CN105251006B - Tlr3抑制剂在制备治疗***成瘾的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了TLR3抑制剂在制备治疗成瘾药物成瘾的药物中的用途。本发明还公开了一种治疗***成瘾的药物，它是以TLR3抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。本发明TLR3抑制剂可以有效减弱对***的依赖和渴求，减弱***诱导的行为敏化效应，能够治疗***成瘾，临床应用前景良好。

Description

TLR3抑制剂在制备治疗***成瘾的药物中的用途

技术领域

本发明涉及TLR3抑制剂在制备治疗***成瘾的药物中的用途。

背景技术

***(Cocaine)又称古柯碱,化学名为苯甲酰甲基芽子碱(methylbenzoylecgonine)，一般呈白色晶体状,无臭,味苦而麻，其最早用于局部麻醉和治疗哮喘，是最强的天然中枢***，因其对中枢神经***的兴奋作用而导致滥用，1985年起成为世界性主要毒品之一。

***成瘾，是一种慢性复发性脑部疾病，属于药物依赖(drug dependence)类疾病，***成瘾会引起大脑结构和功能的可塑性变化，相关脑区包括伏隔核、纹状体、前额皮质、海马和腹侧被盖区，健康也受到多方面的危害，包括精神颓废、人格缺损、心智功能紊乱、并发相应的感染合并症以及吸毒者不顾一切地寻求和使用毒品而诱发各种违法犯罪活动。

***成瘾的主要特点表现为即使患者在知晓用药的严重后果后，依然强迫性索取和使用以满足欲望、对药物的寻觅和索取失去控制、对事物失去兴趣、成瘾记忆十分深刻，即使经过戒断治疗若干年后，接触与成瘾有关的刺激(如毒友、与过去用药有关的环境等)都可能诱发复吸。

鉴于***成瘾危害甚大，找到合适的治疗靶点和药物，治疗***成瘾迫在眉睫。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一类治疗***成瘾的药物。

TLR3：Toll样受体3。

TLR3抑制剂：抑制Toll样受体3的活性或者表达的物质。

本发明首先提供了TLR3抑制剂在制备治疗***成瘾的药物中的用途。

优选地，所述治疗***成瘾的药物是降低pIKBα和NF-kB表达水平的药物。

优选地，所述TLR3抑制剂为化合物I，其结构式如下：

名称为(R)-2-(3-Chloro-6-fluorobenzo[b]thiophene-2-carboxamido)-3-phenylpropanoic acid。

本发明还提供了一种治疗***成瘾的药物，它是以TLR3抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

优选地，所述治疗***成瘾的药物是降低pIKBα和NF-kB表达水平的药物。

优选地，所述TLR3抑制剂为化合物I，其结构式如下：

优选地，所述制剂是注射制剂。

TLR3抑制剂可以有效减弱对***的依赖和渴求，减弱***诱导的行为敏化效应，能够治疗***成瘾，临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 pReceiver-Lv201载体图

图2 小鼠条件性位置偏好箱

图3 自主给药***。

图4 自发活动装置。

图5 伏隔核解剖图谱

图6 不同剂量***的条件性位置偏好效应。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。20mg/kg：***20mg组；10mg/kg：***10mg组；3mg/kg：***3mg/kg组；Sa:生理盐水对照组

图7 TLR3基因敲除小鼠、MyD88基因敲除小鼠的***CPP行为学效应。***(20mg/kg)给予不同基因型小鼠CPP效应图。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。WT：野生型小鼠组；TLR3KO：TLR3基因敲除小鼠组；MyD88KO：MyD88KO基因敲除小鼠组。

图8 TLR3基因敲除小鼠、MyD88基因敲除小鼠的***CPP行为学效应。***(10mg/kg)给予不同基因型小鼠CPP效应图图。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。WT：野生型小鼠组；TLR3KO：TLR3基因敲除小鼠组；MyD88KO：MyD88基因敲除小鼠组。

图9 TLR3基因敲除小鼠、MyD88基因敲除小鼠的***CPP行为学效应。***(3mg/kg)给予不同基因型小鼠CPP效应图。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。WT：野生型小鼠组；TLR3KO：TLR3基因敲除小鼠组；MyD88KO：MyD88基因敲除小鼠组。

