CN110384712A - 核酸适配子在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了核酸适配子在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用。通过SELEX技术筛选出与人AChE结合的适配子Ob2，所述的核酸适配子Ob2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。体外检测Ob2具有抑制AChE活性的作用。通过侧脑室给药，Ob2能改善阿尔茨海默病(AD)模型小鼠的空间学习记忆能力，降低小鼠海马及皮层Aβ40及Aβ42含量和老年斑沉积数量等作用。由于适配子的高特异性和高结合性，针对人AChE的适配子是体内外检测AChE的有力工具，并有望开发为治疗AD等疾病的新型AChE抑制剂。为新型特异的AChE抑制的开发提供研究基础，为AD治疗提供新方法和新思路。

Description

核酸适配子在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及核酸适配子在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种引起老年人群痴呆最常见的渐进性不可逆性中枢神经***退行性脑病，其典型临床症状为记忆、语言及影响一个人进行日常活动的认知功能的障碍。随着人们寿命的延长，痴呆患者数量正急剧增加，同时带来了极大的家庭及社会经济负担。据统计，2018年全球范围内每3秒钟就会出现一例新的痴呆病例，且痴呆症患者数目已经达到5000万人。到2050年，这一数字将增加两倍多，达到1.52亿。2018年全球痴呆症的总成本为1万亿美元，到2030年，这一数字将增至2万亿美元。

AD患者的大脑内有几种不同的神经病理特征，包括细胞外淀粉样斑块、细胞内神经原纤维缠结、星型胶质细胞变性、反应性小胶质细胞、炎症及神经元和突触丢失。细胞外聚集的β-淀粉样斑块(beta-amyloid protein,Aβ)来源于β-分泌酶和γ-分泌酶切割淀粉样前体蛋白(amyloid b-precursor protein,APP)。神经原纤维缠结由神经元内过磷酸化的tau蛋白组成。虽然这些神经病理特征在皮层顶叶和颞叶、海马、内嗅皮层及杏仁核表现非常突出，但也只是其中之一，AD最早的病理学现象是基底前脑胆碱能神经元退行性变。

乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)是所有胆碱能神经元具有的神经递质，广泛分布于外周及中枢神经***，在大脑皮层发育、皮层活动、脑血流控制、睡眠-觉醒周期、调节认知功能及学***及胆碱高亲和力摄取显著下降，基底前脑这些胆碱能缺陷严重程度与AD患者的认知行为障碍及非认知行为障碍呈正相关。

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)存在于胆碱能神经元突触间，通过水解ACh终止其对突触后膜的持续作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。。在患有AD的个体中，AChE的活性增加，导致神经递质ACh的分解增强，从而使大脑中的胆碱水平下降。此外，AChE与AD的另一关系是AChE部分参与Aβ及神经原纤维的形成。有研究表明，AChE通过与生长的原纤维形成复合物促进β淀粉样肽片段的聚集，这些形成的复合物显示出比单独的Aβ斑块更大的细胞毒性。

胆碱能神经元释放的ACh能结合两种不同的受体亚型：烟碱型ACh受体及毒蕈碱受体。研究显示这两类受体对AD药物研发具有重要的作用。基于AD的胆碱能神经元丢失假说及ACh水平的下降，AD的治疗方法主要是通过抑制AChE、激活烟碱型胆碱受体及毒蕈碱型胆碱受体。其中激活大脑中的毒蕈碱受体可以刺激APP的非淀粉样α分泌酶的加工，同时抑制APP的β分泌酶加工途径，从而显著降低大脑皮层和海马的β-淀粉样蛋白(beta-amyloidprotein,Aβ)水平。乙酰胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesterase inhibitor,AChEI)通过抑制AChE的水解作用，增加大脑突触间ACh含量，从而改善AD的认知功能。此外，AChEI除了通过抑制AChE改善AD症状外，还可以延缓淀粉样斑块的沉积。

