CN110396122B

CN110396122B - 一种核磁共振造影剂、制备方法及其用于肿瘤诊断中的用途

Info

Publication number: CN110396122B
Application number: CN201910752186.9A
Authority: CN
Inventors: ***; 李芳巍; 李永生; 徐建忠; 刘晓冬; 张琦; 梁爽
Original assignee: Mudanjiang Medical University
Current assignee: Mudanjiang Medical University
Priority date: 2019-08-13
Filing date: 2019-08-13
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2039-08-13
Also published as: CN110396122A

Abstract

提供一种核磁共振造影剂，其结构如式I所示，其中，n为1‑3的整数；L_A‑COOH为甘草次酸、胆酸、叶酸中的任意一种，所述化合物具弛豫率高、对肿瘤尤其是对肝肿瘤靶向性好、且剂量小的优点，是一类有效的用于肿瘤诊断的核磁共振造影剂。

Description

一种核磁共振造影剂、制备方法及其用于肿瘤诊断中的用途

技术领域

本发明涉及一种核磁共振造影剂，具体涉及一种以甘草次酸、胆酸或叶酸修饰的DO3A类衍生物配体的钆金属配合物造影剂，其制备方法，以及用于核磁共振诊断肿瘤的用途。

背景技术

核磁共振成像(MRI)是一种利用生物体内水分子氢核在磁场中的共振作用而产生信号，经空间编码、重建而获得图像的技术。与传统的影像学检查方法相比(X射线、CT、PET、ECT 等)，MRI表现出了出色的优越性，如较高的空间分辨率，良好的软组织对比度、无电离辐射损害，以及可以进行功能成像等。目前关于磁共振成像技术的研究主要集中在两个方面，一是研究高灵敏度的磁信号分子探针，提高成像的组织分辨力；而是加快成像速率。磁共振造影剂(contrast agent for magnetic resonance imaging，MRICA)就是前者研究的内容之一，即通过缩短周围水质子的T1、T2弛豫时间，加速弛豫速率，提升组织之间的图像成比，达到提高MRI诊断的敏感性与特异性。

目前商业化并应用于临床的MRI造影剂主要有6种，均为小分子钆类螯合物，分时Gd-DTPA

及其二酰胺衍生物Gd-DEPA-BMA

Gd-DTPA-BMEA

Gd-DOTA

及其配体衍生物Gd-DO3A-butrol

Gd-HP-DO3A

以上MRI造影剂均为细胞外试剂，在体内呈非特异性分布，且静脉注射后迅速漏到血管外并被肾脏清除，因而检查所需剂量高，特别是对于肝、脾等组织病变及肿瘤缺乏特异性，有时为了诊断的目的，不得不加大用药剂量，从而增加了机体出现不良反应的风险。

药物靶向是将治疗药物选择性地分布到病变部位，从而提高病变药物浓度，增加药物利用率，同时又降低药物对正常组织的毒副作用。近年来，MRI造影剂的研究借鉴了上述思想，设计合成具有组织特异性的水溶性顺磁配合物，尤其以肿瘤靶向研究较多，如何根据组织病变生理的特点设计并实现使MRI造影剂准确到达肿瘤组织并表现出较高的弛豫效能逐渐成为研究热点。 (Radiology，1987，vol.163，255-258)通过化学方法将钆与含两条烷基侧链的DTPA衍生物相结合，最终制得了Gd-DTPA-SA 双膜脂质体，平均粒径为400nm，而在正常肝组织中存在大量的属于网状内皮***的单核巨噬细胞(kupffer细胞)，当血浆中的异源颗粒的粒径大于200nm时倾向于被其识别、吞噬和清除，而肿瘤细胞缺乏kupffer细胞，没有或很少有造影剂停留。 Gd-DTPA-SA双膜脂质体作为造影剂，获得了肝脏明显的增强成像效果(+110％肝脏，4℃，+180％肝脏，37℃)。(Radiology， 1992，vol.183，59-64)将苯乙氧基(EOB)共价连接于二乙三胺五乙酸(DTPA)上制得具有两亲性的小分子钆螯合物MRI 造影剂Gd-EOB-DTPA，通过用含苯环的亲脂性基团修饰小分子钆螯合物，使其能够被正常肝肾细胞里的谷胱甘肽S-芳基转移酶识别，增强肝细胞对其吞噬的能力，达到肝组织内积聚的目的，增强了其与肝肿瘤组织的图像对比度。

随着人们对肿瘤诊断，尤其是对癌症早期病变，如对肝脏的早期病变诊断要求的提高和对现在使用的MRI对比剂毒副作用的深入了解，MRI造影剂在体内的分布规律和组织器官特异性识别研究，设计靶向性能更好、剂量更小、毒副作用更小的MRI 造影剂显得越发重要和迫切。

从改变肝脏造影剂的靶向作用机制和降低剂量的目标出发，将具有很高肝靶向性的小分子如甘草次酸、胆酸和叶酸等引入至造影剂金属配合物中，制备出高识别性和弛豫率的造影剂，目前尚无文献报道。

