CN110396493B - 培养基组合及生产异亮氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及培养基组合及生产异亮氨酸的方法。本发明提供了的培养基中发酵培养基和种子培养基的组分合理,补料培养基能够在发酵培养基中氮源营养开始不足时,通过匀速流加以一定比例配置的玉米浆和水解液(豆粕水解液或玉米浆水解液)的混合液,及时补充氮源,提高了异亮氨酸的生成速率及产量,且由于水解液(豆粕水解液或玉米浆水解液)所含生物素很少,避免了菌体量的过量增长,维持了较高的转化率。该方法简单易行,异亮氨酸生产水平得到显著提高,50L罐水平发酵产酸可达45.5g/L。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及培养基组合及生产异亮氨酸的方法。
背景技术
L-异亮氨酸又称“L-异白氨酸”,属于支链氨基酸(branched chain amino acid,BCAA),是人与动物自身不能合成而必需以来外源供给的八大必需氨基酸之一,具有多种生理功能,是合成人体激素、酶类的原料,具有促进蛋白质生成和抑制其分解的效果,在人体生命活动中起着重要作用,因此在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。
L-异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三种,而目前在工业生产上实施的只有发酵法。发酵法是利用微生物的代谢作用,生物合成并过量积累L-异亮氨酸的的方法,包括添加前体发酵法和直接发酵法两类。其中添加前体发酵法又称微生物转化法,这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源,在添加特异的前体物质以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用,经微生物作用将其有效的转化为目的氨基酸。对于L-异亮氨酸,其前提物质主要有α-氨基丁酸、α-羟基丁酸、α-酮基丁酸和D-苏氨酸等,采用的微生物主要有芽孢杆菌、假单胞菌或粘质赛氏杆菌等。直接发酵法借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力,通过对特定微生物的诱变处理,选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性变异株,以解除代谢调解中的反馈抑制与阻遏,达到过量积累某种氨基酸的目的。目前L-异亮氨酸产生菌大多由谷氨酸产生菌(黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌等)诱变选育而来。L-异亮氨酸的生物合成途径包括:葡萄糖经酵解途径生成磷酸烯醇式丙酮酸,磷酸烯醇式丙酮酸经二氧化碳固定反应生成四碳二羧酸,后经氨基化反应生成天冬氨酸;天冬氨酸在天冬氨酸激酶催化作用下,生成天冬氨酸半醛;天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶的催化下,生成高丝氨酸;高丝氨酸在高丝氨酸激酶的催化作用下生成苏氨酸;苏氨酸经苏氨酸脱氨酶、乙酰羧基酸合成酶和支链氨基酸谷氨酸转氨酶的催化作用,生成异亮氨酸。
目前,国内已有多家企业通过发酵法进行L-异亮氨酸的生产,但仍存在菌株产酸水平低,发酵产物提取技术差等问题。因此,改进L-异亮氨酸的发酵技术工艺,提高产酸水平,进而降低提取难度,对提高国内L-异亮氨酸的产量及产品市场竞争力具有重要意义。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供培养基组合及生产异亮氨酸的方法,该培养基组合能够使异亮氨酸生产水平得到显著提高。
本发明提供的谷氨酸棒状杆菌的培养基组合包括:
种子培养基、发酵培养基和补料培养基;
所述种子培养基包括:葡萄糖20g/L、玉米浆60g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.3mg/L、VB1 2mg/L;
所述发酵培养基包括:葡萄糖80g/L、玉米浆30g/L、硫酸铵10g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.1mg/L、VB1 0.1mg/L;
所述补料培养基包括:玉米浆和水解液;所述水解液为豆粕水解液或玉米浆水解液。
一些实施例中,所述补料培养基中包括:玉米浆125g/L~250g/L和水解液250g/L~375g/L。