AChEI作为目前最有效的AD治疗药物，已经获得美国FDA批准的AChEI：他克林、多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏。他克林是美国FDA第一个批准治疗AD的药物，是一种非选择性可逆性AChEI，由于具有肝毒性，可引起转氨酶升高，已于2012年5月撤出美国市场。多奈哌齐(Donepezil)是第二代特异性可逆性中枢AChEI，对外周AChE作用很小，抑制AChE活性的强度是抑制丁酰胆碱酯酶的570倍，具有较高的选择性，副作用低且没有明显肝毒性，是大多数AD患者的首选药物。利斯的明是氨基甲酸酯类、长效可逆、非竞争性AChEI，其对大脑海马及皮层的AChE具有选择性，用于轻、中度阿尔茨海默病的口服治疗。加兰他敏是来源于雪球球茎的生物碱，能可逆性抑制AChE同时激活突触前及突触后烟碱型ACh受体，而烟碱型ACh受体激动剂能提高动物及人的记忆。

适配子(aptamer)也称为适配体或适体，是通过指数级富集的配体***进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选得到的能折叠成三维空间结构的单链DNA/RNA寡核苷酸，可特异性识别多种靶标，如蛋白质、多肽、金属离子、小分子甚至完整的细胞等。SELEX技术是由美国的Ellington和Tuerk等人于1990年首次在不同实验室发明的可用于筛选专一靶向于某一特定靶分子的核苷酸的技术，他们分别筛选得到了能与有机染料和噬菌体T4DNA聚合酶特异性结合的RNA片段，并称之为适配子，由此适配子这一全新的概念出现并逐渐发展。核酸适配子能与靶分子以高亲和力特异性结合(解离常数为pM-μM)，其性质类似于抗体，但相比抗体而言其具有更多独特的优势，如：1)快速且可控：适配子是完全经体外生产得到的，故而可快速合成；体外筛选使适配子的特异性和亲和力受到严格控制，并允许产生针对毒性和非免疫原性靶点的引子；2)优良的药代动力学：天然RNA/DNA具有较低的药代动力学，其主要原因是核酸酶的降解和肾脏的清除；适配子通过适当的化学修饰可以解决这两种限制；3)耐核酸酶：体内核酸通过内切酶和5’-3’和3’-5’核酸外切酶的结合而在血清中降解；适当的化学修饰阻止了适配子在血清中经这两种酶降解；4)清除率：即使经过广泛的修饰以阻止核酸酶的降解，适配子也必须大于40kD才能长时间停留在血循环中；5)给药方式多样：大多数治疗性单克隆抗体的溶解度相对较低，体积也很大，因此大多数抗体治疗药物是通过静脉输注(通常超过2-4h)给药，适配子可以通过静脉或皮下注射；6)稳定性好：适配子经高温、变性后能重新恢复活性，并且冻干粉末可以在室温下保存更长的时间(超过1年)；7)低毒性及低免疫原性；8)低成本等。

基于适配子的优点，核酸适配子类药物得以快速发展，其主要通过抑制或激活靶分子，干扰下游信号通路而发挥治疗作用。目前已有11种处于临床试验不同阶段的适配子，可用于治疗黄斑变性、癌症、血栓性疾病和炎症等不同疾病。除了作为药物单独应用外，适配子通过结合各种治疗剂，包括化疗药物、纳米材料、蛋白质/多肽、核酸、光敏剂等，用作靶向载体运载药物到特定组织。

发明内容

本发明的第一个目的是提供核酸适配子或其化学修饰物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用，所述的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第二个目的是提供核酸适配子或其化学修饰物在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用。

所述的化学修饰物是在上述的核酸适配子中包括的至少一个核苷酸的核糖2'位上的羟基被氢原子、氟原子、-O-酰基和氨基中任意一种所取代，以及在3'端或5'端加入FCM、FITC、biotin的任意修饰。

