CN110408594A - 一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法 - Google Patents
一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110408594A CN110408594A CN201910701425.8A CN201910701425A CN110408594A CN 110408594 A CN110408594 A CN 110408594A CN 201910701425 A CN201910701425 A CN 201910701425A CN 110408594 A CN110408594 A CN 110408594A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- group
- culture
- vcrfsgy
- culture medium
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 title claims abstract description 31
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 13
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims abstract description 10
- 101000693530 Staphylococcus aureus Staphylokinase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 24
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 10
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 9
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 6
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 6
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 6
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 6
- 150000003384 small molecules Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 3
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 3
- XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N dorsomorphin Chemical compound C=1C=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C=CN=CC=2)C=CC=1OCCN1CCCCC1 XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 210000000630 fibrocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 abstract description 17
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 abstract description 17
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 8
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 abstract description 5
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102000002734 Collagen Type VI Human genes 0.000 description 3
- 108010043741 Collagen Type VI Proteins 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000664703 Homo sapiens Transcription factor SOX-10 Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 1
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 102000001435 Synapsin Human genes 0.000 description 1
- 108050009621 Synapsin Proteins 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102100038808 Transcription factor SOX-10 Human genes 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 description 1
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0619—Neurons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开的属于生物细胞技术领域，具体为一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法，S1：培养人***成纤维细胞(HFFs)：①将儿童术后***置于F12完全培养基(95％DMEM/F12和5％PS)；②在超净工作台中将***剪开铺展，1％PS的PBS洗两遍，用眼科剪除去皮下脂肪组织，剪成3mmˉ3mm大小，0.2％中性蛋白酶覆盖4℃过夜；S2：将HFFs重编程为神经细胞，本方法～1KPa的I型胶原基质(Collagen type I，Col)可以促进人成纤维重编程为成熟神经细胞；可以获得接近100％Tuj1+的神经细胞，效率高；10天即可获得表达SYN的成熟神经细胞，时间短。
Description
技术领域
本发明涉及生物细胞技术领域，具体为一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法。
背景技术
在多种细胞外微环境的因素中，生物物理学越来越成为干细胞组织工程的研究热点，Engler等证明细胞外基质不同的弹性模量导致干细胞向不同方向分化，包括神经细胞，肌细胞和骨细胞，引起大家的广泛关注并被进一步证实，但利用基质硬度获得具有电生理功能的神经细胞成为一大难题，目前人们已经可以单纯利用物理因素—3D成球(Su，G.，etal.2013)，无线电不对称输送机(REAC)产生的射频微电流(Maioli，M.，et al.2013)和纳米凹槽底物(Yoo，J.，et al.2015)将成纤维细胞重编程为神经细胞，同时也有利用物理因素—具有光栅形貌的基质(Kulangara，K.，et al.2014)，纳米金颗粒承载的电磁能(Yoo，J.，et al.2017)，模拟体内微电流的双向脉冲电流(Jin，Y.，et al.2016)和3D脑细胞外基质水凝胶(Jin，Y.，et al..2018)促进成纤维细胞重编程为神经细胞的效率，但基质硬度促进成纤维细胞重编程为神经细胞效率目前未见出现。
I型胶原是神经细胞外基质的成分，并常用于组织工程神经的构建，同时2D的I型胶原体系可以较好的模拟体内的硬度，而3D的I型胶原体系可以在体外构建与体内相近的细胞发育***，并且I型胶原成分单一，可避免其他因素对实验结果的影响，因此I型胶原体系是较好的模拟神经细胞外基质成分以及硬度的材料，本文采用较成熟的方法制备了～100Pa和1KPa的2D I型胶原硬度体系，并进行一些探讨。
同时，在本研究的前期工作中，单纯的利用基质硬度体系并未获得理想的神经细胞，故我们选择了目前已经将人成纤维细胞转分化为神经细胞的小分子组合(Hu，W.，etal.2015)，但其诱导效率在20％左右且纯度在30％左右，并且获得具有电生理功能的神经细胞为14天，表达突触蛋白的成熟神经细胞为21天，需要较长时间获得成熟神经细胞将在组织工程的临床替代疗法应用中受限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法，该将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法具体步骤如下：
S1：培养人***成纤维细胞(HFFs)：
①将儿童术后***置于F12完全培养基(95％DMEM/F12和5％PS)；
②在超净工作台中将***剪开铺展，1％PS的PBS洗两遍，用眼科剪除去皮下脂肪组织，剪成3mmˉ3mm大小，0.2％中性蛋白酶覆盖4℃过夜；
③用眼科镊将真皮和表皮撕开，弃掉表皮，将真皮放入低黏附培养皿，加入少量培养基，剪碎，0.2％I型胶原酶37℃消化6h，用80目筛网过滤；
④使用1500rpm离心机离心5min，用PBS洗两遍；
⑤HFM培养基(90％DMEM，10％FBS，1％NEAA，1％PS和0.5％GlutaMAX)培养；
S2：将HFFs重编程为神经细胞：
①将HFFs培养至第三代融合至90％以上后，消化计数，将细胞重悬于HFM培养基中暂时保存，并将密度调整为1×106/ml的细胞悬液；
②在冰浴条件下，将1.5mlEP管中依次加入以下成分：
用枪混匀，并取HFM培养液167ul，加入上述成分中混合，取250ul混合液加入至24孔板的一个孔，37℃孵育30min以上，成胶后加入472ul HFM培养液和28ul细胞悬液，小分子组0.1％Gelatin包被1h吸干后直接加入472ul HFM培养液和28ul细胞悬液，八字混匀，培养过夜；
③第二天将Soft组和Stiff组换液为IM培养基(48.15％DMEM/F12，48.15％Neurobasal，1％B27，0.5％N2，1％(10mM)cAMP，0.2％(10ug/ml)bFGF和1％PS)，将VCRFSGY组，Soft+VCRFSGY组和Stiff+VCRFSGY组换液为IMT培养基(IM培养基，0.5mM VPA，3uMCHIR99021，1uM Repsox，10uM Forskolin，10uM SP600125，5uM Go6983和5uM Y27632)，诱导4天，再换一次液；
④继续诱导3天，将Soft组和Stiff组换液为MM培养基(48％DMEM/F12，48％Neurobasal，1％B27，0.5％N2，1％(10mM)cAMP，0.2％(10ug/ml)bFGF，0.2％(10ug/ml)BDNF，0.2％(10ug/ml)GDNF，0.2％(10ug/ml)NT3和1％PS)，将VCRFSGY组，Soft+VCRFSGY组和Stiff+VCRFSGY组换液为MMT培养基(MM培养基，3uM CHIR99021，10uM Forskolin和1uMDorsomorphin)，继续培养3天，诱导完成。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)～1KPa的I型胶原基质(Collagen type I，Col)可以促进人成纤维重编程为成熟神经细胞；
2)可以获得接近100％Tuj1+的神经细胞，效率高；
3)10天即可获得表达SYN的成熟神经细胞，时间短。
附图说明
图1为本发明工作原理图；
图2为本发明实验结果1的附图；
