CN110464726A - 他达拉非作为蛋白质精氨酸甲基转移酶prmt5抑制剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种他达拉非作为蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMT5抑制剂的应用。本发明根据PRMT5晶体结构及活性位点信息,使用虚拟筛选策略分析可靶向PRMT5的活性化合物,最终发现他达拉非是新的PRMT5抑制剂;本发明不仅证实了他达拉非可以抑制PRMT5的酶活性,而且证实他达拉非单独使用可以抑制乳腺癌肿瘤的生长,并增加乳腺癌化疗敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及他达拉非(Tadalafil)提高乳腺癌阿霉素化疗敏感性的机制,具体涉及他达拉非作为靶向蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMT5的抑制剂在治疗乳腺癌中的应用。
背景技术
在计算机辅助药物设计领域,准确的了解蛋白靶标和活性分子之间的相互作用是十分重要的。生物大分子的X-射线衍射技术的进步为其提供了更多的蛋白和核酸分子的结构。这些结构可以作为生物活性物质的靶标,使人们理解活性物质在生物学方面的作用机理。计算机辅助药物设计的一般原理是:首先通过X-单晶衍射获得受体大分子结合部位的结构,并且采用分子模拟软件分析结合部位的结构性质,如静电场、疏水场、氢键作用位点分布等信息。然后再运用数据库搜寻或者药物分子设计技术,识别得到分子形状和理化性质与受体作用位点相匹配的分子,合成并测试这些分子的生物活性,经过几轮循环,最终有可能发现潜在的先导化合物。
蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMTs)是一类催化活性甲基基团转移到蛋白质精氨酸上的催化酶。PRMTs通过对底物的甲基化修饰,从而改变目的蛋白的结构、蛋白质稳定性,及实现DNA损伤修复等功能。在人体内共有9种蛋白质精氨酸甲基转移酶,其甲基化的类型可分为三种:单甲基化(MMA)、对称性双甲基化(SDMA)和不对称性双甲基化(ADMA)。根据催化的甲基化类型,PRMTs可分为四个类型,其中I型和II型PRMTs较为重要。PRMT5属于II型PRMTs,可催化形成MMA和SDMA。已有大量研究显示,PRMT5在多种肿瘤组织中高表达,并且与患者的不良预后密切相关。申请人前期研究显示,PRMT5可以促进乳腺癌的DNA损伤修复能力,其高表达可以导致阿霉素治疗耐药。因此,抑制PRMT5的甲基化转移酶功能有助于提高乳腺癌的阿霉素治疗敏感性,提高辅助化疗疗效。
鉴于PRMT5在肿瘤发生过程中的重要作用,设计针对PRMT5的小分子抑制剂成为抗肿瘤药物研发的热点。将计算机辅助药物设计方法与药物化学合成方法相结合,有助于获得活性强且对PRMT5具有一定选择性的小分子抑制剂。目前,已经报道的PRMT5的抑制剂包括:JNJ-64619178、EPZ015666、GSK3326595等。其中,GSK3326595(EPZ015938)和JNJ-64619178已经进入临床试验阶段。虽然,针对PRMT5的抑制剂已有一些研究,但是目前的研究结果仍需要一定时间进行临床试验,是否能够成功进入临床,尚需要较长时间。利用市场可售的小分子库进行PRMT5的抑制剂筛选,将极大的缩短这一研究周期,加快基础到临床的转化进程。
他达拉非分子式为C22H19N3O4,是环磷酸鸟苷(cGMP)特异性磷酸二酯酶5(PDE5)的选择性、可逆性抑制剂。目前他达拉非主要用于治疗男性***功能障碍。临床研究表明他达拉非可以增强硝酸盐类药物的降压作用。这被认为是硝酸盐类药物和他达拉非共同作用于一氧化氮/cGMP通路的结果。由于他达拉非目前的应用不适用于妇女,故未在妊娠妇女中进行过他达拉非的研究。动物研究没有表明其对妊娠、胚胎/胎儿发育以及分娩和出生后发育有直接或间接的有害影响。在健康受试者中他达拉非的药代动力学的时间和剂量呈线性关系。