一些实施例中,所述补料培养基中,玉米浆和水解液的总量为500g/L;其中,玉米浆和水解液的比例为1:(1~3)。
一些实施例中,所述种子培养基或发酵培养基中的消泡剂为有机硅油,菜籽油,矿物油或聚醚类化合物。
一些具体实施例中,所述消泡剂为聚醚消泡剂DF103。
本发明所述的培养基组合在发酵生产L-异亮氨酸中的应用。
在现有发酵工艺中,培养基中玉米浆等氮源往往在发酵开始一次性投入,随着发酵进行,底物浓度,尤其是氮源营养逐渐下降,同时菌体的比生长速率也呈逐渐下降趋势。实验发现,当菌体的比生长速率低于0.1h-1时,产酸速率会明显变慢,表明此时培养基中氮源营养已明显不足。因此在菌体的比生长速率接近0.1h-1时,及时补充氮源,有助于减慢菌体的比生长速率下降速度,提高异亮氨酸的生成速率及产量。而实验表明,本发明提供的补料培养基对氮源的补充更有效,并且有利于异亮氨酸的产量。
本发明还提供了一种发酵生产L-异亮氨酸的方法,其包括:
以本发明所述的种子培养基活化谷氨酸棒状杆菌,获得种子液;
将种子液接种至本发明所述的发酵培养基,发酵至比生长速率为0.1±0.01h-1,流加本发明所述的补料培养基,继续发酵获得含有L-异亮氨酸的发酵液。
一些实施例中,所述流加的速度为50mL/h。
在本发明中,接种种子液开始发酵约30~32h后,比生长速率达到0.1±0.01h-1,此时开始流加补料培养基,在流加条件下,再继续发酵28~30h,终止发酵。一些实施例中,所述发酵的总时长为60h。
一些实施例中,所述种子液的接种量为15%。
一些实施例中,所述发酵的条件为:罐压0.05~0.1Mpa,通气量10L/min~25L/min,搅拌200~800rpm,温度31~33℃,pH值为6.8~7.2,溶氧20%~40%。
本发明提供了培养基组合,该培养基中发酵培养基和种子培养基的组分合理,补料培养基能够在发酵培养基中氮源营养开始不足时,通过匀速流加以一定比例配置的玉米浆和水解液(豆粕水解液或玉米浆水解液)的混合液,及时补充氮源,提高了异亮氨酸的生成速率及产量,且由于水解液(豆粕水解液或玉米浆水解液)所含生物素很少,避免了菌体量的过量增长,维持了较高的转化率。该方法简单易行,异亮氨酸生产水平得到显著提高,50L罐水平发酵产酸可达45.5g/L。
具体实施方式
本发明提供了培养基组合及生产异亮氨酸的方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
玉米浆是发酵常用的有机氮源,其含有丰富的可溶性蛋白,以及磷和生长因子(如生物素)等。豆粕水解液、玉米浆水解液也属于常用氮源,因其一般是豆粕或玉米浆经酸处理后得到,所以pH一般较低,其中生长因子(如生物素)较玉米浆要少,但各种游离氨基酸较多,更易被菌体所利用。本发明研究表明,发酵过程中如仅流加玉米浆,会带入较多的生物素,导致菌体量过量增长,不利于转化率的提高,而采用流加以一定比例(1:1~1:3)配置的玉米浆和水解液(豆粕水解液或玉米浆水解液)的混合液则可解决这个问题,使转化率得到大幅提高。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
对比例不流加补充玉米浆和水解液
将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按15%的接种量接入50L发酵罐中,初定容20L。种子所用培养基组成为:葡萄糖20g/L、玉米浆60g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、聚醚消泡剂DF103(美国陶氏化学)0.3mL/L、生物素0.3mg/L、VB1 2mg/L,其余为水。发酵所用培养基组成为:葡萄糖80g/L、玉米浆30g/L、硫酸铵10g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、聚醚消泡剂DF103(美国陶氏化学)0.3mL/L、生物素0.1mg/L、VB1 0.1mg/L,其余为水。发酵条件为:罐压0.05~0.1Mpa,通气量10~25L/min,搅拌200~800rpm,温度31~33℃,pH6.8~7.2,溶氧20%~40%。
本对比实验例重复3次,发酵结束,利用HPLC测定发酵液中的异亮氨酸含量,发酵指标见下表1。
实施例1
