CN108239646B - 结合肝癌细胞的核酸适配体及其应用和应用其的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种结合肝癌细胞的核酸适配体及其应用和应用其的检测方法，涉及生物医学技术领域，该结合肝癌细胞的核酸适配体能够与肝癌细胞特异性结合，具有如SEQ ID NO.1所示序列，具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点。缓解了现有技术中存在的缺少一种能够靶向肝癌细胞的核酸适配体的技术问题。

Description

结合肝癌细胞的核酸适配体及其应用和应用其的检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物医学技术领域，尤其是涉及一种结合肝癌细胞的核酸适配体及其应用和应用其的检测方法。
背景技术
核酸适配体(aptamer)是通过链内碱基间的氢键作用折叠形成稳定的发卡、茎环、假结、口袋、凸环和G－四链体等二级或三级结构，并与靶标产生空间结构匹配的高亲和力和特异性结合的核糖核酸(RNA)和单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。核酸适配体一般由几十个核苷酸组成，相对分子质量小、易穿透细胞膜、性质稳定、容易制备和修饰；其结合的靶标范围广，包括离子、小分子、蛋白质、细胞和微生物等；其亲和力可与抗体相当，亲和常数可达纳摩尔或皮摩尔水平。近年来，核酸适配体受到科学家的广泛关注，其在基础、临床、药物开发中的研究不断增多。
原发性肝癌是临床上最常见的消化***恶性肿瘤之一，其死亡率在我国排第二位，世界排第三位。肝癌在我国的发病率非常高，据统计，中国的肝癌患者例数占全世界约一半以上，我国肝癌患者被诊断时多已处于进展期或晚期，其治疗手段非常受限，同时伴随着血行转移和癌栓形成，直接导致我国肝癌术后五年生存率与欧美发达国家相比处于较低的水平。
分子靶向治疗是肿瘤治疗领域发展的新方向，相比传统的治疗手段，分子靶向治疗具有更好的分子靶向性，能选择性地杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织的损伤，不易产生耐药，安全性和耐受性好。
靶向治疗利用抗原-抗体结合或配体-配基结合等生物特异性相互作用来实现药物的靶向传递。目前可作为主动靶向的配体或“靶向载体”主要是抗体、多肽、叶酸、多糖。抗体通常对靶点具有高亲和力，但免疫原性高；多肽分子量小且易于合成，但多肽在体循环中易于酶解，不适合在体内应用；小分子化合物，如叶酸分子量小，稳定性好，但对肿瘤靶向性不高。因此，筛选出一种可以靶向肝癌细胞的适配体并且将其应用在肝癌细胞检测、肝肿瘤研究、制备靶向肝癌的药物等，是有待解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种结合肝癌细胞的核酸适配体，缓解了现有技术中存在的缺少一种能够靶向肝癌细胞的核酸适配体的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种检测肝癌细胞的方法，缓解了现有技术中存在的缺少一种利用能够靶向肝癌细胞的核酸适配体检测肝癌细胞的技术问题。
本发明的第三目的在于提供一种上述结合肝癌的细胞的核酸适配体在肿瘤研究或制备检测肝癌细胞的试剂盒中的应用，缓解了现有技术中存在的缺少一种能够应用在肿瘤研究或制备检测肝癌细胞的试剂盒中的靶向肝癌细胞的核酸适配体在的技术问题。
本发明的第四目的在于提供一种包含上述结合肝癌细胞的核酸适配体的靶向肝癌细胞的药物、探针、DNA或RNA，缓解了现有技术中存在的缺少一种包含了能够结合肝癌细胞的核酸适配体的靶向肝癌细胞的药物、探针、DNA或RNA的技术问题。
一种结合肝癌细胞的核酸适配体，所述核酸适配体具有如SEQ ID NO.1所示序列。
进一步的，所述核酸适配体的5’端和/或3’经过修饰物修饰。
进一步的，所述修饰物包括荧光标记、生物素标记、药物标记或化学基团标记。
进一步的，所述核酸适配体特异结合的肝癌细胞包括HepG2、SMMC7721或HCC-LM3。
进一步的，所述核酸适配体为人工合成，或任何其他来源的具有同源序列的核酸适配体。
进一步的，所述人工合成包括体外化学合成或分子生物学方法合成；
优选地，所述分子生物学方法合成为PCR合成；
优选地，所述PCR合成为不对称PCR合成。
一种检测肝癌细胞的方法，应用上述核酸适配体。
进一步的，所述方法包括如下步骤：合成所述核酸适配体，将样品与所述核酸适配体孵育后检测样品与所述核酸适配体的结合；