图10 TLR3基因敲除小鼠和野生型小鼠自发活动。***(20mg/kg)分别给予野生型(WT)组和TLR3KO组，给药后9个时间点自发活动量与自身基线比值。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。TLR3KO：TLR3基因敲除小鼠组；WT：野生型小鼠组。

图11 TLR3基因敲除小鼠和野生型小鼠自发活动。***(10mg/kg)分别给予野生型(WT)组和TLR3KO组，给药后9个时间点自发活动量与自身基线比值。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。TLR3KO：TLR3基因敲除小鼠组；WT：野生型小鼠组。

图12 TLR3基因敲除小鼠和野生型小鼠自发活动。***(3mg/kg)分别给予野生型(WT)组和TLR3KO组，给药后9个时间点自发活动量与自身基线比值。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。TLR3KO：TLR3基因敲除小鼠组；WT：野生型小鼠组。

图13 TLR3基因敲除小鼠和野生型小鼠自主给药***鼻触次数比较图。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。TLR3KO-CO Active：TLR3基因敲除小鼠***有效鼻触次数；TLR3KO-CO inactive：TLR3基因敲除小鼠***无效鼻触次数；WT-CO Active：野生型小鼠***有效鼻触次数；WT-CO inactive：野生型小鼠***无效鼻触次数。

图14 TLR3基因敲除小鼠和野生型小鼠自主给药生理盐水鼻触次数。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。TLR3KO-Saline Active：TLR3基因敲除小鼠生理盐水有效鼻触次数；TLR3KO-Saline Inactive：TLR3基因敲除小鼠生理盐水无效鼻触次数；WT-SalineActive：野生型小鼠生理盐水有效鼻触次数；WT-Saline Inactive：野生型小鼠生理盐水无效鼻触次数。

图15 TLR3基因敲除小鼠和野生型小鼠自主给药***摄入量比较图。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。TLR3KO：TLR3基因敲除小鼠组；WT：野生型小鼠组。

图16 伏隔核定位注射慢病毒载体图

图17 TLR3基因敲除小鼠脑内注射TLR3表达慢病毒载体恢复***条件性位置偏好效应。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。LV-TLR3+CO：TLR3慢病毒载体***组；LV-Mock+CO：TLR3慢病毒对照***组；LV-TLR3+Sa：TLR3慢病毒载体生理盐水组；LV-Mock+Sa：TLR3慢病毒载体***组。

图18 TLR3基因敲除小鼠脑内注射TLR3表达慢病毒载体***自发活动(活动距离)。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。LV-TLR3+CO：TLR3慢病毒载体***组；LV-Mock+CO：TLR3慢病毒对照***组；LV-TLR3+SA：TLR3慢病毒载体生理盐水组；LV-Mock+SA：TLR3慢病毒载体***组。

图19 TLR3基因敲除小鼠脑内注射TLR3表达慢病毒载体增强***行为敏化效应(与基线比值)。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。LV-TLR3+CO：TLR3慢病毒载体***组；LV-Mock+CO：TLR3慢病毒对照***组；LV-TLR3+SA：TLR3慢病毒载体生理盐水组；LV-Mock+SA：TLR3慢病毒载体***组。

图20 C57小鼠伏隔核定位注射TLR3抑制剂抑制***条件性位置偏好效应。p<0.05，与对照组比较有统计学差异。DMSO+CO：溶剂对照***组；Inhibitor+CO：TLR3抑制剂***组；DMSO+CO：溶剂对照生理盐水组；Inhibitor+CO：TLR3抑制剂生理盐水组。

图21 C57小鼠伏隔核定位注射TLR3抑制剂减弱***自发活动(移动距离)。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。(DMSO+CO：溶剂对照***组；Inhibitor+CO：抑制剂***组；DMSO+CO：溶剂对照生理盐水组；Inhibitor+CO：抑制剂生理盐水组)

图22 C57小鼠伏隔核定位注射TLR3抑制剂减弱***行为敏化效应(与基线比值)。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。DMSO+CO：溶剂对照***组；Inhibitor+CO：抑制剂***组；DMSO+CO：溶剂对照生理盐水组；Inhibitor+CO：抑制剂生理盐水组。

图23 C57小鼠***多次给药后伏隔核内IKKβ表达上调。A:Western blot结果；B:IOD分析统计图。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。Cocaine：***组；Saline：生理盐水组。

