JPH022396A - セファロスポリンc及び類似体の一段階酵素反応による7‐アミノセファロスポラン酸及びその類似体への変換 - Google Patents
セファロスポリンc及び類似体の一段階酵素反応による7‐アミノセファロスポラン酸及びその類似体への変換Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
- C12P35/02—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by desacylation of the substituent in the 7 position
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/11—Bacillus megaterium
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はセファロスポリンC及び類似体をそれらに対応
する7−アミノセファロスポラン酸(7A CA )及
びその類似体に一段階で変換する方法に関するものであ
り当該セファロスポリンC及び類似体とバチラスメガテ
リウムATCC53667由来、あるいはセファロスポ
リンCアミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有し
ている、それらの派生物由来、あるいは当該バチラスメ
ガテリウムATCC53667、あるいはセファロスポ
リンCアミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有し
ているそれらの派生物の遺伝子的物質による発現操作に
よって得られるセファロスポリンCアミダーゼとの処理
を含むものである。従って、本発明はセファロスポリン
Cの7−アミノアジポイル側鎖の酵素的開裂(脱アシル
化)を含むものである。
する7−アミノセファロスポラン酸(7A CA )及
びその類似体に一段階で変換する方法に関するものであ
り当該セファロスポリンC及び類似体とバチラスメガテ
リウムATCC53667由来、あるいはセファロスポ
リンCアミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有し
ている、それらの派生物由来、あるいは当該バチラスメ
ガテリウムATCC53667、あるいはセファロスポ
リンCアミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有し
ているそれらの派生物の遺伝子的物質による発現操作に
よって得られるセファロスポリンCアミダーゼとの処理
を含むものである。従って、本発明はセファロスポリン
Cの7−アミノアジポイル側鎖の酵素的開裂(脱アシル
化)を含むものである。
7−アミノアジポイル側鎖はアミド結合の開裂により除
去されるので、変換をさせうる特定の酵素はここに示し
であるアミダーゼの様な物である。
去されるので、変換をさせうる特定の酵素はここに示し
であるアミダーゼの様な物である。
セファロスポリンC1それ自体は発酵産物であるが出発
材料はほぼすべて、現在市販されているセファロスポリ
ン類である。しかしながら、本質的には、これら種々の
商業的セファロスポリン類の製法に対する合成操作は7
−アミノセファロスポラン酸によって開始される。そし
て、それは7−アミノアジポイル側鎖が開裂されている
セファロスポリンCに由来している。
材料はほぼすべて、現在市販されているセファロスポリ
ン類である。しかしながら、本質的には、これら種々の
商業的セファロスポリン類の製法に対する合成操作は7
−アミノセファロスポラン酸によって開始される。そし
て、それは7−アミノアジポイル側鎖が開裂されている
セファロスポリンCに由来している。
現在、公知の方法として使用されている7−アミノアジ
ポイル側鎖開裂の方法は化学的反応による方法である。
ポイル側鎖開裂の方法は化学的反応による方法である。
基本的にイミノ−ハライド方法には7−アミノアジポイ
ル側鎖のアミン基、カルボキシル基の保護操作が必要で
あり、目下、種々の方法がこの方法遂行に際して使用さ
れている。ところが現在用いられている方法である化学
的開裂方法には多数の不都合な面が存在している。つま
り、これらの方法には、多段階的、複合操作法や、操作
中での極度の低温保持、高価な試薬、廃棄物処理問題を
引きおこす大量の副産物の産生、及び化学的反応操作開
始前の不純物を多く含む出発材料の精製などといった、
操作及び配慮が必要なのである。従がって、現在用いら
れている化学的方法よりも、より経済的な方法という面
で、7−アミノセファロスポラン酸を提供しうる、セフ
ァロスポリンCの酵素的脱アシル化を目的とした、微生
物あるいは発酵的方法を用いた方法が目下開発中である
。
ル側鎖のアミン基、カルボキシル基の保護操作が必要で
あり、目下、種々の方法がこの方法遂行に際して使用さ
れている。ところが現在用いられている方法である化学
的開裂方法には多数の不都合な面が存在している。つま
り、これらの方法には、多段階的、複合操作法や、操作
中での極度の低温保持、高価な試薬、廃棄物処理問題を
引きおこす大量の副産物の産生、及び化学的反応操作開
始前の不純物を多く含む出発材料の精製などといった、
操作及び配慮が必要なのである。従がって、現在用いら
れている化学的方法よりも、より経済的な方法という面
で、7−アミノセファロスポラン酸を提供しうる、セフ
ァロスポリンCの酵素的脱アシル化を目的とした、微生
物あるいは発酵的方法を用いた方法が目下開発中である
。
しかしながら、この好結果をもたらす微生物学的方法に
おいても、かなりのむだな操作も含まれている事が示さ
れた。これは文献などによりセファロスポリンC分子の
アミノアジポイル側鎖の構造、特にその立体構造が明ら
かにされた結果であり、よって、ペニシリンなどは、種
々の微生物によって作り出されるペニシリンアシラーゼ
の使用による酵素的開裂の結果、脱アシル化された成功
例である。一方、文献に示されているセファロスポリン
Cの一段階酵素的脱アシル化反応に対する成功例の報告
は、再現性の乏しい、製産量にかなりの制限がある事を
証明していた。
おいても、かなりのむだな操作も含まれている事が示さ
れた。これは文献などによりセファロスポリンC分子の
アミノアジポイル側鎖の構造、特にその立体構造が明ら
かにされた結果であり、よって、ペニシリンなどは、種
々の微生物によって作り出されるペニシリンアシラーゼ
の使用による酵素的開裂の結果、脱アシル化された成功
例である。一方、文献に示されているセファロスポリン
Cの一段階酵素的脱アシル化反応に対する成功例の報告
は、再現性の乏しい、製産量にかなりの制限がある事を
証明していた。
更に、反応産物としての7−ACAの単離には、ただ一
つの酵素的転換方法による方法でセファロスポリンCか
ら7−ACAに変換するという、つまり真の意味での一
段階変換というものが必要なのではない。他の酵素でも