图3为本发明实验结果2的附图；
图4为本发明实验结果3的附图；
图5为本发明实验结果4的附图；
图6为本发明实验结果5的附图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
请参阅图1-6，具体实施方式如下：一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法，该将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法具体步骤如下：
S1：培养人***成纤维细胞(HFFs)：
①将儿童术后***置于F12完全培养基(95％DMEM/F12和5％PS)；
②在超净工作台中将***剪开铺展，1％PS的PBS洗两遍，用眼科剪除去皮下脂肪组织，剪成3mmˉ3mm大小，0.2％中性蛋白酶覆盖4℃过夜；
③用眼科镊将真皮和表皮撕开，弃掉表皮，将真皮放入低黏附培养皿，加入少量培养基，剪碎，0.2％I型胶原酶37℃消化6h，用80目筛网过滤；
④使用1500rpm离心机离心5min，用PBS洗两遍；
⑤HFM培养基(90％DMEM，10％FBS，1％NEAA，1％PS和0.5％GlutaMAX)培养；
S2：将HFFs重编程为神经细胞：
①将HFFs培养至第三代融合至90％以上后，消化计数，将细胞重悬于HFM培养基中暂时保存，并将密度调整为1×106/ml的细胞悬液；
②在冰浴条件下，将1.5mlEP管中依次加入以下成分：
用枪混匀，并取HFM培养液167ul，加入上述成分中混合，取250ul混合液加入至24孔板的一个孔，37℃孵育30min以上，成胶后加入472ul HFM培养液和28ul细胞悬液，小分子组0.1％Gelatin包被1h吸干后直接加入472ul HFM培养液和28ul细胞悬液，八字混匀，培养过夜；
③第二天将Soft组和Stiff组换液为IM培养基(48.15％DMEM/F12，48.15％Neurobasal，1％B27，0.5％N2，1％(10mM)cAMP，0.2％(10ug/ml)bFGF和1％PS)，将VCRFSGY组，Soft+VCRFSGY组和Stiff+VCRFSGY组换液为IMT培养基(IM培养基，0.5mM VPA，3uMCHIR99021，1uM Repsox，10uM Forskolin，10uM SP600125，5uM Go6983和5uM Y27632)，诱导4天，再换一次液；
④继续诱导3天，将Soft组和Stiff组换液为MM培养基(48％DMEM/F12，48％Neurobasal，1％B27，0.5％N2，1％(10mM)cAMP，0.2％(10ug/ml)bFGF，0.2％(10ug/ml)BDNF，0.2％(10ug/ml)GDNF，0.2％(10ug/ml)NT3和1％PS)，将VCRFSGY组，Soft+VCRFSGY组和Stiff+VCRFSGY组换液为MMT培养基(MM培养基，3uM CHIR99021，10uM Forskolin和1uMDorsomorphin)，继续培养3天，诱导完成。
实验结果1.HFFs的分离培养与鉴定
实验结果1中：A为HFFs的原代分离与培养；
B HFFs的表面标记物CD105/CD34/CD45/CD44/CD90/CD73鉴定，与hF-MSCs表面标记相近C HFFs的成脂成骨诱导，虽偶见脂滴形成，但可以确定HFFs不具有成脂成骨多向分化潜能；
D为HFFs高表达Vimentin，低表达E-cadherin，与***类似，表达Ki67，具有增殖能力；不表达SOX2，NANOG和OCT4，不具有自我更新和多向分化能力；
E为HFFs不表达:Nestin，SOX9(无神经干细胞污染)，SOX10(无神经嵴细胞污染)，Tuj1(无神经前体细胞污染)，NeuN，MAP2(无神经元污染)，O4，GFAP(无胶质细胞污染)。
实验结果2.I型胶原硬度体系的制备
实验结果2中：A：在细胞培养过程中均可观察到肉眼可见的I型胶原基质(Collagen type I，Col)，B为I型胶原Soft组(～100Pa)和Stiff组(～1KPa)的40×镜下形态，两组均有胶原纤维缠结，Soft组较Stiff组少。
实验结果3.I型胶原成分的作用
实验结果3中：A图为Gelatin/Col涂布组与Gelatin/Col涂布+小分子组的Tuj1免疫荧光结果，B图为A图的Tuj1阳性率统计，可以看出小分子的作用依旧很明显，与Gelatin涂布组对比可以看出I型胶原成分具有促进增殖和神经分化的作用。
实验结果4.神经诱导方案与形态
实验结果4中：A为方案的诱导流程图，B为HFFs在五组(Soft、Stiff、VCRFSGY、Soft+VCRFSGY和Stiff+VCRFSGY)中诱导4天，诱导7天和诱导10天的100×镜下形态和典型细胞形态(右上角)，HFFs在Soft组和Stiff组处于增殖状态，在VCRFSGY、Soft+VCRFSGY和Stiff+VCRFSGY组中诱导10天时出现具有突触形态的细胞，并且Soft+VCRFSGY和Stiff+VCRFSGY组较VCRFSGY组获得更多的神经形态的细胞，Stiff+VCRFSGY组的神经突触形态细胞最多。
实验结果5.I型胶原硬度体系诱导的免疫荧光检测
实验结果5中：A为HFFs在各组中诱导4天和7天时Tuj 1的免疫荧光表达情况；
B对A进行阳性率统计，结果显示HFFs在Stiff+VCRFSGY组中诱导4天和7天时Tuj1表达最高；
C将获得的Tuj1+细胞数量与初始细胞数量作比值，统计发现I型胶原基质(Collagen type I，Col)的加入可以增加Tuj+细胞获得的数量，提高诱导效率；
D HFFs在各组中诱导4天，7天和10天时SYN的免疫荧光表达情况；
E对D进行阳性率统计，结果显示SYN在五组中十天时表达较高，提示我们10天是获得成熟神经元的最适宜的诱导时间。