优选地，所述样品包括细胞或组织切片。
一种包含上述的结合肝癌的细胞的核酸适配体在肿瘤研究或制备检测肝癌细胞的试剂盒中的应用。
一种上述的结合肝癌细胞的核酸适配体的靶向肝癌细胞的药物、探针、DNA或RNA。
本发明提供的结合肝癌细胞的核酸适配体，具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点。与蛋白类的抗体相比，单链的寡核苷酸更加稳定；核酸适配体可直接体外合成并且连接其他核酸序列或进行标记，因此可携带靶向药物、不需要标记二抗直接检测肝癌细胞，使得靶向导入siRNA、抗肿瘤药物和检测操作更为简单、迅速；核酸适配体的合成成本也比制备抗体成本低，周期短。该核酸适配体能够特异识别多种肝肿瘤细胞株，包括HepG2、SMMC7721和HCC-LM3等；该核酸适配体还能够特异识别受试的临床肝癌患者的癌组织切片中的癌细胞，对照核酸序列与上述细胞及组织均无结合。
本发明提供的检测肝癌细胞的方法，可直接使用多种方式检测肝癌细胞，例如采用流式细胞仪，共聚焦显微镜检测标记了荧光的核酸适配体；采用免疫化学发光法检测标记了地高辛的核酸适配体，例如使用带有碱性磷酸酶的地高辛抗体，用NBT或BCIP做底物显色，从而检测出与标记了地高辛的核酸适配体结合的癌症细胞。因此，该核酸适配体适用于多种检测方法和***，适用性广泛，大部分实验室均可使用该方法检测。
本发明提供的上述结合肝癌细胞的核酸适配体在肿瘤研究或制备检测肝癌细胞的试剂盒中的应用，适用范围广泛，可应用于癌症检测或肝癌研究领域，包含上述结合肝癌细胞的核酸适配体的试剂盒，适合多种领域和实验室应用，使用简单便捷。
本发明提供的包含上述结合肝癌细胞的核酸适配体的靶向肝癌细胞的药物、探针、DNA或RNA，可以靶向肝癌细胞，增强药物、探针、DNA或RNA的靶向性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的流式细胞方法验证FAM-07S与肝癌细胞HepG2的结合结果图；
图2为本发明实施例2提供的流式细胞方法验证FAM-07S与肝癌细胞SMMC7721的结合结果图；
图3为本发明实施例2提供的流式细胞方法验证FAM-07S与肝癌细胞HCC-LM3的结合结果图；
图4为本发明实施例2提供的流式细胞方法验证FAM-07S与肝正常细胞L02的结合结果图；
图5为本发明实施例2提供的流式细胞方法验证FAM-07S与肝正常细胞HBL100的结合结果图；
图6为本发明实施例2提供的流式细胞方法验证FAM-07S与肝正常细胞MCF-7的结合结果图；
图7为本发明实施例2提供的流式细胞方法验证FAM-07S与肝正常细胞H460的结合结果图；
图8为本发明实施例2提供的流式细胞方法验证FAM-07S与肝正常细胞MGC-803的结合结果图；
图9为本发明实施例2提供的流式细胞方法验证FAM-07S与肝正常细胞SW480的结合结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例与附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种结合肝癌细胞的核酸适配体，该核酸适配体具有如SEQ IDNO.1所示序列。
近年来，以核酸适配体(aptamer)作为药物主动靶向给药载体的研究已成为主动靶向给药***研究领域的新课题。核酸适配体是一段寡聚的单链DNA或RNA，一般由20～80个碱基构成，分子量介于6～25kD，能折叠成特殊的三维结构，特异性地识别并结合蛋白质、糖类、核苷酸等分子。由于核酸适配体具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，又称为“人工替代抗体”。通过设计核酸适体与药物的结合，能够实现药物或药物载体的靶向传递，提高药物疗效并减轻不良反应，为主动靶向给药***的开发提供了新的方向。因此，在基础医学、新药研发等方面具有广阔的应用前景，尤其是近年来兴起的复合靶SELEX技术，使得对未知靶分子进行筛选成为可能，并且通过引入消减筛选步骤，能够获得特异识别两组细胞或复合靶子中差异存在分子的核酸适配体，并能利用该适配体反过来差异靶向导入药物，为开发新型靶向药物，尤其是特异靶向杀伤肿瘤细胞开辟了新的途径。