图24 C57小鼠***多次给药后伏隔核内pIkBα表达上调。A:Western blot结果；B:IOD分析统计图。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。Cocaine：***组；Saline：生理盐水组。

图25 C57小鼠***多次给药后伏隔核胞浆NF-κB表达。A:Western blot结果；B:IOD分析统计图。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。Cocaine：***组；Saline：生理盐水组。

图26 C57小鼠***多次给药后伏隔核内NF-κB表达。A:Western blot结果；B:IOD分析统计图。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。Cocaine：***组；Saline：生理盐水组。

图27 C57小鼠脑定位注射TLR3抑制剂对***小鼠伏隔核pIKBα表达的影响。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。Inhibitor+Cocaine：抑制剂脑定位注射***组；Inhibitor+Saline：抑制剂脑定位注射生理盐水组；DMSO+Cocaine：溶剂对照脑定位注射***组；DMSO+Saline：溶剂对照脑定位注射生理盐水组。

图28 C57小鼠脑定位注射TLR3抑制剂对***小鼠伏隔核核内NF-κB表达的影响。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。Inhibitor+Cocaine：抑制剂脑定位注射***组；Inhibitor+Saline：抑制剂脑定位注射生理盐水组；DMSO+Cocaine：溶剂对照脑定位注射***组；DMSO+Saline：溶剂对照脑定位注射生理盐水组。

图29 TLR3小鼠脑定位注射TLR3表达慢病毒载体对***小鼠伏隔核核内pIKBα表达的影响。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。LV-TLR3+Cocaine：TLR3表达慢病毒脑定位注射***组；LV-TLR3+Saline：TLR3表达慢病毒脑定位注射生理盐水组；LV-Mock+Cocaine：慢病毒对照脑定位注射***组；LV-Mock+Saline：慢病毒对照脑定位注射生理盐水组。

图30 TLR3小鼠脑定位注射TLR3表达慢病毒载体对***小鼠伏隔核核内NF-κB表达的影响。*p<0.05，与对照组比较有统计学差异。LV-TLR3+Cocaine：TLR3表达慢病毒脑定位注射***组；LV-TLR3+Saline：TLR3表达慢病毒脑定位注射生理盐水组；LV-Mock+Cocaine：慢病毒对照脑定位注射***组；LV-Mock+Saline：慢病毒对照脑定位注射生理盐水组。

具体实施方式

实验例1 TLR3抑制剂治疗***成瘾

1前言

在本研究中，我们从遗传学和药理学等角度出发，利用基因敲除技术、慢病毒载体构建以及小分子抑制剂等进行多角度确证，首次发现TLR3参与调节小鼠***成瘾的过程。在实验过程中，联合CPP模型、自主给药模型和自发活动模型，多侧证明了TLR3抑制剂可以治疗***成瘾。

2实验材料与方法

2.1药物

盐酸***：购自中国药品生物制品鉴定所，白色粉末，纯度大于99％，生产批号：171210-200803。

生理盐水：用四川科伦药业股份有限公司，批准文号：国药准字H51021158，生产批号：M12101307。

盐酸***用生理盐水稀释到所需浓度。

本实验采用的TLR3抑制剂为化合物(R)-2-(3-Chloro-6-fluorobenzo[b]thiophene-2-carboxamido)-3-phenylpropanoic acid，其结构式：

购自默克密理博公司(614310|TLR3/dsRNA Complex Inhibitor–Calbiochem，产品目录编号614310-10MGCN)。

2.2实验动物

雄性健康性成熟(10～12周)C57BL/6J小鼠，体重20～22g，购自上海市斯莱克实验动物有限责任公司提供(生产许可证号：SCXK(沪)2007－0005)，体重20～22g。

TLR3基因敲除小鼠品系为B6N.129S1-Tlr3tm1Flv/J，编号：009675；MyD88基因敲除小鼠品系为B6.129P2(SJL)-Myd88tm1Defr/J，编号：008888。以上两种基因敲除动物购自美国Jackson实验室，由四川大学生物治疗国家重点实验室馈赠。两种动物均具有生育能力。

所有动物饲养条件：国家成都新药安全性评价中心SPF级动物房，温度20～25℃，相对湿度55～65％，饲养环境符合国标GB14925-2001，试验动物许可证：SCXK(川)2003-01。