柳金金等(伐地那非逆转MCF-7/ADR细胞阿霉素耐药的作用研究)提及了伐地那非、西地那非、他达拉非对于MCF-7/ADR细胞阿霉素耐药的逆转作用,并从细胞凋亡的角度对机制进行了分析,但未能揭示他达拉非作为PRMT5抑制剂的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种他达拉非作为蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMT5抑制剂的应用。
为达到上述目的,本发明采用了以下技术方案:
他达拉非在制备用于通过抑制PRMT5酶活性***的药物中的应用。
他达拉非在制备用于治疗乳腺癌的药物中的应用。
他达拉非在制备用于抑制乳腺癌细胞增殖的药物中的应用。
他达拉非在制备乳腺癌化疗辅助药物中的应用。
优选的,所述药物为口服制剂。
优选的,所述他达拉非给药剂量为1.29-2.58mg/kg(小鼠给药),对应人体给药剂量为口服10-20mg(按照70kg体重计算)。
本发明的有益效果体现在:
本发明根据PRMT5晶体结构及活性位点信息,使用虚拟筛选策略分析可靶向PRMT5的活性化合物,最终发现他达拉非是PRMT5抑制剂;本发明不仅证实了他达拉非可以抑制PRMT5的酶活性,而且分别通过对正常乳腺癌细胞株(即非耐药细胞株)及由其生成的荷瘤动物模型的化疗敏感性实验及干预实验,证实他达拉非单独使用可以抑制乳腺癌肿瘤的生长,且其具有的PRMT5抑制活性,有利于防止乳腺癌药物治疗中耐药性的产生,并增加乳腺癌化疗敏感性。
附图说明
图1为他达拉非(Tadalafil)的分子结构示意图。
图2为他达拉非(Tadalafil)与PRMT5蛋白晶体结构活性位点附近的结合构象示意图。
图3为他达拉非(Tadalafil)与PRMT5蛋白的亲和能力(SPR分析结果)示意图。
图4为他达拉非(Tadalafil)抑制PRMT5的酶功能和下游底物水平的示意图;(A)PRMT5下游底物SDMA和H4R3me2s的表达,Tad(即Tadalafil)100μM,24h;(B)不同浓度他达拉非下PRMT5下游底物H4R3me2s的表达;actin为内参;MEP50是PRMT5发挥功能的稳定结合蛋白,作为内参照。
图5为他达拉非(Tadalafil)协同阿霉素提高乳腺癌的化疗敏感性(细胞增殖能力检测)的示意图;其中,Tadalafil(Tad):100μM;Doxorubicin(DOX):0.2、0.4、0.8、1.6μg/mL;*p<0.05,**p<0.01。
图6为他达拉非(Tadalafil)干预及协同阿霉素提高乳腺癌的化疗敏感性(小鼠在体功能分析)的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
1.筛选PRMT5抑制剂
PRMT5晶体结构数据下载于PDB数据库,PDB ID为3UA4。其代表了PRMT5在无配体下的结构。
上市药物小分子结构数据从公开数据集中整理汇总得到,包含1813种已经批准上市的临床用小分子药物的结构信息。
计算机虚拟筛选所采用的方法包括以下几个步骤:
(1)小分子三维结构建立:使用babel命令将上市药物提供的SDF转换为3维的PDB格式。通过babel命令将SDF文件转换为smi字符串,然后转换为PDB文件,在smi转换为PDB结构时,babel会根据原子连接的特点建立非平面的分子立体结构。
(2)模拟分子对接:使用AutoDock Vina进行分子对接。根据晶体结构,将小分子限定于有效结合空间范围内进行对接。Vina通过计算分子在格点中与晶体结构的氢键、电荷作用等分子间相互作用力推断小分子的结合自由能变化,并通过模拟退火算法寻找最佳对接位置。Vina能够通过小分子的原子连接关系判断小分子的可旋转键,实现半柔性对接。计算会执行9次搜索,最终给出9次搜索获得的对接构象。本筛选使用PDB ID为3UA4的晶体结构作为对接对象,根据文献提供的活性位点信息划定搜索范围为以(72.75,-1.427,13.062)为中心点的边长为30的立方体区域。
(3)候选药物筛选:根据对接得分<-8.0和分子量<400,从上市药物库中筛选出符合条件的化合物他达拉非(Tadalafil,分子量为389.4)和柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine,分子量为398.39)。他达拉非的分子结构如图1所示,其和PRMT5蛋白3UA4对接的最佳结合构象如图2所示。但后期的功能实验和SPR实验结果显示,柳氮磺胺吡啶的肿瘤抑制功能较弱,与PRMT5的结合能力较低。