F将获得的SYN+细胞数量与初始细胞数量作比值，统计发现I型胶原基质(Collagen type I，Col)的加入可以增加SYN+细胞获得的数量，提高诱导效率，10天时Stiff+VCRFSGY组可以获得最多的SYN+细胞。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明；因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (1)
1.一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法，其特征在于：该将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法具体步骤如下：
S1：培养人***成纤维细胞(HFFs)：
①将儿童术后***置于F12完全培养基(95％DMEM/F12和5％PS)；
②在超净工作台中将***剪开铺展，1％PS的PBS洗两遍，用眼科剪除去皮下脂肪组织，剪成3mm×3mm大小，0.2％中性蛋白酶覆盖4℃过夜；
③用眼科镊将真皮和表皮撕开，弃掉表皮，将真皮放入低黏附培养皿，加入少量培养基，剪碎，0.2％I型胶原酶37℃消化6h，用80目筛网过滤；
④使用1500rpm离心机离心5min，用PBS洗两遍；
⑤HFM培养基(90％DMEM，10％FBS，1％NEAA，1％PS和0.5％GlutaMAX)培养；
S2：将HFFs重编程为神经细胞：
①将HFFs培养至第三代融合至90％以上后，消化计数，将细胞重悬于HFM培养基中暂时保存，并将密度调整为1×106/ml的细胞悬液；
②在冰浴条件下，在1.5mlEP管中依次加入以下成分：
用枪混匀，并取HFM培养液167ul，加入上述成分中混合，取250ul混合液加入至24孔板的一个孔，37℃孵育30min以上，成胶后加入472ul HFM培养液和28ul细胞悬液，小分子组0.1％Gelatin包被1h吸干后直接加入472ul HFM培养液和28ul细胞悬液，八字混匀，培养过夜；
③第二天将Soft组和Stiff组换液为IM培养基(48.15％DMEM/F12，48.15％Neurobasal，1％B27，0.5％N2，1％(10mM)cAMP，0.2％(10ug/ml)bFGF和1％PS)，将VCRFSGY组，Soft+VCRFSGY组和Stiff+VCRFSGY组换液为IMT培养基(IM培养基，0.5mM VPA，3uMCHIR99021，1uM Repsox，10uM Forskolin，10uM SP600125，5uM Go6983和5uM Y27632)，诱导4天，再换一次液；
④继续诱导3天，将Soft组和Stiff组换液为MM培养基(48％DMEM/F12，48％Neurobasal，1％B27，0.5％N2，1％(10mM)cAMP，0.2％(10ug/ml)bFGF，0.2％(10ug/ml)BDNF，0.2％(10ug/ml)GDNF，0.2％(10ug/ml)NT3和1％PS)，将VCRFSGY组，Soft+VCRFSGY组和Stiff+VCRFSGY组换液为MMT培养基(MM培养基，3uM CHIR99021，10uM Forskolin和1uMDorsomorphin)，继续培养3天，诱导完成。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910701425.8A CN110408594A (zh) | 2019-07-31 | 2019-07-31 | 一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910701425.8A CN110408594A (zh) | 2019-07-31 | 2019-07-31 | 一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110408594A true CN110408594A (zh) | 2019-11-05 |
Family
ID=68364697
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910701425.8A Pending CN110408594A (zh) | 2019-07-31 | 2019-07-31 | 一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110408594A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110423721A (zh) * | 2018-05-01 | 2019-11-08 | 云南济慈再生医学研究院有限公司 | 一种年轻化的修复型成纤维细胞的制备方法及其应用 |
| CN113278585A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-08-20 | 广西大学 | 一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法 |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101033462A (zh) * | 2006-03-10 | 2007-09-12 | 上海国睿生命科技有限公司 | 一种真皮成纤维样细胞的培养和用途 |
| US20090297579A1 (en) * | 2006-06-01 | 2009-12-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Control of Cells and Cell Multipotentiality in Three Dimensional Matrices |
| CN101760447A (zh) * | 2009-10-30 | 2010-06-30 | 中国人民解放军总医院 | 表皮干细胞诱导驯化为神经细胞的方法 |