本课题所有的动物实验操作均符合国际实验动物饲养管理评估和认可协会(AAALAC)要求。整个实验过程中，动物自由摄食和饮水，实验前正常饲养实验动物一定时间以熟悉并适应环境。

2.3主要仪器

电子分析天平(上海天平仪器厂)

洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)

DK-8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)

高速低温离心机(德国eppendorf公司MR1812)

电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)

小鼠不锈钢代谢笼具(上海同育医学解剖模型制造公司)

大小鼠位置偏爱箱(淮北正华生物仪器设备有限公司)

自主给药***(安来仪器有限公司)

电泳槽(美国Bio-Rad公司)

移液枪(德国eppendorf公司)

液氮罐(成都液氮容器厂)

2.4实验试剂

100％乙醇(上海化学试剂有限公司)

75％乙醇(以DEPC处理的水配制)

0.01M EDTA(华美生物工程公司)

甲醛(上海化学试剂有限公司)

甲醛(Ambion)

Gold View染料(上海赛百胜基因技术有限公司)

抗beta-actin抗体(美国CST公司)

抗NF-κB抗体(美国CST公司)

抗pIKBα抗体(美国CST公司)

抗IKKβ抗体(美国CST公司)

其余试剂均为国产分析纯。

2.5TLR3表达慢病毒载体的构建

2.5.1设计序列

1)载体信息：

载体为pReceiver-Lv201，图1为载体图。目的基因片段TLR3引物，上游：5’-atgaacggt gtt cctctt atc taa tgt act cct ttg c-3’；下游：5’-ggg gac ttg tcc ctatgg att ctt ctg gtg tct ctag-3’。

2)制备感受态细胞及转化

CaCl₂法制备感受态细胞进行转化实验步骤如下：(1)各取每种感受态细胞悬液200μL转移至无菌微量离心管中，每管加入连接液10μL，轻轻旋转混匀，然后置冰中放置30min。制备感受态细胞，使其具有摄取外源DNA的能力。(2)42℃热休克90s,快速将离心管转移到冰浴中冷却细胞1-2min。每管加入800μL LB培养基,水浴加温至37℃，然后放置摇床温育45min以复苏细菌。(3)将150μL转化感受态细胞转移到AMP(100μg/mL)抗性的LB琼脂培养基上。把平板置于室温直至液体被吸收。然后倒置平皿，置于37℃培养箱中培养16h。(4)克隆进行后续PCR鉴定。

2.5.2重组质粒构建

PCR产物连接入线性化表达载体反应体系见表1，反应条件:25℃ 30min；42℃15min。

表1 PCR反应体系

X：线性化载体DNA的体积数；Y：纯化后PCR产物片段体积数。

2.5.3病毒包装

消化293T细胞，调整其密度为每20mL有1.2X10⁷个细胞，接种细胞于培养皿中，放置37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，待细胞密度达70％-80％时可用于细胞转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。转染前2h将含胎牛血清培养基更换为无血清培养基。向离心管中加入制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg、pHelper1.0载体15μg、pHelper 2.0载体10μg)与相应体积培养基混合均匀，调整总体积为2.5mL，室温下温育5min。将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取100μLLipofectamine2000试剂在另一管中与2.4mL Opti‐MEM培养基混合，室温下温育5min。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻颠混匀，避免振荡，且须5min内混合。混合后室温下温育20min，然后将混合液转移至293T细胞培养液中，混合均匀，放置37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养8h后倒去培养基，每瓶细胞加入20mL磷酸盐缓冲液(PBS)，以洗涤残余混合液，移去混合液。每瓶细胞中加入含10％胎牛血清培养基25mL，放置37℃，5％CO₂培养箱内继续培养2天。

2.5.4滴度测定

1)样品制备

293T细胞传代，24孔中每孔加入1×10⁵个细胞，体积为500μL；次日准备10个无菌Ep管，每管中加90μL培养基；取待测病毒原液10μL加入到第一个管中，混合均匀，取混合均匀的第一管液10μL加入到第二个管中继续相同的操作直到最后一管；选取所需细胞孔，吸去90μL培养基。加稀释好的病毒溶液，放置37℃，5％CO₂培养箱培养；1天后，加入新鲜培养基500μL。小心操作，4天后抽提RNA。