本发明的目的就是为了解决以上技术问题。

发明内容

本发明的目的之一，在于提供一种具有弛豫率高、对肿瘤尤其是对肝肿瘤靶向性好、剂量小的小分子核磁共振造影剂。为了达到这个目的，本发明提供一种钆金属的被甘草次酸、胆酸或叶酸修饰的DO3A类衍生物配体的金属配合物造影剂。所述的配合物结构如式I所示：

其中，n为1-3的整数；L_A-COOH为甘草次酸、胆酸、叶酸中的任意一种。

本发明的另一目的在于提供一种所述核磁共振造影剂的制备方法，其合成路线如下：

所述方法包括如下步骤：

步骤(1)：轮环滕宁II和氯乙酸叔丁酯反应，随后调整 pH为8～9，醇析，得到1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁酯III；

步骤(2)：将式III化合物与氯代烷基醇IV溶于乙腈中，加入碱，反应制备得到式V化合物；

步骤(3)将式V化合物与甘草次酸、胆酸或叶酸混合，加入20％的TFA水溶液，进行酯化缩合反应，得到甘草次酸、胆酸或叶酸修饰的十二氮杂环配体化合物VI；

步骤(4)：将式V化合物与氯化钆进行络合反应，随后经醇析得到如式(I)所示的核磁共振造影剂。

作为优选，所述步骤(1)的反应是在缚酸剂催化下进行， 60-90℃下反应10-24小时。

进一步地，所述的缚酸剂为碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺或叔丁胺。

作为优选，所述的轮环滕宁II与缚酸剂的摩尔比为1:1.5～4。

进一步地，所述步骤(2)，所述碱为无机碱或有机碱，优选为氢氧化钠、氢氧化钾或三乙胺；所述反应为加热回流反应 5-20小时。

进一步地，所述步骤(3)的酯化缩合反应在50～95℃温度下进行，反应时间优选为16～32小时。

作为优选，所述步骤(4)中式V化合物与氯化钆的摩尔比为1:1～1.5。

更优选地，所述的络合反应的温度为30-90℃，优选为 70-85℃。

本发明的又一目的在于提供所述核磁共振造影剂、或者上述方法制备得到的核磁共振造影剂用于对肿瘤的核磁共振诊断的用途，所述肿瘤优选为肝癌肿瘤。

附图说明

图1为实施例2制备的化合物I-1-a造影剂注射小鼠后获得原发肝癌小鼠的MRI。

图2为实施例2制备的化合物I-1-a造影剂注射小鼠后获得转移肝癌小鼠的MRI。

具体实施方式

尽管在本申请中示出和描述了本发明优选的实施方案，但是对本领域技术人员而言明显的是，该实施方案仅以实例的方式提供。本领域技术人员将想起大量的变更、变换和置换，这些均在本发明范围内。应理解的是，在实践本发明中，可以使用本申请所述的本发明实施方案的各种备选方案。意在所附权利要求限定了本发明范围并且由此覆盖了在这些权利要求范围内的方法和结构及它们的等同形式。

除非另外定义，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解相同的含义。将本申请提及的所有专利和出版物通过引用的方式并入本文。

实施例1：中间体V-1(n＝2)的制备

制备路线为：

取5g轮环滕宁(II)、加入20mL的去离子水，搅拌，取氯乙酸叔丁酯(1.5当量)溶于15mL的去离子水中，加入5.0g碳酸钠溶于10ml去离子水形成的水溶液。升温至75℃，控制反应体系pH为9左右，反应12小时，反应结束，降温至室温，缓慢加入150ml乙醇，有大量固体析出，过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂得到式III化合物8.6g(HPLC纯度为87％)。

取6g式III化合粗品溶于35mL乙腈中，加入氯代正丙醇IV-1，加入3mL三乙胺，加热回流18小时，冷却至室温，加入30mL水和40mL的二氯甲烷，分液，用20mL×3水洗有机相，合并有机相，减压蒸馏回收溶剂，得到式V-1化合物粗品 7.1g。加入二氯乙烷:***的体积比为1:3的混合溶剂中25mL 重结晶，得到V-1化合物纯品4.5g(HPLC纯度99.2％)。

¹H NMR(400MHz，D₂O，TMS):δ＝4.51(s，27H)， 4.22(t，1H)，3.75(s,6H)，3.47(m，12H)，3.41(m， 4H)，3.33(t，2H)，3.28(m，2H)

实施例2：I-1-a～I-1-c(n＝2，L_A-COOH为甘草次酸、胆酸、叶酸)的制备：

制备路线为：

(1)取0.8g的式V-1化合物和甘草次酸(1.1当量)溶于乙醇中，加入1.2mL的20％TFA水溶液，加热回流反应20小时，冷却至室温，加入乙酸乙酯20mL，萃取提取有机相，用20mL×3水洗有机相，合并有机相，减压蒸馏回收溶剂，得到中间体VI-1-a(HPLC纯度：95％)。

