CN1104502C - 编码阿佛曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体的基因 - Google Patents
编码阿佛曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体的基因 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及编码链霉菌属微生物的支链α-酮酸脱氢酶复合体的DNA顺序,以及由该顺序的表达生产的多肽。本发明还涉及提高天然阿佛曼菌素产量的方法及发酵生产阿佛曼菌素的方法。
Description
发明背景
本发明涉及编码链霉菌属微生物的支链α-酮酸脱氢酶复合体的新DNA顺序,以及由该顺序表达产生的新多肽。本发明还涉及提高天然阿佛曼菌素(avermectin)产量的新方法及通过发酵生产新的阿佛曼菌素类的新方法。
许多医药产品都是用微生物来生产的。在这些微生物中,链霉菌属微生物(一类革兰氏阳性土壤细菌)受到广泛重视,由其生产的抗生素占治疗用抗生素的90%以上。深入的研究工作应用重组DNA克隆技术来分离抗生素生物合成基因,产生新的衍生物或杂交复合物,分离调控基因,研究初级代谢和次级代谢中涉及的调控机理。链霉菌是这些研究工作的核心。
阿佛曼链霉菌(
S. avermitilis)产生八种各不相同但却密切相关的抗寄生多醚(polyketide)化合物,这些化合物称为阿佛曼菌素。阿佛曼链霉菌产生的阿佛曼菌素复合体有四个主要组分A1a、A2a、B1a和B2a,以及四个次要组分A1b、A2b、B1b和B2b。各组分的结构如下所示。 阿佛曼菌素
R 1
R 2
X-YA1a 仲丁基 Me CH=CHA1b 异丙基 Me CH=CHA2a 仲丁基 Me CH2-CH(OH)A2b 异丙基 Me CH2-CH(OH)B1a 仲丁基 H CH=CHB1b 异丙基 H CH=CHB2a 仲丁基 H CH2-CH(OH)B2b 异丙基 H CH2-CH(OH)
阿佛曼菌素的多醚结构是由7个乙酸分子、5个丙酸分子和1个α-支链脂肪酸分子衍生的,其中的α-支链脂肪酸是S(+)-2-甲基丁酸或异丁酸。符号“A”和“B”分别表示阿佛曼菌素中的5-取代基是甲氧基或羟基。数字“1”指阿佛曼菌素的22-23位有一个双键;数字“2”指阿佛曼菌素的22位上有一个氢,23位上有一个羟基。最后,C-25有两个可能的取代基:在阿佛曼菌素“a”系列中是仲丁基取代基(衍生自L-异亮氨酸),在阿佛曼菌素“b”系列中是异丙基取代基(衍生自L-缬氨酸)(综述见Fisher,M.H.和Mrozik,H.,1984,“Macrolide Antibiotics”,Academic Press,第14章)。
“天然”阿佛曼菌素是指那些由阿佛曼链霉菌产生的阿佛曼菌素,其中的25位取代基如上所述是异丙基或仲丁基。25位基团不是异丙基或仲丁基的阿佛曼菌素在这里称为新的或非天然的阿佛曼菌素。
生成辅酶A(CoA)形式的上述α-支链脂肪酸的一条代谢路线是通过支链氨基酸转氨酶反应,继之以支链α-酮酸脱氢酶反应。(另外,也可由全程合成生成的支链α-酮酸产生支链脂肪酰CoA衍生物)。这些代谢途径如下所示。
以前曾分离出一个阿佛曼链霉菌突变株,该突变株的支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)不具有可检测的支链α-酮酸脱氢酶活性(Hafner等,1988,欧洲专利申请88300353.5,公开号0284176)。在对阿佛曼链霉菌ATCC 31272株进行标准的化学诱变后,筛选出不能由14C-1标记的2-氧代异己酸底物(亮氨酸类似物)生成14CO2的菌株,从而分离出突变株。该突变株不能合成天然阿佛曼菌素,除非在突变株的发酵培养基中加入α-支链脂肪酸或带有异丙基或仲丁基(S型)的前体。如果在含水通气条件下,在含有适当的替代性羧酸(如环己烷甲酸)或其前体的营养培养基中进行发酵,该突变株还能够生产新的或非天然的阿佛曼菌素。
克隆阿佛曼链霉菌BCKDH是很需要的。通过重组DNA技术对这些基因进行操作会有利于天然阿佛曼菌素和新阿佛曼菌素的生产。对某些菌株来说,增加BCKDH基因的拷贝数预计会使天然阿佛曼菌素的效价提高。此外,通过基因置换使BCKDH活性永久性缺失或受到修饰,可产生一个不可逆阻断的
bkd菌株,相对于目前的如上所述用化学诱变法得到的
bkd突变株而言,这将是一个更好的选择。
α-酮酸脱氢酶多酶复合体,即支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)复合体、丙酮酸脱氢酶(PDH)复合体及α-酮戊二酸脱氢酶(KGDH)复合体,分别催化支链α-酮酸、丙酮酸和α-酮戊二酸的氧化脱羧反应,释放出CO2并生成相应的酰基辅酶A和NADH(Perham,R.N.,Biochemistry,30:8501-8512,1991)。每个复合体都由三个不同的催化酶组成,这三个催化酶是:脱羧酶(E1)、二氢硫辛酰胺酰基转移酶转酰基酶(E2)二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)。
支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)是一种由三个功能性组分组成的多酶复合体,这三个组分是:E1:脱羧酶;E2:转酰酶;E3:硫辛酰胺脱氢酶。由恶臭假单胞菌、绿脓假单胞菌和枯草芽孢杆菌中纯化出的复合体由四个多肽组成。纯化的哺乳动物复合体也由四个多肽即E1α、E1β、E2和E3组成。曾经从枯草芽孢杆菌中分离出一种既具有丙酮酸脱氢酶活性又具有支链α-酮酸脱氢酶活性的α-酮酸脱氢酶复合体。这种双功能复合体氧化丙酮酸,并为膜磷脂提供支链脂肪酸。
关于原核支链α-酮酸脱氢酶基因的克隆,假单胞菌和芽孢杆菌已有报导,但链霉菌则尚未有报导。在这些***中发现,编码BCKDH的基因聚集在一个操纵子中。已克隆出恶臭假单胞菌的BCKDH复合体基因,并测定了这一区域的核苷酸顺序(Sykes等,J.Bacteriol.,169:1619-1625,1987;Burns等,Eur.J.Biochem.,176:165-169,1988和176:311-317,1988)。E1 α的分子量是45289,E1β的分子量是37138,E2的分子量是45135,E3的分子量是48164。这四个基因以如下顺序聚集:E1α、E1β、E2、E3。Northern印迹分析表明,这四个基因由同一个mRNA进行表达,而且这四个基因构成一个操纵子。在紧靠E1α编码区起点之前,有一个典型的原核共同启动子,这个启动子允许假单胞菌
bkd基因的组成性表达。E1β编码区的起始密码子位于距E1α开放读码(ORF)末端下游仅40个核苷酸处。相比之下,E1β和E2开放读码间没有基因间间隔,因为E1β开放读码的终止密码子是紧靠E2开放读码起始密码子之前的三联体。E2和E3开放读码间的基因间间隔则减至仅2个核苷酸。所以,假单胞菌的各个
bkd基因是紧密相连的。类似地,已克隆出编码枯草芽孢杆菌BCKDH/PDH双功能复合体的操纵子(Hemila等,J.Bacteriol.,172:5052-5063,1990)。这个操纵子含有编码四个分子量分别为42、36、48和50千道尔顿(kDa)的蛋白的四个开放读码。已证明这四个蛋白与假单胞菌
bkd基因簇的E1α、E1β、E2和E3亚基高度同源。最近,还克隆出了编码嗜热脂肪芽孢杆菌双功能BCKDH/PDH多酶复合体E1组分α和β亚基的基因,并对这些基因进行了顺序测定(α和β亚基的估计分子量分别约为41,000和35,000)(Hawkins等,Eur.J.Biochem,191:337-346,1990)。
此外,一些真核E1α和βBCKDH亚基(人、猪和大鼠)的顺序也已公开。最近,利用计算机分析对许多物种的PDH和BCKDH复合体的E1α和E1β组分的所有已发表的已知顺序进行了氨基酸顺序比较(Wexler等,FEBS Letters,282:209-213,1991)。有趣的是,所鉴定出的α和β亚基的若干区域不仅在迄今所记载的所有PDH中高度保守,而且在原核和真核BCKDH复合体中也都高度保守。
本文叙述阿佛曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶的克隆。利用两种分子遗传学技术,即DNA聚合酶链反应(PCR)和同源性探测相结合来克隆新基因。同源性探测涉及用相应于蛋白氨基酸顺序的放射标记的合成寡核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库。遗憾的是,这一技术有一些局限性,其中之一就是对可使用的寡核苷酸的简并性有相当严格的限制。此外,进行筛选杂交的条件不严格,因此假阳性数很高。为克服寡核苷酸杂交的某些局限性,最近建立了一种经过修改的同源性探测法,这种方法涉及DNA聚合酶链反应(PCR),并允许使用高度简并的寡核苷酸作为探针。这种方法只要求了解所编码蛋白的两个短区域(长度约为7-10个氨基酸的氨基酸顺序。在该反应中使用相应于每个肽顺序的两个寡核苷酸作为引物。所用的每个引物都可以是含有能编码已知氨基酸顺序的所有可能密码子组合的全简并寡核苷酸的混合物。扩增模板可以是若干DNA来源中的任何一种,包括基因组DNA和超螺旋形式的质粒文库。最近在文献中发表的几篇研究报告证实,可以将聚合酶链反应与同源性探测结合起来用于鉴定许多物种的基因。
术语
本申请所使用的技术术语是分子遗传学领域的技术人员所公知的。这些术语的定义见于分子生物学领域的许多教科书中,例如Benjamin Lewin博士所著的“Genes”第二版(John Wiley & Sons,Inc.New York,1985)。本文本中常用的术语定义如下:
抗生素:抑制细菌细胞生长的化学药剂,用于选择重组细菌细胞。
抗生素抗性基因:引入天然对特定抗生素敏感的宿主细胞后能对该抗生素产生抗性的DNA顺序。也称为抗生素标记。
噬菌体:感染细菌的病毒。
cRNA:与某个DNA互补的单链RNA,是由后者通过体外转录合成的。
染色体:携带许多基因的分立的基因组单元。
克隆:与单一祖先相同的大量细胞或分子。
克隆载体:可***欲克隆的外源DNA的任何质粒。它在转化后将外源DNA带入宿主细菌细胞。
CoA:辅酶A。
粘性末端顺序(Cos):由噬菌体λ得到的DNA顺序,可实现体外包装。
粘粒:已***噬菌体λ
cos位点的质粒,结果使质粒DNA(携有外源DNA***片段)可以体外包装在噬菌体外壳中。
道尔顿:常用于表示分子大小的质量单位,相当于一个氢原子。
DNA连接:连接两个DNA片段的化学键的形成。
真核细胞:高等生物的含有具膜细胞核的细胞。
基因簇:染色体上物理接近的一组基因。
基因组:整套染色体。某个个体所有基因的总和。
杂交、集落杂交:用于鉴定携有嵌合载体的细菌集落的技术,该嵌合载体的***DNA与某个特定顺序相似。
kb:1000碱基对DNA或RNA的缩写。
NADH:还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
接头:含有一种或更多种限制酶的靶位点的短双链合成寡脱氧核苷酸,它加到载体中后产生一个新的多接头或多克隆位点(MCS)。
核苷酸:核酸的构件或单体单元。
寡核苷酸:短链核苷酸。
操纵子:一个完整的细菌基因表达和调控单位,包括结构基因、调控基因和DNA中由调控基因产物识别的控制单元。
质粒:自我复制的自主性染色体外环DNA。
质粒拷贝数:每条宿主染色体维持在细菌内的质粒分子数。
引物:与一股DNA配对并提供一个游离3’-OH末端的短DNA或RNA顺序,DNA聚合酶在游离3’-OH末端开始脱氧核糖核苷酸链的合成。
原核细胞:包括大多数微生物在内的相对简单的小细胞。
启动子:负责转录起始的DNA区。
限制酶:识别特异的短DNA顺序并对其进行切割的酶。
限制识别顺序:由特定限制酶特异识别的DNA顺序,也称为靶位点。
穿梭载体:能够在一个或更多个交替宿主(如大肠杆菌和链霉菌)中复制的双功能克隆载体。
Southern印迹分析:将变性DNA从琼脂糖凝胶中转移到硝化纤维素滤膜上使其与互补核酸探针杂交的程序。
亚克隆:将克隆的DNA片段从一种类型的载体转移到另一种类型的载体中,例如从重组粘粒转移到质粒中,然后再将这个新的重组质粒转化到适当的宿主细胞中即得到一个
亚克隆菌株。
转录:由DNA模板合成RNA的过程。
细菌细胞的转化:指通过掺入外加的DNA而获得新的遗传标记。
发明概述
本发明涉及一种分离的DNA片段,该片段编码链霉菌属生物的支链α-酮酸脱氢酶复合体。
本发明还涉及一种如上所述的分离的DNA片段,该片段进一步包含调控所述支链α-酮酸脱氢酶复合体表达的DNA区。
本发明还涉及一种分离的DNA片段,该片段编码阿佛曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体。
本发明还涉及一种DNA片段,该片段包含如下所示的1号顺序、2号顺序、3号顺序、4号顺序或5号顺序的DNAA顺序,或该顺序的等位变异。本发明还涉及一种属于上述DNA片段的子集并在功能上与其等价的DNA片段。
本发明还涉及:(a)重组DNA,该重组DNA包含1号顺序、2号顺序、3号顺序、4号顺序或5号顺序的DNA顺序或该顺序的等位变异;(b)一种质粒,该质粒包含所述重组DNA;(c)一种宿主细胞,其中已掺入了所述重组DNA。
本发明还涉及包含在一个DNA片段中的支链α-酮酸脱氢酶复合体基因,所述DNA片段选自如下所限定的pCD528、pCD545、pCD574、pCD550、pCD559和pCD577。
本发明还涉及一种生产天然阿佛曼菌素的方法,该方法包括:在适于生产该天然阿佛曼菌素的条件下,在适于生产该天然阿佛曼菌素的发酵培养基中,发酵一种阿佛曼链霉菌,该阿佛曼链霉菌中已增加了编码支链α-酮酸脱氢酶复合体的基因的拷贝数。
本发明还涉及一种生产天然阿佛曼菌素的方法,该方法包括:在适于生产该天然阿佛曼菌素的条件下,在适于生产该天然阿佛曼菌素的发酵培养基中,发酵一种阿佛曼链霉菌,该阿佛曼链霉菌中,编码支链α-酮酸脱氢酶复合体的基因的表达已由于负责调控所述表达的基因的操作或置换而得到增强。
本发明还涉及一种生产新阿佛曼菌素的方法,该方法包括:在适于生产该新阿佛曼菌素的条件下,在适于生产该新阿佛曼菌素的发酵培养基中,发酵一种阿佛曼链霉菌,该阿佛曼链霉菌中,支链α-酮酸脱氢酶复合体的表达已减弱或消失,例如由于负责所述表达的基因的操作(例如缺失、灭活或置换)而减弱或消失。
本发明还涉及一种DNA片段,该片段包含1号顺序、2号顺序、3号顺序、4号顺序或5号顺序的DNA顺序,或该顺序的等位变异。
本发明还涉及一种DNA片段,该片段包含一种DNA顺序或其等位变异,所述DNA顺序属于1号顺序、2号顺序、3号顺序、4号顺序或5号顺序的DNA顺序的子集,并且在作为探针使用时能够分别与1号顺序、2号顺序、4号顺序或5号顺序或其等位变异杂交,或者在作为聚合酶链反应引物使用时能够扩增所述顺序的全部或部分。