2)总RNA抽提

去细胞上清液，每孔加入1mL Trizol，吹打，室温静置5min，转移至另一新1.5mLEp管中。每管加200μL氯仿，用力震荡15s，室温静置15min。4℃下120000r/min离心15min。从每管中吸取上清液至另一新1.5mL Ep管中。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后-20℃沉淀10min。4℃下120000r/min离心10min，移去上清液。加入1mL4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。4℃下10000r/min离心5min，移弃上清液。4℃下10000r/min再次离心5min，吸去残液，室温下干燥，不需完全干燥。加20μL无RNA酶(RNase)水至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA浓度。

3)RNA逆转录获cDNA

将1μL Oligo dT(0.5μg/μL)和2.0μg总RNA加入PCR小管，补焦碳酸二乙酯(DEPC)水至9μL。混合均匀、离心，70℃温浴10min。紧接着***到0℃冰水浴中。按下表比例，根据反应管数算出所需试剂量。将M-MLV酶等在冰上混匀得到逆转录反应液。在每个反应管中加11μL逆转录反应液，混合均匀后离心。其中，11μL逆转录反应液含5×逆转录缓冲液4μL、10mmol/LdNTPs2μL、RNA抑制剂0.5μL、M-MLV-RTase1μL、DEPC水3.5μL。在42℃进行1h完成逆转录反应，后用70℃处理10min使逆转录酶失活。逆转录反应产物cDNA可用于PCR，也可-80℃长期保存。

4)实时定量PCR检测

配置反应体系：每管加入SYBRpremix ex Taq10μL、上游引物(5μmol/L)1.0μL、下游引物(5μmol/L)1.0μL、cDNA1.0μL、ddH₂O 7.5μL。设定程序为两步法实时定量PCR。预变性95℃ 5s；变性95℃5s，退火60℃ 30s，延伸60℃ 30s，40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值，用于制作熔解曲线。PCR结束后，在95℃变性1min。然后冷却至55℃，使DNA双链充分聚合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s，同时读取吸光值。两个循环后将调定点升高0.5℃。

2.5.5慢病毒的收获及浓缩

收集转染后2d的293T细胞上清液，4℃、4000×g离心10min，以除去细胞碎片。用0.45μm过滤器过滤上清液到40mL超速离心管中。把病毒粗提液样品加入过滤杯中。将过滤杯插到滤过液收集管中，再4000×g离心至所需病毒浓缩体积，时间15min。离心结束后取出离心装置，将过滤杯和滤过液收集杯分开。将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心力不超过1000×g，时间2min。过高转速会使样品损失。把过滤杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中即为病毒浓缩液。

2.6伏隔核脑区埋管

脑区定位埋管是脑区定位给药的直接手段和常用技术。本研究中使用10％水合氯醛(0.4g/kg体重)麻醉小鼠，头顶部剃毛，将麻醉后的小鼠固定在脑立体定位仪上，固定后调节头部至水平状态，医用酒精消毒皮肤，手术暴露颅骨，用棉球和眼科剪刀除去颅骨表面的脑膜，找到前囟部位，记号笔标记；调节立体定位仪，安置注射导管(深圳瑞沃德生物科技有限公司，#62003，OD 0.48mm X ID 0.34mm)，于前囟点调零；以前囟部位为原点，参考定位坐标(伏隔核：AP+1.6；ML+1.5)把注射针移动到注射部位的正上方，使注射针与颅骨刚接触，调零Y坐标，向下缓慢移动注射针至4.4mm深，松开坐标臂并移开，将牙科粉与稀释液调至浆糊状固定套管下部，与颅骨相连达到固定导管的目的。***导管帽(深圳瑞沃德生物科技有限公司，#62102，OD 0.30mm)，防止导管堵塞，缝合头顶部伤口。手术结束后，将小鼠保温至苏醒，然后放入干净饲养笼中，单只单笼饲养。从手术后第二天开始，每天后腿部肌肉注射青霉素钠溶液(160000U/ml,0.1ml/只小鼠)，并隔天松动导管帽，确保导管通畅，小鼠的术后恢复期为7天。经过此手术的动物用于研究伏隔核注射TLR3抑制剂。

