本发明目的是利用本实验室已有的二步酶法,通过对它们组成的由CPC至GL-7ACA继而至7-ACA的二个酶反应***相容性的研究,建立两酶合并在一个反应器的水相***中快速、简便、高效地转化较高浓度的CPC,进而制造7-ACA的方法。这两种酶已能由本实验室的高产菌株实现。
本发明系利用两酶法的反应历程,但是采用一步工艺由CPC制造7-ACA。就是在一个反应器中,同时存在二个反应***,同时进行二步酶反应和一步化学氧化反应,经过较短的反应时间,即将底物CPC转化为7-ACA。
本发明所用的两酶法反应历程中,首先是D-氨基酸氧化酶或含有D-氨基酸氧化酶(D-AAO)的三角酵母多倍体(Trigonopsis variabilis FAI)转化CPC为相应的酮酸(OX-CPC),继而双氧水氧化脱羧生成GL-7ACA,然后是GL-7ACA酰化酶或含有GL-7ACA酰化酶的酰化酶工程菌裂解GL-7ACA为7-ACA,其反应式如下图:
三角酵母多倍体是应用原生质体融合技术构建的D-AAO高产株[李维泉、焦瑞身:微生物学报31(3)251-3,1991;李维泉,焦瑞身:微生物学报31(5)371-5,1991]经发酵条件优化,酶活达到500u/L。酰化酶工程菌的构建[杨蕴刘等:生物工程学报7(2)99-107,1991;杨蕴剂等:生物工程学报8(1)15-22,1992]运用DNA体外重组技术,把假单胞菌的酰化酶基因克隆到大肠杆菌中,并得到表达。进一步通过重组质粒改造,消除质粒上的β-内酰胺酶,宿主菌选育和发酵条件的初步优化,酰化酶工程菌酶活从原来出发菌株的30多单位提高到700u/L。
本发明中采用的三角酵母多倍体细胞富含D-AAO,并且还有过氧化氢酶,后者能分解过氧化氢,这对CPC经D-AAO催化氧化生成的OX-CPC需要过氧化氢氧化脱羧生成GL-7ACA是不利的,加入过氧化氢酶抑制剂可以抑制过氧化氢酶活。过氧化氢酶抑制剂可以是抗坏
血酸、3-氨基-1,2,3-***、过硼酸钠或叠氮化钠。
GL-7ACA酰化酶对OX-CPC无活性,因此OX-CPC必须转化成GL-7ACA。OX-CPC氧化脱羧需要过氧化氢,虽然D-AAO氧化CPC生成OX-CPC的同时也生成过氧化氢,但不足以完全氧化OX-CPC生成GL-7ACA,因此需要在第一个酶反应***中加入双氧水,促进OX-CPC氧化成GL-7ACA。高浓度的双氧水会破坏头孢菌素的化学结构,并且使D-AAO失活,因此加双氧水的量要控制,最好采用分批或流加的方式。
三角酵母多倍体细胞中存在使CPC发生副反应的某些酶。预处理可以破坏这些酶而减少甚至避免发生副反应。预处理的方法,把三角酵母多倍体湿细胞悬于8-10倍量的0.1M焦磷酸缓冲液,pH范围6.0-8.5,温度45-55℃,时间0.5-1小时。
GL-7ACA酰化酶工程菌对CPC有5u/g干菌的β-内酰胺酶活力,在第二酶反应***中加入1-10mg/mlβ-内酰胺酶抑制剂,如舒巴坦钠(Sulbactam)、棒酸(clavulanic acid)、硼酸及其衍生物(boronic acid)。
在第二酶反应***中,随着GL-7ACA的水解、生成戊二酸,***的pH会下降,使GL-7ACA酰化酶活力降低。因此要用1-3N NaOH分批或流加,保持pH7.0-8.5。