我们通过SELEX技术成功筛选得到能与AChE结合的DNA适配子Ob1,Ob2,Ob3。首先运用AChE活性检测试剂盒探究适配子Ob1、Ob2、Ob3是否具有体外抑制小鼠脑匀浆AChE活性作用，结果表明适配子Ob2具有体外抑制小鼠脑匀浆AChE活性作用；随后检测适配子Ob2作用时间及浓度变化对小鼠脑匀浆AChE活性的影响，同时检测适配子Ob2浓度变化对人重组AChE活性的影响。结果表明：适配子Ob2体外抑制小鼠脑匀浆AChE活性作用与时间相关，30min左右Ob2即可使小鼠脑匀浆AChE活性抑制率达到最大；适配子Ob2抑制小鼠脑匀浆AChE的有效半抑制浓度IC₅₀＝0.3174μM，抑制人重组AChE有效半抑制浓度IC₅₀＝2.5665μM。侧脑室给药并检测针对AChE的适配子Ob2在AD模型小鼠Tg6799上的作用。结果显示适配子Ob2可改善AD模型小鼠空间学***下降，而通过α分泌酶途径的降解产物sAPPα表达量没有明显变化；ELISA显示适配子Ob2可降低小鼠海马及皮层Aβ40及Aβ42含量；硫磺素S染色及免疫荧光显示适配子Ob2治疗组小鼠海马区及皮层老年斑沉积数量及覆盖面积均降低；同时Ob2处理组小鼠海马区反应性星型胶质细胞荧光密度下降。针对人AChE的适配子是体内外检测AChE的有力工具，并有望开发为治疗AD等疾病的新型AChE抑制剂。

本研究通过SELEX技术成功筛选得到能以高亲和力结合AChE的DNA适配子Ob2，并证明该适配子具有抑制AChE体外活性的作用。为新的强效特异的AChE抑制剂的开发提供了研究基础，为AD治疗提供了新的方法和思路。

附图说明

图1是体外检测适配子Ob2抑制AChE的活性。a：针对AChE的适配子Ob1-Ob3及对照适配子Scr体外抑制小鼠脑匀浆AChE活性情况，^**P<0.01。b：针对AChE的适配子Ob2不同浓度体外抑制小鼠脑匀浆AChE活性作用时间关系。c：针对AChE的适配子Ob2、对照适配子Scr及阳性对照药物多奈哌齐体外抑制小鼠脑匀浆AChE活性作用浓度关系。d：针对AChE的适配子Ob2、对照适配子Scr及阳性对照药物多奈哌齐体外抑制人重组AChE活性作用浓度关系。

图2是适配子Ob2及Scr脑内给药后对转基因小鼠Tg6799运动能力及工作记忆的影响。a：Tg6799小鼠埋管给药及行为与生化实验时间顺序示意图。b：Tg6799小鼠埋管位置示意图。c：旷场实验中各组小鼠运动总距离及中心区时间。d：Y迷宫实验中各组小鼠进入各臂的总次数及自发交替率。

图3是转基因小鼠Tg6799经适配子Ob2脑内给药后水迷宫的空间学***台位置的次数，^*P<0.05。b：小鼠在隐蔽站台实验中的潜伏期，^*P<0.05。c：小鼠的平均游泳速度。d：在空间探索实验中，小鼠在目标象限所呆时间占总时间的百分比。e-f：空间探索实验中，Scr及Ob2组小鼠运动轨迹代表图。

图4是转基因小鼠Tg6799经适配子Ob2及Scr脑内给药后相关蛋白表达情况。a：小鼠海马区BACE1、sAPPα、sAPPβ及星型胶质细胞标记蛋白GFAP蛋白质免疫印迹条带。b：小鼠海马区BACE1、sAPPα、sAPPβ及星型胶质细胞标记蛋白GFAP蛋白质免疫印迹条带灰度值统计分析图，^**P<0.01,^*P<0.05,ns:no significance。c：小鼠皮层BACE1、sAPPα、sAPPβ及星型胶质细胞标记蛋白GFAP蛋白质免疫印迹条带。d：小鼠皮层BACE1、sAPPα、sAPPβ及星型胶质细胞标记蛋白GFAP蛋白质免疫印迹条带灰度值统计分析图。^**P<0.01,^*P<0.05,ns:nosignificance。

图5是适配子Ob2及Scr给药后小鼠Aβ42及Aβ40在小鼠海马及皮层的含量。a：小鼠海马及皮层Aβ42含量；b：小鼠海马及皮层Aβ40含量；

图6是适配子Ob2及Scr脑内给药后小鼠海马与皮层免疫荧光染色。a：小鼠海马区6E10与GFAP免疫荧光染色代表图。b：小鼠皮层6E10与GFAP免疫荧光染色代表图。c:小鼠海马6E10阳性斑块数目及GFAP平均荧光强度，^*P<0.05。d:小鼠皮层6E10阳性斑块数目，^*P<0.05。

