光源,光源波长为420 nm~780 nm,所述可见光功率为100~300 W,光催化剂与光源距离10~15 cm,辐照时间为2~10 h;所述光催化剂为g-C3N4/Bi4O7。
2.根据权利要求1所述的利用光催化原理杀灭霉菌的方法,其特征在于:所述孢子为孵育8~10 h的孢子。
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