CN110437175A - 双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)及其在检测肼中的应用 - Google Patents

双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)及其在检测肼中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了双激发荧光探针EuШ‑dtpa‑bis(HBT)及其在检测肼中的应用。取二乙三胺五乙酸，乙酸酐，吡啶在80℃下搅拌回流24h，冷却，减压抽滤，洗涤，干燥；将得到的二乙三胺五乙酸二酐与三乙胺，二甲基甲酰胺(DMF)，2‑(2‑羟基苯基)苯并噻唑(HBT)，于100℃搅拌回流24h，冷却，旋蒸，洗涤，干燥；得到的二乙三胺五乙酸‑双(HBT)与Eu(NO3)3·6H2O于100℃加热搅拌3h，得到目标产物。将EuIII‑dtpa‑bis(HBT)作为探针结合荧光方法检测肼(N2H4)。本发明方法简单新颖，成本低，效率高，且可应用在环境水样和生物细胞当中。

Description

双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)及其在检测肼中的应用
技术领域
本发明属于分析化学领域，尤其涉及一种双激发荧光探针的合成和在实际水样和生物细胞中检测肼(N2H4)中的应用。
背景技术
肼(N2H4)是一种无色、油状的液体，有强烈的刺鼻味道。由于肼具有较强的碱性和还原性，被广泛应用于催化剂、医药中间体、乳化剂、染料和农业等领域。另外，由于肼的能量密度较高，使它具有***特性，被经常用作导弹、火箭和卫星的高能燃料推进剂。然而，肼也是一种潜在的致癌物质，当与皮肤接触会加速致突变效应，经口腔吸入会引起呼吸道感染，经肺部吸入会对肾脏、肝脏、肺部和中枢神经***造成损害，严重的会产生急性神经毒性并有致癌作用。如果肼在制造、使用和运输过程中处理不当，不仅会威胁到人体的健康，还将会对环境水体造成严重影响。因此，建立一种简便有效的检测方法，对控制环境污染，保障人体健康具有重要意义。
传统的检测肼的方法主要有滴定法、化学发光法、液相色谱法、分光光度法、电化学分析法等。尽管这些方法能够对水体中的肼进行检测，但是检测过程中制样复杂、耗时长和需要特殊的精密仪器等。因此，设计一种方便、快速、有效的检测肼的方法具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是设计合成一种可用于有效检测实际水样和生物细胞中肼的双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)。
本发明的目的之二是提供一种操作简单，成本低，敏感快速，且选择性好的检测肼的方法。
本发明采用的技术方案是：本发明提供的双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)，其制备方法包括如下步骤：
1)将二乙三胺五乙酸、乙酸酐和吡啶混合均匀，在80℃下搅拌回流24h，冷却至室温，减压抽滤，依次用乙酸酐和无水***洗涤，60℃下干燥，得二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)。优选的，按摩尔比，二乙三胺五乙酸：乙酸酐：吡啶＝1:4:6。
2)将二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)、三乙胺、无水DMF和2-(2-羟基苯基)苯并噻唑(HBT)混合均匀，在100℃下搅拌回流24h，冷却至室温，旋转蒸发，加入冰水，剧烈搅拌，得淡黄色固体，依次用冰水和无水***洗涤，减压抽滤，于60℃干燥，得二乙三胺五乙酸-双(HBT)(dtpa-bis(HBT))。优选的，按摩尔比，二乙三胺五乙酸二酐：三乙胺：HBT＝1:3:2。
3)将二乙三胺五乙酸-双(HBT)和Eu(NO3)3·6H2O分别加Tris-HCl缓冲溶液溶解，然后混合，于100℃搅拌加热3h，冷却，得EuШ-dtpa-bis(HBT)。优选的，按摩尔比，二乙三胺五乙酸-双(腺嘌呤)：Eu(NO3)3·6H2O＝1:1。
上述的荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)在定性和定量检测实际水样中肼(N2H4)中的应用。
定性检测实际水样中肼的方法：取含有肼的实际水样，加入上述双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)的水溶液，充分混合，分别在270nm和325nm波长光的激发下进行荧光检测，观察荧光光谱的变化。可以发现，随着实际水样中肼含量增加，双激发荧光探针的荧光强度明显增强。
定量检测实际水样中肼的方法：在浓度为5.0×10-4mol/L的上述双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)的水溶液中分别加入不同浓度的肼(1.0×10-5mol/L-2.0×10-4mol/L)，分别在270nm和325nm波长光的激发下进行荧光检测，得出不同浓度的肼与EuIII-dtpa-bis(HBT)荧光强度标准曲线。根据标准曲线，EuIII-dtpa-bis(HBT)作为双激发荧光探针来检测实际水样中肼的浓度。
上述荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)在定性检测生物细胞中肼(N2H4)中的应用。
定性检测生物细胞中肼的方法：取含有肼的生物细胞，加入上述双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)的水溶液，充分混合，分别在亮场下和蓝光下进行荧光成像，观察细胞形状和细胞成像的变化。
本发明的有益效果是：
1.本发明针对被检测物肼的结构特点，利用酯化反应对dtpa进行修饰，然后通过肼解作用实现对肼的检测，设计合成了一种新型的双激发荧光探针。
2.通过本发明的方法，荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)可以对肼进行灵敏且特异性检测。与其它检测肼的方法相比，具有简单，快速，成本低，选择性好，不受外界干扰物影响等优点。
附图说明
图1是双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)的合成路线图。
图2a是dtpa的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。
图2b是2-(2-羟基苯基)苯并噻唑(HBT)的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。
图2c是dtpa-bis(HBT)的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。
图2d是dtpa-bis(N2H4)的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。
图3是HBT，EuШ-dtpa-bis(HBT)和EuШ-dtpa-bis(HBT)+肼(N2H4)的紫外吸收光谱图。
图4a是双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)(λex＝270nm)对肼(N2H4)检测的荧光光谱图。
图4b是双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)(λex＝325nm)对肼(N2H4)检测的荧光光谱图。
图5a-1是双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)对肼(N2H4)分别与不同物质混合的干扰荧光光谱(λex＝270nm)对比图。
图5a-2是图5a-1的柱状图。
图5b-1是双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)对肼(N2H4)分别与不同物质混合的干扰荧光光谱(λex＝325nm)对比图。
图5b-2是图5b-1的柱状图。
图6a-1是双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)对实际水样中肼(N2H4)检测的荧光光谱(λex＝270nm)对比图。
图6a-2是图6a-1的柱状图。
图6b-1是双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)对实际水样中肼(N2H4)检测的荧光光谱(λex＝325nm)对比图。
图6b-2是图6b-1的柱状图。
图7是双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)对BV2细胞的毒性测试。
图8是双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)对生物细胞中肼(N2H4)检测的生物成像图；
其中，a-1:亮场下，BV2细胞+EuIII-dtpa-bis(HBT)；
a-2:蓝光下，BV2细胞+EuIII-dtpa-bis(HBT)；
b-1:亮场下，BV2细胞+EuIII-dtpa-bis(HBT)+肼；
b-2:蓝光下，BV2细胞+EuIII-dtpa-bis(HBT)+肼。
具体实施方式
实施例1双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)
合成路线如图1所示。
(一)制备方法
1、二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)的制备
称取7.8670g(0.02mol)二乙三胺五乙酸(dtpa)，乙酸酐16.0mL(0.08mol)，吡啶10.0mL(0.12mol)置于三颈圆底烧瓶中，在80℃下缓慢搅拌加热，冷凝回流24h。停止加热和搅拌，冷却至室温后将产物减压抽滤，依次用乙酸酐和无水***分别洗涤三次(3×10mL)，并减压抽滤，将产物于干燥箱中60℃干燥，即得二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)。
2、二乙三胺五乙酸-双(2-(2-羟基苯基)苯并噻唑)(dtpa-bis(HBT))的制备
取二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)1.9652g(5.5mmol)，2.334mL的三乙胺(16.5mmol)，无水DMF(50mL)，2-(2-羟基苯基)苯并噻唑(HBT)2.4971g(11mmol)，于三颈圆底烧瓶中。恒温100℃条件下，快速搅拌，冷凝回流24h。反应完全后静置，冷却到室温后，旋转蒸发除去溶剂DMF，加入100mL冰水，剧烈搅拌，析出淡黄色的固体。减压抽滤，依次用冰水和无水***分别洗涤三次，减压抽滤。于60℃条件下干燥，即得二乙三胺五乙酸-双(2-(2-羟基苯基)苯并噻唑)(dtpa-bis(HBT))。
3、荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)的制备
称取dtpa-bis(HBT)(0.1010g,0.125mmol)溶于50mL Tris-HCl([Tris-HCl]＝50mmol/L，pH＝7.50)缓冲溶液中，加热搅拌至完全溶解。再称取Eu(NO3)3·6H2O(0.0558g,0.125mmol)于上述混合溶液中，100℃加热搅拌回流3小时。将反应后的溶液冷却至室温，然后转移至250mL容量瓶中，用Tris-HCl缓冲溶液定容到250mL，得到EuIII-dtpa-bis(HBT)储备液(5.00×10-4mol/L)。
(二)检测
(1).dtpa、2-(2-羟基苯基)苯并噻唑(HBT)、dtpa-bis(HBT)和dtpa-bis(N2H4)的FT-IR图。如图2a，2b，2c，2d所示。对比图2a和图2c可以发现，C＝O的伸缩振动峰分别位于1752cm-1和1749cm-1处。与图2a相比，图2c中C＝O的吸收峰蓝移3cm-1。图2c中，C-O-C的不对称伸缩振动和对称伸缩振动分别位于1254cm-1和1151cm-1。从图2c中可以发现，C-H的伸缩振动峰出现在851cm-1处。与图2b相比，图2c中C-H的伸缩振动峰红移34cm-1。这些特征峰的移动说明酯键的形成，即dtpa-bis(HBT)被成功合成。另外，从图2d可以发现，N-H的伸缩振动峰出现在3419cm-1处。C＝O的伸缩振动峰出现在1660cm-1，与图2a相比，图2d中C＝O的伸缩振动峰蓝移92cm-1。这两个特征峰的移动说明dtpa-bis(N2H4)通过肼解作用被生成。
(2).HBT，EuШ-dtpa-bis(HBT)和EuШ-dtpa-bis(HBT)+N2H4的紫外吸收光谱图如图3所示。从图3可以看出，EuШ-dtpa-bis(HBT)在220nm处有一弱的吸收峰。然而当肼被加入EuIII-dtpa-bis(HBT)溶液后，EuIII-dtpa-bis(HBT)+N2H4混合溶液的吸收峰强度明显增强。可以预测EuШ-dtpa-bis(HBT)的荧光强度在加入肼之后会发生很大改变。
实施例2双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)在检测肼中的应用
(一)双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)对肼检测的荧光光谱
实验条件：分别量取5mL浓度为5.00×10-4mol/L的EuIII-dtpa-bis(HBT)储备液加入2个50mL容量瓶中，再量取5mL浓度为5.00×10-4mol/L的肼溶液加入上述容量瓶中，用Tris-HCl缓冲溶液定容到50mL。分别在270nm和325nm波长光的激发下观察荧光光谱的变化进行荧光测定。
结果如图4a，4b所示。在270nm和325nm波长光的激发下，双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)分别在470nm和480nm处呈现出两个弱的发射峰。当把肼加入到探针溶液中后，探针的荧光都被明显地增强。
(二)不同共存物质与肼混合对双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)检测的影响
实验条件：分别量取5ml浓度为5.00×10-4mol/L的EuIII-dtpa-bis(HBT)储备液加入18个50mL容量瓶中。再分别量取5mL浓度为5.00×10-4mol/L的肼溶液加入到18个50mL容量瓶中。之后于17个50mL容量瓶中依次加入5mL浓度为5.00×10-4mol/L的K+，Na+，Zn2+，Mg2+，Ba2+，Ni2+，Mn2+，Ca2+，Cr3+，Al3+，Fe3+，Cl-，ClO-，SO4 2-，glucose，H2O2和NH3·H2O储备溶液，用Tris-HCl缓冲溶液定容到50mL，得到各物质浓度均为5.00×10-5mol/L。另外需要单独制备一个5.00×10-3mol/L的肼溶液。分别在270nm和325nm波长光的激发下观察荧光光谱的变化进行荧光测定。
结果如图5a-1、图5a-2、图5b-1和图5b-2所示。从图5a-1和图5b-1中可以看出，在270nm和325nm波长光的激发下，探针溶液分别在470nm和480nm处发出弱的荧光。当肼加入到探针溶液中后，探针的荧光都被明显地增强。然而当K+，Na+，Zn2+，Mg2+，Ba2+，Ni2+，Mn2+，Ca2 +，Cr3+，Al3+，Fe3+，Cl-，ClO-，SO4 2-，glucose，H2O2和NH3·H2O等共存物质分别加入探针和肼的混合溶液中后，混合溶液的荧光几乎不发生改变。这说明，其他与肼共存的物质不会干扰探针对肼的检测。图5a-2和图5b-2能更直观的看到荧光强度的变化。
(三)双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)在实际水样中检测肼
实验条件：本实验在薓窝水库选取水库库中水和水库出口水，还有自来水和饮用水四个水样，对照组采用的是去离子水的溶液。
首先，分别取2mL、5mL和10mL肼浓度为5.00×10-4mol/L的储备液于3个容量瓶中，得到肼终浓度为2.00×10-5mol/L，5.00×10-5mol/L和10.00×10-5mol/L。另外取16个50ml的容量瓶，分成三组每组5个。每个容量瓶中都加入5mL的浓度为5.00×10-4mol/L的EuIII-dtpa-bis(HBT)储备液。然后，每组的5个容量瓶中都分别加入5mL浓度为2.00×10-5mol/L，5.00×10-5mol/L和10.00×10-5mol/L的肼溶液。最后每组5个容量瓶分别用薓窝水库库中水、水库出口水、自来水、饮用水和去离子水定容至50mL，分别在270nm和325nm波长光的激发下观察荧光光谱的变化进行荧光测定。
结果如图6a-1和图6b-1所示。在270nm和325nm波长光的激发下，EuIII-dtpa-bis(HBT)分别在470nm和480nm处有弱的发射峰，当加入四种不同的水样后，对于同一浓度的肼，EuIII-dtpa-bis(HBT)溶液的荧光强度基本不变；然而，随着肼的浓度增加在2.00×10- 5mol/L-10.00×10-5mol/L范围内，EuIII-dtpa-bis(HBT)荧光强度呈现出很好的上升梯度。更清晰的比较可以从图6a-2和图6b-2中看出，对于肼的每一个浓度，四种水样的荧光强度基本相同且接近于对照水样中加入相同浓度的肼。因此，在270nm和325nm波长光的激发下，证明了EuIII-dtpa-bis(HBT)可以特异性地检测实际水样中的肼。
(四)双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)对BV2细胞的毒性测试
实验条件：首先，BV2细胞被接种在96孔的培养板上，将细胞在培养箱(37℃,5％CO2和95％空气)中用不同浓度(0-50μmol/L)的EuIII-dtpa-bis(HBT)溶液培养24小时。然后，分别取10μL 3-(4,5-二甲基-2-硫唑)-2.5-二苯-2H-噻唑蓝(MTT)(5mg/mL)添加到每个孔内，继续培养4小时。最后取100mL的DMSO溶液分别添加到每个孔中溶解晶体。最后，将培养板搅拌10分钟，用酶标仪分析每个孔内的细胞。
从图7中可以看出，在培养基中没有荧光探针EuIII-dtpa-bis(HBT)存在的情况下，BV2细胞存活率为100％。即使当EuIII-dtpa-bis(HBT)溶液的浓度达到5.00×10-5mol/L，BV2细胞的存活率仅减少11％。这表明荧光探针EuIII-dtpa-bis(HBT)对BV2细胞具有较低的毒性。因此，可以预测该双激发荧光探针EuIII-dtpa-bis(HBT)可用于活细胞中肼的检测。
(五)双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)对生物细胞中肼(N2H4)检测的生物成像
实验条件：用高糖培养基(5％牛血清和1％双抗体)，在空气培养箱(37℃,5％CO2/95％)中培养BV2细胞。再将这些细胞接种于6孔板上并使其贴附12小时。对于荧光成像，将一组细胞在EuIII-dtpa-bis(HBT)(20μM)配合物溶液中培养1.0小时，另一组细胞在EuIII-dtpa-bis(HBT)+N2H4(20μM)混合溶液中培养1.0小时。然后除去培养基，用PBS缓冲液分别冲洗细胞三次，去除细胞外化合物。所得细胞在共聚焦显微镜上成像，在蓝色通道记录荧光成像的图像。
结果如图8所示。在亮场下，BV2细胞的成像如图8中a-1所示。在EuIII-dtpa-bis(HBT)的存在下，BV2细胞可以正常的生长，说明了EuIII-dtpa-bis(HBT)对BV2细胞没有毒性。图8中a-2是在蓝光通道下培养的BV2细胞的成像。从图中可以看出，在EuIII-dtpa-bis(HBT)的存在下，培养的BV2细胞几乎没有荧光，这说明细胞中没有肼分子。当在培养基中加入肼后，在亮场下(图8中b-1)，BV2细胞的大小和形状都与图8中a-1中的有着明显的不同，这说明了肼的存在影响了BV2细胞的正常生长。图8中b-2是在蓝光通道下，EuIII-dtpa-bis(HBT)和N2H4同时存在时，BV2细胞呈现出明显的蓝色荧光。实验结果表明EuIII-dtpa-bis(HBT)作为双激发荧光探针可以用于活细胞中肼的检测。

Claims (8)

1.双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)，其特征在于，所述双激发荧光探针EuIII-dtpa-bis(HBT)的制备方法包括如下步骤：
1)将二乙三胺五乙酸(dtpa)、乙酸酐和吡啶混合均匀，在80℃下搅拌回流24h，冷却至室温，减压抽滤，依次用乙酸酐和无水***洗涤，于60℃干燥，得二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)；
2)将二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)、三乙胺、无水DMF和2-(2-羟基苯基)苯并噻唑(HBT)混合均匀，在100℃下搅拌回流24h，冷却至室温，旋转蒸发，加入冰水，剧烈搅拌，得淡黄色固体，依次用冰水和无水***洗涤，减压抽滤，于60℃干燥，得二乙三胺五乙酸-双(HBT)(dtpa-bis(HBT))；
3)将二乙三胺五乙酸-双(HBT)(dtpa-bis(HBT))和Eu(NO3)3·6H2O分别加Tris-HCl缓冲溶液溶解，然后混合，于100℃搅拌加热3h，冷却，得到EuIII-dtpa-bis(HBT)。
2.如权利要求1所述的双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)，其特征在于，步骤1)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸：乙酸酐：吡啶＝1:4:6。
3.如权利要求1所述的双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)，其特征在于，步骤2)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸二酐：三乙胺：2-(2-羟基苯基)苯并噻唑(HBT)＝1:3:2。
4.如权利要求1所述的双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)，其特征在于，步骤3)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸-双(HBT)：Eu(NO3)3·6H2O＝1:1。
5.权利要求1-4任一项所述的双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)在定性和定量检测环境水样中肼(N2H4)中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，方法如下：于含有肼的实际水样中，加入权利要求1-4任一项所述的双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)的水溶液，混合均匀，分别于270nm和325nm波长光的激发下进行荧光检测。
7.权利要求1-4任一项所述的双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)在定性检测生物细胞中肼(N2H4)中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，方法如下：于含有肼的生物细胞中，加入权利要求1-4任一项所述的双激发荧光探针EuШ-dtpa-bis(HBT)的水溶液，混合均匀，分别于亮场下和蓝光下进行荧光成像。
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