图7是适配子Ob2及Scr脑内给药后小鼠海马及皮层斑块含量。a：小鼠海马区硫黄素S斑块染色(左)及斑块数目与面积百分比(右)。b：小鼠皮层硫黄素S斑块染色(左)及斑块数目(右)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：针对人AChE核酸适配子的合成

利用SELEX技术筛选得到针对人AChE的3个适配子序列(Ob1，Ob2，Ob3)。其中筛选的靶标为人AChE，使用的随机文库(85nt)是含有25个随机序列。我们在上海invitrogen公司合成下列针对人AChE的适配子序列，纯度可达HPLC纯。其中Scr为随机序列作为阴性对照，用于后续的实验。

Ob1：5'-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCCTCTCGTGCTAAACATAGGCCCGTACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'(SEQ ID NO:1)

Ob2：5'-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCCTTCGAAAACACCCTGCCCCTCACACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'(SEQ ID NO:2)

Ob3：5'-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCCATTAGAATCTGTGACAATAACGTTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'(SEQ ID NO:3)

Scr：5'-TGGTAGGTACGAGATCTATTAAACCTCGCATTTCCAGAATCATGTTATTAAACACCAGACCGATAGAGTAGGCACTTTGCGAGAC-3'(SEQ ID NO:4)

实施例2：适配子体外抑制AChE活性实验

(1)10％小鼠脑组织匀浆的制备：小鼠经二氧化碳处死后，在冰台上迅速取出其脑组织、称重，用4℃以下生理盐水漂洗脑组织表面，用滤纸吸干表面水分，称量，按重量(g)：体积(mL)＝1:9的比例，加入9倍生理盐水，用小剪刀尽快剪碎组织块(将盛有组织的小烧杯放于冰水浴里)，并加入小磁珠，用机械匀浆机快速匀浆，匀浆液在4000rpm/min，4℃条件下离心30min，取其上清液分装于2mL离心管中，于-80℃保存备用。

(2)BCA法测定10％小鼠脑匀浆中的蛋白质浓度：将试剂盒内2mg/mL的牛血清白蛋白标准品用双蒸水进行倍比稀释，浓度分别为2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0mg/mL。工作液配制按A液：B液＝50:1配制，所需工作液用量为100μL/孔×3个复孔×(标准品数+样品总数)。在96孔板内每孔加入配制好的工作液100μL，随后分别加入配制好的标准品及稀释后的脑匀浆蛋白质样品，每孔5μL，各三个复孔，全程冰上操作并尽量避免产生气泡。加样完成后，敲打96孔板四个侧壁使样品与工作液充分混匀，并将96孔板放置于37℃烘箱内孵育显色30min，随后置于酶标仪中检测样品在595nm处的吸光值。根据标准曲线，在曲线线性范围内读取各蛋白样品浓度，根据蛋白样品稀释倍数计算蛋白浓度。

(3)AChE活性测定：采用96孔板，按试剂盒说明书取50μL脑组织匀浆溶液，与试剂盒中的1μmol/mL标准品对照测定其活力。采用96孔板，每个反应做三组重复，反应体系具体操作如表1，反应完毕后酶标仪检测样品在波长405nm的吸光度(OD值)，按公式1计算匀浆溶液的酶活力；

表1酶活力测定的具体操作步骤

计算公式1：

(4)适配子抑制AChE活性测定

a)适配子的稀释：稀释前，将引物管离心数秒使DNA聚集至管底，小心开启管盖，以免引起粉末溅出来造成DNA损失，再加入适量的生理盐水，浓度50μM，使用时再稀释成所需浓度；适配子加药前处理：95℃加热5min，冰上冷却10min，37℃放置10min。

b)反应步骤：取6μL待测适配子溶液和6μL小鼠脑匀浆溶液，混匀后置37℃下保温30min取5μL作为测定样本；再按上表1中测定管与对照管的具体操作步骤操作；最后用酶标仪检测样品在405nm处OD值，与脑匀浆溶液为样本的测定孔OD值比较计算得出的百分率即为酶抑制率；

c)数据处理：按计算公式2计算各适配子的酶抑制率。其中测试孔1为小鼠脑匀浆溶液，测试孔2为待测适配子与小鼠脑匀浆溶液的混合物，对照孔1和对照孔2分别为前面两空的空白实验以消除***误差。