将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按15%的接种量接入50L发酵罐中,初定容20L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比例相同。发酵32h时,比生长速率达到0.108h-1,开始以50mL/h的速度流加补料培养基(以水配制,含玉米浆250g/L和玉米浆水解液250g/L),发酵60h停止流加。发酵条件为:温度31℃,pH6.9~7.0,溶氧20%~30%,根据溶氧需要提升搅拌/通风量/罐压,罐压0.05~0.1Mpa,通气量10~25L/min,搅拌200~800rpm。
本实施例重复3次,发酵结束,利用HPLC测定发酵液中的异亮氨酸含量,发酵指标见下表1。
实施例2
将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按15%的接种量接入50L发酵罐中,初定容20L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比例相同。发酵32h时,比生长速率达到0.108h-1,开始以50mL/h的速度流加补料培养基(以水配制,含玉米浆250g/L和豆粕水解液250g/L),发酵60h停止流加。发酵条件为:温度32℃,pH6.9~7.0,溶氧20%~30%,根据溶氧需要提升搅拌/通风量/罐压,罐压0.05~0.1Mpa,通气量10~25L/min,搅拌200~800rpm。
本实施例重复3次,发酵结束,利用HPLC测定发酵液中的异亮氨酸含量,发酵指标见下表1。
实施例3
将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按15%的接种量接入50L发酵罐中,初定容20L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比例相同。发酵32h时,比生长速率达到0.1h-1,开始以50mL/h的速度流加补料培养基(以水配制,含玉米浆167g/L和玉米浆水解液333g/L),发酵60h停止流加。发酵条件为:温度32℃,pH6.9~7.0,溶氧30%~40%,根据溶氧需要提升搅拌/通风量/罐压,罐压0.05~0.1Mpa,通气量10~25L/min,搅拌200~800rpm。
本实施例重复3次,发酵结束,利用HPLC测定发酵液中的异亮氨酸含量,发酵指标见下表1。
实施例4
将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按15%的接种量接入50L发酵罐中,初定容20L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比例相同。发酵32h时,比生长速率达到0.1h-1,开始以50mL/h的速度流加补料培养基(以水配制,含玉米浆167g/L和豆粕水解液333g/L),发酵60h停止流加。发酵条件为:温度32℃,pH7.0~7.2,溶氧20%~30%,根据溶氧需要提升搅拌/通风量/罐压,罐压0.05~0.1Mpa,通气量10~25L/min,搅拌200~800rpm。
本实施例重复3次,发酵结束,利用HPLC测定发酵液中的异亮氨酸含量,发酵指标见下表1。
实施例5
将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按15%的接种量接入50L发酵罐中,初定容20L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比例相同。发酵30h时,比生长速率达到0.103h-1,开始以50mL/h的速度流加补料培养基(以水配制,含玉米浆125g/L和玉米浆水解液375g/L),发酵60h停止流加。发酵条件为:温度33℃,pH7.0~7.2,溶氧20%~30%,根据溶氧需要提升搅拌/通风量/罐压,罐压0.05~0.1Mpa,通气量10~25L/min,搅拌200~800rpm。
本实施例重复3次,发酵结束,利用HPLC测定发酵液中的异亮氨酸含量,发酵指标见下表1。
实施例6
将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按15%的接种量接入50L发酵罐中,初定容20L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比例相同。发酵30h时,比生长速率达到0.103h-1,开始以50mL/h的速度流加补料培养基(以水配制,含玉米浆125g/L和豆粕水解液375g/L),发酵60h停止流加。发酵条件为:温度33℃,pH7.0~7.2,溶氧30%~40%,根据溶氧需要提升搅拌/通风量/罐压,罐压0.05~0.1Mpa,通气量10~25L/min,搅拌200~800rpm。