あるいはセファロスポリンCを、セファロスポリンCア
ミダーゼ酵素による開裂に十分に反応しうる他の化合物
へ転換しうるであろう。
つの酵素的転換方法による方法でセファロスポリンCか
ら7−ACAに変換するという、つまり真の意味での一
段階変換というものが必要なのではない。他の酵素でも
あるいはセファロスポリンCを、セファロスポリンCア
ミダーゼ酵素による開裂に十分に反応しうる他の化合物
へ転換しうるであろう。
例えば日本特許出願53−94093 (以下参照)の
メイン(Meij i)はセファロスポリンCアミダー
ゼと考えているところの物についての単離に関して記載
し、セファロスポリンCの7−ACAへの転換には、そ
れに先立ってD−アミノ酸オキシダーゼによるセファロ
スポリンCからグルタリル7−ACAへの酵素的変換の
ある事が唯一、示されている。
メイン(Meij i)はセファロスポリンCアミダー
ゼと考えているところの物についての単離に関して記載
し、セファロスポリンCの7−ACAへの転換には、そ
れに先立ってD−アミノ酸オキシダーゼによるセファロ
スポリンCからグルタリル7−ACAへの酵素的変換の
ある事が唯一、示されている。
シプヤ(Shibuya)等、アグリク、パイオル、ケ
ム。
ム。
(Agric、 Biol、 Chem、) 、第45
巻、第1561〜1567頁(1981)、参照。
巻、第1561〜1567頁(1981)、参照。
このように、セファロスポリンCの効率的な一段階酵素
脱アシル化反応による7−アミノセファロスポラン酸の
大量産生をもたらすバチラスメガチリウム株の獲得が可
能であるという事は意外な結果であった。更にこの後に
記載しである様に、一段階開裂が行なわれているという
明らかな証拠は、バチラスメガテリウム由来の酵素と伴
にインキュベーションしたセファロスポリンCより単離
された産生物、つまり7−ACAとアミノアジピン酸の
モル比がl:lであった事に示されている。
脱アシル化反応による7−アミノセファロスポラン酸の
大量産生をもたらすバチラスメガチリウム株の獲得が可
能であるという事は意外な結果であった。更にこの後に
記載しである様に、一段階開裂が行なわれているという
明らかな証拠は、バチラスメガテリウム由来の酵素と伴
にインキュベーションしたセファロスポリンCより単離
された産生物、つまり7−ACAとアミノアジピン酸の
モル比がl:lであった事に示されている。
セファロスポリンCの酵素的開裂を遂行するためのこれ
ら開発中の内容について記述しである文献についてまと
めた物を以下に詳しく記載した。
ら開発中の内容について記述しである文献についてまと
めた物を以下に詳しく記載した。
1、−1 アシル 、CehC→7−ΔCAデブ、
インド、ミクロバイアル、(Dev、 Ind。
インド、ミクロバイアル、(Dev、 Ind。
Microbial、) 、第5巻、第349頁(19
64)米国特許番号3,239,394 ウオルトン(Walton) (メルク(Merck)
)微生物のスクリーニング及び 選択における土壌栄養法 アクロモバクタ ブレビバクテリウム、 フラボバクテリウム 日本特許公報 53−94093 (1978)ゴイ
(Goi)等、(メイン(Meiji))シュードモナ
ス種 BN−188 日本特許公報 52−143289 (1977)米国
特許番号4,141,790 (メイン(Meiji)) アスペルギラス種
アルテルナリア種 日本特許公f1 61−21097 (1986)イチ
カワ(Ichikaiva)等、(アサヒ(Asahi
))シュードモナス種 5E−83(新種) フランス特許2,241,557(1975)(アリー
ス(Aries)) ハチラスセレウス変異株 フルオレセンス 西ドイツ特許3,447,023(1986)(ホーエ
クスト (Hoechs t) )α−ケト酸存在下、
酵素は D−アミノ酸トランスアミナーゼ バチラスリケニホルミス 2、− アシルし、ペニシリン−6−へPA
日本特許公報 58−190399 (ジオツギ(Shionogi)) バチラスメガテ
リウム変異株 ペニシリテカム 3、 ニ アシルヒ、Ce h C” 7−
へCA米国特許3,960,662 アグリク、パイオル、ケム、 (Agric、 Bi
olChem、)、第45巻、第1561−67頁(1
981)フジイ(Fujii)等、(トーヨージョーゾ
ー(Toyo Jozo)) D−アミノ酸オキシグーゼによる脱アミン化の後に脱ア
シル化 シュードモナス種4、 アシル
、GL−7−ACA”→7−八〇へ日へ特許公報 52
−128293 (1977)(トーヨージョーゾ−(
Toyo Jozo))ハ゛チラス、 アルスロバクタ− アルカリゲネス 5、 − アシル 、その →7−ACAプロセスバ
イオケム、 (Process Biochem、)、
第11巻、第21頁(1976) フジイ (Fujii)等、(トーヨージョーゾー(T
oyo Jozo)) フェニルアセチル7− スメガテリウム 米国特許番号3,522,250 ケルウィン(Kerwin)等、(アメリカンホームプ
ロダクツ(American tlome Produ
cts)セファロシン→7ーACへ 工・ソセリ・ンヒ
ア コリー日本特許公報 50 − 107186(ト
ーヨープレウイング(Toyo Brewing))フ
ェニルアセトアミド7−AcA33導体の脱アシル化 アルスロバクタ− パ°チラス、 エッセリソヒア、 クロイベラ、 ミクロコツカス、 ノカルジア、 プロテウス、 キサンソモナス 6、 アシル 、7−AC八へその日本特許公報
54−110394 (ハンユー(Banyu) ) 7−ACA セファピリン アルスロバクタ− ビスコサス ”GL−’1−ACA=グルタリル7−ACAあるいは
脱アミノされたceph C 本発明に従かい以下の方法を提供する。
64)米国特許番号3,239,394 ウオルトン(Walton) (メルク(Merck)
)微生物のスクリーニング及び 選択における土壌栄養法 アクロモバクタ ブレビバクテリウム、 フラボバクテリウム 日本特許公報 53−94093 (1978)ゴイ
(Goi)等、(メイン(Meiji))シュードモナ
ス種 BN−188 日本特許公報 52−143289 (1977)米国
特許番号4,141,790 (メイン(Meiji)) アスペルギラス種
アルテルナリア種 日本特許公f1 61−21097 (1986)イチ
カワ(Ichikaiva)等、(アサヒ(Asahi
))シュードモナス種 5E−83(新種) フランス特許2,241,557(1975)(アリー
ス(Aries)) ハチラスセレウス変異株 フルオレセンス 西ドイツ特許3,447,023(1986)(ホーエ
クスト (Hoechs t) )α−ケト酸存在下、
酵素は D−アミノ酸トランスアミナーゼ バチラスリケニホルミス 2、− アシルし、ペニシリン−6−へPA
日本特許公報 58−190399 (ジオツギ(Shionogi)) バチラスメガテ
リウム変異株 ペニシリテカム 3、 ニ アシルヒ、Ce h C” 7−