计算公式2：

结果显示：运用AChE活性检测试剂盒证明前期筛选得到的三种针对AChE的适配子Ob1-Ob3中，其中Scr为随机序列作为阴性对照，Ob1与Ob3对小鼠脑匀浆AChE活性无明显抑制效果，效果与对照适配子Scr相似，Ob2具有明显的抑制小鼠脑匀浆AChE活性作用(图1a)。进一步为了探究适配子Ob2体外抑制小鼠AChE活性是否随着Ob2与小鼠脑匀浆孵育时间及Ob2浓度改变而改变，我们检测了不同浓度适配子Ob2体外抑制小鼠脑匀浆AChE活性与适配子Ob2作用时间关系(图1b)，发现适配子Ob2与小鼠脑匀浆作用时间在0-15min内，小鼠脑匀浆AChE活性抑制率快速上升，随后上升速度变慢，并且30min左右Ob2即可使小鼠脑匀浆AChE活性抑制率达到最大。同时，与阳性对照药物多奈哌齐相比，我们检测了Ob2浓度变化对小鼠脑AChE活性变化(图1c)，我们发现适配子Ob2对小鼠脑AChE具有非常好的抑制作用，有效半抑制浓度IC₅₀＝0.3174μM(多奈哌齐IC₅₀＝0.4653μM)。同时，我们还验证了适配子Ob2对人AChE同样具有抑酶活性，并检测Ob2浓度改变对rhAChE活性的影响(图1d)，发现适配子Ob2对rhAChE同样具有很好的抑制作用，有效半抑制浓度IC50＝2.5665μM(多奈哌齐IC₅₀＝0.9514μM)。

实施例3：小鼠侧脑室埋管给药和动物行为实验

(1)麻醉：选3-4个月大的雄性阿尔茨海默病模型鼠Tg6799，用4％水合氯醛按每20g小鼠腹腔给药0.2mL麻醉，每增加1g给药量增加0.01mL，小鼠倒下，掐尾巴无疼痛反应、肌肉松弛、呼吸平顺即达到充分麻醉效果；

(2)固定：将已经麻醉的小鼠以俯卧的姿势置于适配器上并固定好(整个头颅水平，不能摇动)；

(3)备皮及埋管：剪去小鼠头部皮肤附着毛发，75％酒精常规消毒手术区域后剪皮，暴露颅骨，以无菌棉签蘸少量生理盐水涂擦颅骨表面，暴露前囟点，坐标参考《小鼠脑立体定位图谱》，埋管后使用振动式切片机确定管子埋在侧脑室，选择前囟旁开0.8mm，向后0.16mm，深度2.3mm作为正式埋管的坐标。定点后用钻头打孔，注意不要损伤硬脑膜及脑实质。植入套管后，用牙科粉将套管与颅骨紧密粘合，待牙科粉完全凝固后，取下小鼠并盖上导管帽，将小鼠随机分成实验组及对照组，并用marker笔在牙科粉涂色作为实验组的标记。埋管后的小鼠用隔板两只一笼饲养，术3-4天后用四通道给药泵进行给药。

(4)适配子药物配制及给药：用生理盐水配制适配子(Ob2及Scr)，浓度为100μM，充分混匀，配制方式如前述。小鼠埋管后第四天开始给药，每只小鼠每次给药4μL，每三天给药一次，共给药15次，每次给药后注射内管及连接的导管都需要用双蒸水冲洗干净，以防生理盐水堵住注射内管。给药结束后，连续三天handle小鼠，每只小鼠在实验者手中呆5min使小鼠适应实验者的操作，目的是在正式行为实验中，实验者对小鼠抓取不会对其造成刺激。小鼠handle结束后，第四天开始进行一系列行为实验，包括旷场实验、Y迷宫、morris水迷宫。

a)旷场实验：旷场实验(open field test,OFT)是一种用于评价动物自发活动、探索行为、焦虑、抑郁状态的实验。实验箱在尺寸为40×40×30cm的灰色聚氯乙烯方形盒子内进行，通过摄像机采集数据，分析软件记录实验数据。实验开始前将用酒精擦干净实验盒子，随后将小鼠轻放入旷场中心，让小鼠自由探索5分钟，用Etho Vision 7.0软件采集小鼠运动5分钟内运动总路程等。每放入一只小鼠前同样需要将实验区用酒精擦干净，且用纸板扇一下加速残余酒精挥发，避免小鼠气味及酒精气味对小鼠的干扰。