本实施例重复3次,发酵结束,利用HPLC测定发酵液中的异亮氨酸含量,发酵指标见下表1。
发酵指标统计与分析
本发明采用安捷伦公司的高效液相色谱仪(Agilent Technologies 1200)进行发酵液中积累的异亮氨酸含量检测,具体方法如下:
色谱柱:ZORBAX Eclipse-AAA柱(3.5μm,4.6×75mm)
流动相A:称取6.24g NaH2PO4·2H2O,转移到1000mL玻璃烧杯中。加入1000mL超纯水,搅拌,直到所有晶体完全溶解。用NaOH调节溶液pH值至7.80。
流动相B:乙腈:甲醇:水=45:45:10(V/V/V)。
流速:2ml/min。
表1对比例与各实施例产酸量(g/L)
重复1次 | 重复2次 | 重复3次 | 平均值 | |
对比例 | 35.2 | 34.4 | 33.9 | 34.5 |
实施例1 | 40.9 | 41.4 | 41.6 | 41.3* |
实施例2 | 42.5 | 41.7 | 41.3 | 41.8* |
实施例3 | 43.5 | 44.3 | 44.8 | 44.2* |
实施例4 | 45.6 | 44.8 | 46.1 | 45.5* |
实施例5 | 41.4 | 42.0 | 43.2 | 42.2* |
实施例6 | 41.9 | 43.5 | 42.0 | 42.5* |
注:*示与对比例相比具有极显著差异(P<0.01)。
由表1可知,在培养基中氮源营养开始不足时,通过匀速流加以一定比例配置的玉米浆和水解液混合液,确实可以提高异亮氨酸的生成速率及产量,实施例1~6较对比例能够将产酸量提高6.8~11.0g/L。其中,实施例4当流加玉米浆和豆粕水解液的配比为1:2时,效果最为显著,产酸量较对比例可提高11.0g/L。实施例4的效果相较实施例1、实施例2、实施例5和实施例6均有显著差异(P<0.01),但较实施例3差异不显著(P>0.05)。说明按实施例3和实施例4的方法对提高异亮氨酸产酸量有同等好的效果。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种谷氨酸棒状杆菌的培养基组合,其包括:
种子培养基、发酵培养基和补料培养基;
所述种子培养基为葡萄糖20 g/L、玉米浆60 g/L、氯化钾0.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、消泡剂0.3 mL/L、生物素0.3 mg/L、VB1 2 mg/L,其余为水;
所述发酵培养基为葡萄糖80 g/L、玉米浆30 g/L、硫酸铵10 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、消泡剂0.3 mL/L、生物素0.1 mg/L、VB1 0.1 mg/L,其余为水;
所述补料培养基为125g/L~250g/L玉米浆和250g/L~375g/L水解液;所述水解液为豆粕水解液或玉米浆水解液。
2.根据权利要求1的培养基组合,其特征在于,
所述补料培养基中,玉米浆和水解液的总量为500 g/L;其中,玉米浆和水解液的比例为1:(1~3)。
3.根据权利要求1所述的培养基组合,其特征在于,所述种子培养基或发酵培养基中的消泡剂为有机硅油,菜籽油,矿物油或聚醚类化合物。
4.权利要求1~3任一项所述的培养基组合在发酵生产L-异亮氨酸中的应用。
5.一种发酵生产L-异亮氨酸的方法,其包括:
以权利要求1~3任一项中所述的种子培养基活化谷氨酸棒状杆菌,获得种子液;
将种子液接种至权利要求1~3任一项中所述的发酵培养基,发酵至比生长速率为0.1±0.01 h-1,流加权利要求1~3任一项中所述的补料培养基,继续发酵获得含有L-异亮氨酸的发酵液。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述流加的速度为50 mL/h。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述发酵的总时长为60h。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述种子液的接种量为15%。
9.根据权利要求5~8任一项所述的方法,其特征在于,所述发酵的条件为:罐压0.05~0.1Mpa,通气量10 L/min ~25L/min,搅拌200~800rpm,温度31~33℃,pH值为6.8~7.2,溶氧20%~40%。
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