本发明的二个酶反应***都是水相磷酸缓冲液体系,因此能够把二个酶反应***完全合并在一个反应器中,但是这二个***在一起各自仍能正常反应,并能有效地形成7-ACA,必须做到二个酶反应***存在相容性,这是本发明能否成立的关键。具体说,必须存在一个对二个酶反应***都合适的反应条件,如温度、pH。在一个酶反应***中存在的化学药品对另一个酶反应***并无或很少为害。为了了解二个酶反应***是否存在一个对二者都合适的反应条件,我们研究了二个酶反应***各自适合的温度和pH范围。结果发现pH7.0-8.0范围中二个酶反应***都具有反应产物不低于74%的相对生成率;温度24-37℃范围中二个酶反应***都具有反应产物不低于79%的相对生成率,说明二个酶反应***适宜的温度、pH范围相当重合。在反应***中使用的化学品,经研究发现,第一酶反应***中使用的叠氮化钠、双氧水对第二酶反应***的GL-7ACA酰化酶活力基本无影响;第二酶反应***中的酰化酶工程菌,当存在舒巴坦钠时,并不破坏第一酶反应***中的底物CPC;在第二酶反应***中使用的舒巴坦钠对第一酶反应***中三角酵母多倍体细胞转化CPC没有影响。三角酵母多倍体对7-ACA的稳定性稍有影响,因此反应结束后立即分离菌体为宜。以上情况为二个酶反应***合并在一个反应器中试验奠定了基础。
用3-6%CPC钠盐在一个反应器中混合存在二种酶的菌细胞,最好采用3%左右浓度,能获得较高的7-ACA生成率。这种一步两酶法制造7-ACA,可以采用振荡或搅拌或通气搅拌方法,以增加酶反应***中的溶氧,并使加入的双氧水和氢氧化钠溶液迅速分散。各含有D-AAO和GL-7ACA酰化酶的二种湿菌的总重占底物溶液量的8-11%。二种湿菌的比例(三角酵母多倍体:酰化酶工程菌)1.75~1∶1。叠氮化钠1-10mmol/L、双氧水25-50mmol/L、舒巴坦钠1-10mg/ml。温度范围20-45℃,pH范围7.0-8.5。
本发明的一步两酶法也可以用纯化的酶直接参与反应。通常采用3-6%的头孢菌素C钠盐和反应液中应含1-2u/ml D-氨基酸氧化酶、1-3u/ml GL-7ACA酰化酶和25-50mmol/L的6%双氧水,在20-45℃和pH7.0-8.5时反应。双氧水可流加或分批加。
前述反应随着反应的进行,pH会下降,为保持pH值,可以采用加碱溶液的方法调节pH值。通常可用1-3N的NaOH水溶液,分批或流加的方法加入反应液中。
本发明的方法经过0.5-1.5小时就能获得满意的结果。
本发明一步两酶法的方法,不仅操作步骤、工艺流程和设备器材都比二步酶法简化了一步。而且,一步两酶法的反应时间要比两步酶法减少一半,而7-ACA生成率却提高了。说明一步两酶的反应***除了具有相容性外,还存在协同作用才会获得优于二步酶反应的效果。
可以通过下述实施例进一步理解本发明的内容。
本实施例中分析方法如下:
1.D-AAO酶活测定
取1毫升发酵液中的菌体或酶液,加5毫升pH8.5 50mmol/L DL-甲硫氨酸溶液,37℃振荡半小时,用10%三氯乙酸3毫升中止反应。离心后取1毫升上清液加0.2%2.4-二硝基苯肼试剂0.4毫升,10分钟后加3N NaOH1.5毫升,15分钟后离心,上清液550nm测光密度。用丙酮酸钠制备标准曲线。一个酶单位的定义:在测定条件下,每分钟生成1μmol酮酸的酶量。
2.GL-7ACA酰化酶活测定
取1毫升发酵液中的菌体或酶液,加6毫升PH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液,取以上溶液0.5毫升加0.5毫升5mg/ml GL-7ACA溶液,37℃保温30分钟,加3毫升终止液(20%冰醋酸∶0.05N NaOH=2∶1)离心后的上清液加0.5毫升0.5%对-二甲氨基苯甲醛的乙醇液,30分钟后415nm测光密度。用7-ACA制标准曲线。一个酶单位定义:在测定条件下,每分钟生成1μmol7-ACA的酶量。