采用上述相同的方法，将式V-1化合物分别和胆酸(1.1当量) 和叶酸(1.5当量)缩合分别制备得到中间体VI-1-b(HPLC纯度：92％)和VI-1-c(HPLC纯度：94％)。

(2)取0.5g的化合物V-1-a加入到5mL的去离子水中，加入0.95g的氯化钆，升温至85，反应6小时，冷却至室温，用氢氧化钠水溶液调节pH为8，滴加60mL的乙醇，升温回流，搅拌析晶4小时，降温至室温，过滤，真空干燥得到配合物I-1-a 0.83g。

采用上述相同的方法，分别制备得到配合物I-1-b和I-1-c。

实施例3：

核磁共振成像及弛豫率测试：成像效果及弛豫率用西门子 Trio 3T磁共振成像设备进行测定，先将钆配合物按浓度梯度稀释，盛放在1.5ml的离心管中，在3T场强下采用反转恢复法进行核磁共振成像，通过图像的亮度可以计算出每个浓度溶液的纵向弛豫时间(T₁)，再通过公式：

c.r₁+1/T_W＝1/T₁

计算出每个浓度下的T₁(其中c为钆含量，T_W为水分子的纵向弛豫时间)，最后通过计算机拟合得到造影剂的弛豫率r₁。其中钆含量利用全谱直读等离子体发射光谱(ICP-AES)进行测定。

通过核磁共振成像实验测得，化合物I-1-a、I-1-b、I-1-c的均有较高的弛豫率分别为12.1mM^-1s^-1、11.3mM^-1s^-1、13.6mM^-1s^-1，为商用Gd-HP-DO3A(

r₁＝3.7mM^-1s^-1) 的三倍多。

实施例4：化合物I-1-a对小鼠肝脏肿瘤靶向体外核磁共振成像：

(1)原发性肝肿瘤动物模型：以剂量100mg/kg注射出生后2周的老鼠二乙基亚硝胺(DEN)，2周饥饿处理后以剂量 20mg/kg注射2-乙酰氨基芴(2-AAF，橄榄油溶解)，2周后再次注射2-AAF。然后所有小鼠12h白天/黑夜循环，供给水和食物，正常条件培养。小鼠月龄6-7个月后观察MRI成像，然后处死小鼠切除肝并立即在液态氮冷冻进行病理切片。

(2)肿瘤模型建立与造影剂对比评估方法。通过小鼠模拟临床的化学诱导肝癌一般在诱导5-6个月发病，解剖后有肉眼可见的肿瘤块。注射采取与临床相同的注射方式，即静脉注射，对小鼠易操作的静脉注射为尾静脉注射。本发明所述的造影剂折射量推荐的剂量为3mmol/kg。考虑有效性，每个造影剂至少测量三组小鼠，每组两个小鼠，一个为原发肝癌一个为转移肝癌。造影剂的效果主要观察：i)在体内的代谢，包括器官蓄积，血液半衰期等。按照FDA的要求，作为诊断试剂必须完全代谢出体外。这也是作为诊断试剂安全性的一个重要指标。2)有效性，即观察肿瘤与背景对比度在注射前后的增强效果。

对造影剂I-a-1的核磁共振造影剂的MRI测试结果如图1-2所示，可以看出，病变大小范围从0.4毫米到1毫米，转移的病变形状不规则，相对于原发性病变为球形。因此，将本发明造影剂用于肝癌的核磁共振成像中，两种肝癌模型都清楚地显示肿瘤病变位置与大小。

Claims

1.化合物，其结构如式I所示：

其中，n为1-3的整数；L_A-COOH为甘草次酸，所述化合物用于制备用于对肝癌肿瘤进行诊断的核磁共振造影剂的用途。

2.根据权利要求1所述的化合物的制备方法，其合成路线如下：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤(1)：轮环滕宁II和氯乙酸叔丁酯反应，随后调整pH为8～9，醇析，得到1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸叔丁酯III；

步骤(3)：将式V化合物与甘草次酸混合，加入20％的TFA水溶液，进行酯化缩合反应，得到甘草次酸修饰的十二氮杂环配体化合物VI；

步骤(4)：将式V化合物与氯化钆进行络合反应，随后经醇析得到如式I所示的化合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的反应是在缚酸剂催化下进行，60-90℃下反应10-24小时；所述的轮环滕宁II与缚酸剂的摩尔比为1∶1.5～4。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的缚酸剂为碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺或叔丁胺。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)，所述碱为无机碱或有机碱；所述反应为加热回流反应5-20小时。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾或三乙胺。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的酯化缩合反应在50-95℃温度下进行，反应时间为16-32小时。

9.根据权利要求3或8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中式V化合物与氯化钆的摩尔比为1∶1～1.5。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的络合反应的温度为30-90℃。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述络合反应的温度为70-85℃。

12.根据权利要求1所述的化合物、或者根据权利要求2-11任一项所述的制备方法制得的化合物用于制备核磁共振造影剂的用途，所述核磁共振造影剂用于对肝癌肿瘤进行诊断。