2.他达拉非与PRMT5蛋白的亲和力分析
基于Biacore T200分析平台和表面等离子体谐振(SPR)技术,进行他达拉非与靶蛋白(PRMT5)的结合亲和力分析。所用他达拉非(Tadalafil)为MCE公司产品,目录号:HY-90009A(50mg)。PRMT5/MEP50纯化蛋白为abcam公司产品,目录号:ab198151(20μg)。他达拉非(Tadalafil)的稀释浓度依次为:0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100(μM)。结果显示,他达拉非与PRMT5蛋白具有较好的亲和力,Kd=22.65±9.6μM,结果见图3。
3.他达拉非抑制PRMT5酶功能分析
利用他达拉非分别作用于MDA-MB-231和T47D细胞,检测PRMT5及其下游底物H4R3me2s和对称二甲基化(SDMA)的表达水平。Western blot结果显示,下游底物H4R3me2s和SDMA的表达水平显著降低(图4A);同时,他达拉非可以呈剂量依赖性抑制PRMT5及其下游底物H4R3me2的表达水平(图4B)。这些结果说明,他达拉非可以抑制PRMT5的酶活性。
4.他达拉非联合阿霉素提高乳腺癌的化疗敏感性(细胞水平)
通过分组实验,利用他达拉非(100μM)与不同浓度的阿霉素(0、0.2、0.4、0.8、1.60μg/mL)联合作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231,对应分组为TAD 100、TAD+DOX 0.2、TAD+DOX0.4、TAD+DOX 0.8、TAD+DOX 1.6;阴性对照组(Control)为PBS处理,阳性对照组为对应浓度阿霉素单独处理(DOX 0.2、DOX 0.4、DOX 0.8、DOX 1.6)。药物作用48小时后,细胞增殖能力分析(MTT)结果显示,他达拉非可以在短时内显著提高乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性(图5)。
5.他达拉非干预及联合阿霉素提高乳腺癌的化疗敏感性(动物水平)
分别给予免疫缺陷小鼠接种MDA-MB-231细胞,待肿瘤体积达到50-100mm3时,分别给予小鼠四种不同的干预方式:PBS(对照,Ctrl)、他达拉非(Tadalafil)、阿霉素(DOX)、他达拉非与阿霉素联合应用(DOX+Tadalafil)。其中他达拉非给药方式为口服灌胃(2mg/kg,每天一次);阿霉素为鼠尾静脉注射(2mg/kg,每周一次)。每天称量小鼠体重和肿瘤体积,共观察25天。结果显示,对照组小鼠肿瘤体积持续增加,他达拉非和阿霉素单药应用组可以抑制肿瘤的生长;而他达拉非与阿霉素联合应用组小鼠的肿瘤体积明显缩小(图6)。这一结果说明,他达拉非可以单独(与联合应用相比,给药频次增加)或联合阿霉素治疗乳腺癌,在联合阿霉素治疗时可有效提高乳腺癌的化疗疗效(化疗疗效的提高,表明他达拉非可以通过抑制PRMT5酶活性协同阿霉素提高乳腺癌的化疗敏感性)。
Claims (9)
1.他达拉非在制备用于通过抑制PRMT5酶活性***的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述肿瘤选自乳腺癌。
3.他达拉非在制备用于治疗乳腺癌的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述药物为口服制剂。
5.他达拉非在制备用于抑制乳腺癌细胞增殖的药物中的应用。
6.他达拉非在制备乳腺癌化疗辅助药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述药物为口服制剂。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述药物协同阿霉素提高乳腺癌的化疗敏感性。
9.他达拉非在制备PRMT5抑制剂中的应用。
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