3.β-内酰胺酶活的测定:
用0.1mol/L PH7.6磷酸缓冲液配制约含15mg温菌/ml的酰化酶工程菌液和1mg/ml CPC-Na溶液。二液各取0.5毫升在恒温水浴中反应半小时,加4毫升终止液(与分析方法2.相同),以菌液保温后先加终止液后加底物为对照,离心后上清液测260nm的光密度,二者光密度的差数可计算得酶活。一个酶单位的定义:在测定条件下,每分钟破坏1μmol CPC的β-内酰胺环的酶量。
4.HPLC测定CPC、GL-7ACA和7-ACA
仪器:Beckman Gold system HPLC
层析柱:填料直径5μ,柱容4.6mm×25cm的Ultrasphere ODS反相色谱柱
溶剂相:6%乙腈,15%甲醇,1%乙酸的水液
流速:1.5ml/min
保留时间:25℃,7-ACA 1.74分,CPC 2.03分,GL-7ACA 4.05分
实施例1:三角酵母多倍体的培养和预处理
蛋白胨0.5%,酵母抽出粉0.5%,DL-甲硫氨酸0.3%,葡萄糖2.0%,H3BO30.01%,CuSO4·5H2O、ZnSO47H2O和(NH4)2MoO4各为0.004%,生物素和FeSO4·7H2O各为0.002%,硫胺素0.001%,pH自然,500ml三角烧瓶装80ml,121℃灭菌25分钟,接入以上前四种成份再加2.0%琼脂的斜面所培养的菌种,28℃,转床培养45小时。发酵液8000rpm离心10分钟,用生理盐水洗一次,菌体置-20℃保存。取低温保存的湿菌体加10倍量(W/V)pH8.5 0.1mol/L焦磷酸缓冲液45℃保温一小时,离心收集处理菌体,-20℃保存。
实施例2:GL-7ACA酰化酶工程菌的培养
胰蛋白胨1%,酵母抽出粉0.5%,氯化钠0.8%,pH自然,500ml三角烧瓶装80ml培养基,121℃灭菌25分钟。以上配方再加入50μg/ml氨苄青霉素和2%琼脂培养的平皿菌种接入三角烧瓶培养基。以上培养均在37℃。发酵瓶自第16小时开始每隔2小时加葡萄糖0.1%共四次,41小时后取出发酵液,经8000rpm离心10分钟,用生理盐水洗一次,菌体置-20℃保存。
实施例3:温度对三角酵母多倍体细胞转化CPC的影响
按实施例1方法培养和预处理湿菌0.3克,用0.1mol/L pH7.6的磷酸缓冲液配制的3%CPC钠盐(CPC含量70%)溶液5ml置于50ml三角烧瓶,再加入13mg/ml叠氮化钠50μl,在恒温水浴中振荡1小时,期间分批加入6%双氧水100μl。反应结束后离心得上清液,按分析方法4,HPLC测GL-7ACA。不同反应温度转化3%CPC钠盐为GL-7ACA的相对生成百分数15℃为93.9%、20℃为100%、28℃为96.2%、37℃为86.0%、45℃为60.0%。
实施例4:温度对酰化酶工程菌转化GL-7ACA为7-ACA的影响
按实施例2的方法培养酰化酶工程菌,在50ml三角烧瓶中加0.2克湿菌、2%GL-7ACA(90%纯度)溶于0.1mol/L pH7.6磷酸缓冲液5ml、舒巴坦钠5mg。在恒温水浴中振荡1小时,期间用1N NaOH调pH不低于7.0,反应结束后离心得上清液。按分析方法4,HPLC测7-ACA。不同反应温度转化2%GL-7ACA为7-ACA的相对生成百分数24℃为79.0%、28℃为99.2%、33℃为100%、37℃为99.2%、45℃为85.0%。