へCA米国特許3,960,662 アグリク、パイオル、ケム、 (Agric、 Bi
olChem、)、第45巻、第1561−67頁(1
981)フジイ(Fujii)等、(トーヨージョーゾ
ー(Toyo Jozo)) D−アミノ酸オキシグーゼによる脱アミン化の後に脱ア
シル化 シュードモナス種4、 アシル
、GL−7−ACA”→7−八〇へ日へ特許公報 52
−128293 (1977)(トーヨージョーゾ−(
Toyo Jozo))ハ゛チラス、 アルスロバクタ− アルカリゲネス 5、 − アシル 、その →7−ACAプロセスバ
イオケム、 (Process Biochem、)、
第11巻、第21頁(1976) フジイ (Fujii)等、(トーヨージョーゾー(T
oyo Jozo)) フェニルアセチル7− スメガテリウム 米国特許番号3,522,250 ケルウィン(Kerwin)等、(アメリカンホームプ
ロダクツ(American tlome Produ
cts)セファロシン→7ーACへ 工・ソセリ・ンヒ
ア コリー日本特許公報 50 − 107186(ト
ーヨープレウイング(Toyo Brewing))フ
ェニルアセトアミド7−AcA33導体の脱アシル化 アルスロバクタ− パ°チラス、 エッセリソヒア、 クロイベラ、 ミクロコツカス、 ノカルジア、 プロテウス、 キサンソモナス 6、 アシル 、7−AC八へその日本特許公報
54−110394 (ハンユー(Banyu) ) 7−ACA セファピリン アルスロバクタ− ビスコサス ”GL−’1−ACA=グルタリル7−ACAあるいは
脱アミノされたceph C 本発明に従かい以下の方法を提供する。
次の構造式を持つセファロスポリンC及びその類似体を
一段階変換反応によって (1,) COOM (式中 びR″は独立的にそれぞれ水素あるいは、たやすく除去
しうるカルボキシルあるいはアミン保8I基であり、あ
るいは抗菌性物質として7位の側鎖はセファロスポリン
として公知されている。
一段階変換反応によって (1,) COOM (式中 びR″は独立的にそれぞれ水素あるいは、たやすく除去
しうるカルボキシルあるいはアミン保8I基であり、あ
るいは抗菌性物質として7位の側鎖はセファロスポリン
として公知されている。
R2は一■]である。
R3は−Hあるいは一〇CMHzあるいはCIl□R4
であり R4は−H1−0H1あるいは−0−CCI+3である
。
であり R4は−H1−0H1あるいは−0−CCI+3である
。
またMは〇 −H、アルカリ金属、あるいはその他の
薬理的に許容される塩あるいはエステル、あるいはたや
すく除去しうるカルボキシル保護基である。) 次の構造式を持つ7−アミノセファロスポラン酸へ変換
する方法であり 構造式Iなる化合物を、構造式Iから構造式IIなる化
合物へと、一段階で変換しうる酵素、つまりセファロス
ポリンCアミダーゼと、伴に処理する方法であり、当該
酵素は、バチラスメガテリウムATCC53667、あ
るいはセファロスポリンCアミダーゼ産生またはその産
生を潜在的に保有しているそれらの派生物由来、あるい
は当該バチラスメガテリウムATCC53667、また
はセファロスポリンCアミダーゼ産生またはその産生を
潜在的に保有しているそれらの派生物の遺伝子的物質に
よる発現操作によって、獲得られたと特徴づけられてい
る酵素である。
薬理的に許容される塩あるいはエステル、あるいはたや
すく除去しうるカルボキシル保護基である。) 次の構造式を持つ7−アミノセファロスポラン酸へ変換
する方法であり 構造式Iなる化合物を、構造式Iから構造式IIなる化
合物へと、一段階で変換しうる酵素、つまりセファロス
ポリンCアミダーゼと、伴に処理する方法であり、当該
酵素は、バチラスメガテリウムATCC53667、あ
るいはセファロスポリンCアミダーゼ産生またはその産
生を潜在的に保有しているそれらの派生物由来、あるい
は当該バチラスメガテリウムATCC53667、また
はセファロスポリンCアミダーゼ産生またはその産生を
潜在的に保有しているそれらの派生物の遺伝子的物質に
よる発現操作によって、獲得られたと特徴づけられてい
る酵素である。
また本発明に従がい、同様に微生物バチラスメガテリウ
ムATCC53667、あるいはセファロスポリンCア
ミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有しているそ
れらの派生物をも提供する。
ムATCC53667、あるいはセファロスポリンCア
ミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有しているそ
れらの派生物をも提供する。
また本発明に従がい、更に、当該セフプロスポリンCア
ミダーゼを発現しうるバチラスメガテリウムATCC5
3667、あるいはセファロスポリンCアミダーゼ産生
あるいはその産生を潜在的に保有しているその派生物か
らのゲノム及び当該ゲノムの一部分である、これらゲノ
ムをも提供する。
ミダーゼを発現しうるバチラスメガテリウムATCC5
3667、あるいはセファロスポリンCアミダーゼ産生
あるいはその産生を潜在的に保有しているその派生物か
らのゲノム及び当該ゲノムの一部分である、これらゲノ
ムをも提供する。
また本発明に従かい更にまた、構造式1なる化合物を構
造式IIなる化合物へと一段階で変換しうる酵素、つま
りセフブロスボリンCアミダーゼを提供するものであり
、当該酵素とはバチラスメガテリウムATCC5366
7、あるいはセファロスポリンCアミダーゼ産生または
その産生を潜在的に保有しているそれらの派生物由来あ
るいは当該バチラスメガテリウムATCC53667、
またはセファロスポリンCアミダーゼ産生またはその産
生を潜在的に保有しているそれらの派生物の遺伝子的材
料物質による発現操作によって獲得されたと特徴づけら
れている酵素のことである。
造式IIなる化合物へと一段階で変換しうる酵素、つま
りセフブロスボリンCアミダーゼを提供するものであり
、当該酵素とはバチラスメガテリウムATCC5366
7、あるいはセファロスポリンCアミダーゼ産生または
その産生を潜在的に保有しているそれらの派生物由来あ
るいは当該バチラスメガテリウムATCC53667、
またはセファロスポリンCアミダーゼ産生またはその産
生を潜在的に保有しているそれらの派生物の遺伝子的材
料物質による発現操作によって獲得されたと特徴づけら
れている酵素のことである。
上記構造式Iの化合物に関して、セファロスボリンC7
−アミノアジポイル側鎖としてのR1基が、好ましい一
つの具体例として 110□C−Ctl(CHz) zcO−であることを
明らかにしていN+h る。このアミノアジポイル側鎖のカルボキシル及びアミ
ノ基両者に対する一般的な保護基はよく知られているの
で、R′及びR“は、それぞれたやすく除去しうるカル
ボキシルあるいはアミノ保護基を含む事が同様に定義さ
れている。
−アミノアジポイル側鎖としてのR1基が、好ましい一