本发明还涉及一种基本上纯化的多肽,该多肽包含6号顺序、7号顺序、8号顺序或9号顺序的氨基酸顺序。
附图简要说明
图1:用于克隆阿佛曼链霉菌E1-αBCKDH基因的聚合酶链反应(PCR)引物的核苷酸顺序。由每个寡脱氧核苷酸编码的推测氨基酸顺序示于相应DNA顺序的上方。箭头表示扩增方向。图1A是右向引物,图1B是左向引物。
图2:支链α-酮酸脱氢酶顺序比较。列出了阿佛曼链霉菌(Sa)PCR克隆的CD503基因组片段、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bs)、恶臭假单胞菌(Pp)和人(Hs)的推测氨基酸顺序。垂直线表示相同的氨基酸。示出了相应于用于克隆的右向和左向PCR引物的顺序的位置(分别位于左上端和右上端)。
图3:阿佛曼链霉菌
bkd基因簇的基因组限制图谱、位置和亚克隆。图谱下面的黑方块表示用PCR克隆的初始E1α特异性阿佛曼链霉菌CD503基因组片段的位置和取向。示出了基因组亚克隆(pGEM-3Z的衍生物)。还示出了编码E1α(E1a)、E1β(E1b)和E2 BCKDH亚基的
bkd结构基因的位置和构成。已鉴定出的开放读码(由方框表示)的方向是由左向右。缩写:B.BamHI;E.EcoRI;K.KpnI;Bg.BglII;S.SphI。
图4A、4B、4C、4D、4E和4F:含有E1α、E1β和E2(部分)
bkd开放读码的2728bp阿佛曼链霉菌基因组DNA片段的核苷酸顺序和推测的转译产物。E1α开放读码位于该顺序的403-1548位,E1β开放读码位于1622-2626位,E2开放读码则在2626位起始。核苷酸在各行顺序的上部编码。终止密码子用星号(*)表示。可能的Shine-Dalgarno核糖体结合顺序划下线表示。BamHI限制识别顺序用方框表示。
图5:含有部分E2
bkd开放读码的0.8kb Bgl II-Sph I阿佛曼链霉菌基因组DNA片段(pCD539)的核苷酸顺序和推测的转译产物。对从BglII位点(以方框表示)开始的251bp进行了顺序测定。核苷酸在各行顺序的上部编号。
图6:用于构建pT7衍生物的聚合酶链反应(PCR)诱变(右向)引物和通用(左向)引物的核苷酸顺序。pT7衍生物用于在大肠杆菌中异源表达阿佛曼链霉菌
bkd基因。利用PCR引物在E1α或E1β阿佛曼链霉菌
bkd开放读码的转译起始密码子处引入NdeI限制位点(分别为引物对55:31和56:30)。每个诱变寡脱氧核苷酸编码的推测氨基酸顺序示于相应DNA顺序的上方。示出了限制识别顺序。箭头表示扩增方向。图6A是右向诱变引物,图6B是左向诱变引物。
发明的详细叙述
下面叙述用于克隆阿佛曼链霉菌
bkd基因和测定编码阿佛曼链霉菌BCKDH多酶复合体的基因初级结构的新方法。
首先,根据由不同物种及文献中现有的推测E1αBCKDH肽顺序的多重排列鉴定出的保守区,设计出称为“右向”和“左向”的2个引物(图1)。同时使用右向和左向引物扩增阿佛曼链霉菌基因组DNA,检测出约0.2kb长的PCR产物。随后把这个PCR扩增的DNA片段克隆到大肠杆菌载体pGEM-3Z中,生成重组质粒pCD503。随后将质粒pCD503转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将一个转化体命名为CD503株。对克隆的DNA片段CD503进行DNA顺序测定表明存在一个开放读码,所推测的肽与E1αBCKDH亚基高度同源(图2)。然后用克隆的CD503基因组DNA片段作探针,以集落杂交法筛选阿佛曼链霉菌染色体文库。鉴定出四个粘粒克隆,即CD518、CD519、CD520和CD521。限制分析和Southern印迹分析表明,这四个克隆携有重叠的基因组片段。对亚克隆基因组DNA片段的成套缺失进行DNA顺序测定(如实施例8所详述),证实了CD503顺序是完整
bkd基因簇的一部分。克隆的阿佛曼链霉菌
bkd基因包含一个约15千碱基长的染色体区(图3)。DNA顺序分析表明存在成簇排列的推定转录启动子顺序和
bkd结构基因,其构成如下:启动子顺序、E1α、E1β、E2开放读码(图4和图5)。
最后,将完整的阿佛曼链霉菌
bkd基因簇克隆到强大肠杆菌T7启动子的下游,以便在大肠杆菌宿主中表达。类似地,将E1α和E1β开放读码也分别或一起克隆到T7启动子的下游,并测试每个构建体的表达情况。实施例9详细描述了用于在E1α和E1β开放读码的ATG转译起点处引入独特NdeI限制位点的新PCR诱变引物(也参见图6)。对双功能质粒T7表达***的研究证实,由CD503得到的阿佛曼链霉菌
bkd基因簇(E1α和E1β)至少有两个开放读码在大肠杆菌中表达时可完全转译。此外,旨在特异分析BCKDH复合体E1组分的酶分析确认了有两个重组大肠杆菌克隆含有E1 BCKDH特异性酶活性,其中一个克隆携有全部的
bkd基因簇,另一个克隆同时携有E1α和E1β开放读码(表1)。
本文叙述了从产阿佛曼菌素的阿佛曼链霉菌中分离
bkd基因。链霉菌大基因组(约104kb)是大肠杆菌基因组的两倍多。链霉菌基因组由极高鸟苷加胞苷(G+C)含量(平均达73%,某些区域>90%)的DNA组成,这一含量接近自然界所观察到的上限。由于有这些独特的特性,必须建立链霉菌特异性重组DNA技术。这方面工作的例子见美国专利申请08/048,719(1993年4月16日提交)和美国专利申请08/032,925(1993年3月18日提交)。这两份申请在此全文列为参考。
为本发明目的而专门优化的其他技术,例如PCR基因组DNA扩增、成套缺失的产生、DNA顺序测定、以及在大肠杆菌中异源表达阿佛曼链霉菌
bkd基因,将在实施例部分中详细叙述。
下面将详细叙述阿佛曼链霉菌
bkd基因克隆过程中所涉及的实验步骤及所得的结果:
(a)E1αBCKDH肽亚基中可作为候选PCR引物结合位点的保守区的鉴定。
对分别得自人(Fisher等,J.Biol.Chem,264:3448-3453,1989)、大鼠(Zhang等,J.Biol.Chem.,262:15220-15224,1987)、恶臭假单胞菌(Sokatch等,Eur.J.Biochem.,176:311-317,1988)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Perham等,Eur.J.Biochem.,191:337-346,1990)的四个E1αBCKDH肽顺序进行排列,鉴别出可作为候选顺序来设计相应PCR引物的保守区。利用来自GCG顺序分析软件包(Madison,WI)的Line Up和Pretty程序进行计算机分析,以鉴定出E1α亚基中在原核和真核BCKDH复合体中都高度保守的区域。四个E1α BCKDH肽的多重排列显示出若干同源性得到延伸的区域(见Wexler,ID.等,FEBSLetters,282:209-213,1991)。位于人E1α氨基酸182-229之间的焦磷酸硫胺素结合基序(motif)(Perham等,FEBS Letters,255:77-82,1989)、以及一个跨越氨基酸245-289的包含磷酸化位点1和2的区域,在所分析的四个E1α BCKDH肽中都显著保守。还有一个以前曾被描述过的位于氨基酸291-307之间的高同源区。这一区域看来是既含有α亚基也含有β亚基的α-酮酸脱氢酶所独有的,并且与大肠杆菌pDC E1或大肠杆菌和酵母α-酮戊二酸脱氢酶复合体(仅由一条E1多肽组成的二聚体)的E1组分中的任何顺序都不同源。由于上述原因,有人认为后一同源区在亚基相互作用中起作用(Patel等,FEBS Letters,282:209-213,1991)。为设计PCR引物而选择的保守区编码人E1αBCKDH蛋白的氨基酸残基192-200和370-376。
(b)由上述E1αBCKDH保守区得到的准备作为PCR引物使用的新寡核苷酸的设计
如上所述,根据多重排列研究结果选择E1αBCKDH亚基的两个保守区。根据含有人E1αBCKDH亚基(用作E1αBCKDH亚基的代表性模型)氨基酸192-200的区域设计右向PCR引物(图1)。上述氨基酸位于焦磷酸硫胺素结合基序内。根据含有E1αBCKDH亚基氨基酸370-376的区域设计左向PCR引物(图1)。后一氨基酸顺序位于该肽的C末端区附近。采用链霉菌基因密码子配分(assignments)(F.Wright和M.J.Bibb,Gene,113:55-65,1992)。在每个引物的5’端有一个限制酶识别顺序(右向引物中是EcoRI,左向引物中是XbaI),从而有利于PCR产物的克隆。右向PCR引物的完整顺序是:5’-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3’。
左向PCR引物的完整顺序是:
5’-
TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3’
与E1α
bkd基因不同源但掺入到克隆引物中的顺序划下线下表(也参见图1)。
(c)阿佛曼链霉菌基因组DNA片段的PCR扩增
利用适于高GC含量DNA的反应条件,对阿佛曼链霉菌基因组DNA进行酶促扩增,从而达到链霉菌DNA的高效而特异的扩增(见实施例2)。利用上述的引物组合(右向引物5’-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3’和左向引物5’-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3’)进行PCR。用琼脂糖凝胶电泳法对扩增产物进行分子量分级分离。在上述PCR条件下,在使用上述引物组合时检测到单条DNA条带(约250碱基对长)。
(d)将扩增的基因组DNA片段克隆到大肠杆菌克隆载体中,然后转化到大肠杆菌宿主中
如上所述,将一个EcoRI限制位点掺入到右向PCR引物中,以便于克隆,而在左向引物的5’端有一个XbaI限制位点。然而,采用***片段和克隆载体都用EcoRI和XbaI消化的连接方法来克隆0.25kb PCR片段的尝试并不成功。因此,有人探寻了克隆0.25kb PCR片段的另一途径,这一途径涉及用DNA聚合酶I的Klenow片段使PCR片段产生平末端。将该平末端片段***到SmaI线性化的平末端大肠杆菌载体(pGEM-3Z[f+])中后,回收到单个重组克隆,从而生成重组质粒pCD503。然后,用转化法将pCD503引入到大肠杆菌DH5-α感受态细胞中。选择出的转化体命名为CD503株。验证性的限制分析表明,从大肠杆菌CD503株中分离出来的质粒pCD503确实含有0.25kb阿佛曼链霉菌***片段。
(e)将0.25kbPCR扩增的DNA***片段亚克隆到噬菌体M13中,对克隆的片段进行DNA顺序测定,并鉴定出
bkd特异性顺序
将存在于质粒pCD503中的0.25kb***片段亚克隆到噬菌体M13中。为达到这一目的。首先用EcoRI和PstI消化pCD503,从大肠杆菌载体中释放出***片段,所用的上述两种限制酶的识别顺序位于pGEM载体的多克隆位点中所克隆的***片段的两侧。然后将该特异性片段克隆到经EcoRI处理的经PstI处理的M13 mp18和mp19两种载体中。克隆到两种载体中就确保了***片段DNA的两条链都生成单链DNA的可能性,以便进行顺序测定。将从mp18转染实验中选择出的一个含有特异性***片段的克隆命名为CD505株。将另一个也含有特异性***片段但是从mp19转染实验中选择出的克隆命名为CD506。利用双脱氧核苷酸链终止法,用单链DNA模板和Tag Track试剂盒(Promega)进行DNA顺序测定。所有情况下都是两条DNA链都进行顺序测定,这两条DNA链一条得自克隆CD505,其互补链则得自克隆CD506。对由CD505和CD506克隆得到的DNA测序数据进行密码子优先分析(GCG顺序分析软件包,Madison,WI),表明存在一个具有正确的链霉菌基因密码子用法的开放读码。
接着,用IntelliGenetics Suite软件(IntelliGenetics Inc.,MountainView,California)的Seq和Translate程序将推定的开放读码翻译成氨基酸顺序。最后,用IntelliGenetics软件的FASTDB程序进行可疑肽顺序的数据库相似性检索。所有数据库检索或者检索DNA数据库(GenBank和EMBL),或者检索蛋白数据库(PIR和Swiss-Prot),这些检索都毫无疑问地表明,得自克隆CD503的顺序与数据库中所列的原核和真核来源的所有其他E1α BCKDH肽都高度同源,但却是一种不同于其他肽的新肽。人、大鼠、恶臭假单胞菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的E1αBCKDH肽顺序以及新的阿佛曼链霉菌E1αBCKDHCD503肽顺序的多重排列示于图2。由这些数据可以得出结论,克隆在大肠杆菌CD503株中的250bp阿佛曼链霉菌基因组PCR产物确实是一个新的E1α
bkd基因片段。
(f)完整阿佛曼链霉菌
bkd基因簇的克隆、限制分析和Southern印迹分析、以及染色体图谱的建立
使用来自pCD503的携有E1α
bkd特异性阿佛曼链霉菌DNA顺序的约0.25kb长BamHI/EcoRI DNA片段,作为放射标记探针以集落杂交法来筛选阿佛曼链霉菌基因组DNA粘粒文库。鉴定并回收4个克隆(CD518、CD519、CD520和CD521)。限制分析和Southern印迹杂交分析表明,这4个克隆含有源于同一染色体区的重叠顺序。在高度严格的条件下对经过消化的阿佛曼链霉菌ATCC31272染色体DNA的Southern印迹使用相同的探针。后一分析确认了从基因组文库中回收的克隆的身分。含有阿佛曼链霉菌CD503顺序的基因组区的限制图谱示于图3。
(g)得自克隆CD518和CD521的基因组DNA片段的亚克隆、以及携有
bkd基因簇的阿佛曼链霉菌染色体区的DNA顺序测定
将覆盖阿佛曼链霉菌染色体整个CD503
bkd区的基因组片组(1-2kb长)从DNA文库克隆CD521和CD518中亚克隆到大肠杆菌载体pGEM-3Z中。这一工作构建出的亚克隆,包括每个质粒的简介,列出如下:1.质粒pCD528含有从pCD518中亚克隆的7kb BamHI片段;2.质粒pCD545含有从pCD528中亚克隆的2.3kb SphI片段;3.质粒pCD550含有从pCD521中亚克隆的6kb SphI片段;4.质粒pCD559含有从pCD521中亚克隆的7kb BamHI片段;5质粒pCD574含有从pCD550中亚克隆的4.2kb SphI-Bgl II片段;6质粒pCD577含有约10.4kb***片段。这个***片段含有两个重新组装在一起的相邻基团组片段:一个是从pCD550中亚克隆的4.2kb SphI/Bgl II片段,一个是从pCD559中亚克隆的6.2kb Bgl II/BamHI片段。质粒限制图谱、Southern杂交、以及PCR分析,证实了每个亚克隆的身份。采用Sanger链终止法测定核苷酸顺序。为此目的,随后将阿佛曼链霉菌基因组片段亚克隆到M13mp18和M13mp19噬菌体中,以测定两条DNA链的顺序。从上述的pGEM衍生克隆中分离出若干DNA限制片段,并连接到M13mp18和M13mp19中,得到下列重组噬菌体:
CD535:用PCR法克隆的0.4kb阿佛曼链霉菌DNA片段,该PCR使用pCD528 DNA作模板,并使用了特异引物29-PCR-EX(5’AA
GAATTCTCGAGCTGGCCCACAAGGCCGTCGGCTAC-3’)和通用引物31-PCR-BP(见实施例9和图6)。扩增的片段用EcoRI和PstI进行限制消化,并克隆到用EcoRI/PstI线性化的M13mp18 DNA中。
CD536:如上所述克隆到M13mp19DNA中的类似DNA片段。
CD537:从pCD528亚克隆到M13mp18中的携有CD503顺序的1.15kb SaII DNA片段。
CD538:克隆到M13mp18中的1.15kb Sal IpCD528DNA片段(位于上述1.15kb SalI片段的上游)。
CD539:从pCD550亚克隆到M13mp18中的1.5kb BamHI/glIIDNA片段。
CD540:如上所述以相反取向克隆在M13mp18中的类似DNA片段。
CD541:从pCD528亚克隆M13mp18中的0.35kb Sal I/BamHIDNA片段。
CD542:从pCD528亚克隆到M13mp19中的0.35kb Sal I/BamHIDNA片段。
CD553:从pCD550亚克隆到M13mp18中的0.8kb BamHI/BglIIDNA片段。
CD554:从pCD550亚克隆到M13mp18中的11kb BamHI DNA片段。
CD555:如上所述以相反取向克隆在M13mp18中的类似DNA片段。
CD558:从pCD553亚克隆到M13mp19中的0.8kb BamHI/HindIII DNA片段。
CD561:从pCD537亚克隆到M13mp18中的1.15kb Sal I DNA片段(与构建体CD537中的取向相反)。
CD565:从pCD537亚克隆到M13mp19中的1.15kb Sal I DNA片段。
CD566:从pCD537亚克隆到M13mp19中的1.15kb Sal I DNA片段(与构建体CD565中的取向相反)。
CD567:从pCD538亚克隆到M13mp19中的1.15kb Sal I DNA片段。
CD582:从pCD550亚克隆到M13mp18中的0.8kb BamHI/BglIIDNA片段(与CD553中的取向相反)。
这些克隆所携带的阿佛曼链霉菌基因组***片段随后用核酸外切酶III处理使其缩短,得到一系列亚克隆(“成套缺失体”,见实施例8)。
(h)由克隆的DNA片段得到的DNA顺序测定数据的计算机分析及阿佛曼链霉菌E1α、E1β、和E2
bkd开放读码的鉴定。
含有
bkd基因的2.7kb阿佛曼链霉菌基因组区的核苷酸顺序示于图4。利用“DNA Inspector”软件对含有阿佛曼链霉菌E1α、E1β和E2(部分)
bkd开放读码(ORF)的2.7kb基因组区进行滑动碱基组成分析。该分析提供了G+C含量分组平均值的概况,所用的区段长度为30个碱基,偏移值(offset value)为20。对应于该阿佛曼链霉菌染色体区的总G+C含量为72%。表明启动子区的低G+C谷(G+C含量约为50%)位于紧靠
bkd开放读码上游处。
还分析了G+C含量随密码子位置的变化。利用“CodonPreference”程序(Genetics Copmuter Group,Madison,WI)及链霉菌64个基因的密码子使用表(F.Wright和M.J.Bibb,Gene,113:55-65,1992)检测开放读码。CodonPreference程序是一种码特异性基因搜寻程序,旨在借助蛋白编码顺序与密码子频率表的相似性或通过其每个密码子第三位的组成偏向(通常是GC)来识别蛋白编码顺序。开放读码在各自的读码图下部以方框表示。还检测了所有的起始密码子(ATG)和终止密码子(垂直线)。每个读码中出现的稀有密码子在每个开放读码图的下面标出。G+C含量是用25个密码子的滑动窗来计算的,所以在观察到蛋白编码区的全部影响(full impact)之前,预计会有一个约25个密码子的滞后。得到如下三种情况:1,三联体的第一位;2,三联体的第二位;3,三联体的第三位。这一分析的结果定位出三个
bkd开放读码,相应于下列BCKDH亚基:E1α、E1β、E2(图4和图5)。
(i)作为以PCR为基础的定位诱变的引物使用的新寡核苷酸的设计
利用以接头或PCR为基础的定位诱变,在E1α和E1β开放读码的ATG转译起始位点处引入一个NdeI限制位点。设计下列新寡核苷酸(另见实施例9和图6):
左向通用(载体)引物:
30-PCR-BP:5’-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3’
31-PCR-BP:5’-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3’
右向诱变引物:
55-PCR:5’-AAGAGATCTCATATGACGGTCATGGAGCAGCGG-3’
56-PCR:5’-AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3’
(j)为在开放读码的上游构建新的Nde I限制位点而对阿佛曼链霉菌
bkd基因进行定位诱变
表达质粒是携有E1α、E1β、E1α加E1β开放读码、或完整阿佛曼链霉菌
bkd基因簇的质粒pT7-7衍生物(见S.Tabor,1990,InCurrent Protocols in Molecular Biology,pp.16.2.1-16.2.11.GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York)。通过以PCR为基础的定位诱变构建Nde I限制位点。本研究构建了如下5个表达质粒:
质粒pCD670:携有阿佛曼链霉菌E1α
bkd开放读码(ORF1)的pT7-7衍生物。利用PCR诱变引物55-PCR进行扩增并同时进行诱变,在阿佛曼链霉菌E1α
bkd基因中引入跨过ATG起始密码子的NdeI限制位点(见实施例9和图6)。
质粒pCD666:携有阿佛曼链霉菌E1β
bkd开放读码(ORF2)的pT7-7衍生物。利用PCR诱变引物56-PCR进行扩增并同时进行诱变,在阿佛曼链霉菌E1β
bkd基因中引入跨过ATG起始密码子的Nde I限制位点(见实施例9和图6)。为使这个开放读码达到最佳表达,将密码子7的第3位由C变为G,产生类似大肠杆菌密码子用法的同义密码子。这一改变不影响E1β肽顺序。
质粒pCD736:同时携有处于T7启动子控制下的E1α(ORF1)和E1β(ORF2)的pT7-7衍生物。
质粒pCD705:与pCD736类似,但具有以错误取向定位的E1β开放读码的3’一半。该构建体在表达实验中用作阴性对照。
质粒pCD685:携有完整阿佛曼链霉菌
bkd基因簇的pT7-7衍生物。
(K)利用T7双功能质粒表达***在大肠杆菌中表达阿佛曼链霉菌bkd开放读码。
基本上如S.Tabor所述(1990.In Current Protocols in MolecularBiology,pp 162.1-16.2.11. Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York),利用T7 RNA聚合酶/启动子双功能质粒***实现阿佛曼链霉菌
bkd基因在大肠杆菌中的表达。对含有不同pT7-7构建体的大肠杆菌C600衍生物(pGP-1)进行分析。热诱导后利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)监测阿佛曼链霉菌开放读码在大肠杆菌宿主中的表达。对诱导后的蛋白形式进行SDS-PAGE分析表明,E1α和E1β开放读码过度表达出所诱导的肽,这些肽的分子量与预测值(由相应的DNA顺序推测)相似,如下所示:
预测分子量(Da) 实测分子量(Da)
ORF1(E1α) 41,000 41,000
ORF2(E1β) 35,000 34,000
(e)用特异性检测方法检测重组大肠杆菌克隆粗提物中的E1阿佛曼链霉菌BCKDH活性
后面的表I(实施例11)总结了这些结果。在携有pCD736的大肠杆菌细胞粗提液中进行的E1特异性BCKDH检测表明,诱导T7启动子时产生显著的E1活性。而携有带有以错误取向定位的部分***片段的构建体(pCD705)的类似培养物,只显示出本底水平的活性。
此外,酶检测分析表明,含有质粒pCD685的大肠杆菌菌株粗提液也具有显著的E1 BCKDH活性(超过本底水平10倍多)。对该克隆未经诱导的培养物也进行了分析,该培养物显示出高于本底2倍的基础活性。后一结果是预料之中的,因为已知T7***即使在未诱导条个下也允许克隆基因的低水平组成性表达。
克隆的阿佛曼链霉菌
bkd基因簇可通过增加这些基因的拷贝数或优化其在生产菌株中的表达而用于提高天然阿佛曼菌素的产量。使克隆的
bkd基因达到高效表达的一个可能途径是,把这些基因***到一个多拷贝大肠杆菌/链霉菌穿梭载体中(例如质粒pCD262,DenoyaC.D.,1993,“用于链霉菌和大肠杆菌的新的细菌质粒穿梭载体”,美国专利申请08/032,925,1993年3月18日提交),使这些基因由一个强启动子转录。这一操作将确保这些基因的高效转录。此外,可考虑采取某些做法来确保高效表达。这些做法包括:(a)启动子强度;(b)mRNA的稳定性;(c)调控因子的存在与否;(d)可诱导性;(e)改进核糖体识别信号和转译起始信号的定位诱变。也可以用基因置换技术以不同的启动子代替野生型启动子和调控区,从而优化
bkd基因的表达。关于可用于优化这里所公开的新阿佛曼链霉菌
bkd基因表达的启动子,文献中有许多有用启动子的实例,例如强
ermE启动子(Hopwood等,1985,“Genetic Manipulation of
Streptomyces:A LaboratoryManual”,The John Innes Foundation,Norwich,U.K.)和硫链丝菌肽诱导性
tipA启动子(Murkakami等,J.Bacteriol,171:1459-1466,1989)。此外,利用基因置换技术进行缺失或定位诱变,从而使
bkd基因失活,同时丧失BCKDH活性,将产生改进的、不可逆阻断的
bkd阿佛曼链霉菌菌株,这些菌株可用于生产新的阿佛曼菌素。
实施例
以下是用于克隆和分析阿佛曼链霉菌
bkd基因的实验操作的详细实施例。这些实验操作也在附图中加以说明。分子生物学领域技术人员所公知的标准技术的另一些详细内容,以及所用的特定酶的命名,见于例如Maniatis等人的“Molecular Cloning”实验手册(ColdSpring Harbor Laboratory,1989)。
实施例1
阿佛曼链霉菌基因组DNA的制备
于29℃下,将阿佛曼链霉菌ATCC31272菌丝体在YPD-2琼脂培养基上以汇合菌苔形式培养7天。该培养基含有:
Difco酵母提取物 10g
Difco Bacto-peptone 10g
右旋糖 5g
Difco Bacto琼脂 20g
乙酸钠 2g
MOPS 10g
pH调至7.0。
终体积:1升。
121℃高压灭菌25分钟。
然后用培养后的菌丝体接种300ml带挡板摇瓶中的30ml AS-7培养基(见Hafner等,1988,欧洲专利申请88300353.5,公开号0284176),摇瓶于振荡(230rpm)下保持29℃24小时。该培养基含有:
稀淀粉1 20g
Ardamine pH2 5g
Pharmamedia3 15g
碳酸钙(CaCO3) 2g
用氢氧化钠(NaOH)将pH调至7.2。
终体积:1升。
121℃下高压灭菌25分钟。
1用地衣型芽孢杆菌的α-淀粉酶将淀粉水解至右旋糖当量为约40%而制得。
2得自Yeast Products,Inc.,Clifton,NJ07012。
3得自Traders Protein,Memphis,TN38108。
用约0.3ml上述培养物接种另一个装有30ml改良液体酵母提取物麦芽汁(YEME)培养基的300ml带挡板培养瓶(Bibb,M.J.,Freeman,R.F.和D.A.Hopwood,Mol.Gen.Genetics 154:155-166,1977)。改良YEME培养基每升含有:
Difco酵母提取物 3g
Difco Bacto-peptone 5g
Oxoid麦芽汁 3g
蔗糖 300g
葡萄糖 10g
121℃下高压灭菌40分。
高压灭菌后加入2ml 2.5M氯化镁六水合物(MgCl2·6H2O)。
终体积调至1升。
将培养物于29℃下培养48-72小时。离心回收菌丝体,并按照D.A.Hopwood博士等人所著的教科书中所述的程序制备基因组DNA(“Isolation of
Streptomyces Total DNA by Cesium ChlorideGradient Centrifugation:Procedure 2”,in Genetic Manipulation ofStreptomyces,A Laboratory Manual,The John Innes Foundation,Norwich,U.K.,1985)。将DNA沉淀重新悬浮于3ml TE缓冲液中(10mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA)。
实施例2
聚合酶链反应阿佛曼链霉菌基因组DNA扩增
利用Perkin-Elmer Cetus热循环仪对阿佛曼链霉菌基因组DNA进行酶扩增。在20μM dNTP、15%甘油、0.5μM每种引物、50ng模板DNA(本例中是阿佛曼链霉菌基因组DNA)和2.5单位酶存在下,用Taq聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)和制造商提供的缓冲液进行PCR反应,总体积为100μl,共进行30次循环。第一次循环的热分布如下:95℃3分钟(变性步骤)、55℃2分钟(退火步骤)、72℃2分钟(伸长步骤)。其后的29次循环的热分布类似,只是变性步骤缩短到1.5分钟。DNA引物由Genosys Biotechnologies,Inc.(Texas)供应。右向引物(图1)为5’-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3’,左向引物(图1)为5’-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3’。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳法进行分子量分级分离。如Maniatis等人所述,将PCR样品在水平1.5%琼脂糖凝胶中以100V电泳1.5小时,缓冲液为1×TBE缓冲液(90mM Tris-HCl,pH 8.5,90mM硼酸,2.5mM乙二胺四乙酸(EDTA))。用溴化乙锭染色将分离的PCR DNA产物固定在凝胶中,用365nm紫外光显示荧光带。在上述PCR条件下,使用上述引物组合时检测到单条DNA带(约250碱基对长)。
实施例3
将0.25kb PCR扩增的阿佛曼链霉菌基因组DNA片段克隆到大肠杆菌载体中,然后转化到大肠杆菌宿主中。
A.回收0.25kb PCR产物
如上所述,用阿佛曼链霉菌基因组DNA作模板,利用右向引物加左向引物组合,以PCR法扩增0.25kb DNA片段。如图1所示,右向引物有一个位于5’端的EcoRI识别位点,左向引物有一个位于5’端的XbaI识别位点。然而,在试图用EcoRI和Xba I消化***片段和克隆载体,从而用连接法克隆0.25kb PCR片段时却不成功。所以尝试了克隆0.25kb PCR片段的另一条途径,这一途径涉及用DNA聚合酶I的Klenow片段在PCR片段中生成平末端。扩增(如实施例2所述)后,约80μl PCR反应液用苯酚-氯仿萃取两次,用***萃取两次,然后如上所述用乙醇沉淀PCR DNA产物。将DNA重新悬浮于18.5μl H2O中。然后加入2.5μl 10×缺刻转译缓冲液(0.5MTris-HCl,pH7.2,0.1M硫酸镁(MgSO4),1mM二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清清蛋白)(Maniatis等,1989)和20单位大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段(Boehringer Mannheim Biochemicals),混合物于37℃下保温5分钟。然后加入1μl 2mM dNTP(4种dNTP每种各2mM),反应液在室温下再保温15分钟。加入1μl 0.5M EDTA,pH8.0停止修复反应,将反应混合物的全部内容物加到15%琼脂糖凝胶上进行电泳。如上所述显示0.25kb DNA片段,并如下用电洗脱法回收该片段:用刀片切下0.25kb DNA条带,用单向电洗脱仪(InternationalBiotechnology Inc.,New Haven,CT)以80V电洗脱35分,将DNA从琼脂糖凝胶中电洗脱到装有10M乙酸铵的V形井中,从而回收DNA。然后用乙醇沉淀该DNA,沉降,最后重新溶解于20μl DNA缓冲液(10mM Tris-HCl,4mM氯化钠(NaCl),0.1mM EDTA;pH7.5)。
B.质粒载体pGEM-3Z的SmaI消化和脱磷酸化
在供货商指定的检测缓冲液中,使约1μg质粒pGEM-3Zf(+)(Promega Corp.,Madison,WI)和2单位限制酶Sma I(所有限制酶都购自Boehringer Mannheim Biochemicals)于25C下保温3.5小时,生成线性平末端分子。反应总体积为40μl。然后用小牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)(购自Promega Corp.,Madison,WI),按照供货商提供的说明书使SmaI线性化的载体脱磷酸化。反应混合物于37℃下保温35分钟,然后DNA用等体积的苯酚氯仿萃取两次,用等体积的***萃取两次,最后加入2倍体积的无水乙醇使DNA沉淀。以10,000G离心10分钟回收沉淀的DNA,并真空干燥。最终沉淀重新溶解于20μlDNA缓冲液中。
C.连接生成pCD503
取约9μl经Klenow处理的0.25kb PCR DNA产物和约1μl经SmaI线性化、CIAP脱磷酸化的平末端pGEM-3Zf(+),在供货商指定的条件下于14℃下与1单位连接酶(New England Biolabs,IC,Beverly,MA)一起保温过夜,反应总体积为20μl。把小试管放在冰上终止反应,然后用15μl反应混合物按照如Maniatis等人(1989)所述的标准程序转化感受态大肠杆菌JM109。回收到许多氨苄青霉素抗性转化体。质粒载体pGEM-3Zf(+)含有得自大肠杆菌
lac操纵子的编码β-半乳糖苷酶氨基端片段的DNA区段(Yanish-Perron,C.,Vieira,J.和J.Messing,Gene,33:103,1985)。该片段的合成可以用异丙硫基-β-D-半乳糖苷(IPTG)来诱导。该片段能够与由宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶进行基因内(α)互补。大肠杆菌细胞如与诱导物IPTG接触则两个酶片段都合成,如果接种在含有生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)的培养基上则形成蓝色菌落。外源DNA***质粒的多克隆位点则使β-半乳糖苷酶的氨基端片段失活,从而消除了α-互补。所以,携有重组质粒的细菌产生白色菌落。由该转化实验回收到许多白色菌落。这些菌落应含有质粒pCD503。这一点通过选择一个菌落进一步进行分析而得到证实,这个菌落命名为CD503株。按标准微生物学方法将大肠杆菌CD503株的单个菌落接种至含50μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)液体培养基中。LB培养基含有:
细菌胰胨 10g
细菌酵母提取物 5g
NaCl 10g
用5N氢氧化钠(NaOH)调节pH至7.0。
溶液终体积调至1升。
121℃下高压灭菌20分钟。
将该培养物于35℃下培养过夜。第二天上午,以10,000rpm于4℃下离心5分钟收集细菌细胞。如Denoya等人所述(Microbios Lett.,29:87,1985),采用经过修改的Birnboim和Doly的方法(Nucleic AcidsRes.,7:1513,1979),由新收集的大肠杆菌CD503细胞分离质粒载体。最后把分离出的质粒DNA溶解于DNA缓冲液中(10mM Tris-HCl,4mM NaCl,0.1mM EDTA;pH7.5),达到每10μl缓冲液约1μgpCD503的浓度。用限制酶EcoRI和PstI进行验证性的限制分析表明,正如所预计的,pCD503携有0.25kb DNA***片段。
实施例4
放射标记的DNA和RNA探针的制备
A.均匀标记的双链DNA探针的制备
用缺刻转译法制备双链DNA探针(该技术的一般性描述见Maniatis等人,1989)。首先进行适当的限制性消化并基本如实施例1所述进行电洗脱纯化,制得携有目标顺序的特异DNA片段。每种情况下都是用购自NEN-Dupont的[α-32P]dCTP([α-32P]脱氧胞苷5’-三磷酸四(三乙铵)盐和购自BRL Life Technologies,Inc.的BRL缺刻转译***,按照供货商提供的说明书标记约1μg DNA。在50μl的体积中进行一个典型的反应。加入5μl终止缓冲液(如BRI推荐的方法中所述)后,利用Stratagene按钮柱(push column),按照供货商提供的说明书,使标记的DNA与未掺入的核苷酸分离。按照这些方法一般得到比活大大高于108cpm/μg的32P标记的DNA。
B.标记的单链RNA探针的制备
利用Riboprobe Gemini转录***(Promega),用体外转录法制备32P-标记的RNA探针。用标准方法将纯化的目标DNA片段克隆到转录载体pGEM-3Z中。用于体外转录反应的模板质粒DNA的制备是如实施例3所述进行的,但包括一个聚乙二醇(PEG)沉淀步骤,以选择性地除去可能污染这些制备物的小核苷酸。该乙二醇沉淀步骤如下:乙醇沉淀步骤后,将沉淀物重新悬浮于520μl水中。然后加入100μl 5M NaCl和620μl 13%PEG(分子量为6000-8000)。混合后,将试管置于冰上保温1小时,于4℃下以10000XG沉降DNA 15分钟。沉淀物用500μl 80%冷乙醇洗一次,并象通常那样重新悬浮。取约1μg模板质粒DNA,用Sac I或Hind III限制酶使其线性化,随后分别用SP6或T7噬菌体DNA依赖性RNA聚合酶进行体外转录。该反应中使用购自NEN-Dupont的[α-32P]胞苷5’-三磷酸四(三乙铵)盐(CTP)。采用供货商所推荐的反应条件。保温后,反应混合物按标准程序用1单位RQ1-DNA酶(Promega)处理使DNA模板降解,用苯酚-氯仿萃取两次,然后用乙醇沉淀。沉淀物干燥后重新悬浮于20μl无RNA酶的水(Promega)中。取一小份标记的RNA转录本,如Denoya等人所述(J.Bacteriol.,169:3857-3860,1987)进行聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶电泳分析。在这里所述的条件下,一般得到标记的全长转录本。
实施例5
用Southern杂交法分析阿佛曼链霉菌基因组DNA
取约10μg纯化的阿佛曼链霉菌基因组DNA,在37℃下用2单位限制酶BamHI至少消化2小时。消化结束后,通过1%琼脂糖凝胶电泳分离各DNA片段(见实施例1A),并利用毛细管转移法(Southern,E.M.,J.Mol.Biol.,98:503,1975)过夜转移到尼龙膜上(孔径为0.45μm)(Schleicher and Schuell Nytran膜)。第二天,将尼龙膜包在塑料包装纸中,使每块膜的DNA一侧对紫外辐射源(302nm)曝光,使DNA固定在膜上。按照Maniatis等人(1989)所述的程序,进行放射标记的RNA或DNA探针与固定在尼龙膜上的DNA的杂交。预杂交和杂交都在42℃下进行。杂交溶液含有:6×SSC(1X:0.15M氯化钠(NaCl)、15mM柠檬酸钠,pH7.0)、10×Denhardt试剂[1x:0.02%菲科尔、0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.02%牛血清清蛋白]、1%SDS(十二烷基硫酸钠)、100μg/ml变性鲑精DNA片段、100μg/ml大肠杆菌tRNA、50%甲酰胺(Fluka)。过夜杂交后,如下洗涤膜:室温下用1×SSC、0.1%SDS洗两次,每次洗15分;42℃下用0.1×SSC、0.1%SDS洗两次,每次洗15分钟。在有些实验中,杂交在无甲酰胺存在下在65℃下进行,并用SSPE(1x:0.18M NaCl,10mM磷酸钠(NaPO4),pH7.7,1mM EDTA)代替SSC。最后使膜对X光片曝光得到放射自显影。
实施例6
将0.25kb CD503阿佛曼链霉菌基因组片段克隆到噬菌体M13中并进行DNA顺序测定
将0.25kb CD503阿佛曼链霉菌DNA片段克隆到噬菌体M13mp18和M13mp19中,以制备单链重组DNA,该DNA将在Sanger双脱氧测序法(Sanger等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,74:5463-5467,1977)中作为模板使用。取约2μg按上述微量制备法制备的质粒pCD503,用限制酶EcoRI和Pst I消化,释放出0.25kb阿佛曼链霉菌基因组***片段。以前的限制分析表明,仅用EcoRI或仅用Pst I消化的pCD503是线性的。这一分析证实了0.25kb***片段既不含EcoR I识别位点,也不含Pst I识别位点。消化混合物在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳,电洗脱出0.25kb片段,并如上所述进行沉淀。此外,取纯化的双链复制型(RF)M13mp18和M13mp19DNA各约1μg,用EcoR I和Pst I进行双消化,用小牛小肠碱性磷酸酶(CLAP)(购自PromegaCorp.,Madison,WI)脱磷酸化,最后如上所述与0.25kb DNA片段连接。纯化的RF M13克隆载体购自New England Biolabs。用连接混合物转染感受态大肠杆菌JM109细胞。如文献所述(Maniatis等人,198),选择来自mp18转染的单个白色噬斑和来自mp19转染的单个白色噬斑,进行噬菌体培养并制备单链DNA。利用M13特异性40测序引物(New England Biolabs,目录号1212)、[35S]脱氨腺苷5’-[α-硫代]三磷酸(NEN-Dupont)和TaqTrack测序试剂盒(Promega),按照供货商(Promega)提供的说明书,对每个单链DNA模板进行DNA顺序测定。pCD503阿佛曼链霉菌基因组片段的DNA顺序测定数据示于图4。
实施例7
完整
bkd阿佛曼链霉菌基因簇的克隆及染色体图谱的建立
用BamHI和EcoRI限制酶对约5μg纯化的pCD503进行双限制消化,在1.2%琼脂糖凝胶中电泳分离DNA片段,用电洗脱法回收携有特异于阿佛曼链霉菌
bkd E1α基因的顺序的约0.25kb长DNA片段,并基本如前所述用缺刻转译法进行标记。然后用[32P]标记的DNA片段作探针筛选阿佛曼链霉菌基因组粘粒文库。基因组文库一般制备方法的详细叙述见于Maniatis等,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual。链霉菌染色体文库制备的完整叙述见于Hopwood等,1985,Genetic Manipulation of
Streptomyces-A Laboratory Manual。粘粒载体的描述见于1993年4月16日提交的Denoya CD.的美国专利申请08/048,719“用于链霉菌基因组DNA克隆的粘粒载体”。对2200多个重组文库克隆进行筛选后,鉴定出4个克隆。在氨苄青霉素选择压下在LB培养基中培养4个杂交克隆(记为大肠杆菌克隆CD518、CD519、CD520和CD521)。如上所述由每个培养物制备质粒,限制分析和Southern印迹杂交分析表明,这4个克隆彼此相关,具有重叠的染色体区。按标准程序得到示于图3的阿佛曼链霉菌基因组限制图谱,该图谱覆盖了包括CD503顺序在内的整个染色体区。
实施例8
产生成套缺失突变体以对携有
bkd基因簇的阿佛曼链霉菌染色体区进行定位DNA顺序测定
按照基本上与Henikoff,S.所述相似的程序(Methods Enzymol.,155:156,1987),用核酸外切酶III产生在阿佛曼链霉菌
bkd目标DNA的一端或另一端累进缺少核苷酸的成套缺失突变体。为产生单向缺失突变体,每种重组噬菌体M13复制型DNA的双链DNA都用两种限制酶来消化,这两种限制酶都在目标DNA的一端和引物结合位点之间有切割位点。在靠目标顺序较近处切割的限制酶产生一个平末端或凹进的3’端,另一种酶则产生一个伸出的3’端。核酸外切酶III催化5’单核苷酸从双链DNA凹进的或平整的3’-羟基末端的逐步脱除。然而,伸出的3’端对酶活性完全具有抗性。所以,所得的线性DNA只有一端对核酸外切酶III敏感,因此消化过程从切割位点向目标DNA顺序单向进行。
下面将作为一个实例来描述pCD565成套缺失的制备。质粒pCD565是一个携有1.15kb Sal I片段的M13mp 19RF衍生物,该片段含有部分E1 α阿佛曼链霉菌
bkd开放读码。如Maniatis等人(1989)所述,通过在氯化铯和溴乙锭梯度中平衡离心来纯化质粒pCD565。核酸外切酶III能够由单链缺刻启动消化,所以重要的是使用松环分子含量不到10%的制备物。取约10μg质粒pCD565(见“发明详述”部分),在37℃下用限制酶Sac I和Xba I双消化4小时,然后进行苯酚-氯仿和***提取,并如前所述进行乙醇沉淀。将沉淀物重新悬浮于60μ1核酸外切酶III反应缓冲液中(10×核酸外切酶III缓冲液:0.66MTris-HCl,pH8.0,66mM氯化镁(MgCl2))。然后在300单位核酸外切酶III(Ambion Inc.)存在下将DNA溶液于37℃下保温,以30秒的间隔取2.5μl等份试样。然后使样品与核酸酶S1一起保温,用琼脂糖凝胶电泳法分析每个样品的等份试样。合并含有所需大小的DNA片段的样品,用DNA聚合酶I的Klenow片段修复DNA,连接过夜,并转染到感受态大肠杆菌JM109细胞中。利用EcoR I/Hind III限制消化和琼脂糖凝胶电泳分析所回收的克隆中***片段的大小。选择以下5个克隆进行顺序测定:565-D19(11kb)、565-D7(0.88kb)、565-d24(0.77kb)、565-D1(0.51kb)和565-D16(0.36kb)。由每个克隆制备单链DNA,并如上所述进行顺序测定。
实施例9
准备用于在大肠杆菌中表达阿佛曼链霉菌
bkd基因的质粒pCD670、pCD666、pCD736和pCD685的构建
基本上如S.Tabor所述(Current Protocols in Molecular Biology,pp.16.2.1-16.2.11,1990,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NewYork),用T7 RNA聚合酶/启动子双功能质粒***实现阿佛曼链霉菌bkd基因在大肠杆菌中的表达。
A.携有阿佛曼链霉菌E1α
bkd开放读码的pCD670的构建
利用以PCR为基础的方法,在阿佛曼链霉菌
bkd基因中引入一个跨过ATG起始密码子的Nde I限制位点。PCR模板为质粒pCD528,该质粒是携有7kb阿佛曼链霉菌基因组***片段的pGEM-3Z衍生物,所述***片段含有E1α开放读码的氨基端一半。在PCR反应中用两个寡核苷酸作引物(见图6):
1.左向通用(载体)引物31-PCR-BP(5’-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3’),该引物向下游方向确定pGEM-3Z MCS的Hind III位点的图谱(91-114位)。该引物的5’端有两个A和两个限制位点(BamHI和Pst I),有利于PCR产物的克隆。
2.诱变引物55-PCR(5’-AAGAGATCTCATATGACGGTCATGGAGCAGCGG-3’)。该引物的5’端有两个A、一个G和两个限制位点(Bgl II和Nde I)。Nde I位点与E1α开放读码的ATG起始密码子重叠。
如上所述进行聚合酶链反应。反应产物用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳分析。电洗脱出经PCR扩增的正确大小(约1.1kb长)的DNA片段,用限制酶Nde I和BamHI消化,再亚克隆到Nde I/BamHI线性化的质粒pT7-7中,经连接并转化到大肠杆菌DH5-α细胞中后得到质粒pCD663。取约1μg质粒pCD663(用质粒微量制备法由大肠杆菌CD663株制备),用BamHI线性化,脱磷酸化,最后在通过用BamHI消化质粒pCD550而分离出的约0.5μg经电洗脱纯化的11kbBamHI片段存在下进行连接,得到质粒pCD670。通过确定存在于***片段中的Sal I位点的图谱,确定后一构建体中1.1kb BamHI片段的正确取向。最后,在携有质粒pGP1-2(含有T7 RNA聚合酶基因的质粒)的大肠杆菌C600株中引入质粒pCD670(见Tabor,1990)。选择一个转化体供进一步处理,并将该转化体记为CD676株。
B.携有阿佛曼链霉菌E1β
bkd开放读码的pCD666的构建
利用以PCR为基础的方法在阿佛曼链霉菌
bkd E1β基因中引入跨过ATG起始密码子的Nde I限制位点。PCR模板为质粒pCD574,它是携有4.5kb阿佛曼链霉菌基因组***片段的pGIEM-3Z衍生物,所述***片段含有E1 β开放读码。在PCR反应中用两个寡核苷酸作引物(也见图6):
1.左向通用(载体)引物30-PCR-BP:(5’-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3’),该引物向上游方向确定pGEM-3Z MCS的EcoRI位点的图谱(2689-2712位)。在该引物的5’端有两个A和两个限制位点(BamHI和Pst I),有利于PCR产物的克隆。
2.右向诱变引物56-PCR:(5’-AAGA GATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3’),该引物的5’端有两个A、一个G和两个限制位点(Bgl II和Nde I)。Nde I位点与E1β开放读码的ATG起始密码子重叠。
如上所述进行聚合酶链反应。用0.8%琼脂糖凝胶对反应产物进行电泳分析。电洗脱出经PCR扩增的正确大小(约1.9kb长)的DNA片段,用限制酶NdeI和EcoRI消化,并亚克隆到用NdeI/EcoRI线性化的质粒pT7-7中,经连接并转化到大肠杆菌DH5-α细胞中后得到质粒pCD666。最后,将质粒pCD666引入携有质粒pGP1-2(含有T7RNA聚合酶基因的质粒)的大肠杆菌C600株中(见Tabor,1990)。选择一个转化体供进一步处理,并将该转化体记为CD673株。
C.携有阿佛曼链霉菌E1α和E1β
bkd开放读码的pCD736的构建
通过部分BamHI消化使约2μg质粒pCD670线性化。为获得线性形式的质粒pCD670,在下列时间点取BamHI消化混合物的等份试样:1、3、5、10和20分钟。各等分试样在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳。用电洗脱法回收线性形式(约4.3kb长),并用CIAP脱磷酸化(如上所述)。然后使脱磷酸化线性形式质粒pCD670的一半与从质粒pCD577中分离出的0.8kb BamHI/BglII片段连接。用连接混合物转化感受态大肠杆菌DH5-α细胞。回收到10个克隆,并对用微量制备法制得的质粒DNA进行限制分析。有一个克隆含有正确组装的质粒pCD736,记为CD736株。最后,将质粒pCD736引入携有质粒pGP1-2的大肠杆菌C600株中。选择一个转化体供进一步处理,该转化体记为CD737。另一个克隆记为CD705株,它含有质粒pCD705,该质粒携有错误取向的0.8kb BamHI/Bgl II片段。在表达实验中用构建体pCD705作为阴性对照。
D.携有阿佛曼链霉菌
bkd基因簇的pCD685的构建
将如上所述通过用限制酶BamHI部分消化而得到的脱磷酸化线性形式质粒pCD670的剩余一半,与从质粒pCD577中分离出的7kbBamHI片段连接。用连接混合物转化感受态大肠杆菌DH5-α细胞。回收到许多克隆,选择其中16个进行进一步的分析。提取质粒DNA并用限制分析法进行分析。有一个克隆含有正确组装的质粒(pCD685),该克隆记为CD685株。最后,将质粒pCD685引入携有质粒pGP1-2的大肠杆菌C600株。选择一个转化体供进一步处理,该转化体记为CD687株。
实施例10
利用T7双功能质粒***使阿佛曼链霉菌
bkd基因在大肠杆菌中表达
含有不同pT7-7构建体的大肠杆菌C600(pGP-1)衍生物(CD676、CD673、CD737和CD687株),于30℃下在5ml含有卡那霉素(60μg/ml)和氨苄青霉素(60μg/ml)的LB培养基中培养过夜。然后将该过夜培养物以1∶40(0.25∶10.00ml)稀释到装有新鲜LB/氨苄青霉毒/卡那霉素培养基的培养管(25×150mm)中,于30℃下振荡通气培养至测得的光密度(OD590)为约0.4。将温度提高到42℃30分钟以诱导T7 RNA聚合酶基因,这又诱导了处于T7启动子控制下的基因(如S.Tabor,1990所述)。最后,将温度降至37℃,将细胞再振荡培养90分钟。未诱导的对照培养物一直保持在30℃。如C.D.Denoya等人所述(J.Bacteriol.,168:1133-1141,1986),用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质。如实施例11所述分析酶活性。
实施例11
重组大肠杆菌菌株粗提液中E1阿佛曼链霉菌BCKDH活性的测定
A.细胞溶解液的制备
离心(5000rpm,3000xg,5分钟,使用于4℃下制冷的SorvallSS-34转子)收集细胞(得自8ml培养物),并将细胞重新悬浮于5ml“裂解缓冲液”中(0.05M磷酸钾缓冲液,pH7.0,含有3%Triton X-100、15%甘油、3mM二硫苏糖醇、1mg/ml火鸡蛋清胰蛋白酶抑制剂、5mM EDTA和0.04mM TPP(焦磷酸硫胺素))。将重新悬浮的细胞转移到法式压榨器中,在5000磅/英寸2下一次通过使细胞破碎。然后将一份1.5ml的压榨液转移到一个小离心管中,并于14000rpm离心30秒使之澄清。每次酶测定使用100μl上清液等份试样。利用Bio-Rad蛋白测定仪(Bio-Rad Laboratories,Richmond,California)测定蛋白浓度,该测定仪是以Bradford染料结合法为基础的(Bradford,M.,Anal.Biochem.,72:248,1976)。
B.阿佛曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)复合体E1组分的测定
用前人所述的经过修改的放射化学测定法测定BCKDH E1活性(Chuang,D.T.,Methods Enzymol.,166:146-154,1988;Hafner,E.W.等,J.Antibiotics,44:349,1991)。在15ml玻璃闪烁瓶底部加入:0.148ml0.25M磷酸钾缓冲液,pH6.5;0.002ml 0.1M乙二胺四乙酸(EDTA,二钠盐);0.004ml 0.1M MgCl2;0.02ml 3.7mM焦磷酸硫胺素(TPP);0.02ml 37mM NaAsO2;0.01ml 37mM 2,6-二氯苯酚靛酚(钠盐,SigmaD-1878);0.008ml α-[1-14C]酮异己酸贮液(如下文所述制备);0.058ml水;0.1ml澄清的无细胞提取液。瓶口立刻用已浸有Solvable(一种购自NEN-Dupont的组织和凝胶增溶剂)的Whatman 4CHR滤纸(Whatman目录号3004614)盖上。然后在瓶上牢固地盖上一个塑料盖,塑料盖和瓶的上半部都用parafilm包上,轻微振荡下于30℃保温2小时。保温过后,将滤纸移入装有4ml“Ready Safe”(Beckman)闪烁液的7ml玻璃闪烁瓶中测定放射性。α-[1-14C]酮异己酸贮液的制备方法是:混合5.6μl 20mMα-酮异己酸(钠盐,Sigma K-0629)、50μl α-[1-14C]酮异己酸(55mCi/mmol,50μCi/ml,Amersham)和足量的水,使终体积达到1ml。如下表1所示,支链α-酮酸脱氢酶E1组分的比活是每毫克蛋白质每分钟释出的二氧化碳皮摩尔数。
表1
重组大肠杆菌细胞粗提液中的E1阿佛曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶活性
构建体 质粒 菌株 诱导 E1 BCKDH
比活1,2
无***片段 pT7-7 CD677 + 0.9
E1-a pCD670 CD676 - 0.6
+ 0.8
E1-b pCD666 CD673 - 0.5
+ 0.7
E1-[a+b] pCD736 CD737 - 2.0
+ 13.7
E1[a+b]3 pCD705 CD705 - 0.9
+ 0.5
E1-[a+b]-E2-E3 pCD685 CD687 - 2.9
+ 6.0
1支链α-酮酸脱氢酶E1组分的比活是每毫克蛋白每分钟释出的CO2的皮摩尔数。
2结果是二次平行测定的平均值。
3该构建体携有错误取向的E1β开放读码的C末端部分,该构建体用作阴性对照。
顺序描述
1号顺序表示编码阿佛曼链霉菌BCKDH的E1α亚基的DNA顺序。该顺序也作为碱基403-1548示于图4中。
2号顺序表示编码阿佛曼链霉菌BCKDH的E1β亚基的DNA顺序。该顺序也作为碱基1622-2626示于图4中。
3号顺序表示起始编码阿佛曼链霉菌BCKDH E2亚基氨基末端区的开放读码的DNA顺序。该顺序也作为碱基2626-2727示于图4中。
4号顺序表示pCD539的碱基3-251的DNA顺序。这是编码阿佛曼链霉菌BCKDH E2亚基的基因的一个部分内部顺序。该顺序也示于图5中。
5号顺序表示2728碱基对的阿佛曼链霉菌基因组DNA片段,该片段示于图4中,它含有阿佛曼链霉菌BCKDH E1α、E1β和E2(部分)亚基的开放读码。
6号顺序表示阿佛曼链霉菌BCKDH E1α亚基的氨基酸顺序。该氨基酸顺序由1号顺序的DNA顺序编码。
7号顺序表示阿佛曼链霉菌BCKDH E1β亚基的氨基酸顺序。该氨基酸顺序由2号顺序的DNA顺序编码。
8号顺序表示阿佛曼链霉菌BCKDH E2亚基的氨基末端部分的氨基酸顺序。该氨基酸顺序由3号顺序的DNA顺序编码。
9号顺序表示由pCD539的碱基3-251的DNA顺序(4号顺序)编码的氨基酸顺序。该氨基酸顺序是阿佛曼链霉菌BCKDH的E2亚基的一个内部肽片段。
顺序表
(1)一般信息:
(i)申请人(除美国外的所有指定国):
(A)名称:辉瑞有限公司
(B)街区:235 East 42nd Street,20th Floor
(C)城市:New York
(D)州:New York
(E)国家:美国
(F)邮政编码10017-5755
(ii)申请人(只限于美国):
(A)CLAUDIO D.DENOYA
(B)街区:80 Spyglass Circle
(C)城市:Groton
(D)州:Connecticut
(E)国家:美国
(F)邮政编码:06340
(iii)发明名称:编码阿佛曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体的基因
(iv)通信地址
(A)收信人:Peter C.Richardson
(B)街区:Pfizer Inc.,235 East 42nd Street,20th Floor
(C)城市:New York
(D)州:New York
(E)国家:美国
(F)邮政编码:10017-5755
(V)本申请数据:
(A)申请号:08/100,518
(B)提交日:1993年7月30日
(C)分类:
(vi)在先申请资料:
(A)申请号:US08/100,518
(B)提交日:1993年7月30日
(vii)代理人信息:
(A)姓名:Sheyka,Robert F.