实施例5:PH对三角酵母多倍体细胞转化CPC为GL-7ACA的影响
按实施例3的方法,温度为28℃,用不同pH的磷酸或焦磷酸缓冲液转化3%CPC钠盐为GL-7ACA的相对生成百分数,pH7.0为74%、pH7.6为95%、pH8.0为100%。
实施例6:pH对酰化酶工程菌转化GL-7ACA为7-ACA的影响
按实施例4方法,温度为28℃,用3N NaOH调不同pH,转化2%GL-7ACA为7-ACA的相对生成百分数,pH7.0为80.1%、pH7.6为100%、pH8.0为99.2%、pH8.5为88.4%。
实施例7:叠氮化钠、双氧水、舒巴坦钠对酰化酶活力的影响
在离心管中加入用0.1mol/L pH7.6磷酸缓冲液配制的含GL-ACA酰化酶工程菌湿菌20mg/ml悬浊液1ml,再分别加入1mg舒巴坦钠或6%双氧水10μl或13mg/ml叠氮化钠10μl,不加为对照,28℃保温1.5小时离心弃上清液,按分析方法2,测GL-7ACA酰化酶活力。酰化酶相对活力对照为100%,则加叠氮化钠为98.9%,加双氧水为101.1%,加舒巴坦钠为103.4%。
实施例8:存在舒巴坦钠时,酰化酶工程菌对CPC稳定性的影响
按实施例4的方法,3%CPC钠盐代替2%GL-7ACA,温度28℃,不加NaOH溶液。反应结束后离心得上清液,按分析方法4,HPLC测CPC,以不加菌体为对照,存在舒巴坦钠时,加酰化酶工程菌的CPC相对剩余值为102%。
实施例9:舒巴坦钠对三角酵母多倍体转化CPC为GL-7ACA的影响
按实施例3的方法菌体预处理改为55℃半小时,转化温度28℃,转化反应前加入1mg/ml舒巴坦钠,以不加为对照。反应结束后按分析方法4,HPLC测GL-7ACA。加舒巴坦钠生成的GL-7ACA为对照的102%。
实施例10:三角酵母多倍体对7-ACA稳定性的影响
按实施例3方法,用1.5%7-ACA(93%纯度)代替3%CPC钠盐,用1mg/ml舒巴坦钠代替叠氮化钠。28℃保温期间不加双氧水,1小时后按分析方法4测剩余的7-ACA,以不加菌体为对照,加三角酵母多倍体的7-ACA为对照的94.6%。
实施例11:三角酵母多倍体与GL-7ACA酰化酶工程菌细胞分别或合并转化的效果
按实施例3方法,但改为0.35克三角酵母多倍体湿菌经55℃半小时预处理,反应温度为28℃,GL-7ACA生成率71.5%。
按实施例4方法,转化GL-7ACA,反应温度28℃,7-ACA生成率88%,合并6次反应上清液得30ml,加15ml乙醇和5ml乙酸乙脂,离心除去沉淀,上清液用6N HCl调pH3.5析出结晶,4℃过夜,用滤纸抽滤,pH3.5水洗一次,滤并真空干燥得0.268克白色固体,按分析方法4,HPLC测7-ACA含量79.5%,按反应上清液计得率62.3%。合并70ml反应上清液,含10.9mg/ml 7-ACA,用6N HCl调pH3.5,析出结晶,4℃置约二小时,用滤纸抽滤,真空干燥滤饼得0.640克白色固体,按分析方法4,HPLC测7-ACA含量为90.7%,按反应上清液计得率76.1%。测母液含1.675mg/ml的7-ACA,母液中的7-ACA占反应上清液的15.4%。