指数富集配体***进化技术(SELEX)是基于分子生物学的认识：核酸分子与蛋白质分子等在体内的特异性相互作用，是基因转录、核酸复制、蛋白表达等一系列基本生命活动有序进行的保证。SELEX技术的基本原理：人工合成单链核酸文库(ssDNA或RNA)，文库含40nt左右的随机序列，其可能的序列理论上可达440种。一级序列的多样性，也导致了ssDNA或RNA二级和三级结构的多样性。这些不同序列与不同空间结构的核酸，经过多个循环的筛选，多种靶物质，如蛋白质、核酸、小肽和氨基酸等有机分子，甚至金属离子，在理论上都可以找到与之特异并稳固结合的核酸序列。经过多轮循环筛选及PCR/RT-PCR技术的扩增，再经克隆测序鉴定，进而可以大量生产并纯化得到与靶物质结合的这一段特异序列的核酸链-配基，也称适配体。
在一个可选的实施方式中，上述核酸适配体的5’端和/或3’经过修饰物修饰。
由于核酸适配体可人工合成，因此可在其末端修饰不同的化学基团，使之与药物载体连接，制备出不同功能的药物传递***，例如核酸适配体可以和聚合物、无机纳米粒子、树枝状分子、脂质体、胶束连接形成不同的药物传递***。另外，核酸适配体也可连接多种标记物，应用于肝癌细胞或组织检测与鉴定。
在一个可选的实施方式中，上述修饰物包括荧光标记、生物素标记、药物标记或化学基团标记。
将标记物标记于核酸适配体的5’端和/或3’后导入待检测样品，可使用多种手段检测核酸适配体与待测样品的结合情况，例如采用流式细胞仪，共聚焦显微镜检测标记了荧光的核酸适配体，采用免疫化学发光检测方法检测标记了地高辛的核酸适配体，因此该核酸适配体适用于多种检测方法和***。并且，药物嵌入核酸适配体是一种简单而有效的靶向递药方式，药物也可经化学修饰形成稳定的酯、胺和二硫键结合至核酸适配体上或通过连接子共价结合。
在一个可选的实施方式中，上述核酸适配体特异结合的肝癌细胞包括HepG2、SMMC7721或HCC-LM3。
该核酸适配体能够特异识别多种肝肿瘤细胞株，包括HepG2、SMMC7721和HCC-LM3等；该核酸适配体还能够特异识别受试的临床肝癌患者的癌组织切片中的癌细胞，对照核酸序列与上述细胞及组织均无结合。
在一个可选的实施方式中，上述核酸适配体为人工合成，或任何其他来源的具有同源序列的核酸适配体。
在一个可选的实施方式中，上述人工合成包括体外化学合成或分子生物学方法合成
寡聚核苷酸可以通过多种方式体外合成或经PCR合成得到，并且在体外合成的过程中添加修饰物或与siRNA连接，在PCR过程中也可以与其他DNA序列连接。
在一个优选的实施方式中，上述分子生物学方法合成为PCR合成。
PCR合成成本低，速度快，可一次同时合成多条寡聚核苷酸。
在一个更优选的实施方式中，上述PCR合成为不对称PCR合成。
不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。使用普通PCR的方法和试剂即可得到大量核酸适配体，操作方便简单，成本低廉。
本发明提供了一种检测肝癌细胞的方法，应用上述的核酸适配体。
在一个可选的实施方式中，上述方法包括如下步骤：合成上述核酸适配体，将样品与上述核酸适配体孵育后检测样品与上述核酸适配体的结合。
在一个优选的实施方式中，上述样品包括细胞或组织切片。
该核酸适配体能够特异识别多种肝肿瘤细胞株，包括HepG2、SMMC7721和HCC-LM3等；该核酸适配体还能够特异识别受试的临床肝癌患者的癌组织切片中的癌细胞，对照核酸序列与上述细胞及组织均无结合；该核酸适配体经修饰后可直接使用多种方式检测肝癌细胞，例如采用流式细胞仪，共聚焦显微镜检测标记了荧光的核酸适配体，采用免疫化学发光检测方法检测标记了地高辛的核酸适配体，因此该核酸适配体适用于多种检测方法和***。
本发明提供了一种上述结合肝癌的细胞的核酸适配体在肿瘤研究或制备检测肝癌细胞的试剂盒中的应用。适用范围广泛，可应用于癌症检测或肝癌研究领域，包含上述结合肝癌细胞的核酸适配体的试剂盒，适合多种领域和实验室应用，使用简单便捷。
本发明提供了一种上述结合肝癌细胞的核酸适配体的靶向肝癌细胞的药物、探针、DNA或RNA。
将化疗药物嵌入核酸适配体是一种简单而有效的靶向递药方式，这种嵌入条件通常是温和的，且不需要对药物或配体进行任何化学修饰，药物和核酸适配体都能保持生物活性，且能达到高的载药量。药物也可经化学修饰形成稳定的酯、胺和二硫键结合至核酸适配体上或通过连接子共价结合。
抗肿瘤药物一般都是在细胞内发挥作用，提高药物摄取量是其有效性的关键。纳米粒子能通过细胞内吞途径进入细胞，如果将核酸适配体连接到纳米粒子表面，药物靶向肿瘤细胞后，可介导内吞发生，有利于提高药物摄取量，这种给药方式成为目前研究的热点。