つの具体例として 110□C−Ctl(CHz) zcO−であることを
明らかにしていN+h る。このアミノアジポイル側鎖のカルボキシル及びアミ
ノ基両者に対する一般的な保護基はよく知られているの
で、R′及びR“は、それぞれたやすく除去しうるカル
ボキシルあるいはアミノ保護基を含む事が同様に定義さ
れている。
“容易に除去しうるカルボキシルあるいはアミノ保護基
“という表現は、カルボキシルあるいはアミン基の水素
を別の一般的な置換基に代えてそれによって、その後に
引き続き行なわれる合成反応において使用される試薬と
当該基との反応を阻止する事を意味するものである。こ
の様なカルボキシルあるいはアミノ基の保護は時おり必
要なものであり、当該基も含めて、置換により望ましく
ない拮抗反応を阻止するものである。従がって、これら
化合物はすべて中間生成物とされている。
“という表現は、カルボキシルあるいはアミン基の水素
を別の一般的な置換基に代えてそれによって、その後に
引き続き行なわれる合成反応において使用される試薬と
当該基との反応を阻止する事を意味するものである。こ
の様なカルボキシルあるいはアミノ基の保護は時おり必
要なものであり、当該基も含めて、置換により望ましく
ない拮抗反応を阻止するものである。従がって、これら
化合物はすべて中間生成物とされている。
また同様に一般的な保護置換基は“容易に除去しうる”
という物でなければならず、それは選択的な除去を意味
するものである。すなわらセファロスポリン母核及び側
鎖において遂行されている一般的な操作過程に際しては
除去されにくい状態になっており、一方、反対にその結
果としてセファロスポリン母核の基本的環状構造や無保
護置換基に障害をもたらすことのない様な、おだやかな
操作方法により除去されうるちのであることを意味して
いる。
という物でなければならず、それは選択的な除去を意味
するものである。すなわらセファロスポリン母核及び側
鎖において遂行されている一般的な操作過程に際しては
除去されにくい状態になっており、一方、反対にその結
果としてセファロスポリン母核の基本的環状構造や無保
護置換基に障害をもたらすことのない様な、おだやかな
操作方法により除去されうるちのであることを意味して
いる。
R1はその上7位の側鎖はセファロスポリン抗菌性物質
として公知されている。本発明のセファロスポリンCア
ミダーゼはアミド結合を認識し、かつセファロスポリン
C分子の部分を全体として残すので、セファロスポリン
抗菌性物質として公知であるその他の側鎖つまりアミド
結合、及び共通にセファロスポリンC分子の部分を保有
しているすべての側鎖は、本質的には酵素的開裂に障害
を与えず、また、このようにして、セファロスポリンC
の7−アミノアジポイル側鎖の除去とある意味で類似し
た様な方法で除去されると予期されている。7位側鎖に
おいて知られているこの様な開裂は、セファロスポリン
抗菌性物質として知られているその他の誘導体において
も価値あるものである。
として公知されている。本発明のセファロスポリンCア
ミダーゼはアミド結合を認識し、かつセファロスポリン
C分子の部分を全体として残すので、セファロスポリン
抗菌性物質として公知であるその他の側鎖つまりアミド
結合、及び共通にセファロスポリンC分子の部分を保有
しているすべての側鎖は、本質的には酵素的開裂に障害
を与えず、また、このようにして、セファロスポリンC
の7−アミノアジポイル側鎖の除去とある意味で類似し
た様な方法で除去されると予期されている。7位側鎖に
おいて知られているこの様な開裂は、セファロスポリン
抗菌性物質として知られているその他の誘導体において
も価値あるものである。
R3基は代表的発酵産生物特有の種々の置tA基を含む
ものとされている。たとえば、セファロスポリンCに対
してR3はCH,R’であり、R4とは0CC1hであ
る。R3として限定されている置換基はいずれも本発明
のセファロスポリンCアミダーゼの酵素的反応をいかな
る点においても阻害するものではないと予期され、十分
に上記において検討されている理由に基づくものである
。
ものとされている。たとえば、セファロスポリンCに対
してR3はCH,R’であり、R4とは0CC1hであ
る。R3として限定されている置換基はいずれも本発明
のセファロスポリンCアミダーゼの酵素的反応をいかな
る点においても阻害するものではないと予期され、十分
に上記において検討されている理由に基づくものである
。
本発明に関する、セファロスポリンC及び類似体から7
−アミノ−セファロスポラン酸及びその類似体への一段
階酵素的変換方法の略図を以下に示す。
−アミノ−セファロスポラン酸及びその類似体への一段
階酵素的変換方法の略図を以下に示す。
R3基は代表的発酵産生物特有の種々の置換を含むもの
とされている。たとえばセファロスポリンCに対してR
3はCIhR’であり、R1とは0CCH3である。R
3として限定されている置換基はいずれも本発明のセフ
ァロスポリンCアミダーゼの酵素的反応を、いかなる点
においても阻害するものではないと予期され、十分に上
記において検討されている理由に基づくものである。
とされている。たとえばセファロスポリンCに対してR
3はCIhR’であり、R1とは0CCH3である。R
3として限定されている置換基はいずれも本発明のセフ
ァロスポリンCアミダーゼの酵素的反応を、いかなる点
においても阻害するものではないと予期され、十分に上
記において検討されている理由に基づくものである。
このようにして、本発明の方法に従ってデスアセトキシ
セファロスポリンC(R’=CII□R’ 、R’=H
)についても、本質的にはセファロスポリンCから7−
アミノセファロスポランill (7−ACA)への変
換と、同様の範囲で7−アミノデスアセトキシセファロ
スポラン酸(7−ADCA)へと、変換されるであろう
。これは、3位における官能基が酵素と基質との結合に
は重要な要素ではないという事実に起因するものである
。本発明にかかる、セファロスポリンC及び類似体から
7−アミノ−セファロスポラン酸及びその類似体への、
一段階酵素的変換方法の略図を以下に示す。
セファロスポリンC(R’=CII□R’ 、R’=H
)についても、本質的にはセファロスポリンCから7−
アミノセファロスポランill (7−ACA)への変
換と、同様の範囲で7−アミノデスアセトキシセファロ
スポラン酸(7−ADCA)へと、変換されるであろう
。これは、3位における官能基が酵素と基質との結合に
は重要な要素ではないという事実に起因するものである
。本発明にかかる、セファロスポリンC及び類似体から
7−アミノ−セファロスポラン酸及びその類似体への、
一段階酵素的変換方法の略図を以下に示す。
C00門
更に詳細に、このセファロスポリンCから7アミノセフ
アロスボラン酸への変換を図示すると以下の様になる。
アロスボラン酸への変換を図示すると以下の様になる。
本発明におけるセファロスポリンCアミダーゼを効果的
にもたらす本発明の方法は、構造式Iなる化合物との反
応においては、あらゆる点で遂行され、構造式■なる化
合物の構造式IIなる化合物への酵素的変換を誘起する
ものである。これはその広義の情況において“処理する
”という用語を定義するものである。通常、粗セファロ
スポリンCあるいは類似体の無細胞系培養液はその培地
を流動的供給方法において使用され、粗セファロスポリ
ンCアミダーゼ培養液と伴にバーチ方式によって処理す
るのが好ましい。この操作方法は、反応物のどの様な本
質的な精製も始めは必要のないことよりとても効率的な
アプローチの方法であると思われる。もち論、改良も可
能である。例えば、互いに反応させる前に必要な範囲に
おいて、いくらでも精製されるものである。同様に、パ
ッチ方式ではなく、連続方式によりこの方法を遂行する
ことも可能である。これら反応物の混合は方法の技術の
発展を考えながら種々の方法をもって改良されるもので
ある。従って、固定化酵素カラムは構造式Iなる化合物
を含むセファロスポリンCと、そのカラムに通すという
面において使用されるであろう。この様な方法の技術の
他の実施例には、膜リアクターに関するものがある。更
に反応物の混合に対する別の方法として、セファロスポ
リンCあるいは類似反応物産生時に用いた、同様の発酵
用培地におけるバチラスメガテリウムATCC5366
7あるいはその派生物の培養がある。また、−度セファ
ロスポリンCあるいは類似体を産生じた発酵用培地を更
にバチラスメガテリウムATCC53667あるいはそ
の派生物に用いて、それらを培養してセファロスポリン
Cアミダーゼを産生させるという改良も可能である。し
かしながらこの操作方法はその産生量において、最適な
方法ではないようである。反応物の混合方法は上記記載
にあるとおり、固定化酵素カラムを用いた方が好ましい
。
にもたらす本発明の方法は、構造式Iなる化合物との反
応においては、あらゆる点で遂行され、構造式■なる化
合物の構造式IIなる化合物への酵素的変換を誘起する
ものである。これはその広義の情況において“処理する
”という用語を定義するものである。通常、粗セファロ
スポリンCあるいは類似体の無細胞系培養液はその培地
を流動的供給方法において使用され、粗セファロスポリ
ンCアミダーゼ培養液と伴にバーチ方式によって処理す
るのが好ましい。この操作方法は、反応物のどの様な本
質的な精製も始めは必要のないことよりとても効率的な
アプローチの方法であると思われる。もち論、改良も可
能である。例えば、互いに反応させる前に必要な範囲に
おいて、いくらでも精製されるものである。同様に、パ
ッチ方式ではなく、連続方式によりこの方法を遂行する
ことも可能である。これら反応物の混合は方法の技術の
発展を考えながら種々の方法をもって改良されるもので
ある。従って、固定化酵素カラムは構造式Iなる化合物
を含むセファロスポリンCと、そのカラムに通すという
面において使用されるであろう。この様な方法の技術の
他の実施例には、膜リアクターに関するものがある。更
に反応物の混合に対する別の方法として、セファロスポ
リンCあるいは類似反応物産生時に用いた、同様の発酵
用培地におけるバチラスメガテリウムATCC5366
7あるいはその派生物の培養がある。また、−度セファ
ロスポリンCあるいは類似体を産生じた発酵用培地を更
にバチラスメガテリウムATCC53667あるいはそ
の派生物に用いて、それらを培養してセファロスポリン
Cアミダーゼを産生させるという改良も可能である。し
かしながらこの操作方法はその産生量において、最適な
方法ではないようである。反応物の混合方法は上記記載
にあるとおり、固定化酵素カラムを用いた方が好ましい
。
更に以下記載の操作実施例は、酵素の濃度を増大し、か
つ、それによって7−アミノセファロスポラン酸の獲得
量をより増進する目的には十分な方法で、セファロスポ
リンCアミダーゼの予備実験的な精製方法をも含む、セ
ファロスポリンCの酵素的脱アシル化を説明する為の、
現在用いられている方法を、記載したものである。それ
ゆえ、実施例中における方法について商業的製造に対す
る有用性という面では必ずしも示唆されるものではない
であろう。
つ、それによって7−アミノセファロスポラン酸の獲得
量をより増進する目的には十分な方法で、セファロスポ
リンCアミダーゼの予備実験的な精製方法をも含む、セ
ファロスポリンCの酵素的脱アシル化を説明する為の、
現在用いられている方法を、記載したものである。それ
ゆえ、実施例中における方法について商業的製造に対す
る有用性という面では必ずしも示唆されるものではない
であろう。
微生物の種々の株より作り出される期待しうる産生物の
量の増進に対しては、発酵業者間では公知の技術がかな
りある。例えば、与えられた産生株を、放射あるいは照
射する事により微生物の遺伝子的材料物質の段階におけ
る変異株作成をより強く増進すると知られている、その
他の刺激株とする事。敏感な選択方法の使用により期待
すべき産生物の産生量を増大しうる株を、数多くの変異
株中より選択する事が可能である。この方法においても
、引き続き、種々の選択されてきた派生物からの産生株
の取り出しに対する改良も可能である。本発明に関して
、選択されたバチラスメガテリウムATCC53667
の派生物によるセファロスポリンCアミダーゼの取り出
しに対する同様の改良がなされている。この目的にあっ
た満足のいく選択方法は、低濃度のレベルでも酵素的開
裂産生の検出が可能であり、それによりセファロスポリ
ンCアミダーゼがいかなる特定の派生物から作り出され
ているかという問題をはっきりと確定する高速流体クロ
マトグラフィーの使用である。同様に、この選択方法は
更に効率よくセファロスポリンCアミダーゼを産生ずる
派生物を提供し、それによってセファロスポリンCから
7−アミノセファロスポラン酸への酵素的変換における
高い産生量をもたらす可能性を持っている。
量の増進に対しては、発酵業者間では公知の技術がかな
りある。例えば、与えられた産生株を、放射あるいは照
射する事により微生物の遺伝子的材料物質の段階におけ
る変異株作成をより強く増進すると知られている、その
他の刺激株とする事。敏感な選択方法の使用により期待
すべき産生物の産生量を増大しうる株を、数多くの変異
株中より選択する事が可能である。この方法においても
、引き続き、種々の選択されてきた派生物からの産生株
の取り出しに対する改良も可能である。本発明に関して
、選択されたバチラスメガテリウムATCC53667
の派生物によるセファロスポリンCアミダーゼの取り出
しに対する同様の改良がなされている。この目的にあっ
た満足のいく選択方法は、低濃度のレベルでも酵素的開
裂産生の検出が可能であり、それによりセファロスポリ
ンCアミダーゼがいかなる特定の派生物から作り出され
ているかという問題をはっきりと確定する高速流体クロ
マトグラフィーの使用である。同様に、この選択方法は
更に効率よくセファロスポリンCアミダーゼを産生ずる
派生物を提供し、それによってセファロスポリンCから
7−アミノセファロスポラン酸への酵素的変換における
高い産生量をもたらす可能性を持っている。
この様なバチラスメガテリウムATCC53667のす
べての派生物は、ここに記載されているとおり、そのす
べてがより効率のいいセファロスポリンCアミダーゼを
作るものであることより、本発明の範囲の中に入れであ
る。
べての派生物は、ここに記載されているとおり、そのす
べてがより効率のいいセファロスポリンCアミダーゼを
作るものであることより、本発明の範囲の中に入れであ
る。
また遺伝子的材料物質の処理を可能にするところの技術
も、今は、有効な手段となっている。すなわち、微生物
の表面にそれらのすべて、あるいは選択された部分が発
現させられる微生物のゲノムを用いる事であり、例えば
他の微生物としたら大腸菌の様な物である。エンドヌク
レアーゼ制限酵素の使用はバチラスメガテリウムATC
C53667、あるいはセファロスポリンC産生または
その産生を潜在的に保有しているそれらの派生物などの
遺伝子的材料物質を切断し、ある種の別な微生物あるい
は遺伝子物質を発現しうる様な生体系の遺伝子と伴に、
それらを組換える事を可能にした。すなわち、セファロ
スポリンCアミダーゼ産生をツー1゛シているメツセン
ジャーRNAに串じたタンパク質を形成するという事で
ある。公知されている様に、この方法においては、種々
のイントロンや他の遺伝子コートも含まれている。
も、今は、有効な手段となっている。すなわち、微生物
の表面にそれらのすべて、あるいは選択された部分が発
現させられる微生物のゲノムを用いる事であり、例えば
他の微生物としたら大腸菌の様な物である。エンドヌク
レアーゼ制限酵素の使用はバチラスメガテリウムATC
C53667、あるいはセファロスポリンC産生または
その産生を潜在的に保有しているそれらの派生物などの
遺伝子的材料物質を切断し、ある種の別な微生物あるい
は遺伝子物質を発現しうる様な生体系の遺伝子と伴に、
それらを組換える事を可能にした。すなわち、セファロ
スポリンCアミダーゼ産生をツー1゛シているメツセン
ジャーRNAに串じたタンパク質を形成するという事で
ある。公知されている様に、この方法においては、種々
のイントロンや他の遺伝子コートも含まれている。
実際、この技術の進歩は、その様な発現という面におい
ても、すぐに適応されるものである。例えば半ビボ(e
x vivo)において、細胞部分及びmRNAを用い
て生体系の外部へ発現させうる事が可能である。しかし
ながら上記記載の発現系のタイプにおける基本的な目的
はどれでも同じで、与えられたバチラスメガテリウムA
TCC53667、あるいは特定の派生物由来の遺伝子
的材料物質により産生されうるセファロスポリンCアミ
ダーゼの量を増大させることにある。また同様に、その
様な酵素の総合的な期待される結合特性についての明ら
かにされた知識に従って、より効果的なセファロスポリ
ンCアミダーゼを産生ずる為に遺伝子的材料物質を交換
しうる可能性もある。よって本発明のセファロスポリン
Cアミダーゼを産生ずるバチラスメガテリウムATCC
53667、あるいはセファロスポリンCアミダーゼ産
生またはその産生を潜在的に保有しているその派生物に
おける遺伝子的材料物質のいかなる発現も本発明の範囲
の中に入れられる。
ても、すぐに適応されるものである。例えば半ビボ(e
x vivo)において、細胞部分及びmRNAを用い
て生体系の外部へ発現させうる事が可能である。しかし
ながら上記記載の発現系のタイプにおける基本的な目的
はどれでも同じで、与えられたバチラスメガテリウムA
TCC53667、あるいは特定の派生物由来の遺伝子
的材料物質により産生されうるセファロスポリンCアミ
ダーゼの量を増大させることにある。また同様に、その
様な酵素の総合的な期待される結合特性についての明ら
かにされた知識に従って、より効果的なセファロスポリ
ンCアミダーゼを産生ずる為に遺伝子的材料物質を交換
しうる可能性もある。よって本発明のセファロスポリン
Cアミダーゼを産生ずるバチラスメガテリウムATCC
53667、あるいはセファロスポリンCアミダーゼ産
生またはその産生を潜在的に保有しているその派生物に
おける遺伝子的材料物質のいかなる発現も本発明の範囲
の中に入れられる。
本明細書中で用いられている“セファロスポリンCアミ
ダーゼ産生、あるいは、またはその産生を潜在的に保有
している派生物”という表現は、すべての派生物がセフ
ァロスポリンCアミダーゼを産生ずるのではなく、また
これらの非産生派生物が本発明の一部分を構成するもの
ではなく、反対にこの非産生派生物が発現した時にセフ
ァロスポリンCアミダーゼを作り出すことの出来る遺伝
子的材料物質を保有しているという事、また、遺伝子的
物質がある種の別な特徴をコードしているならば、発現
は起こらないといった、これら事実を、単純に表わした
表現である。その様な派生物は“産生を潜在的に保有し
ている”派生物であり明らかに本発明の一部分を構成し
ているものである。
ダーゼ産生、あるいは、またはその産生を潜在的に保有
している派生物”という表現は、すべての派生物がセフ
ァロスポリンCアミダーゼを産生ずるのではなく、また
これらの非産生派生物が本発明の一部分を構成するもの
ではなく、反対にこの非産生派生物が発現した時にセフ
ァロスポリンCアミダーゼを作り出すことの出来る遺伝
子的材料物質を保有しているという事、また、遺伝子的
物質がある種の別な特徴をコードしているならば、発現
は起こらないといった、これら事実を、単純に表わした
表現である。その様な派生物は“産生を潜在的に保有し
ている”派生物であり明らかに本発明の一部分を構成し
ているものである。
上記記載の株はアメリカン タイプ カルテャコレクシ
ョン(ATCC)に寄託されたものであり、寄託番号は
53667である。
ョン(ATCC)に寄託されたものであり、寄託番号は
53667である。
セファロスポリンCの酵素的脱アシル化により7−アミ
ノセファロスポラン酸(7−ACA)を獲得する手順を
説明するために、以下に一般的な方法を用いて示した。
ノセファロスポラン酸(7−ACA)を獲得する手順を
説明するために、以下に一般的な方法を用いて示した。
↓
液体シード培地に植菌
↓ 24時間、30℃
プロダクション培地に移植
↓ 41時間、30℃
細胞懸濁液をハーベスト、次に遠心により細胞を除去
↓
60%から80%の飽和硫安(N II 4)2 SO
aによる濃縮及び部分精製活性物の分画 孟牲少別足 酸素0.9mj?を20mg/m/セファロスポリンC
0,1m6と伴にインキュベート、37℃、3時間後に
HP L Cアッセイにより?−ACAを測定更に詳細
な、この−船釣方法を以下に示す。
aによる濃縮及び部分精製活性物の分画 孟牲少別足 酸素0.9mj?を20mg/m/セファロスポリンC
0,1m6と伴にインキュベート、37℃、3時間後に
HP L Cアッセイにより?−ACAを測定更に詳細
な、この−船釣方法を以下に示す。
夫枢桝上
バチラスメガテリウム培養由来のセフプロスポリ1、株
を以下の成分よりなる0M寒天プレートあるいは傾斜寒