(B)登记号:31,304
(C)案号:PC8346
(viii)电讯信息:
(A)电话:(212)573-1189
(B)传真:(212)573-1939
(C)电传:无
(ix)顺序数:9
(x)计算机可读形式:
(A)介质类型:软盘
(B)计算机:IBM PC兼容机
(C)操作***:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:PatentIn Release#1.0,Version#1.25
(2)1号顺序信息:
(i)顺序特征:
(A)长度:1146碱基对
(B)类型:核酸
(C)链数:双链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(iii)假设:无
(xi)顺序描述:1号顺序ATGACGGTCA TGGAGCAGCG GGGCGCTTAC CGGCCCACAC CGCCGCCCGC CTGGCAGCCC 60CGCACCGACC CCGCGCCACT GCTGCCCGAC GCGCTGCCCC ACCGCGTCCT GGGCACCGAG 120GCGGCCGCGG AGGCCGACCC GCTACTGCTG CGCCGCCTGT ACGCGGAGCT GGTGCGCGGC 180CGCCGCTACA ACACGCAGGC CACGGCTCTC ACCAAGCAGG GCCGGCTCGC CGTCTACCCG 240TCGAGCACGG GCCAGGAGGC CTGCGAGGTC GCCGCCGCGC TCGTGCTGGA GGAGCGCGAC 300TGGCTCTTCC CCAGCTACCG GGACACCCTC GCCGCCGTCG CCCGCGGCCT CGATCCCGTC 360CAGGCGCTCA CCCTCCTGCG CGGCGACTGG CACACCGGGT ACGACCCCCG TGAGCACCGC 420ATCGCGCCCC TGTGCACCCC TCTCGCGACC CAGCTCCCGC ACGCCGTCGG CCTCGCGCAC 480GCCGCCCGCC TCAAGGGCGA CGACGTGGTC GCGCTCGCCC TGGTCGGCGA CGGCGGCACC 540AGCGAGGGCG ACTTCCACGA GGCACTGAAC TTCGCCGCCG TCTGGCAGGC GCCGGTCGTC 600TTCCTCGTGC AGAACAACGG CTTCGCCATC TCCGTCCCGC TCGCCAAGCA GACCGCCGCC 660CCGTCGCTGG CCCACAAGGC CGTCGGCTAC GGGATGCCGGG CCGCCTGGT CGACGGCAAC 720GACGCGGCGG CCGTGCACGA GGTCCTCAGC GACGCCGTGG CCCACGCGCG CGCGGGAGGG 780GGGCCGACGC TCGTGGAGGC GGTGACCTAC CGCATCGACG CCCACACCAA CGCCGACGAC 840GCGACGCGCT ACCGGGGGGA CTCCGAGGTG GAGGCCTGGC GCGCGCACGA CCCGATCGCG 900CTCCTGGAGC ACGAGTTGAC CGAACGCGGG CTGCTCGACG AGGACGGCAT CCGGGCCGCC 960CGCGAGGACG CCGAGGCGAT GGCCGCGGAC CTGCGCGCAC GCATGAACCA GGATCCGGCC 1020CTGGACCCCA TGGACCTGTT CGCCCATGTG TATGCCGAGC CCACCCCCCA GCTGCGGGAG 1080CAGGAAGCCC AGTTGCGGGC CGAGCTGGCA GCGGAGGCCG ACGGGCCCCA AGGAGTCGGC 1140CGATGA 1146
(2)2号顺序信息:
(i)顺序特征:
(A)长度:1005碱基对
(B)类型:核酸
(C)链数:双链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)顺序描述:2号顺序ATGACCACCG TTGCCCTCAA GCCGGCCACC ATGGCGCAGG CACTCACACG CGCGTTGCGT 60GACGCCATGG CCGCCGACCC CGCCGTCCAC GTGATGGGCG AGGACGTCGG CACGCTCGGC 120GGGGTCTTCC GGGTCACCGA CGGGCTCGCC AAGGAGTTCG GCGAGGACCG CTGCACGGAC 180ACGCCGCTCG CCGAGGCAGG CATCCTCGGC ACGGCCGTCG GCATGGCGAT GTACGGGCTG 240CGGCCGGTCG TCGAGATGCA GTTCGACGCG TTCGCGTACC CGGCGTTCGA GCAGCTCATC 300AGCCATGTCG CGCGGGATGC GCAACGCACC CGCGGGGCGA TGCCGCTGCC GATCACCATC 360CGTGTCCCCT ACGGCGGCGG AATCGGCGGA GTCGAACACC ACAGCGACTC CTCCGAGGCG 420TACTACATGG CGACTCCGGG GCTCCATGTC GTCACGCCCG CCACGGTCGC CGACGCGTAC 480GGGCTGCTGC GCGCCGCCAT CGCCTCCGAC GACCCGGTCG TCTTCCTGGA GCCCAAGCGG 540CTGTACTGGT CGAAGGACTC CTGGAACCCG GACGAGCCGG GGACCGTTGA ACCGATAGGC 600CGCGCGGTGG TGCGGCGCTC GGGCCGGAGC GCCACGCTCA TCACGTACGG GCCTTCCCTG 660CCCGTCTGCC TGGAGGCGGC CGAGGCGGCC CGGGCCGAGG GCTGGGACCT CGAAGTCGTC 720GATCTGCGCT CCCTGGTGCC CTTCGACGAC GAGACGGTTG TGCGCGTCGG TGCGCGGACC 780GGACGCGCCG TCGTCGTGCA CGAGTCGGGT GGTTACGGCG GCCCGGGCGG GGAGATCGCC 840GCGGGCATCA CCGAGCGCTG CTTCCACCAT CTGGAGGCGC CGGTGCTGCG CGTCGCCGGG 900TTCGACATCC CGTATCCGCC GCCGATGCTG GAGCGCCATC ATCTGCCCGG TGTCGACCGG 960ATCCTGGACG CGGTGGGGCG GCTTCAGTGG GAGGCGGGGA GCTGA 1005
(2)3号顺序信息:
(i)顺序特征:
(A)长度:102碱基对
(B)类型:核酸
(C)链数:双链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)顺序描述:3号顺序ATGGCCCAGG TGCTCGAGTT CAAGCTCCCC GACCTCGGGG AGGGCCTGAC CGAGGCCGAG 60ATCGTCCGCT GGCTGGTGCA GGTCGGCGAC GTCGTGGCGA TC 102
(2)4号顺序信息:
(i)顺序特征:
(A)长度:249碱基对
(B)类型:核酸
(C)链数:双链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)顺序描:4号顺序ATCTCCCTCA TCGCGCTGCT CGCCAGGATC TGCACCGCCG CACTGGCCCG CTTCCCCGAG 60CTCAACTCCA CCGTCGACAT GGACGCCCGC GAGGTCGTAC GGCTCGACCA GGTGCACCTG 120GGCTTCGCCG CGCAGACCGA ACGGGGGCTC GTCGTCCCGG TCGTGCGGGA CGCGCACGCG 180CGGGACGCCG AGTCGCTCAG CGCCGAGTTC GCGCGGCTGA CCGAGGCCGC CCGGACCGGC 240ACCCTCACA 249
(2)5号顺序信息:
(i)顺序特征:
(A)长度:2728碱基对
(B)类型:核酸
(C)链数:双链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)顺序描述:5号顺序GTCGACGCGG GCTCCGAAAC CGCGGATCAC GCCGTCGTCG ATGAGCCGGT TGATTCGCGC 60GTAGGCATTG GCACGCGACA CGTGGGCGCG CTCGGCCACG GACCGTATCG AGGCGCGGCC 120GTCCGCCTGG AGCATCTGGA GGATGTCCTG ATCGATGGCG TCCAGCGGGC GGGCGGGCGG 180CAGGGGTACC CCGGGCTCCG CTCCCTCGGC CATTTGTTCA GGTGCCATGT CCTCCGGCCT 240CCTTACCATG GACGTAGTGC GTTCATTCCA GGCTGTGGAG AACCGTTTGT CCACAGCCTG 300ACGGTGCCTG TAGCCAAAAT GTGCCGACGA CCGAACAATC GGTAGGTGAG GCGCCTCACA 360CCCGTGGCGC GCCCAAAGCC GCTCCCACGA GGAGGTGCCG TCATGACGGT CATGGAGCAG 420CGGGGCGCTT ACCGGCCCAC ACCGCCGCCC GCCTGGCAGC CCCGCACCGA CCCCGCGCCA 480CTGCTGCCCG ACGCGCTGCC CCACCGCGTC CTGGGCACCG AGGCGGCCGC GGAGGCCGAC 540CCGCTACTGC TGCGCCGCCT GTACGCGGAG CTGGTGCGCG GCCGCCGCTA CAACACGCAG 600GCCACGGCTC TCACCAAGCA GGGCCGGCTC GCCGTCTACC CGTCGAGCAC GGGCCAGGAG 660GCCTGCGAGG TCGCCGCCGC GCTCGTGCTG GAGGAGCGCG ACTGGCTCTT CCCCAGCTAC 720CGGGACACCC TCGCCGCCGT CGCCCGCGGC CTCGATCCCG TCCAGGCGCT CACCCTCCTG 780CGCGGCGACT GGCACACCGG GTACGACCCC CGTGAGCACC GCATCGCGCC CCTGTGCACC 840CCTCTCGCGA CCCAGCTCCC GCACGCCGTC GGCCTCGCGC ACGCCGCCCG CCTCAAGGGC 900GACGACGTGG TCGCGCTCGC CCTGGTCGGC GACGGCGGCA CCAGCGAGGG CGACTTCCAC 960GAGGCACTGA ACTTCGCCGC CGTCTGGCAG GCGCCGGTCG TCTTCCTCGT GCAGAACAAC 1020GGCTTCGCCA TCTCCGTCCC GCTCGCCAAG CAGACCGCCG CCCCGTCGCT GGCCCACAAG 1080GCCGTCGGCT ACGGGATGCC GGGCCGCCTG GTCGACGGCA ACGACGCGGC GGCCGTGCAC 1140GAGGTCCTCA GCGACGCCGT GGCCCACGCG CGCGCGGCAG GGGGGCCGAC GCTCGTGGAG 1200GCGGTGACCT ACCGCATCGA CGCCCACACC AACGCCGACG ACGCGACGCG CTACCGGGGG 1260GACTCCGAGG TGGAGGCCTG GCGCGCGCAC GACCCGATCG CGCTCCTGGA GCACGAGTTG 1320ACCGAACGCG GGCTGCTCGA CGAGGACGGC ATCCGGGCCG CCCGCGAGGA CGCCGAGGCG 1380ATGGCCGCGG ACCTGCGCGC ACGCATGAAC CAGGATCCGG CCCTGGACCC CATGGACCTG 1440TTCGCCCATG TGTATGCCGA GCCCACCCCC CAGCTGCGGG AGCAGGAAGC CCAGTTGCGG 1500GCCGAGCTGG CAGCGGAGGC CGACGGGCCC CAAGGAGTCG GCCGATGAAG AGAGTTGACC 1560ATCGGGCCCC GAGAAGCGGG CCGATGACCT CCGTTGGCCT TTGGCCGGAA GGAGCCGGGC 1620GATGACCACC GTTGCCCTCA AGCCGGCCAC CATGGCGCAG GCACTCACAC GCGCGTTGCG 1680TGACGCCATG GCCGCCGACC CCGCCGTCCA CGTGATGGGC GAGGACGTCG GCACGCTCGG 1740CGGGGTCTTC CGGGTCACCG ACGGGCTCGC CAAGGAGTTC GGCGAGGACC GCTGCACGGA 1800CACGCCGCTC GCCGAGGCAG GCATCCTCGG CACGGCCGTC GGCATGGCGA TGTACGGGCT 1860GCGGCCGGTC GTCGAGATGC AGTTCGACGC GTTCGCGTAC CCGGCGTTCG AGCAGCTCAT 1920CAGCCATGTC GCGCGGGATG CGCAACGCAC CCGCGGGGCG ATGCCGCTGC CGATCACCAT 1980CCGTGTCCCC TACGGCGGCG GAATCGGCGG AGTCGAACAC CACAGCGACT CCTCCGAGGC 2040GTACTACATG GCGACTCCGG GGCTCCATGT CGTCACGCCC GCCACGGTCG CCGACGCGTA 2100CGGGCTGCTG CGCGCCGCCA TCGCCTCCGA CGACCCGGTC GTCTTCCTGG AGCCCAAGCG 2160GCTGTACTGG TCGAAGGACT CCTGGAACCC GGACGAGCCG GGGACCGTTG AACCGATAGG 2220CCGCGCGGTG GTGCGGCGCT CGGGCCGGAG CGCCACGCTC ATCACGTACG GGCCTTCCCT 2280GCCCGTCTGC CTGGAGGCGG CCGAGGCGGC CCGGGCCGAG GGCTGGGACC TCGAAGTCGT 2340CGATCTGCGC TCCCTGGTGC CCTTCGACGA CGAGACGGTT GTGCGCGTCG GTGCGCGGAC 2400CGGACGCGCC GTCGTCGTGC ACGAGTCGGG TGGTTACGGC GGCCCGGGCG GGGAGATCGC 2460CGCGGGCATC ACCGAGCGCT GCTTCCACCA TCTGGAGGCG CCGGTGCTGC GCGTCGCCGG 2520GTTCGACATC CCGTATCCGC CGCCGATGCT GGAGCGCCAT CATCTGCCCG GTGTCGACCG 2580 GATCCTGGAC GCGGTGGGGC GGCTTCAGTG GGAGGCGGGG AGCTGATGGC CCAGGTGCTC 2640-GAGTTCAAGC TCCCCGACCT CGGGGAGGGC CTGACCGAGG CCGAGATCGT CCGCTGGCTG 2700GTGCAGGTCG GCGACGTCGT GGCGATCG 2728
(2)6号顺序信息
(i)顺序特征:
(A)长度:381个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链数:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:肽