现代科学证明，癌症的发病原因是相关癌基因表达太多，抑癌基因失活或表达降低引起。抑制癌基因的表达、提高抑癌基因的表达是***的基本策略。在细胞和动物体内证实，小双链RNA是抑制基因表达的最好方法，少量双链RNA导入到细胞内，就能控制对应基因的表达，该方法又称RNA干扰(RNAi)。小双链RNA可在体外合成。但是，小干扰RNA(siRNA)作为药物导入到体内时，由于本身不具备对组织或细胞的靶向能力，因此，siRNA的靶向性是影响该技术应用到临床治疗上的主要障碍。在体外合成siRNA时同时合成核酸适配体，可使siRNA具有靶向性，缓解了siRNA本身不具备对组织或细胞的靶向能力的技术问题。
下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明
实施例1结合肝癌细胞的核酸适配体的筛选
适配体的筛选是依据SELEX技术筛选产生的。合成随机寡核苷酸ssDNA文库GP30(5’-gcaatggtac ggtacttccn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc aaaagtgcacgctactttgc taa-3’，n表示a、t、c、g中的任意一种)，
使用人源永生化的肝细胞系L-02作为消减细胞，将文库GP30同消减细胞孵育，将未与消减细胞结合的GP30文库再同靶细胞孵育，靶细胞采用人HepG2和SMMC7721两种肝癌细胞，然后洗涤掉未结合部分，将结合在靶细胞上的ssDNA洗脱后PCR扩增、回收。重复上述过程进行次轮筛选。几轮筛选后将富集的文库高通量测序，并与T载体连接，转化Ecoli，建立克隆。挑单克隆测序，得到富集文库中的适配体序列。对各序列进行二级结构及同源性分析后，选择合适的ssDNA进行合成并FAM标记，运用流式细胞术鉴定适配体与靶细胞的结合力。最后得到结合力最好的ssDNA命名为07S，其序列如SEQ ID NO.1所示；随机寡核苷酸文库GP30与07S均为FAM修饰；核酸适配体07S序列如下：5’-gtactgtcaa ttggaagtggtgttacgttg tgtagtcaaa tcagtgc-3’；
实施例2结合肝癌细胞的核酸适配体与靶细胞的结合检测
细胞准备：
(a)实验前一天为细胞更新培养基，培养基为含10％胎牛血清(康源生物)的高糖DMEM培养基(gibco)；
(b)75cm2培养瓶培养细胞至7成满，细胞处于最佳生长状态，用3mL1×PBS润洗细胞两次；
(c)1mL胰酶(含EDTA)消化细胞，待细胞变圆，弃胰酶，2mL完全培养基中和，1000rpm×5min离心，弃上清；
(d)10mL无血清DMEM培养基洗涤细胞两次，分别1000rpm×3min离心，弃上清(务必保证无EDTA残留)；
(e)合适体积洗涤缓冲液1×PBS-1mM MgCl2重悬计数，取3万个细胞置冰上备用，与适配体孵育。
整个细胞准备过程中均轻柔操作，避免吹打细胞造成细胞破裂，造成内源性Dnase释放，影响适配体与靶细胞的结合检测。
适配体准备：
分别取200pmol FAM-GP30和FAM-07S于1×PBS-1mM MgCl2中，95℃加热5min后迅速置于冰上冷却10min。
适配体与靶细胞孵育结合：
(a)将预处理细胞与适配体混合，加入冰上预冷的1μg/μL酵母tRNA和1μg/μL鲑鱼精DNA，使最终的孵育体系为1×PBS-1mM MgCl2-0.1μg/μL酵母tRNA-0.1μg/μL鲑鱼精DNA-200pmol适配体，共100μL。
(b)将孵育体系置冰上于摇床上轻轻震摇孵育10min，1000rpm×5min离心，弃上清，加1×PBS-1mM MgCl2-3％BSA至300μL，用流式细胞仪计数测定FAM荧光强度。
整个过程尽量缩短细胞在1×PBS-1mM MgCl2中的停留时间，由于适配体经FAM标记，须避光操作防止荧光淬灭。
结果如图1-图9所示，纵坐标为count，横坐标为FL1-FITC，流式细胞术实验时选择通道1，该通道参数设置为FITC获取通道，可以用于本实验。
由图1-图9可以看出，07S适配体可以特异性识别人源肝细胞癌HepG2、SMMC 7721、HCC-LM3。不识别其他人源永生化正常细胞系及其他非肝癌的肿瘤细胞系。
由图1得出结论：与对照序列GP30相比，FAM-07S可以特异性识别人源肝细胞癌HepG2细胞。
由图2得出结论：与对照序列GP30相比，FAM-07S可以特异性识别人源肝细胞癌SMMC7721细胞。
由图3得出结论：与对照序列GP30相比，FAM-07S可以特异性识别人源肝细胞癌HCC-LM3细胞。
由图4得出结论：与对照序列GP30相比，FAM-07S不识别人源永生化正常肝细胞系L02细胞。
由图5得出结论：与对照序列GP30相比，FAM-07S不识别人源永生化乳腺细胞系HBL100细胞。