| CN102228718A (zh) * | 2011-06-24 | 2011-11-02 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种组织工程化神经组织及其构建方法 |
| CN105200007A (zh) * | 2015-10-20 | 2015-12-30 | 博雅干细胞科技有限公司 | 从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞的方法 |
| CN106337037A (zh) * | 2015-07-08 | 2017-01-18 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物及其用途 |
| CN107254441A (zh) * | 2017-07-24 | 2017-10-17 | 陈强 | 一种诱导成纤维细胞为神经细胞样细胞的方法 |
| CN108531453A (zh) * | 2017-03-01 | 2018-09-14 | 中国科学院动物研究所 | 一种将非神经元细胞转化为神经元细胞的方法 |
| CN109674809A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-04-26 | 吉林大学 | 一种包括miR-124-3P的组合物及其在诱导神经元形成的药物中的应用 |
| CN110862966A (zh) * | 2019-11-10 | 2020-03-06 | 吉林大学 | 构建三维工程化神经组织的方法、三维工程化神经组织及其用途 |
| WO2022155274A1 (en) * | 2021-01-13 | 2022-07-21 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Methods of predicting progression of neurological disease |
-
2019
- 2019-07-31 CN CN201910701425.8A patent/CN110408594A/zh active Pending
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101033462A (zh) * | 2006-03-10 | 2007-09-12 | 上海国睿生命科技有限公司 | 一种真皮成纤维样细胞的培养和用途 |
| US20090297579A1 (en) * | 2006-06-01 | 2009-12-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Control of Cells and Cell Multipotentiality in Three Dimensional Matrices |
| CN101760447A (zh) * | 2009-10-30 | 2010-06-30 | 中国人民解放军总医院 | 表皮干细胞诱导驯化为神经细胞的方法 |
| CN102228718A (zh) * | 2011-06-24 | 2011-11-02 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种组织工程化神经组织及其构建方法 |
| CN106337037A (zh) * | 2015-07-08 | 2017-01-18 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物及其用途 |
| CN105200007A (zh) * | 2015-10-20 | 2015-12-30 | 博雅干细胞科技有限公司 | 从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞的方法 |
| CN108531453A (zh) * | 2017-03-01 | 2018-09-14 | 中国科学院动物研究所 | 一种将非神经元细胞转化为神经元细胞的方法 |
| CN107254441A (zh) * | 2017-07-24 | 2017-10-17 | 陈强 | 一种诱导成纤维细胞为神经细胞样细胞的方法 |
| CN109674809A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-04-26 | 吉林大学 | 一种包括miR-124-3P的组合物及其在诱导神经元形成的药物中的应用 |
| CN110862966A (zh) * | 2019-11-10 | 2020-03-06 | 吉林大学 | 构建三维工程化神经组织的方法、三维工程化神经组织及其用途 |
| WO2022155274A1 (en) * | 2021-01-13 | 2022-07-21 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Methods of predicting progression of neurological disease |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| MARILYN A. LUDUEKJA等: "Nerve Cell Differentiation in Vitro", 《DEVELOPMENTAL BIOLOGY》 * |
| W. MA等: "CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels", 《EXPERIMENTAL NEUROLOGY》 * |
| XIAO‑YU WAN等: "Chemical conversion of human lung fibroblasts into neuronal cells", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE》 * |