(xi)顺序描述:6号顺序Met Thr Val Met Glu Gln Arg Gly Ala Tyr Arg Pro Thr Pro Pro Pro1 5 10 15Ala Trp Gln Pro Arg Thr Asp Pro Ala Pro Leu Leu Pro Asp Ala Leu
20 25 30Pro His Arg Val Leu Gly Thr Glu Ala Ala Ala Glu Ala Asp Pro Leu
35 40 45Leu Leu Arg Arg Leu Tyr Ala Glu Leu Val Arg Gly Arg Arg Tyr Asn
50 55 60Thr Gln Ala Thr Ala Leu Thr Lys Gln Gly Arg Leu Ala Val Tyr Pro65 70 75 80Ser Ser Thr Gly Gln Glu Ala Cys Glu Val Ala Ala Ala Leu Val Leu
85 90 95Glu Glu Arg Asp Trp Leu Phe Pro Ser Tyr Arg Asp Thr Leu Ala Ala
100 105 110Val Ala Arg Gly Leu Asp Pro Val Gln Ala Leu Thr Leu Leu Arg Gly
115 120 125Asp Trp His Thr Gly Tyr Asp Pro Arg Glu His Arg Ile Ala Pro Leu130 135 140Cys Thr Pro Leu Ala Thr Gln Leu Pro His Ala Val Gly Leu Ala His145 150 155 160Ala Ala Arg Leu Lys Gly Asp Asp Val Val Ala Leu Ala Leu Val Gly
165 170 175Asp Gly Gly Thr Ser Glu Gly Asp Phe His Glu Ala Leu Asn Phe Ala
180 185 190Ala Val Trp Gln Ala Pro Val Val Phe Leu Val Gln Asn Asn Gly Phe
195 200 205Ala Ile Ser Val Pro Leu Ala Lys Gln Thr Ala Ala Pro Ser Leu Ala
210 215 220His Lys Ala Val Gly Tyr Gly Met Pro Gly Arg Leu Val Asp Gly Asn225 230 235 240Asp Ala Ala Ala Val His Glu Val Leu Ser Asp Ala Val Ala His Ala
245 250 255Arg Ala Gly Gly Gly Pro Thr Leu Val Glu Ala Val Thr Tyr Arg Ile
260 265 270Asp Ala His Thr Asn Ala Asp Asp Ala Thr Arg Tyr Arg Gly Asp Ser
275 280 285Glu Val Glu Ala Trp Arg Ala His Asp Pro Ile Ala Leu Leu Glu His
290 295 300Glu Leu Thr Glu Arg Gly Leu Leu Asp Glu Asp Gly Ile Arg Ala Ala305 310 315 320Arg Glu Asp Ala Glu Ala Met Ala Ala Asp Leu Arg Ala Arg Met Asn
325 330 335Gln Asp Pro Ala Leu Asp Pro Met Asp Leu Phe Ala His Val Tyr Ala
340 345 350Glu Pro Thr Pro Gln Leu Arg Glu Gln Glu Ala Gln Leu Arg Ala Glu
355 360 365Leu Ala Ala Glu Ala Asp Gly Pro Gln Gly Val Gly Arg
370 375 380
(2)7号顺序信息
(i)顺序特征:
(A)长度:334个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链数:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:肽
(xi)顺序描述:7号顺序Met Thr Thr Val Ala Leu Lys Pro Ala Thr Met Ala Gln Ala Leu Thr1 5 10 15Arg Ala Leu Arg Asp Ala Met Ala Ala Asp Pro Ala Val His Val Met
20 25 30Gly Glu Asp Val Gly Thr Leu Gly Gly Val Phe Arg Val Thr Asp Gly
35 40 45Leu Ala Lys Glu Phe Gly Glu Asp Arg Cys Thr Asp Thr Pro Leu Ala
50 55 60Glu Ala Gly Ile Leu Gly Thr Ala Val Gly Met Ala Met Tyr Gly Leu65 70 75 80Arg Pro Val Val Glu Met Gln Phe Asp Ala Phe Ala Tyr Pro Ala Phe
85 90 95Glu Gln Leu Ile Ser His Val Ala Arg Asp Ala Gln Arg Thr Arg Gly
100 105 110Ala Met Pro Leu Pro Ile Thr Ile Arg Val Pro Tyr Gly Gly Gly Ile
115 120 125Gly Gly Val Glu His His Ser Asp Ser Ser Glu Ala Tyr Tyr Met Ala
130 135 140Thr Pro Gly Leu His Val Val Thr Pro Ala Thr Val Ala Asp Ala Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Arg Ala Ala Ile Ala Ser Asp Asp Pro Val Val Phe Leu
165 170 175Glu Pro Lys Arg Leu Tyr Trp Ser Lys Asp Ser Trp Asn Pro Asp Glu
180 185 190Pro Gly Thr Val Glu Pro Ile Gly Arg Ala Val Val Arg Arg Ser Gly
195 200 205Arg Ser Ala Thr Leu Ile Thr Tyr Gly Pro Ser Leu Pro Val Cys Leu
210 215 220Glu Ala Ala Glu Ala Ala Arg Ala Glu Gly Trp Asp Leu Glu Val Val225 230 235 240Asp Leu Arg Ser Leu Val Pro Phe Asp Asp Glu Thr Val Val Arg Val
245 250 255Gly Ala Arg Thr Gly Arg Ala Val Val Val His Glu Ser Gly Gly Tyr
260 265 270Gly Gly Pro Gly Gly Glu Ile Ala Ala Gly Ile Thr Glu Arg Cys Phe
275 280 285His His Leu Glu Ala Pro Val Leu Arg Val Ala Gly Phe Asp Ile Pro290 295 300Tyr Pro Pro Pro Met Leu Glu Arg His His Leu Pro Gly Val Asp Arg305 310 315 320Ile Leu Asp Ala Val Gly Arg Leu Gln Trp Glu Ala Gly Ser
325 330
(2)8顺序信息
(i)顺序特征:
(A)长度:34个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链数:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:肽
(xi)顺序描述:8号顺序Met Ala Gln Val Leu Glu Phe Lys Leu Pro Asp Leu Gly Glu Gly Leu1 5 10 15Thr Glu Ala Glu Ile Val Arg Trp Leu Val Gln Val Gly Asp Val Val
20 25 30Ala Ile
(2)9号顺序信息
(i)顺序特征:
(A)长度:83个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链数:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:肽
(xi)顺序描述:9号顺序Ile Ser Leu Ile Ala Leu Leu Ala Arg Ile Cys Thr Ala Ala Leu Ala1 5 10 15Arg Phe Pro Glu Leu Asn Ser Thr Val Asp Met Asp Ala Arg Glu Val
20 25 30Val Arg Leu Asp Gln Val His Leu Gly Phe Ala Ala Gln Thr Glu Arg
35 40 45Gly Leu Val Val Pro Val Val Arg Asp Ala His Ala Arg Asp Ala Glu
50 55 60Ser Leu Ser Ala Glu Phe Ala Arg Leu Thr Glu Ala Ala Arg Thr Gly65 70 75 80Thr Leu Thr
Claims (12)
1.一种分离的DNA片段,该片段编码链霉菌属(
Streptomyces)微生物的支链α-酮酸脱氢酶复合体,所述DNA片段包含下列1号顺序、2号顺序、3号顺序、4号顺序或5号顺序的DNA顺序或其等位变异。
1号顺序ATGACGGTCA TGGAGCAGCG GGGCGCTTAC CGGCCCACAC CGCCGCCCGC CTGGCAGCCC 60CGCACCGACC CCGCGCCACT GCTGCCCGAC GCGCTGCCCC ACCGCGTCCT GGGCACCGAG 120GCGGCCGCGG AGGCCGACCC GCTACTGCTG CGCCGCCTGT ACGCGGAGCT GGTGCGCGGC 180CGCCGCTACA ACACGCAGGC CACGGCTCTC ACCAAGCAGG GCCGGCTCGC CGTCTACCCG 240TCGAGCACGG GCCAGGAGGC CTGCGAGGTC GCCGCCGCGC TCGTGCTGGA GGAGCGCGAC 300TGGCTCTTCC CCAGCTACCG GGACACCCTC GCCGCCGTCG CCCGCGGCCT CGATCCCGTC 360CAGGCGCTCA CCCTCCTGCG CGGCGACTGG CACACCGGGT ACGACCCCCG TGAGCACCGC 420ATCGCGCCCC TGTGCACCCC TCTCGCGACC CAGCTCCCGC ACGCCGTCGG CCTCGCGCAC 480GCCGCCCGCC TCAAGGGCGA CGACGTGGTC GCGCTCGCCC TGGTCGGCGA CGGCGGCACC 540AGCGAGGGCG ACTTCCACGA GGCACTGAAC TTCGCCGCCG TCTGGCAGGC GCCGGTCGTC 600TTCCTCGTGC AGAACAACGG CTTCGCCATC TCCGTCCCGC TCGCCAAGCA GACCGCCGCC 660CCGTCGCTGG CCCACAAGGC CGTCGGCTAC GGGATGCCGG GCCGCCTGGT CGACGGCAAC 720GACGCGGCGG CCGTGCACGA GGTCCTCAGC GACGCCGTGG CCCACGCGCG CGCGGGAGGG 780GGGCCGACGC TCGTGGAGGC GGTGACCTAC CGCATCGACG CCCACACCAA CGCCGACGAC 840GCGACGCGCT ACCGGGGGGA CTCCGAGGTG GAGGCCTGGC GCGCGCACGA CCCGATCGCG 900CTCCTGGAGC ACGAGTTGAC CGAACGCGGG CTGCTCGACG AGGACGGCAT CCGGGCCGCC 960CGCGAGGACG CCGAGGCGAT GGCCGCGGAC CTGCGCGCAC GCATGAACCA GGATCCGGCC 1020CTGGACCCCA TGGACCTGTT CGCCCATGTG TATGCCGAGC CCACCCCCCA GCTGCGGGAG 1080CAGGAAGCCC AGTTGCGGGC CGAGCTGGCA GCGGAGGCCG ACGGGCCCCA AGGAGTCGGC 1140CGATGA 1146
2号顺序ATGACCACCG TTGCCCTCAA GCCGGCCACC ATGGCGCAGG CACTCACACG CGCGTTGCGT 60GACGCCATGG CCGCCCACCC CGCCGTCCAC GTGATGGGCG AGGACGTCGG CACGCTCGGC 120GGGGTCTTCC GGGTCACCGA CGGGCTCGCC AAGGAGTTCG GCGAGGACCG CTGCACGGAC 180ACGCCGCTCG CCGAGGCAGG CATCCTCGGC ACGGCCGTCG GCATGGCGAT GTACGGGCTG 240CGGCCGGTCG TCGAGATGCA GTTCGACGCG TTCGCGTACC CGGCGTTCGA GCAGCTCATC 300AGCCATGTCG CGCGGGATGC GCAACGCACC CGCGGGGCGA TGCCGCTGCC GATCACCATC 360CGTGTCCCCT ACGGCGGCGG AATCGGCGGA GTCGAACACC ACAGCGACTC CTCCGAGGCG 420TACTACATGG CGACTCCGGG GCTCCATGTC GTCACGCCCG CCACGGTCGC CGACGCGTAC 480GGGCTGCTGC GCGCCGCCAT CGCCTCCGAC GACCCGGTCG TCTTCCTGGA GCCCAAGCGG 540CTGTACTGGT CGAAGGACTC CTGGAACCCG GACGAGCCGG GGACCGTTGA ACCGATAGGC 600CGCGCGGTGG TGCGGCGCTC GGGCCGGAGC GCCACGCTCA TCACGTACGG GCCTTCCCTG 660CCCGTCTGCC TGGAGGCGGC CGAGGCGGCC CGGGCCGAGG GCTGGGACCT CGAAGTCGTC 720GATCTGCGCT CCCTGGTGCC CTTCGACGAC GAGACGGTTG TGCGCGTCGG TGCGCGGACC 780GGACGCGCCG TCGTCGTGCA CGAGTCGGGT GGTTACGGCG GCCCGGGCGG GGAGATCGCC 840GCGGGCATCA CCGAGCGCTG CTTCCACCAT CTGGAGGCGC CGGTGCTGCG CGTCGCCGGG 900TTCGACATCC CGTATCCGCC GCCGATGCTG GAGCGCCATC ATCTGCCCGG TGTCGACCGG 960ATCCTGGACG CGGTGGGGCG GCTTCAGTGG GAGGCGGGGA GCTGA 1005
3号顺序ATGGCCCAGG TGCTCGAGTT CAAGCTCCCC GACCTCGGGG AGGGCCTGAC CGAGGCCGAG 60ATCGTCCGCT GGCTGGTGCA GGTCGGCGAC GTCGTGGCGA TC 102
4号顺序ATCTCCCTCA TCGCGCTGCT CGCCAGGATC TGCACCGCCG CACTGGCCCG CTTCCCCGAG 60CTCAACTCCA CCGTCGACAT GGACGCCCGC GAGGTCGTAC GGCTCGACCA GGTGCACCTG 120GGCTTCGCCG CGCAGACCGA ACGGGGGCTC GTCGTCCCGG TCGTGCGGGA CGCGCACGCG 180CGGGACGCCG AGTCGCTCAG CGCCGAGTTC GCGCGGCTGA CCGAGGCCGC CCGGACCGGC 240ACCCTCACA 249
5号顺序GTCGACGCGG GCTCCGAAAC CGCGGATCAC GCCGTCGTCG ATGAGCCGGT TGATTCGCGC 60GTAGGCATTG GCACGCGACA CGTGGGCGCG CTCGGCCACG GACCGTATCG AGGCGCGGCC 120GTCCGCCTGG AGCATCTGGA GGATGTCCTG ATCGATGGCG TCCAGCGGGC GGGCGGGCGG 180CAGGGGTACC CCGGGCTCCG CTCCCTCGGC CATTTGTTCA GGTGCCATGT CCTCCGGCCT 240CCTTACCATG GACGTAGTGC GTTCATTCCA GGCTGTGGAG AACCGTTTGT CCACAGCCTG 300ACGGTGCCTG TAGCCAAAAT GTGCCGACGA CCGAACAATC GGTAGGTGAG GCGCCTCACA 360CCCGTGGCGC GCCCAAAGCC GCTCCCACGA GGAGGTGCCG TCATGACGGT CATGGAGCAG 420CGGGGCGCTT ACCGGCCCAC ACCGCCGCCC GCCTGGCAGC CCCGCACCGA CCCCGCGCCA 480CTGCTGCCCG ACGCGCTGCC CCACCGCGTC CTGGGCACCG AGGCGGCCGC GGAGGCCGAC 540CCGCTACTGC TGCGCCGCCT GTACGCGGAG CTGGTGCGCG GCCGCCGCTA CAACACGCAG 600GCCACGGCTC TCACCAAGCA GGGCCGGCTC GCCGTCTACC CGTCGAGCAC GGGCCAGGAG 660GCCTGCGAGG TCGCCGCCGC GCTCGTGCTG GAGGAGCGCG ACTGGCTCTT CCCCAGCTAC 720CGGGACACCC TCGCCGCCGT CGCCCGCGGC CTCGATCCCG TCCAGGCGCT CACCCTCCTG 780CGCGGCGACT GGCACACCGG GTACGACCCC CGTGAGCACC GCATCGCGCC CCTGTGCACC 840CCTCTCGCGA CCCAGCTCCC GCACGCCGTC GGCCTCGCGC ACGCCGCCCG CCTCAAGGGC 900GACGACGTGG TCGCGCTCGC CCTGGTCGGC GACGGCGGCA CCAGCGAGGG CGACTTCCAC 960GAGGCACTGA ACTTCGCCGC CGTCTGGCAG GCGCCGGTCG TCTTCCTCGT GCAGAACAAC 1020GGCTTCGCCA TCTCCGTCCC GCTCGCCAAG CAGACCGCCG CCCCGTCGCT GGCCCACAAG 1080GCCGTCGGCT ACGGGATGCC GGGCCGCCTG GTCGACGGCA ACGACGCGGC GGCCGTGCAC 1140GAGGTCCTCA GCGACGCCGT GGCCCACGCG CGCGCGGGAG GGGGGCCGAC GCTCGTGGAG 1200GCGGTGACCT ACCGCATCGA CGCCCACACC AACGCCGACG ACGCGACGCG CTACCGGGGG 1260GACTCCGAGG TGGAGGCCTG GCGCGCGCAC GACCCGATCG CGCTCCTGGA GCACGAGTTG 1320ACCGAACGCG GGCTGCTCGA CGAGGACGGC ATCCGGGCCG CCCGCGAGGA CGCCGAGGCG 1380ATGGCCGCGG ACCTGCGCGC ACGCATGAAC CAGGATCCGG CCCTGGACCC CATGGACCTG 1440TTCGCCCATG TGTATGCCGA GCCCACCCCC CAGCTGCGGG AGCAGGAAGC CCAGTTGCGG 1500GCCGAGCTGG CAGCGGAGGC CGACGGGCCC CAAGGAGTCG GCCGATGAAG AGAGTTGACC 1560ATCGGGCCCC GAGAAGCGGG CCGATGACCT CCGTTGGCCT TTGGCCGGAA GGAGCCGGGC 1620GATGACCACC GTTGCCCTCA AGCCGGCCAC CATGGCGCAG GCACTCACAC GCGCGTTGCG 1680TGACGCCATG GCCGCCGACC CCGCCGTCCA CGTGATGGGC GAGGACGTCG GCACGCTCGG 1740CGGGGTCTTC CGGGTCACCG ACGGGCTCGC CAAGGAGTTC GGCGAGGACC GCTGCACGGA 1800CACGCCGCTC GCCGAGGCAG GCATCCTCGG CACGGCCGTC GGCATGGCGA TGTACGGGCT 1860GCGGCCGGTC GTCGAGATGC AGTTCGACGC GTTCGCGTAC CCGGCGTTCG AGCAGCTCAT 1920CAGCCATGTC GCGCGGGATG CGCAACGCAC CCGCGGGGCG ATGCCGCTGC CGATCACCAT 1980CCGTGTCCCC TACGGCGGCG GAATCGGCGG AGTCGAACAC CACAGCGACT CCTCCGAGGC 2040GTACTACATG GCGACTCCGG GGCTCCATGT CGTCACGCCC GCCACGGTCG CCGACGCGTA 2100CGGGCTGCTG CGCGCCGCCA TCGCCTCCGA CGACCCGGTC GTCTTCCTGG AGCCCAAGCG 2160GCTGTACTGG TCGAAGGACT CCTGGAACCC GGACGAGCCG GGGACCGTTG AACCGATAGG 2220CCGCGCGGTG GTGCGGCGCT CGGGCCGGAG CGCCACGCTC ATCACGTACG GGCCTTCCCT 2280GCCCGTCTGC CTGGAGGCGG CCGAGGCGGC CCGGGCCGAG GGCTGGGACC TCGAAGTCGT 2340CGATCTGCGC TCCCTGGTGC CCTTCGACGA CGAGACGGTT GTGCGCGTCG GTGCGCGGAC 2400CGGACGCGCC GTCGTCGTGC ACGAGTCGGG TGGTTACGGC GGCCCGGGCG GGGAGATCGC 2460CGCGGGCATC ACCGAGCGCT GCTTCCACCA TCTGGAGGCG CCGGTGCTGC GCGTCGCCGG 2520GTTCGACATC CCGTATCCGC CGCCGATGCT GGAGCGCCAT CATCTGCCCG GTGTCGACCG 2580GATCCTGGAC GCGGTGGGGC GGCTTCAGTG GGAGGCGGGG AGCTGATGGC CCAGGTGCTC 2640GAGTTCAAGC TCCCCGACCT CGGGGAGGGC CTGACCGAGG CCGAGATCGT CCGCTGGCTG 2700GTGCAGGTCG GCGACGTCGT GGCGATCG 2728
2.权利要求1的分离的DNA片段,该片段编码阿佛曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体。
3.权利要求1的分离的DNA片段,该片段进一步包含调控所述支链α-酮酸脱氢酶复合体表达的DNA区。
4.权利要求2的分离的DNA片段,该片段进一步包含调控所述支链α-酮酸脱氢酶复合体表达的DNA区。
5.重组DNA,该重组DNA包含权利要求1的DNA片段。
6.一种宿主细胞,该宿主细胞中已掺入权利要求5的重组DNA。
7.一种质粒,该质粒包含权利要求5的重组DNA。
8.一种DNA片段,该DNA片段选自pCD528、pCD545、pCD550、pCD559、pCD574和pCD577。
9.一种宿主细胞,该宿主细胞中已掺入权利要求8的DNA片段。
10.权利要求1的DNA片段,该片段包含调控1号顺序、2号顺序、3号顺序、4号顺序或5号顺序的DNA顺序或其等位变异的转录或转译的DNA区。
11.权利要求8的DNA片段中所含的支链α-酮酸脱氢酶复合体基因。
12.一种基本上纯化的多肽,该多肽包含6号顺序、7号顺序、8号顺序或9号顺序的氨基酸顺序。
6号顺序
Met Thr Val Met Glu Gln Arg Gly Ala Tyr Arg Pro Thr Pro Pro Pro
1 5 10 15
Ala Trp Gln Pro Arg Thr Asp Pro Ala Pro Leu Leu Pro Asp Ala Leu
20 25 30
Pro His Arg Val Leu Gly Thr Glu Ala Ala Ala Glu Ala Asp Pro Leu
35 40 45
Leu Leu Arg Arg Leu Tyr Ala Glu Leu Val Arg Gly Arg Arg Tyr Asn
50 55 60
Thr Gln Ala Thr Ala Leu Thr Lys Gln Gly Arg Leu Ala Val Tyr Pro
65 70 75 80
Ser Ser Thr Gly Gln Glu Ala Cys Glu Val Ala Ala Ala Leu Val Leu
85 90 95
Glu Glu Arg Asp Trp Leu Phe Pro Ser Tyr Arg Asp Thr Leu Ala Ala
100 105 110
Va1 Ala Arg Gly Leu Asp Pro Val Gln Ala Leu Thr Leu Leu Arg Gly
115 120 125
Asp Trp His Thr Gly Tyr Asp Pro Arg Glu His Arg Ile Ala Pro Leu
130 135 140
Cys Thr Pro Leu Ala Thr Gln Leu Pro His Ala Val Gly Leu Ala His
145 150 155 160
Ala Ala Arg Leu Lys Gly Asp Asp Val Val Ala Leu Ala Leu Val Gly
165 170 175
Asp Gly Gly Thr Ser Glu Gly Asp Phe His Glu Ala Leu Asn Phe Ala
180 185 190
Ala Val Trp Gln Ala Pro Val Val Phe Leu Val Gln Asn Asn Gly Phe
195 200 205
Ala Ile Ser Val Pro Leu Ala Lys Gln Thr Ala Ala Pro Ser Leu Ala
210 215 220His Lys Ala Val Gly Tyr Gly Met Pro Gly Arg Leu Val Asp Gly Asn225 230 235 240Asp Ala Ala Ala Val His Glu Val Leu Ser Asp Ala Val Ala His Ala
245 250 255Arg Ala Gly Gly Gly Pro Thr Leu Val Glu Ala Val Thr Tyr Arg Ile
260 265 270Asp Ala His Thr Asn Ala Asp Asp Ala Thr Arg Tyr Arg Gly Asp Ser
275 280 285Glu Val Glu Ala Trp Arg Ala His Asp Pro Ile Ala Leu Leu Glu His
290 295 300Glu Leu Thr Glu Arg Gly Leu Leu Asp Glu Asp Gly Ile Arg Ala Ala305 3l0 315 320Arg Glu Asp Ala Glu Ala Met Ala Ala Asp Leu Arg Ala Arg Met Asn
325 330 335Gln Asp Pro Ala Leu Asp Pro Met Asp Leu Phe Ala His Val Tyr Ala
340 345 350Glu Pro Thr Pro Gln Teu Arg Glu Gln Glu Ala Gln Leu Arg Ala Glu
355 360 365Leu Ala Ala Glu Ala Asp Gly Pro Gln Gly Val Gly Arg
7号顺序Met Thr Thr Val Ala Leu Lys Pro Ala Thr Met Ala Gln Ala Leu Thr1 5 10 15Arg Ala Leu Arg Asp Ala Met Ala Ala Asp Pro Ala Val His Val Met
20 25 30Gly Glu Asp Val Gly Thr Leu Gly Gly Val Phe Arg Val Thr Asp Gly
35 40 45Leu Ala Lys Glu Phe Gly Glu Asp Arg Cys Thr Asp Thr Pro Leu Ala
50 55 60Glu Ala Gly Ile Leu Gly Thr Ala Val Gly Met Ala Met Tyr Gly Leu65 70 75 80Arg Pro Val Val Glu Met Gln Phe Asp Ala Phe Ala Tyr Pro Ala Phe
85 90 95Glu Gln Leu Ile Ser His Val Ala Arg Asp Ala Gln Arg Thr Arg Gly
100 105 110Ala Met Pro Leu Pro Ile Thr Ile Arg Val Pro Tyr Gly Gly Gly Ile
115 120 125Gly Gly Val Glu His His Ser Asp Ser Ser Glu Ala Tyr Tyr Met Ala
130 135 140Thr Pro Gly Leu His Val Val Thr Pro Ala Thr Val Ala Asp Ala Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Arg Ala Ala Ile Ala Ser Asp Asp Pro Val Val Phe Leu
165 170 175Glu Pro Lys Arg Leu Tyr Trp Ser Lys Asp Ser Trp Asn Pro Asp Glu
180 185 190Pro Gly Thr Val Glu Pro Ile Gly Arg Ala Val Val Arg Arg Ser Gly
195 200 205Arg Ser Ala Thr Leu Ile Thr Tyr Gly Pro Ser Leu Pro Val Cys Leu
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260 265 270Gly Gly Pro Gly Gly Glu Ile Ala Ala Gly Ile Thr Glu Arg Cys Phe
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