b)Y-迷宫：Y迷宫即为三臂等分辐射式迷宫，主要应用于动物的工作记忆、辨别式学习，由三个完全相同、相互夹角为120°的支臂组成，每个支臂大小为35×5×10cm，在Y迷宫上方架好摄像头，通过远离Y迷宫的电脑观察摄像头下方小鼠的活动。将Y迷宫三个支臂随机记录为A、B、C，将小鼠放入其中一个支臂的末端，连续自主交替8min，并依次记录交替顺序，检测自主交替率。每只小鼠结束后用75％酒精擦拭Y迷宫臂内上一只小鼠残留气味。交替率％＝交替数/(总次数-2)×100％。

c)morris水迷宫：水迷宫是一种强迫小鼠游泳，学***台的实验，主要用于测试小鼠对空间定位学***台，则让其在平台停留30s，如90s结束后小鼠仍然没有找到平台则引导小鼠上台并让小鼠停留30s；隐蔽站台试验结束后，把站台撤掉，将小鼠从站台对侧象限中点面壁放入水，让其在水中自由探索寻找平台，并记录小鼠穿越原平台的次数、在原平台象限所在的时间占总时间的百分比等。

结果显示：将3-4个月大的雄性阿尔茨海默症转基因小鼠Tg6799随机分为Scr组和Ob2组，使用立体定位仪在小鼠侧脑室埋管，埋管位置如图2b，埋管结束3-4天后开始给药，给药方式及handle操作如前述，小鼠handle结束后，第四天开始进行一系列行为实验，包括旷场实验、Y迷宫、morris水迷宫(图2a)。旷场实验结果显示Scr组及Ob2组小鼠运动总距离及中心区时间(图2c)无统计学意义。Y迷宫实验结果表明Scr组及Ob2组八分钟内进入臂的总次数以及自发交替率两组间无统计学差异(图2d)，说明AChE特异抑制性适配子Ob2给药后不影响实验组小鼠的运动能力，其药物副作用具有局限性，同时无改善AD小鼠工作记忆的作用。随后我们进行了morris水迷宫实验，结果显示两组小鼠在前六天的训练期间寻找可见平台的潜伏期随训练天数的增加而逐渐减少，且Ob2组小鼠潜伏期低于Scr组小鼠，两组间经单因素方差分析具有统计学差异，^*P<0.05(图3b)。两组间游泳速度无统计学差异(图3d)。空间探索试验中，Ob2组小鼠穿越平台次数高于Scr组小鼠，差异有统计学意义，^*P<0.05(图3a)，两组间在目标象限所待时间Ob2组高与Scr组，有趋势但差异无统计学意义(图3c)。Scr及Ob2组小鼠的运动轨迹见图3e和图3f。说明AChE特异性适配子Ob2可改善Tg6799模型小鼠的空间学习记忆。

实施例4：蛋白印迹实验

小鼠经二氧化碳处死后，迅速取出全脑并放入冰的生理盐水中漂洗脑组织表面血液，随后分别取小鼠海马及皮层放入干净EP管中，全程冰上操作；加入RIPA裂解液(RIPA+1％PMSF)，皮层加500μL，海马加150μL随后机械匀浆机快速匀浆，转速6500rpm，10s/次×3个循环，每10s中间停顿10s；随后将样品放入4℃旋转混悬仪充***解30min，4℃、16900rcf离心30min，取上清保存于-20℃；取上清稀释后按前述方式做蛋白定量，根据蛋白定量浓度加入含β-巯基乙醇的5×loading buffer，随后金属浴100℃10min使蛋白变性用于蛋白免疫印迹实验。

结果显示：蛋白质免疫印迹实验检测经AChE特异性适配子Ob2处理的AD模型小鼠Tg6799皮层及海马相关蛋白表达，小鼠海马区(图4a)及皮层区(图4c)相关蛋白表达结果表明Tg6799模型小鼠经AChE特异性适配子Ob2处理后，小鼠海马区(图4b)及皮层区(图4d)蛋白BACE1、蛋白sAPPβ及蛋白GFAP均显著减少(^*P<0.05，^**P<0.01)，而通过α分泌酶途径的降解产物sAPPα表达量与对照小鼠(Scr组)无统计学意义。