| ZIRAN XU等: "How to reprogram human fbroblasts to neurons", 《CELL & BIOSCIENCE》 * |
| 辛颖等: "成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞的研究", 《中国实验诊断学》 * |
| 邵东传等: "成纤维细胞向神经细胞转分化的研究进展", 《国际神经病学神经外科学杂志》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110423721A (zh) * | 2018-05-01 | 2019-11-08 | 云南济慈再生医学研究院有限公司 | 一种年轻化的修复型成纤维细胞的制备方法及其应用 |
| CN110423721B (zh) * | 2018-05-01 | 2024-02-27 | 云南济慈再生医学研究院有限公司 | 一种年轻化的修复型成纤维细胞的制备方法及其应用 |
| CN113278585A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-08-20 | 广西大学 | 一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法 |
| CN113278585B (zh) * | 2021-03-26 | 2023-09-15 | 广西大学 | 一种体外诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ibarretxe et al. | Neural crest stem cells from dental tissues: a new hope for dental and neural regeneration | |
| CN103041450B (zh) | 用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法 | |
| KarbalaeiMahdi et al. | Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells on polycaprolactone/gelatin bi-electrospun nanofibers | |
| CN105745321A (zh) | 用于产生工程化心肌(ehm)的方法 | |
| CN105849253A (zh) | 一种多能干细胞定向分化为功能性心肌的方法 | |
| Wang et al. | The differentiation of rat adipose-derived stem cells into OEC-like cells on collagen scaffolds by co-culturing with OECs | |
| CN110396499A (zh) | 一种诱导神经干细胞的方法及其应用 | |
| CN106701824B (zh) | 基于人iPS细胞获取脊髓运动神经元及其功能性细胞的方法 | |
| CN106399230A (zh) | 一种皮肤来源的成纤维细胞的培养方法 | |
| CN105079783B (zh) | 药物组合物及其制备方法和用途 | |
| CN110408594A (zh) | 一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法 | |
| CN102952777A (zh) | 人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法 | |
| CN108546674A (zh) | 预刺激干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN113846050A (zh) | 一种组织类器官的制备方法 | |
| CN104928247A (zh) | 一种神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法 | |
| CN104946590A (zh) | 成人骨髓中Muse细胞诱导为神经前体细胞的方法 | |
| CN104491931B (zh) | 含有皮脂腺的皮肤组织及其形成方法和用途 | |
| WO2019210887A2 (zh) | 一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法及应用 | |
| CN108324993B (zh) | 一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用 | |
| CN102892879B (zh) | 用于诱导人类多能干细胞的方法和组合物 | |
| CN105087475B (zh) | 一种细胞培养液及其应用以及诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法 | |
| CN102533640A (zh) | 使成体干细胞产生为球体细胞群体的方法 | |
| CN107164325B (zh) | MSCs来源的少突胶质细胞的制备方法及试剂盒 | |
| CN105925524A (zh) | 一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法 | |
| CN103205394B (zh) | 培养基及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191105 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |