CN110408620B - 一种核酸适配子、其获得方法、其衍生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核酸适配子、其获得方法、其衍生物及其应用，核酸适配子的序列为5’‑GACCCTGACTNACACGGTG‑3’；N为随机序列；核酸适配子的获得方法：截短步骤：将靶向人肝癌细胞HepG2的适配子JHIT从5’端和3’端进行核苷酸的截短；适配子JHIT的序列为5’‑AGAGACCCTGACTNACACGGTGGCTTCTT‑3’；N为随机序列；预测步骤：预测经截短的适配子JHIT为含有二级结构，选择最短序列，得到核酸适配子；核酸适配子的应用为将核酸适配子用于识别肝癌细胞HepG2；核酸适配子易进行结构‑‑活性关系研究，可作为代替特异性抗体的靶向探针进行后续的肝细胞癌的诊断与治疗。

Description

一种核酸适配子、其获得方法、其衍生物及其应用
技术领域
本发明涉及一种核酸适配子、其获得方法、其衍生物及其应用，属于分子生物技术领域。
背景技术
寡核苷酸适配子(aptamer)也叫适配子、适配体或核酸适体，是用指数富集配基的***进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELE X)技术，通过体外筛选、扩增和富集获得的、能和小分子物质、多肽、蛋白质、细胞器、核酸及细胞和组织等靶物质高亲和性、高特异性结合的单链DNA/RN A寡核苷酸，其与靶点结合的结构基础是因其可折叠成独特的二级或三级结构从而对靶标有非常高的亲和力和特异性。适配子的作用类似于抗体，凡是涉及抗体的应用领域，几乎都可以用寡核苷酸适配子代替。由于适配子的特异结合性，因此可用于筛选和识别靶标物质，在药物筛选、分析检测等领域都有广泛的应用。
对于肝癌，由于患者症状的显现较晚，多数肝癌患者诊断时已为晚期，即使早期发现，术后复发率也非常高，严重威胁我国人民健康，肝癌靶向剂对于晚期肝癌、术后肿瘤复发的特异性诊断、治疗均具有重要意义，适配子可用于肝癌靶标的确定，进一步提高其特异性和亲和力则有利于加快诊断速度、提高精确性。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种核酸适配子，该核酸适配子的结构得到了优化，亲和力和特异性大大提高。
本发明的第二个目的在于提供上述核酸适配子的获得方法。
本发明的第三个目的提供上述核酸适配子的衍生物，该衍生物具有与核酸适配子相同或类似的功能。
本发明的第四个目的在于提供上述核酸适配子的应用。
实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种核酸适配子，核酸适配子的序列为5’-GACCCTGACTNACACGGTG- 3’；N为随机序列；如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，随机序列N为GCGAACCCAATCGCACCACATCTCAACATGT GG，如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，核酸适配子的Kd值为12.18±4.93nM。
进一步地，核酸适配子包括二级结构。
进一步地，二级结构为茎环结构。
进一步地，随机序列包含于茎环结构中。
实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种核酸适配子的获得方法，包括：
截短步骤：将靶向人肝癌细胞HepG2的适配子JHIT从5’端和3’端进行核苷酸的截短；适配子JHIT的序列为5’-AGAGACCCTGACTNACACGGTGGCT TCTT-3’；N为随机序列，如SEQID NO.3所示；
预测步骤：预测经截短的适配子JHIT为含有二级结构，选择最短序列，得到核酸适配子。
进一步地，截短步骤中，适配子JHIT通过Cell-SELEX技术筛选得到。
进一步地，预测步骤中，通过RNAstructure-6.1和mfold预测程序中的至少一种进行预测。
进一步地，预测步骤中，二级结构为茎-环结构。
实现本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种核酸适配子的衍生物，衍生物通过对核酸适配子进行核苷酸取代或修饰得到；核酸适配子的序列为5’-GACCCTGACTNACACGGTG-3’；N为随机序列。
进一步地，修饰为磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化和同位素化中的至少一种，但不限于以上列举的修饰方式；修饰基团为生物素基团、放射性物质、治疗性物质、地高辛、荧光基团、纳米发光材料和酶标记中的至少一种，但不限于以上列举的修饰基团。
实现本发明的第四个目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种核酸适配子的应用，将核酸适配子用于识别肝癌细胞HepG2；核酸适配子的序列为5’-GACCCTGACTNACACGGTG-3’；N为随机序列。
本发明的配方设计原理如下：经研究认为，常规方法筛选适配子，筛选过程产生的全长适配子包括了在核苷酸的两个末端用于PCR扩增的固定引物序列，但并非适配子的所有核苷酸都是组成靶向性的必需结构，然而，如果适配子的核苷酸链更短，能够体现更高的亲和力及特异性，良好的合成效益；基于以上，本发明首先将全长适配子进行截短优化，但保留相似的二级结构，从而获得全新的核酸适配子。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明核酸适配子的相对分子质量较小，能够比单克隆抗体低1个数量级，穿透组织能力强，从血液中清除快，进入组织后能在较早时间点上获得较高信噪比，比抗体高200多倍；
2、本发明核酸适配子对靶分子或靶蛋白具有很强的亲和力和特异性，解离常数一般为nmol/L-pmol/L；
3、本发明核酸适配子稳定性好，在pH4.0–9.0及<35℃下可长期保存或运输；
4、本发明核酸适配子可全长合成，方法简单、重复性好，批量间差异极小；
5、本发明核酸适配子易进行结构--活性关系研究，位点特异修饰或偶联单一络合分子、光活化探针、放射性核素、毒素及药物动力学修饰；可作为代替特异性抗体的靶向探针进行后续的肝细胞癌的诊断与治疗，相当于找到一个抗人肝癌细胞的“抗体”，将来可以用于肝癌的检测、靶向治疗载体；
6、本发明核酸适配子的靶分子更为广泛，甚至包括细胞，而且可以不需要事先知道靶标、在活细胞情况下筛选；因此核酸适配子具有类抗体作用且能克服抗体缺点，其研究结果容易向临床推广。
附图说明
图1为实施例1RNAstructure-6.1和mfold预测程序预测图示；
图2为实施例2细胞结合情况对比；
图3为实施例2细胞结合情况对比；
图4为实施例3荧光强度与适配子浓度的关系曲线图；
图5为实施例4特异性结合能力荧光图示。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
一种核酸适配子，核酸适配子的序列为5’-GACCCTGACTNACACGGTG- 3’；N为GCGAACCCAATCGCACCACATCTCAACATGTGG；核酸适配子的1 2.18±4.93nM；核酸适配子包括茎环结构，随机序列N包含于茎环结构中。
上述核酸适配子通过以下方法获得：
截短步骤：通过Cell-SELEX技术筛选得到靶向人肝癌细胞HepG2的适配子JHIT，将适配子JHIT从5’端和3’端进行核苷酸的截短；适配子JHIT的序列为5’-AGAGACCCTGACTNACACGGTGGCTTCTT-3’；N为随机序列；
预测步骤：通过RNAstructure-6.1和mfold预测程序预测经截短的适配子J HIT为含有茎-环结构，选择最短序列，得到核酸适配子。
我们使用RNAstructure-6.1、mfold两种核酸二级结构预测程序进行JHIT2 二级结构的预测，以中间随机序列所形成的二级结构为基础，分别从5’端和3’端进行核苷酸的截短，再用两种软件进行相应二级结构的预测，对比之后确定最短且能保持其主要二级结构的序列。根据两种核酸二级结构预测程序结果显示，JHIT2序列中的中间随机序列形成主要的二级茎-环结构，这意味着此茎-环结构对靶向结合尤为重要，细微的差异就能导致特异性及亲和力的较大变化。我们以此结构为基础，分别从5’端和3’端进行一定数量核苷酸的截短优化，综合两种二级结构预测程序的结果得到截短优化后的核酸适配子，能最终保持其二级结构不变，再继续截短，其二级结构将发生明显的变化。因此，我们确定以最短且能保持其主要二级结构的序列。
核酸适配子的相对分子质量约15000，比单克隆抗体(约150000)低1个数量级，因此穿透组织能力强，从血液中清除快。
核酸适配子的衍生物可以达到与核酸适配子相同或相似进行肝癌细胞Hep G2识别的功能；衍生物通过对核酸适配子进行核苷酸取代或修饰得到；修饰为磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化和同位素化中的至少一种，但不限于以上列举的修饰方式；修饰基团为生物素基团、放射性物质、治疗性物质、地高辛、荧光基团、纳米发光材料和酶标记中的至少一种，但不限于以上列举的修饰基团。
核酸适配子和其衍生物的应用，为将核酸适配子或其衍生物用于识别肝癌细胞HepG2。
实施例1：
通过以下方法得到核酸适配子：
截短步骤：通过Cell-SELEX技术筛选得到靶向人肝癌细胞HepG2的适配子JHIT，将适配子JHIT从5’端和3’端进行核苷酸的截短；适配子JHIT的序列为5’-AGAGACCCTGACTGCGAACCCAATCGCACCACATCTCAACATGTGG ACACGGTGGCTTCTT-3’；如SEQ ID NO.4所示；
预测步骤：通过RNAstructure-6.1和mfold预测程序预测经截短的适配子J HIT为含有茎-环结构，如图1所示，图1中，第一行为mfold的预测图示，第二行为RNAstructure-6.1的预测图示，左至右数第一至八列依次为截短至61、5 5、54、53、52、51、50、49个核苷酸时的适配子的二级结构选择最短序列，得到核酸适配子JHIT2e序列为5’-GACCCTGACTGCGAACCCAATCGCACCACA TCTCAACATGTGGACACGGTG-3’；如SEQ ID NO.5所示；。
实施例2：
通过流式细胞术对比分析截短优化后的适配子JHIT2e对肝癌细胞的靶向性：
用无酶细胞消化液适度消化HepG2细胞、L02细胞，使之刚好脱离培养瓶，离心弃培养基，细胞计数2.5×105个，用500μL的washing buffer洗两次，一组 HepG2细胞、L02细胞中加入含FAM-JHIT2e浓度为200nM的binding buffer 2 00μL，一组HepG2细胞、L02细胞中加入含FAM-JHIT浓度为200nM的bindi ng buffer 200μL，在4℃孵育30分钟。之后用washing buffer清洗两次弃去未结合的适配子，最后加入300μL的PBS重悬。用流式细胞仪计数10,000个细胞测定荧光强度。结果如图2所示，左至右依次为空白对照、JHIT与HepG2细胞结合情况图示、JHIT2e与HepG2细胞结合情况图示，核酸适配子JHIT2e具有与JHIT相似的达纳摩尔范围的亲和力，核酸适配子JHIT2e与HepG2细胞结合度好；如图3所示，左至右的图示依次为空白对照、JHIT2e与L02细胞结合情况；JHIT2e与正常肝细胞L02未见明显结合。
实施例3：
通过流式细胞技术分析截短优化后的核酸适配子JHIT2e与HepG2细胞结合的亲和力的变化：
用无酶细胞消化液适度消化HepG2细胞，使之刚好脱离培养瓶，离心弃培养基，细胞计数2.5×105个，设置7个样本，每个样本中分别加入含FAM-JHIT 2e浓度为0、2、5、10、20、50、100nM的binding buffer 200μL，在4℃孵育 30分钟。之后用washing buffer清洗两次弃去未结合的适配子，最后加入300μ L的PBS重悬，用流式细胞仪计数10,000个细胞测定荧光强度；用饱和方程拟合平均荧光强度与适配子浓度的关系，如图4所示；核酸适配子JHIT2e具有与JHIT相似的达纳摩尔范围的亲和力，并有略微的提高，Kd值为12.18±4.93nM。
实施例4：
通过共聚焦实验直观地观察JHIT2及截短优化后的适配子JHIT2e对HepG2 细胞的特异性结合能力：
将HepG2细胞、L02细胞、PC3细胞以1×105的密度铺于20mm的共聚焦皿上培养24h，弃培养基后，用washing buffer清洗两次，分别加入含FAM-JHI T2e浓度为200nM的bindingbuffer 500μL，4℃孵育30min；用washing buffer 清洗两次弃去未结合的适配子，然后加入200μL的4wt％多聚甲醛固定10min，再用washing buffer清洗两次；之后加入200μL的DAPI使细胞核染色5-10min， PBS清洗2次，加入400μL的抗淬剂防淬灭，然后用共聚焦显微镜进行观察。结果如图5所示，FAM-JHIT2e与HepG2细胞孵育后显示出明显的荧光(FAM 列)，FAM-JHIT2e与L02、PC3孵育后则未见明显的荧光。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 中山大学附属第三医院
<120> 一种核酸适配子、其获得方法、其衍生物及其应用
<130> 2019
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n=随机序列
<400> 1
gaccctgact nacacggtg 19
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgaacccaa tcgcaccaca tctcaacatg tgg 33
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n=随机序列
<400> 3
agagaccctg actnacacgg tggcttctt 29
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agagaccctg actgcgaacc caatcgcacc acatctcaac atgtggacac ggtggcttct 60
t 61
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaccctgact gcgaacccaa tcgcaccaca tctcaacatg tggacacggt g 51

Claims (8)

1.一种核酸适配子，其特征在于，所述核酸适配子的序列为5’-GACCCTGACTNACACGGTG-3’；所述N为随机序列；所述随机序列N为GCGAACCCAATCGCACCACATCTCAACATGTGG。
2.如权利要求1所述的核酸适配子，其特征在于，所述核酸适配子包括二级结构。
3.如权利要求2所述的核酸适配子，其特征在于，所述二级结构为茎环结构。
4.如权利要求3所述的核酸适配子，其特征在于，所述随机序列包含于茎环结构中。
5.一种核酸适配子的获得方法，其特征在于，包括：
截短步骤：将靶向人肝癌细胞HepG2的适配子JHIT从5’端和3’端进行核苷酸的截短；所述适配子JHIT的序列为5’-AGAGACCCTGACTNACACGGTGGCTTCTT-3’；所述N为随机序列；所述随机序列N为GCGAACCCAATCGCACCACATCTCAACATGTGG；
预测步骤：预测经截短的适配子JHIT为含有二级结构，得到截短后的核酸适配子JHIT2e，所述核酸适配子JHIT2e的序列为5’-GACCCTGACTNACACGGTG-3’；N为GCGAACCCAATCGCACCACATCTCAACATGTGG。
6.如权利要求5所述的核酸适配子的获得方法，其特征在于，所述预测步骤中，通过RNAstructure-6.1和mfold预测程序中的至少一种进行预测。
7.一种核酸适配子的衍生物，其特征在于，所述衍生物通过对核酸适配子进行修饰得到；所述核酸适配子的序列为5’-GACCCTGACTNACACGGTG-3’；所述N为随机序列；所述随机序列N为GCGAACCCAATCGCACCACATCTCAACATGTGG；所述修饰为磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化和同位素化中的至少一种；修饰基团为生物素基团、放射性物质、地高辛、荧光基团中的至少一种。
8.一种核酸适配子的应用，其特征在于，将所述核酸适配子在用于制备识别肝癌细胞HepG2的试剂盒中的应用；所述核酸适配子的序列为5’-GACCCTGACTNACACGGTG-3’；所述N为随机序列；所述随机序列N为GCGAACCCAATCGCACCACATCTCAACATGTGG。
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