天中において保持する。
を以下の成分よりなる0M寒天プレートあるいは傾斜寒
天中において保持する。
成分 g/l
ビーフエキス 1.5
イーストエキス 3.0
カシトン 4.0 培地は滅菌前にペプ
トン 6.OpH6,4に調整するグルコ
ース 1.0 可溶性スターチ 20.0 寒天 15・0 2、CMプレート上でストリークしたコロニーより再単
離して更に1〜3日、30℃で培養する、単離したコロ
ニーをCM斜面培養(8+nj!/18酊チユーブ)に
植菌し、集密的になるまで増殖させる。
トン 6.OpH6,4に調整するグルコ
ース 1.0 可溶性スターチ 20.0 寒天 15・0 2、CMプレート上でストリークしたコロニーより再単
離して更に1〜3日、30℃で培養する、単離したコロ
ニーをCM斜面培養(8+nj!/18酊チユーブ)に
植菌し、集密的になるまで増殖させる。
斜面培養菌を滅菌蒸留水5m!!で洗浄し、細胞懸濁液
を得る。以下の成分(AあるいはB)を含むシード培地
(20ml/250mlエーレンマイヤーフラスコ)に
その菌液1mlを植菌する。
を得る。以下の成分(AあるいはB)を含むシード培地
(20ml/250mlエーレンマイヤーフラスコ)に
その菌液1mlを植菌する。
成分 A(g/ I! ) B(g/ l )ビー
フエキス 1.5 1.5イーストエキ
ス 3.0 3.0カントン
4.0 4.0 滅菌前にpH7,0デキストロ
ース 1.0 0.5 に調整する可ン
容1生スターチ 20.0 20.0力ゼイ
ン加水分解産物 4.0 4、 回転振とう機(22Orpm)で30℃、24時
間、培養後、そのシード培養菌0.5mlを以下の成分
(CあるいはD)を含むプロダクション培地に移植する
。
フエキス 1.5 1.5イーストエキ
ス 3.0 3.0カントン
4.0 4.0 滅菌前にpH7,0デキストロ
ース 1.0 0.5 に調整する可ン
容1生スターチ 20.0 20.0力ゼイ
ン加水分解産物 4.0 4、 回転振とう機(22Orpm)で30℃、24時
間、培養後、そのシード培養菌0.5mlを以下の成分
(CあるいはD)を含むプロダクション培地に移植する
。
3゜
成分 C(g/ 1 ) D(g/ e )ビーフ
エキス 4.5 −4.5カシトン
9.8 9.0大豆ミール 9
.0 9.0デキストロース 3.0
3.0可溶性スターチ 60.0 マルトース 60,0フエニル酢
酸 1.5 1.5両培地とも、培地のp
Hは7に調整し、250m1のフラスコへ30mAずつ
分注する。培地はオートクレーブにかけて滅菌する。シ
ード培養菌を植菌した後、フラスコを回転振とう機(2
20rpm)で48〜60時間、30℃で培養する。
エキス 4.5 −4.5カシトン
9.8 9.0大豆ミール 9
.0 9.0デキストロース 3.0
3.0可溶性スターチ 60.0 マルトース 60,0フエニル酢
酸 1.5 1.5両培地とも、培地のp
Hは7に調整し、250m1のフラスコへ30mAずつ
分注する。培地はオートクレーブにかけて滅菌する。シ
ード培養菌を植菌した後、フラスコを回転振とう機(2
20rpm)で48〜60時間、30℃で培養する。
5、同様に同相培地による発酵操作も可能である。
この場合は、上記C培地に2%の寒天を加えて固定化す
る。そして、細胞は培地表面より501のT E S
/NaOH,p)l 7.5を用いて、洗浄しながら取
り出す。以下にその過程を示す。
る。そして、細胞は培地表面より501のT E S
/NaOH,p)l 7.5を用いて、洗浄しながら取
り出す。以下にその過程を示す。
群素少皿双
1、 すべての培地(あるいは同相産生培地の時の細胞
洗浄懸濁液)に対して、固体硫酸アンモニウムを60%
会包和になるまで、0“Cにおいて、徐々に加えて行く
。得られたスラリーを0℃、1時間、放置しておく。
洗浄懸濁液)に対して、固体硫酸アンモニウムを60%
会包和になるまで、0“Cにおいて、徐々に加えて行く
。得られたスラリーを0℃、1時間、放置しておく。
26混合物を遠心(9200xg、20分、4℃)にか
けペレットを除去する。上清液の容量を測り、更に、0
°CT:攪拌しながら80%飽和に達するまで固体硫酸
アンモニウムを加え、得られたスラリーを0 ’c、1
時間、放置しておく。
けペレットを除去する。上清液の容量を測り、更に、0
°CT:攪拌しながら80%飽和に達するまで固体硫酸
アンモニウムを加え、得られたスラリーを0 ’c、1
時間、放置しておく。
3、 9200Xg、20分、4℃の遠心によるペレッ
トを集め、以下の成分より成る緩衝液で、このペレット
を1150容量(培養上清の最初の容量に対する容量)
に再懸濁する、50mF′ITES/Na011、pl
+8.0及び5%(w/v)グリセロール。
トを集め、以下の成分より成る緩衝液で、このペレット
を1150容量(培養上清の最初の容量に対する容量)
に再懸濁する、50mF′ITES/Na011、pl
+8.0及び5%(w/v)グリセロール。
もし必要があれば、得られた混合物を短時間の遠心にか
け、清浄化した後、その上清液を0.45μmナイロン
−66のメンプランで濾過し、活性をアッセイする。ま
た、もし活性のアッセイが酵素調製時に同時に行なえな
いのならばサンプルは一30℃で少なくとも3週間は保
存可能であろう。
け、清浄化した後、その上清液を0.45μmナイロン
−66のメンプランで濾過し、活性をアッセイする。ま
た、もし活性のアッセイが酵素調製時に同時に行なえな
いのならばサンプルは一30℃で少なくとも3週間は保
存可能であろう。
孟几皿定
1、基質保存溶液は1mj2緩衝液(成分、上述)に2
0mgのセファロスポリンCカリウム塩を?容量して調
製し、0.45μmナイロン−66メンプランで濾過す
る。
0mgのセファロスポリンCカリウム塩を?容量して調
製し、0.45μmナイロン−66メンプランで濾過す
る。
2、回収された酵素(0,9m6)にセファロスポリン
C保存溶液(0,1m/りを加え、この混合物を37℃
の湯浴中に置き、3〜6時間のインキュベーション後、
7−ACAの形成を11 P L Cで追跡する。以下
の条件でクロマトグラフィーを行なった。
C保存溶液(0,1m/りを加え、この混合物を37℃
の湯浴中に置き、3〜6時間のインキュベーション後、
7−ACAの形成を11 P L Cで追跡する。以下
の条件でクロマトグラフィーを行なった。
移動相 50mM KH2PO4KOft 、 pH
4,7流速 2.Omj!/分 カラム ヌクレオシル10 Cl8(マチエリ−(M
achery)−ナケル(Nagel)0、4 X 2
5 cm 温度 室温 検出 260nm サンプルサイズ 20μ! 装置 スペクトル(Spectra)−フィジイクス
(Phys 1cs)あるいは等価型 7−ACAの標準保持時間は、この条件下で約6.0分
。
4,7流速 2.Omj!/分 カラム ヌクレオシル10 Cl8(マチエリ−(M
achery)−ナケル(Nagel)0、4 X 2