实施例5：ELISA检测Aβ产量(参照试剂盒说明书)

(1)脑组织匀浆制备：称取脑组织重量，按100mg组织加入8体积冷的5M盐酸胍溶液，混匀后机械匀浆，6500rpm，10s×3cycle，室温摇床放置3-4h。随后样品加入10倍体积冷PBS(含1×蛋白酶抑制剂)，4℃条件下16000g离心20min，取上清用BCA法做蛋白定量，并用Standard Diluent Buffer按1:1000稀释样品作为待测样品。

(2)配制标准品：按标准品瓶身说明加入一定量Standard ReconstitutionBuffer，随后按说明书稀释标准品，浓度分别为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.63pg/mL、0pg/mL。

(3)实验过程：将待测样品(50μL/孔)及标准品(50μL/孔)分别加入孔板中，并预留空白孔；除空白孔外，每孔加入50μL检测抗体溶液，用盖板膜封板，用手指从板架和板条上滑过以确保板孔完全密封，轻轻混匀，放置室温摇床孵育3h；孵育完毕后移去盖板膜，弃去孔内液体，用1×洗涤缓冲液(每孔260μL)洗孔4次，在平板纸上拍板，彻底去除板孔中的残留液体；除空白孔外，每孔加入100μL1×HRP标记的抗兔二抗液，轻轻混匀，室温摇床孵育30min；照(5)弃掉液体并洗孔4次，加100μLTMB显色液，放置室温，避光孵育30min；每孔加入100μL终止液终止反应，轻轻敲打盖板边缘混匀，随后置于酶标仪上测定吸光值(450nm)，绘制标准曲线，根据标准曲线读出待测样品浓度，并根据蛋白定量浓度计算样品含量(ng/mg)。

结果显示：根据ELISA试剂盒方法提取小鼠皮层及海马组织蛋白，用ELISA法检测总Aβ40及Aβ42含量，结果显示，与对照小鼠(Scr组)比较，针对AChE的适配子Ob2处理组小鼠海马及皮层内Aβ42(图5a)及Aβ40(图5b)含量均显著减少(^*P<0.05，^**P<0.01)。

实施例6：小鼠免疫荧光

(1)小鼠心脏灌流：按前述麻醉方式将小鼠麻醉后，用针头插住四肢将其固定于泡沫板上，一手用镊子夹住胸骨最突出部分，另一手用剪刀剪开胸腔的皮肤及肋骨，暴露心脏和肝脏，钝性分离心包及周围软组织；左手用止血钳提起心尖部，右手将灌流针(6号)刺破心尖，出现落空感后，进针约5mm，用止血钳固定针尖，打开生理盐水阀门，剪开右心耳，直到从右心耳流出的液体为无色、肝脏色白即可停止灌流；随后灌流针口的导管换成4％多聚甲醛灌注液的导管继续灌流，此时小鼠四肢突然紧张、尾巴翘起说明达到固定效果，继续灌流5min左右。

(2)取脑及脱水：灌注成功后取脑，剪开头部皮肤露出颅骨，右手持剪轻轻剪开颅骨中线，此过程需贴壁向上剪，否则容易破坏脑组织，随后用镊子夹住颅骨从内往外翻，从下向上逐步剔除颅骨，将脑组织量暴露，用镊子从嗅球处开始剥离全脑，深入颅底剥离神交叉及三叉神经并横断小脑，取出全脑后立即放入4％多聚甲醛灌注液中，4℃保存过夜后固定；次日将甲醛灌注液倒掉并用滤纸吸干；置于流动自来水中持续冲1h左右；冲洗结束后将脑组织放入装有30％蔗糖溶液的15mL离心管中脱水，4℃保存，直至全脑沉降到管子底部。

(3)冰冻切片：设定好冷冻切片机温度，将脑组织从蔗糖溶液中取出并吸掉多余液体，在样品托上覆上OCT冰冻切片包埋剂，放入冷冻切片机内至变白，随后取出来快速用刀片修平，并将脑组织修整平齐后置于样品托上，在脑组织表面涂上一层OCT，置于冷冻台继续冷冻30min。根据小鼠脑图谱皮层及海马的位置及形态，开始切片，调整冰冻切片机切片厚度为35μm，切好的片子可以连续收集也可以连续5-6片后一起收集，将所需脑片收集于EP管内并暂放于冰冻切片机内暂时保存，待切片结束将片子存放于-80℃。

