CN102766188B - 胆固醇衍生物、螯合物、重组高密度脂蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胆固醇衍生物、螯合物、重组高密度脂蛋白及其用途。本发明通过将胆固醇连接到含氮多羧基配体上得到含有一个或者两个胆固醇的衍生物配体；该胆固醇衍生物与金属离子进行螯合后得到相应的螯合物；在高密度脂蛋白中组装该螯合物制备得到重组高密度脂蛋白；该重组高密度脂蛋白用于作为造影剂。该造影剂的粒径、形态和生物活性与人体内的高密度脂蛋白相似，并且弛豫效率要高于商用造影剂马根维显(Gd-DTPA)；其通过高密度脂蛋白的主动靶向可实现对肝脏部位特异性造影，并且通过胆固醇在肝脏的代谢过程实现对胆管和十二指肠的磁共振成像。

Description

胆固醇衍生物、螯合物、重组高密度脂蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及了肝脏功能性诊断的顺磁性磁共振造影剂，具体涉及了一种胆固醇衍生物、螯合物、重组高密度脂蛋白及其作为造影剂的用途。

背景技术

磁共振成像作为一种无损无创，成像方位灵活，空间分辨率高的方法，广泛应用于临床的诊断中。随着新的造影剂应用，磁共振成像技术在肝脏成像和胆胰成像中有着广泛的使用。肝脏磁共振成像能够用来确诊血管瘤、局灶性结节性增生和囊肿等，而不需要活组织检查、手术或随访检查等。并且肝脏磁共振成像可以用来检查肝硬化、皮脂腺病或肝血色素沉着症等，可以对肝硬化的患者检查肝癌或肝管癌，对接收移植手术的患者进行诊断。肝转移瘤通常需要判断分期和预后目标，肝脏磁共振成像能够较好的检查肝转移瘤的程度，从而为手术切除、射频消除或化学栓塞提供依据，并且可以监控肝转移瘤的复发。在磁共振成像临床诊断中，造影剂通过改变组织局部的弛豫时间，达到与周围组织的弛豫时间形成一定的差异，从而实现增强造影的目的。但是目前临床上使用的造影剂多为细胞外液造影剂，这类造影剂在静脉注射后，快速从血池渗透到细胞间隙，并且主要在肾脏清除，没有器官特异性磁共振增强。而且近年来有报道表明以钆螯合物为主的细胞外液造影剂会造成有严重肾脏损伤的病人产生肾源性***纤维化疾病。因为这类造影剂存在的剂量高以及毒副作用等问题，所以开发新型的器官靶向性磁共振造影剂成为提高临床诊断准确性和安全性的重要步骤。

高密度脂蛋白作为脂蛋白的一种，存在于血浆中的可溶性球形大分子的脂质载体。高密度脂蛋白由甘油三脂和胆固醇酯等非极性脂质组成疏水性的内核，外层被磷脂单分子层所包裹，在磷脂层上镶嵌着胆固醇和载脂蛋白A-I等几种载脂蛋白。高密度脂蛋白在体内主要参与了胆固醇逆向转运过程，主要步骤为首先高密度脂蛋白摄取肝外周组织处富余的胆固醇并且在体内循环中转变成胆固醇酯贮存在脂核中，然后高密度脂蛋白将胆固醇以及胆固醇酯转运至肝脏进行代谢。利用这种胆固醇逆向转运的途径构建造影剂从而可以提高磁共振造影剂的肝脏特异靶向性。高密度脂蛋白作为载体具有以下优点：⑴HDL作为一种内源性物质，能够在体内降解，无免疫反应，并且避免被单核细胞吞噬***识别和清除；⑵HDL能够通过受体介导的内吞或者选择性摄取将药物输送到目标细胞中，有较高的靶向性；⑶HDL的结构可以使得疏水性药物进入非极性的脂质内核，减少药物与外界环境的接触，避免药物被破坏。经对现有技术的文献检索发现，美国专利US7211248，提出将螯合钆离子的DTPA连接到脂质PA上，组装成高密度脂蛋白后检测动脉粥样硬化斑块，并且已发表的文献大部分将高密度脂蛋白作为造影剂来检测动脉粥样硬化斑块。并且没有文献以及专利报道使用胆固醇连接顺磁性离子螯合物后组装到高密度脂蛋白进行磁共振成像，尤其是对肝胆和十二指肠的磁共振成像。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种胆固醇衍生物、螯合物、重组高密度脂蛋白及其作为造影剂的用途。基于本发明的胆固醇衍生物的磁共振造影剂，是一种高磁共振成像性能、生物兼容性好、肝脏特异性靶向的造影剂，实现了对肝脏和相关器官的功能性磁共振成像。该造影剂在体内的半衰期较长，可以实现对肝脏、胆管和十二指肠区域的持续成像，可以减少造影剂的用量，减少造影剂的毒性，提高造影剂的成像效果。该造影剂能够弥补现有肝胆磁共振成像技术的不足之处，提高磁共振成像诊断的准确性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种胆固醇衍生物，其结构式如式（Ⅰ）所示：

其中，R1为式（Ⅱ）所示的结构，R2为羟基或式（Ⅱ）所示的结构：

优选地，所述R’为烷基、聚乙二醇类型的接连基团或聚醚类型的接连基团。

进一步优选地，所述R’为式（Ⅲ）所示的结构：

其中，n=2～16。

进一步优选地，所述R’为式（Ⅳ）所示的结构：

其中，n=1～16。

进一步优选地，所述R’为式（Ⅴ）所示的结构：

其中，n=1～16。

进一步优选地，所述R’为式（Ⅵ）所示的结构：

其中，n=1～16。

进一步优选地，所述R’为式（Ⅶ）所示的结构：

其中，n=1～16。

第二方面，本发明涉及一种螯合物，所述螯合物由前述的胆固醇衍生物与金属离子螯合而形成。

优选地，所述金属离子为镧系金属离子。

第三方面，本发明涉及一种重组高密度脂蛋白，所述重组高密度脂蛋白由载脂蛋白A-I、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、前述的螯合物组成。

优选地，所述载脂蛋白A-I、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、螯合物的摩尔比的范围为1:400:（20～400）。

优选地，所述重组高密度脂蛋白采用胆酸钠表面活性剂法制备而得，包括如下步骤：将所述载脂蛋白A-I、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、螯合物和胆酸钠混合，孵育，透析除去胆酸钠，即得。

第四方面，本发明涉及一种前述的重组高密度脂蛋作为肝胆功能性靶向的磁共振造影剂的用途。

优选地，所述磁共振造影剂为反映胆固醇在肝脏内代谢成胆酸的过程的造影剂。

优选地，所述磁共振造影剂为反映胆固醇在肝脏体内直接***到胆管的代谢过程的造影剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的磁共振成像造影剂的纵向弛豫效率要好于临床使用的造影剂，能够减少使用剂量。

2、本发明的造影剂能够特异性靶向到肝脏，并且从胆固醇的代谢途径从胆管***，从而能够增强胆管以及十二指肠部位的磁共振成像效果。

3、本发明的造影剂能够功能性增强肝脏的磁共振图像，连接有不同数量胆固醇的顺磁性离子螯合物能够反映不同的胆固醇代谢途径。

4、本发明中连接有单胆固醇的螯合物能够较长时间增强肝脏的磁共振信号，然后通过胆汁代谢增强胆管和十二指肠附件区域的磁共振信号，反映了胆固醇在肝脏体内代谢成胆酸的过程。

5、本发明中连接有双胆固醇的螯合物与连接有单胆固醇的螯合物相比，肝脏信号增强的时间较短，但是仍然有足够的成像时间窗，在短时间内增强胆管和十二指肠附近区域的磁共振信号，主要反映了胆固醇在肝脏体内直接***到胆管的代谢过程。

附图说明

图1为胆固醇衍生物的钆螯合物的合成路线图；

图2为不同的胆固醇连接基团形成的DTPA配体的结构图；

图3为单胆固醇衍生物DTPA-chol的NMR¹H谱图；

图4为单胆固醇衍生物DTPA-chol的NMR¹³C谱图；

图5为双胆固醇衍生物DTPA-(chol)₂的NMR¹H谱图；

图6为双胆固醇衍生物DTPA-(chol)₂的NMR¹³C谱图；

图7为组装有单胆固醇的钆螯合物Gd-DTPA-chol的重组高密度脂蛋白Gd-chol-HDL的粒径分布图；

图8为组装有双胆固醇的钆螯合物Gd-DTPA-(chol)₂的重组高密度脂蛋白Gd-(chol)₂-HDL的粒径分布图；

图9为组装有单胆固醇的钆螯合物GdDTPA-chol的重组高密度脂蛋白Gd-cholHDL的透射电子显微镜(TEM)图片；

图10为组装有双胆固醇的钆螯合物Gd-DTPA-(chol)₂的重组高密度脂蛋白Gd-(chol)₂-HDL的透射电子显微镜(TEM)图片；

图11为所制备的造影剂在水溶液中的纵向弛豫效率(1/T₂)相对于钆浓度拟合的直线图；

图12为Gd-chol-HDL在大鼠体内的对肝脏和十二指肠的T₁加权成像图；

图13为Gd-(chol)₂-HDL在大鼠体内的对肝脏和十二指肠的T₁加权成像图；

图14为两种造影剂在大鼠体内的肝脏和十二指肠区域的磁共振信号增强比例图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、胆固醇衍生物及其螯合物的制备

1.1、制备胆固醇衍生物

1.1.1、胆固醇衍生物Ⅰ的制备

如图1所示，将500mmol乙二胺溶解于100ml无水二氯甲烷中，加入到干燥后的100ml三口烧瓶中，同时加入10mmolN,N-二异丙基乙胺，搅拌使之混匀。将5mmol胆固醇氯甲酸酯溶解于20ml无水二氯甲烷中，在冰水浴下逐滴缓慢加入到乙二胺的溶液中，持续半小时，反应体系的温度上升到室温。三口烧瓶中通入氮气，密封下反应体系在室温下搅拌2天，反应结束后，将反应溶剂加入到250ml茄形瓶中，使用真空泵抽去二氯甲烷直至最小体积，加入10ml预冷的去离子水，搅拌半小时使之溶解乙二胺和盐酸盐。用20ml二氯甲烷萃取两次，15ml去离子水洗涤两次，使用无水硫酸钠干燥过夜，过滤除去硫酸钠沉淀，将上清使用真空泵抽去二氯甲烷，得到粗产物。使用硅胶分离得到胆固醇-乙二胺，分离用的的展开剂为二氯甲烷/甲醇/氨水（92:7:1，v/v）。

将2mmol二乙烯三胺五乙酸双酸酐（结构式为图1中的“4”）溶解于50ml无水二甲基甲酰胺中，加入到250ml三口烧瓶中，加入2mmolN,N-二异丙基乙胺，稍微加温直至二乙烯三胺五乙酸双酸酐全部溶解后使用冰水浴降温。将三口烧瓶密封，通入氮气保护，加入1mmol胆固醇-乙二胺（结构式为图1中的“3”），溶解于20ml无水二氯甲烷中，使用注射器缓慢加入到溶液中，每15分钟注射1ml，注射结束后反应温度缓慢升到室温，继续搅拌反应，反应24小时。反应结束后使用油泵抽去反应溶剂，在真空干燥箱中烘干粗产物。将粗产物加入到20ml去离子中，在室温下搅拌1小时，再升温到60℃搅拌3小时，使二乙烯三胺五乙酸完全溶解从而除去，过滤后收集滤渣，在真空干燥箱中烘干产物。使用硅胶分离出单胆固醇衍生物DTPA-chol（结构式为图1中的“5”）和双胆固醇衍生物DTPA-(chol)₂（结构式为图1中“6”）。

合成出的DTPA-chol配体（结构式为图1中的“5”）为白色粉末状固体，不溶于水，能溶于甲醇与氯仿、二氯甲烷的混合溶剂中，不能单溶于氯仿、二氯甲烷和甲醇；DTPA-(chol)₂配体（结构式为图1中的“6”）为白色粉末状固体，不溶于水和甲醇，能溶于甲醇、二氯甲烷中，在空气中稳定，长期放置物化性质没有变化。

Gd-DTPA-chol的分子式为C₄₄H₇₃N₅O₁₁，使用四极杆飞行时间质谱联用仪(q-TOF)做高分辨质谱鉴定，在负离子模式下，分子式为C₄₄H₇₂N₅O₁₁，分子量计算值为846.5228，实测值为846.5253，ppm为3.0。

图3为单胆固醇衍生物DTPA-chol的NMR1H谱图，1HNMR(400MHz,CDCl3+dropsofCD3OD):δ=0.64(s,3H,H-18’,CH3),0.82(d,3H,H-27’,CH₃),0.83(d,3H,H-26’,CH₃),0.87(d,3H,H-21’,CH₃),0.96(s,3H,H-19’,CH₃),1.01-1.69(m,21H,1-CH₂,9-CH,11-CH₂,12-CH₂,14-CH,15-CH₂,16-CH₂,17-CH,20-CH,22-CH₂,23-CH₂,24-CH₂,25-CH),1.71-2.04(m,5H,2-CH₂,7-CH₂,8-CH),2.17-2.30(m,2H,H-4’,CH₂),2.54-2.79(m,4H,2xN-CH₂),3.13-3.27(m,4H,2XN-CH₂),3.36-3.53(brs,14H,5xN-CH₂-CO,2xNH-CH₂),5.31(s,1H,H-6’),4.38(s,1H,H-3’),

图4为单胆固醇衍生物DTPA-chol的NMR¹³C谱图，¹³CNMR(400MHz,CDCl₃+dropsofCD₃OD):δ=11.78,18.64,19.23,20.99,22.45,22.71,23.81,24.22,27.94,28.16,29.62,31.81,35.75,36.14,36.50,36.92,38.55,39.45,39.68,42.26,49.98,56.14,56.65,74.45,122.50,139.69,

Gd-DTPA-(chol)₂的分子式为C₇₄H₁₂₃N₇O₁₂，使用四极杆飞行时间质谱联用仪(q-TOF)做高分辨质谱鉴定，在负离子模式下，分子式为C₇₄H₁₂₂N₇O₁₂，分子量计算值为1300.9151，实测值为1300.9171，ppm为1.5。

图5为双胆固醇衍生物DTPA-(chol)₂的NMR¹H谱图，DTPA-(chol)₂的NMR为：¹HNMR(400MHz,CDCl₃+dropsofCD₃OD):δ=0.64(s,6H,H-18’,CH₃),0.82(d,6H,H-27’,CH₃),0.83(d,6H,H-26’,CH₃),0.87(d,6H,H-21’,CH₃),0.96(s,6H,H-19’,CH₃),1.01-1.69(m,21H,1-CH₂,9-CH,11-CH₂,12-CH₂,14-CH,15-CH₂,16-CH₂,17-CH,20-CH,22-CH₂,23-CH₂,24-CH₂,25-CH),1.71-2.04(m,10H,2-CH₂,7CH₂,8-CH),2.17-2.34(m,4H,H-4’,CH₂),2.56-2.70(brs,4H,2xN-CH₂),3.1-3.2(s,4H,2xN-CH₂),3.10-3.20(s,8H,2xN-CH₂),3.22-3.33(brs,18H,5xN-CH₂-CO,4xNH-CH₂),5.31(s,2H,H-6’),4.38(s,2H,H-3’);

图6为双胆固醇衍生物DTPA-(chol)₂的NMR¹³C谱图，¹³CNMR(400MHz,CDCl₃+dropsofCD₃OD):δ=11.78,14.02,18.63,19.23,20.98,22.47,22.63,22.73,23.81,24.22,27.95,28.17,29.64,31.79,35.76,36.13,36.50,36.92,38.52,39.45,39.68,42.25,49.97,56.12,56.64,74.56,122.50,139.71,

1.1.2、胆固醇衍生物Ⅱ的制备

按照1.1.1相似的方法，将250mmol2-(氨氧基)-乙胺二盐酸盐溶解于100ml无水二氯甲烷中，加入到干燥后的100ml三口烧瓶中，同时加入10mmolN,N-二异丙基乙胺，搅拌使之混匀。将5mmol胆固醇氯甲酸酯溶解于20ml无水二氯甲烷中，在冰水浴下逐滴缓慢加入到2-(氨氧基)-乙胺二盐酸盐的溶液中，持续半小时，反应体系的温度上升到室温。三口烧瓶中通入氮气，密封下反应体系在室温下搅拌2天，反应结束后，将反应溶剂加入到250ml茄形瓶中，使用真空泵抽去二氯甲烷直至最小体积，使用硅胶分离得到产物2-(氨氧基)-乙胺-胆固醇，分离用的的展开剂为二氯甲烷/甲醇/氨水（90:10:1，v/v）。

按照1.1.1相似的方法，2-(氨氧基)-乙胺-胆固醇与二乙烯三胺五乙酸双酸酐进行反应，使用硅胶进行分离纯化，得到DTAP单酰胺配体（结构式为图2中的“1”）和DTPA双酰胺产物（结构式为图2中的“2”）

合成出的DTPA-chol配体（结构式为图2中的“1”）为白色粉末状固体，不溶于水，能溶于甲醇与氯仿、二氯甲烷的混合溶剂中；DTPA-(chol)₂配体（结构式为图2中的“2”）为白色粉末状固体，不溶于水和甲醇，能溶于甲醇、二氯甲烷中，在空气中稳定，长期放置物化性质没有变化。

DTPA-chol配体（结构式为图2中的“1”）的分子式为C₄₄H₇₃N₅O_12，使用四极杆飞行时间质谱联用仪(q-TOF)做高分辨质谱鉴定，在负离子模式下，分子式为C₄₄H₇₂N₅O₁₂，分子量计算值为862.5177，实测值为862.5198，ppm为2.4。

DTPA-(chol)₂配体（结构式为图2中的“2”）的分子式为C₇₄H₁₂₃N₇O₁₄，使用四极杆飞行时间质谱联用仪(q-TOF)做高分辨质谱鉴定，在负离子模式下，分子式为C₇₄H₁₂₂N₇O₁₄，分子量计算值为1332.9050，实测值为1332.9115，ppm为4.9。

1.1.3、胆固醇衍生物Ⅲ的制备

按照1.1.1相似的方法，将500mmol1,3-二氨基-丙酮溶解于100ml无水二氯甲烷中，加入到干燥后的100ml三口烧瓶中，同时加入10mmolN,N-二异丙基乙胺，搅拌使之混匀。将5mmol胆固醇氯甲酸酯溶解于20ml无水二氯甲烷中，在冰水浴下逐滴缓慢加入到1,3-二氨基-丙酮的溶液中，持续半小时，反应体系的温度上升到室温。三口烧瓶中通入氮气，密封下反应体系在室温下搅拌2天，反应结束后，将反应溶剂加入到250ml茄形瓶中，使用真空泵抽去二氯甲烷直至最小体积，使用硅胶分离得到产物2-(氨氧基)-乙胺-胆固醇，分离用的的展开剂为二氯甲烷/甲醇/氨水（80:20:1，v/v）。

按照1.1.1相似的方法，2-(氨氧基)-乙胺-胆固醇与二乙烯三胺五乙酸双酸酐进行反应，使用硅胶进行分离纯化，得到DTAP单酰胺配体（结构式为图2中的“3”）和DTPA双酰胺产物（结构式为图2中的“4”）

合成出的DTPA-chol配体（结构式为图1中的“3”）为白色粉末状固体，不溶于水，能溶于甲醇与氯仿、二氯甲烷的混合溶剂中；DTPA-(chol)2配体（结构式为图1中的“4”）为白色粉末状固体，不溶于水和甲醇，能溶于甲醇、二氯甲烷中，在空气中稳定，长期放置物化性质没有变化。

DTPA-chol配体（结构式为图2中的“3”）的分子式为C₄₅H₇₃N₅O₁₂，使用四极杆飞行时间质谱联用仪(q-TOF)做高分辨质谱鉴定，在负离子模式下，分子式为C₄₅H₇₂N₅O₁₂，分子量计算值为874.5177，实测值为874.5210，ppm为3.8。

DTPA-(chol)₂配体（结构式为图2中的“4”）的分子式为C₇₆H₁₂₃N₇O₁₄，使用四极杆飞行时间质谱联用仪(q-TOF)做高分辨质谱鉴定，在负离子模式下，分子式为C₇₆H₁₂₂N₇O₁₄，分子量计算值为1356.9050，实测值为1357.5405，ppm为4.7。

1.2、制备胆固醇衍生物与金属离子形成的螯合物

所述金属离子可以为钆、镤、铕、铽、镝、镱等镧系金属中的任意一种；本实施例中选用钆。

称DTPA-chol(360mg,0.425mmol)加入到100ml烧瓶中，加入30ml去离子水，同时加入2N氢氧化钠溶液(425ul)搅拌使之溶解，溶液呈现乳光。六水合氯化钆(158mg，0.425mmol)溶解于2ml纯水中，缓慢加入到DTPA-chol溶液中，搅拌的同时用2N氢氧化钠溶液调节溶液的pH值维持在pH6.8左右，随着氯化钆溶液的加入，溶液逐渐变成乳白色。室温条件下搅拌溶液3小时，然后缓慢加热到60℃搅拌3小时，反应结束后，加入180ml乙腈沉淀产物。将产物过滤收集沉淀，真空干燥箱中干燥过夜，收集产物Gd-DTPA-chol（结构式为图1中“7”）。

双胆固醇衍生物的钆螯合物Gd-DTPA-(chol)₂（结构式为图1中“8”）按照Gd-DTPA-chol的合成方法制备。

Gd-DTPA-chol为白色粉末状固体，Gd-DTPA-(chol)₂为白色蜡状固体。两种螯合物难溶于水；可溶于甲醇与氯仿、二氯甲烷的混合溶剂中。在空气中稳定，无光敏性，长期放置物化性质没有变化，其中，由胆固醇衍生物Ⅰ与金属离子形成的螯合物的化学式和产量如下表1所示。Gd-DTPA-chol中游离钆离子的含量低于0.3%，Gd-DTPA-(chol)₂中游离钆离子的含量低于0.5%，两种钆螯合物纯度>99.5%，

表1两种螯合物的物理性质

化学式/分子式	摩尔分子量	产率(%)	颜色
				Gd-DTPA-chol/C44H69N5O11NaGd	1024	21.6	白色粉末状
Gd-DTPA-(chol)2/C74H120N7O12Gd	1456	34.5	白色蜡状

实施例2、造影剂的制备

将胆固醇衍生物Ⅰ中的单胆固醇衍生物的钆螯合物Gd-DTPA-chol使用胆酸钠表面活性剂法组装进高密度脂蛋白中得到重组高密度脂蛋白Gd-chol-HDL（用作造影剂）。高密度脂蛋白各组分的摩尔比例为：Gd-DTPA-chol:DMPC:胆酸钠=1:1:2(mol/mol)；将所述高密度脂蛋白和螯合物混合，室温下孵育，透析除去胆酸钠，得到重组高密度脂蛋白。具体为：称Gd-DTPA-chol(5mg,5μmol)，DMPC(3.4mg,5μmol)，用氯仿/甲醇（3/1，v/v）混合溶剂使之溶解，用氮气吹干氯仿，在真空干燥箱中除去残余的溶剂，加入胆酸钠4.30mg，用1mlTBS缓冲液溶解，超声30分钟使之溶解。按照载脂蛋白AI：DMPC=1：400(mol/mol),取出保存在-20℃的载脂蛋白AI样品,放置10分钟使之恢复温度到室温，取700ug的载脂蛋白A-I溶液加入Gd-DTPA-chol的胆酸钠溶液中，超声3s，在4℃振荡12-16小时。将溶液装到分子量为10000的透析袋中，使用2LTBS缓冲液（20mMTris,150mMNaCL,pH8.0）在4℃条件下透析2天，并且更换透析液三次。收集样品，放在4℃保存。

双胆固醇衍生物的钆螯合物Gd-DTPA-(chol)₂使用相同的胆酸钠表面活性剂法组装进高密度脂蛋白中，得到重组高密度脂蛋白Gd-(chol)₂-HDL（用作造影剂）。

图7为使用动态光散射法测定重组高密度脂蛋白组装有单胆固醇衍生物Gd-DTPA-chol时的粒径分布图，结果表明平均粒径为21.7±5.8nm，粒径分散指数(PdI)为0.445，粒径与野生型高密度脂蛋白相似，粒子电位为-59±26mV；

图8为使用动态光散射法测定组装有双胆固醇衍生物Gd-DTPA-(chol)₂时的粒径分布图，结果表明平均粒径为25.5±6.8nm，粒径分散指数(PdI)为0.293，粒径与野生型高密度脂蛋白相似，粒子电位为-30±6mV。并且两种重组高密度脂蛋白在4度下可以保持较长时间。

图9为重组高密度脂蛋白Gd-chol-HDL的透射电镜图片，由该图可以看出得到的Gd-chol-HDL粒子为圆盘状高密度脂蛋白，并且计算200个粒子得到的平均粒径为22.0±3.8nm，与使用动态光散射法测定的平均粒径相似。

图10为重组高密度脂蛋白Gd-(chol)₂-HDL的透射电镜图片，由该图可以看出得到的Gd-(chol)₂-HDL粒子为圆盘状高密度脂蛋白，并且计算200个粒子得到的平均粒径为25.1±3.7nm，与使用动态光散射法测定的平均粒径相似。

图11为实施例2所制备的造影剂在水溶液中的纵向弛豫效率(1/T2)相对于钆浓度拟合的直线图，直线斜率即为纵向弛豫率r1，由该图可见，Gd-chol-HDL的纵向弛豫效率r1为7.67mM-1s-1，Gd-(chol)₂-HDL的纵向弛豫效率r1为5.16mM-1s-1，比商用造影剂马根维显(Gd-DTPA)的弛豫效率要高。

图12为Gd-chol-HDL在大鼠体内的对肝脏和十二指肠的T₁加权成像图，将所制备的造影剂通过尾部静脉注射入150g的SD大鼠体内，剂量为10μmol/kg。所使用的仪器为西门子MAGNETOMTrio3T，使用线圈为mousecoil，直径5cm。采用快速自旋回波T1加权成像序列，扫描的参数为TR/TE=1120/24ms，层厚为2mm，层数10-11，视野为60X60mm，扫描时间约5min。在不同时间点对大鼠进行磁共振成像扫描，由该图可见，Gd-chol-HDL能够显著增强肝脏以及十二指肠附件部位的磁共振信号强度。