5 cm 温度 室温 検出 260nm サンプルサイズ 20μ! 装置 スペクトル(Spectra)−フィジイクス
(Phys 1cs)あるいは等価型 7−ACAの標準保持時間は、この条件下で約6.0分
。
盾性至■定猪来
1、上記記載の操作により、2■/ m 1のセファロ
スポリンC存在下での、3時間、37℃、インキュベー
ション後では、その酵素調製物は319crg/mj+
の7−ACAを産生じた。
スポリンC存在下での、3時間、37℃、インキュベー
ション後では、その酵素調製物は319crg/mj+
の7−ACAを産生じた。
2、 より高レベルの7−ACAは、硫酸アンモニウム
の沈澱形成ステップでの酵素の溶解容量をより少量にす
ることで、酵素を更に濃縮して獲得する事ができる。同
様に、液体培地におけるよりも、更に高い細胞濃度を与
える固相培地での産生発酵に対しても操作可能である(
上述、パート■参照)。
の沈澱形成ステップでの酵素の溶解容量をより少量にす
ることで、酵素を更に濃縮して獲得する事ができる。同
様に、液体培地におけるよりも、更に高い細胞濃度を与
える固相培地での産生発酵に対しても操作可能である(
上述、パート■参照)。
災止尉1
セファロスポリンCから7−アミノセファロスポラン酸
への一段階酵素的変換:開裂産生物の直接本発明に関す
るセファロスポリンCから7−アミノセファロスポラン
酸(7−ACA)への変換は実際に、一つの酵素(つま
りセファロスポリンCアミダーゼ)、により行なわれた
、一段階方法によるものであるという更にはっきりとし
た証拠を提供するために、実施例1に記載されているH
P L Cによる7−ACA形成の測定に関して以外
は、実施例1に記載のある方法で開裂を行なってみると
、その他の開裂産生物、アミノアジピン酸の存在も同様
に測定された。この測定は、ベックマン6300高速分
析機を用いて行なった。酵素をセファロスポリンC(最
終温度2nw/ml)と伴に、2.8時間、37°Cで
インキュベーションした。結果を以下に数値表として示
した。
への一段階酵素的変換:開裂産生物の直接本発明に関す
るセファロスポリンCから7−アミノセファロスポラン
酸(7−ACA)への変換は実際に、一つの酵素(つま
りセファロスポリンCアミダーゼ)、により行なわれた
、一段階方法によるものであるという更にはっきりとし
た証拠を提供するために、実施例1に記載されているH
P L Cによる7−ACA形成の測定に関して以外
は、実施例1に記載のある方法で開裂を行なってみると
、その他の開裂産生物、アミノアジピン酸の存在も同様
に測定された。この測定は、ベックマン6300高速分
析機を用いて行なった。酵素をセファロスポリンC(最
終温度2nw/ml)と伴に、2.8時間、37°Cで
インキュベーションした。結果を以下に数値表として示
した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、セファロスポリンC及びその類似体を一段階変換反
応によりそれぞれ対応する7−アミノセファロスポラン
酸及びその類似体に変換する方法において、当該セファ
ロスポリンC及び類似体をバチラスメガテリウムATC
C53667由来、あるいはセファロスポリンCアミダ
ーゼ産生、またはその産生を潜在的に保有しているそれ
らの派生物由来、あるいは当該バチラスメガテリウムA
TTCC 53667、またはセファロスポリンCアミ
ダーゼ産生、またはその産生を潜在的に保有しているそ
れらの派生物の遺伝子的物質による発現操作によって得
られたセファロスポリンCアミダーゼによって処理する
ことよりなる一段階変換方法。 2、次の構造式を持つセファロスポリンC及びその類似
体を一段階変換反応によって ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中 R^1は▲数式、化学式、表等があります▼、であり R′及びR″は独立的にそれぞれ水素あるいは、たやす
く除去しうるカルボキシルあるいはアミノ保護基であり
、あるいは7位の側鎖はセファロスポリン抗菌性物質と
して公知されている。 R^2は−Hである。 R^3は−Hあるいは▲数式、化学式、表等があります
▼あるいはCH_2R^4であり、 R^4は−H、−OH、あるいは▲数式、化学式、表等
があります▼である。 またMは^■、−H、アルカリ金属、あるいはその他の
薬理的に許容される塩あるいはエステルあるいは容易に
除去しうるカルボキシル保護基である。) 次の構造式をもつ7−アミノセファロスポラン酸へ変換
する方法であり ▲数式、化学式、表等があります▼(II) 構造式 I なる化合物を、構造式 I から構造式IIなる化
合物へと一段階で変換しうる酵素、つまりセファロスポ
リンCアミダーゼとともに処理する方法であって、当該
酵素は、バチラスメガテリウムATCC53667、あ
るいはセファロスポリンCアミダーゼ産生またはその産
生を潜在的に保有しているそれらの派生物由来、あるい
は当該バチラスメガテリウムATCC53667、また
はセファロスポリンCアミダーゼ産生またはその産生を
潜在的に保有しているそれらの派生物の遺伝子的物質に
よる発現操作によって、獲得されることにより特徴づけ
られている酵素である、一段階変換方法。 3、構造式 I なる化合物がセファロスポリンCであり
、構造式IIなる化合物が7−アミノセファロスポラン酸
である請求項2記載の方法。 4、微生物バチラスメガテリウムATCC53667、
あるいはセファロスポリンCアミダーゼ産生、あるいは
その産生を潜在的に保有しているその派生物。 5、バチラスメガテリウムATCC53667。 6、当該セファロスポリンCアミダーゼを発現しうる、
バチラスメガテリウムATCC53667、あるいはセ
ファロスポリンCアミダーゼ産生あるいはその産生を潜
在的に保有しているその派生物からのゲノム及び当該ゲ
ノムの一部分よりなるこれらゲノム。 7、ゲノムがバチラスメガテリウムATCC53667
のものである請求項6記載のゲノム。 8、請求項2において限定されている構造式 I なる化
合物を請求項2において限定されている構造式IIなる化
合物へ、一段階で変換しうる酵素、つまりセファロスポ
リンCアミダーゼであり、当該酵素とはバチラスメガテ
リウムATCC53667、あるいはセファロスポリン
Cアミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有してい
るそれらの派生物由来、あるいは当該バチラスメガテリ
ウムATCC53667、またはセファロスポリンCア
ミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有しているそ
れらの派生物の遺伝子的物質による発現操作によって獲
得されたと特徴づけられている酵素。 9、酵素がバチラスメガテリウムATCC53667に
より産生されたものである請求項8記載の酵素。
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