(4)免疫荧光：①漂洗：往-80℃取出的脑切片中加入PBS，倒入已加入PBS的六孔板中漂洗三次，每次5min；②封闭：加入PBS配制的5％BSA(含0.3％TritonX-100)封闭液于室温摇床封闭1h；封闭结束后脑片于PBS中漂洗三次，每次5min；③孵一抗：往脑片中加入一抗溶液，4℃摇床中孵育过夜；次日回收一抗并加入PBS漂洗三次，每次5min；④孵二抗：往脑片中加入相对应种属源性的荧光二抗孵育1h，随后PBS漂洗三次，每次5min，稀释及加入荧光二抗后的操作流程要避光；⑤贴片：贴片后待载玻片表面液体稍干后用DAPI封片剂封片，贴片过程切勿使脑片表面干燥，最后于共聚焦荧光显微镜下拍照观察。

结果显示：多种中枢神经***疾病中，反应性星型胶质细胞可限制炎症的进展及保护脑组织退行性变中的神经元。为探究针对AChE特异适配子Ob2对转基因小鼠脑内斑块沉积及星型胶质细胞的影响，打药结束后取实验组(Ob2组)与对照组(Scr组)小鼠脑切片做免疫荧光，结果显示Ob2处理组小鼠6E10阳性斑块在海马区(图6a)及皮层区(图6b)沉积数量少于对照组，^*P<0.05(图6c-d)，同时Ob2处理组小鼠海马区反应性星型胶质细胞荧光密度(GFAP平均荧光强度)要低于对照组，^*P<0.05(图6a&c)。

实施例7：硫磺素S染色

脑切片置于50％乙醇配制的0.01％硫黄素S染液中染色8min；用眉笔取出脑片放入50％乙醇中漂洗两次，每次5min；取出脑片于PBS中漂洗两次，每次5min；脑片贴片后封片于共聚焦荧光显微镜下观察。

结果显示：为探究针对AChE特异适配子Ob2对转基因小鼠脑内斑块沉积的影响，打药结束后取实验组(Ob2组)与对照组(Scr组)小鼠脑切片做硫磺素S斑块染色，结果显示Ob2处理组小鼠海马区斑块沉积数量及斑块覆盖面积明显少于对照组，^*P<0.05，^**P<0.01(图7a)，同时Ob2组小鼠皮层区斑块沉积数量比Scr组明显减少，^*P<0.05(图7b)。

以上实施例的计量资料用均数±标准误表示。所有实验数据的统计分析应用SPSS20.0软件。根据不同的实验设计采取不同的统计分析；两独立样本的数据分析采用独立样本t检验；重复测量数据的两组间样本数据分析采用双因素方差分析(Two-Way ANOVA)。以α＝0.05作为检验标准。P<0.05时认为实验数据差异具有统计学意义。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 核酸适配子在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taatacgact cactatagca atggtacggt acttccctct cgtgctaaac ataggcccgt 60

acaaaagtgc acgctacttt gctaa 85

<210> 2

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatacgact cactatagca atggtacggt acttcccttc gaaaacaccc tgcccctcac 60

acaaaagtgc acgctacttt gctaa 85

<210> 3

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taatacgact cactatagca atggtacggt acttcccatt agaatctgtg acaataacgt 60

tcaaaagtgc acgctacttt gctaa 85

<210> 4

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggtaggtac gagatctatt aaacctcgca tttccagaat catgttatta aacaccagac 60

cgatagagta ggcactttgc gagac 85

Claims (4)

1.核酸适配子或其化学修饰物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用，所述的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的化学修饰物是所述的核酸适配子中包括的至少一个核苷酸的核糖2'位上的羟基被氢原子、氟原子、-O-酰基和氨基中任意一种所取代，以及在3'端或5'端加入FCM、FITC、biotin的任意修饰。

3.核酸适配子或其化学修饰物在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用，所述的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的化学修饰物是所述的核酸适配子中包括的至少一个核苷酸的核糖2'位上的羟基被氢原子、氟原子、-O-酰基和氨基中任意一种所取代，以及在3'端或5'端加入FCM、FITC、biotin的任意修饰。