在50ml三角烧瓶中加入的按实施例1方法培养和55℃半小时预处理的三角酵母多倍体湿菌0.35克和按实施例3方法加入的叠氮化钠和双氧水;加入按实施例2方法培养的0.2克GL-7ACA酰化酶工程菌湿菌和按实施例4方法加入舒巴坦钠和氢氧化钠溶液。28℃转化3%CPC钠盐,反应1小时后按分析方法4,HPLC测7-ACA生成率为72.5%。
取反应上清液11ml含10.0mg/ml 7-ACA,用6N HCl调pH3.5,析出白色结晶,4℃置2小时,滤纸抽滤,真空干燥得白色固体95.7mg。按分析方法4,HPLC测7-ACA含量78.8%,从反应上清液计得率68%。母液含7-ACA 2.257mg/ml占反应上清液的22.6%。
实施例12:柱反应器中一步两酶反应
底为2号砂芯直径40mm高120mm的玻璃柱,用隔套水浴保温,通过砂芯空气通入柱内。在反应器中加入用pH8.0的0.1mol/L焦磷酸缓冲液配制的3%CPC钠盐溶液80ml,加入按实施例1方法培养和PH6.0磷酸缓冲液预处理的3.2克三角酵母多倍体湿菌,按实施例2方法培养的酰化酶工程菌3.2克和按实施例3方法加入叠氮化钠2mmol/L和双氧水25mmol/L、按实施例4方法加入舒巴坦钠10mg/ml和氢氧化钠溶液调pH7.2,反应温度24℃,通气量约1升/分。1小时后按分析方法4,HPLC测7-ACA生成率为65%。
实施例13:一步两酶法转化5%和6%CPC钠盐
按实施例11,两菌合并转化5%和6%CPC钠盐,但是叠氮化钠为10mmol/L,H2O2用量增加到50mmol/L,1N NaOH用量也增加一倍。转化反应1.5小时后按分析方法4,HPLC测7-ACA生成率分别为65.0%(5%CPC钠盐)和51.7%(6% CPC钠盐)。
实施例14:一步两酶法转化CPC的温度、PH试验
按实施例11,一步两酶法转化3%CPC钠盐,但是反应温度20℃,pH8.5,反应1小时后按分析方法4,HPLC测7-ACA生成率为42.3%。
按实施例11,一步两酶法转化3%CPC钠盐,但反应温度45℃,pH7.0,反应1小时后按分析方法4,HPLC测7-ACA生成率31.9%。
实施例15
三角酵母多倍体湿菌10克经-20℃至20℃三次冻融,加20ml 0.1mol/L pH7.6磷酸缓冲液,超声波破碎10分钟,15000rpm离心10分钟,取上清液,加(NH4)2SO4析出D-AAO活性成份。GL-7ACA酰化酶工程菌10克湿菌经冻融一次后,加20ml 0.1mol/L pH7.6磷酸缓冲液,超声波破碎10分钟,15000rpm离心15分钟,取上清液,加(NH4)2SO4析出酰化酶活性成份,再溶于10ml上述磷酸缓冲液,通过DEAE-Sephadex A50柱,用氯化钠溶液梯度洗脱,取酰化酶高活性流段。
取以上制备的7u D-AAO和9u酰化酶,5ml 3%CPC钠盐,置于50ml三角烧瓶中,28℃水浴振荡一小时,期间分批加入1N NaOH 0.2ml,6%H2O20.1ml,按分析方法4 HPLC测7-ACA生成率65%。
实施例16:
按实施例15方法制备D-AAO和GL-7ACA酰化酶
按实施例15方法转化6%CPC钠盐,但是D-AAO是5u,GL-7ACA酰化酶是15u,温度是20℃,pH7.0。按分析方法4,HPLC测7-ACA生成率52%。
实施例17:
按实施例15方法制备D-AAO和GL-7ACA酰化酶
按实施例15方法转化6%CPC,但是D-AAO是10u,GL-7ACA酰化酶5u,6%H2O20.2ml,温度是45℃,pH8.5,按分析方法4 HPLC测7-ACA生成率34%。