由图6得出结论：与对照序列GP30相比，FAM-07S不识别人源乳腺癌细胞系MCF-7细胞。
由图7得出结论：与对照序列GP30相比，FAM-07S不识别人源大细胞性肺癌细胞H460细胞。
由图8得出结论：与对照序列GP30相比，FAM-07S不识别人源胃腺癌细胞MGC-803细胞。
由图9得出结论：与对照序列GP30相比，FAM-07S不识别人源结肠腺癌细胞SW480细胞。
综上所述，FAM-07S能够特异识别多种人的肝肿瘤细胞，不识别人的其它细胞，具有靶向人肝癌细胞的广泛临床应用和基础应用前景。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛大学
<120> 结合肝癌细胞的核酸适配体及其应用和应用其的检测方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtactgtcaa ttggaagtgg tgttacgttg tgtagtcaaa tcagtgc 47

Claims (13)

1.一种结合肝癌细胞的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的5’端和/或3’经过修饰物修饰。
3.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，所述修饰物包括荧光标记、生物素标记、药物标记或化学基团标记。
4.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体特异结合的肝癌细胞包括HepG2、SMMC7721或HCC-LM3。
5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体为人工合成，或任何其他来源的如SEQ ID NO.1所示序列的核酸适配体。
6.根据权利要求5所述的核酸适配体，其特征在于，所述人工合成包括体外化学合成或分子生物学方法合成。
7.根据权利要求6所述的核酸适配体，其特征在于，所述分子生物学方法合成为PCR合成。
8.根据权利要求7所述的核酸适配体，其特征在于，所述PCR合成为不对称PCR合成。
9.一种非诊断和治疗目的的检测肝癌细胞的方法，其特征在于，应用权利要求1-8任一项所述的核酸适配体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：合成所述核酸适配体，将样品与所述核酸适配体孵育后检测样品与所述核酸适配体的结合。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述样品包括细胞或组织切片。
12.如权利要求1-8任一项所述的结合肝癌细胞的核酸适配体在非诊断和治疗目的的肿瘤研究或制备检测肝癌细胞的试剂盒中的应用。
13.包含权利要求1-8任一项所述的结合肝癌细胞的核酸适配体的靶向肝癌细胞的药物或探针。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110564731B (zh) * 2019-09-02 2023-04-14 湖南大学 用于检测人耐药肝癌细胞株HepG2/ADM的核酸适配体及检测试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101942445A (zh) * 2010-07-19 2011-01-12 谭蔚泓 核酸适体衍生物及其在制备药物载体中的应用
CN102766693A (zh) * 2012-07-25 2012-11-07 湖南大学 可用于检测人肝癌细胞株smmc-7721的核酸适体及其筛选方法和应用
CN103374573A (zh) * 2012-04-28 2013-10-30 复旦大学附属华山医院 肝癌细胞核酸适配体序列及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101942445A (zh) * 2010-07-19 2011-01-12 谭蔚泓 核酸适体衍生物及其在制备药物载体中的应用
CN103374573A (zh) * 2012-04-28 2013-10-30 复旦大学附属华山医院 肝癌细胞核酸适配体序列及其用途
CN102766693A (zh) * 2012-07-25 2012-11-07 湖南大学 可用于检测人肝癌细胞株smmc-7721的核酸适体及其筛选方法和应用

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