图13为Gd-(chol)₂-HDL在大鼠体内的对肝脏和十二指肠的T1加权成像图，按照与Gd-chol-HDL同样的方法注射入大鼠体内，在不同时间点进行磁共振成像扫描。由该图可见，Gd-(chol)₂-HDL能够显著增强肝脏以及十二指肠附件部位的磁共振信号强度。

图14为两种造影剂在大鼠体内的肝脏和十二指肠区域的磁共振信号增强比例图，由该图可见，造影剂Gd-chol-HDL和Gd-(chol)₂-HDL分别代表了胆固醇两种代谢途径，Gd-chol-HDL组装的单胆固醇衍生物反映了胆固醇在肝脏体内被代谢成胆酸然后***到胆管的过程，而Gd-(chol)₂-HDL组装的双胆固醇衍生物反映了胆固醇进入肝脏后直接被***到胆管的过程。从该图可以表明：不同数量的胆固醇连接的钆螯合物不仅可以对肝胆和十二指肠进行磁共振成像增强，并且可以对肝脏进行功能性磁共振成像。

实施例3、粒径和纵向弛豫效率测定

重组高密度脂蛋白的配方会对其性质产生影响。按照实施例2中方法将胆固醇衍生物Ⅱ中的双胆固醇衍生物的钆螯合物Gd-DTPA-(chol)₂制作重组高密度脂蛋白，采用不同的脂质配方，制作重组高密度脂蛋白后测定其粒径和纵向弛豫效率。粒径使用动态光散射法测定，结果显示为在强度下的粒径结果。下表2显示当DMPC：螯合物的摩尔比例提高时，重组高密度脂蛋白的粒径随之正比例相应增加，纵向弛豫效率却反比例减小。

表2

综上所述，本发明将胆固醇连接到含氮多羧基配体上得到含有一个或者两个胆固醇的配体，与金属离子进行螯合后得到相应的螯合物；通过将螯合物组装到高密度脂蛋白而制得重组高密度脂蛋白，该重组高密度脂蛋白用作造影剂。该造影剂的粒径、形态和生物活性与人体内的高密度脂蛋白相似，并且造影剂的弛豫效率要高于商用造影剂马根维显(Gd-DTPA)。该造影剂通过高密度脂蛋白的主动靶向可实现对肝脏部位特异性造影，并且通过胆固醇在肝脏的代谢过程实现对胆管和十二指肠的磁共振成像。该造影剂中含有不同数目胆固醇的螯合物可以通过不同的胆固醇代谢途径实现对肝脏的功能性检测。

Claims (7)

1.一种胆固醇衍生物，其特征在于，结构式如式(Ⅰ)所示：

其中，R1为式(Ⅱ)所示的结构，R2为羟基或式(Ⅱ)所示的结构：

所述R’为式(Ⅲ)所示的结构：

其中，n＝2。

2.一种螯合物，其特征在于，所述螯合物由权利要求1所述的胆固醇衍生物与钆离子螯合而形成。

3.一种重组高密度脂蛋白，其特征在于，所述重组高密度脂蛋白由载脂蛋白A-I、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、权利要求2所述的螯合物组成。

4.如权利要求3所述的重组高密度脂蛋白，其特征在于，所述载脂蛋白A-I、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、螯合物的摩尔比的范围为1:400:(20～400)。

5.一种如权利要求3所述的重组高密度脂蛋白在制备肝胆功能性靶向的磁共振造影剂的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述磁共振造影剂为反映胆固醇在肝脏内代谢成胆酸的过程的造影剂。

7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述磁共振造影剂为反映胆固醇在肝脏体内直接***到胆管的代谢过程的造影剂。