2.7伏隔核定位注射慢病毒

10％水合氯醛(0.4g/kg体重)麻醉小鼠，头顶部剃毛，将麻醉后的小鼠固定在脑立体定位仪上，调节头部至水平状态，医用酒精消毒皮肤，手术暴露颅骨，用棉球和眼科剪刀除去颅骨表面的脑膜，找到前囟部位，记号笔标记；调节立体定位仪，按照定位坐标(AP+1.6；ML±1.5；DV-4.4)，利用33型注射针，以0.1μl/min速率双侧伏隔核内注射0.5μl慢病毒，注射完毕后，缓慢移出注射针，缝合头顶部皮肤。手术结束后，保温小鼠至苏醒，然后放入干净饲养笼中，单只单笼饲养。从手术后第二天开始，每天后腿部肌肉注射青霉素钠溶液(160000U/ml,0.1ml/只小鼠)，连续注射3天，小鼠的术后恢复期为7天。经过此手术的动物用于研究伏隔核注射抑制PRMT1表达慢病毒调控***条件位置偏爱行为学检测和自发活动行为学检测。

2.8小鼠颈静脉插管滞留术

颈部外静脉插管滞留术是颈静脉自身给药模型建立的基础，也是决定该模型建立成功与否的一个关键步骤。手术前，实验动物在环境条件下适应3-5天，并且每天与实验人员接触，以避免实验动物在手术及实验过程中产生应激反应。颈静脉插管采用进口硅胶硬管(外径0.48mm，内径0.40mm，长度约5mm)以及匹配的硅胶软管(长度约3mm)进行制备，软管用于硬管前端，手术时利于插管。

手术时，根据小鼠体重腹腔注射水合氯醛(10％，10ml/kg)麻醉动物，剔除背部胛骨部和颈部左侧锁骨部位鼠毛，小鼠头部朝向实验人员并进行仰卧式固定，在左锁骨上缘部位开一个纵向约1cm切口，钝性分离皮下组织，游离左侧颈部外静脉，整个过程可滴少量生理盐水，防止干燥。手术线结扎静脉远心端，眼科剪在静脉上剪出斜开口，用镊子将之前制作的插管软管端***静脉，用于手术线打结固定插管。自背部经颈部皮下打一个皮下隧道到颈部切口，使插管另一端从背部穿出并固定，以便与给药装置线连接。少量肝素钠溶液(30U/ml)和抗生素(160000U/ml,0.1ml/只小鼠)经背颈部插管注入体内，并用生理盐水冲洗防止残留，确保导管通畅后，用导管盖套在插管末端，缝合背部和颈部伤口。手术结束后，将小鼠保温至苏醒，然后将小鼠放入干净笼中，单只单笼饲养。从手术后第二天开始，每天经插管注射少量肝素钠和抗生素，保证插管通畅，防止伤口感染，小鼠的术后恢复期为7天。经过此手术后的动物用于***自身给药成瘾模型。

2.9模型建立

2.9.1***条件位置偏好模型的建立

动物实验中所有操作均符合AAALAC要求，小鼠位置偏爱箱如图2所示：

1)开始试验前3-5天，每天由同一操作人员对小鼠进行抚摸，让动物对操作者有一定的适应。

2)将小鼠放入CPP箱体内，适应性训练3天，第三天测定的数据作为pretest的数据。适应训练和测试时间均为15分钟，当动物在一侧停留的时间超过600秒时，剔除实验组。

3)将动物停留时间较长的一侧作为自然偏好箱，然后进行腹腔注射给药，给药剂量如下(表2)。

4)给药次数为三次，交替给药。给药组给与生理盐水时放入自然偏好箱；给与盐酸***时，放入非自然偏好箱，每次训练15分钟。对照组每次给与生理盐水并放入对应箱体内。

表2 ***给药途径、给药剂量、给药体积汇总表

5)给药结束后第二天进行CPP测试，将小鼠依次放入中间过度箱中，让其自由在条件性位置偏好箱中穿梭15分钟，并记录每个箱体停留的时间。

6)注意事项：训练动物应该动作轻缓；结束训练之后应该对箱体进行清洁，消除动物气味的影响。

7)通过偏好箱的时间减去非偏好箱的时间来统计结果，采用SPSS统计软件分析实验结果，差值以均数±标准差表示，用t检验分析法比较***给药组和生理盐水对照组的差异，p<0.05为有统计学差异。

2.9.2***自主给药模型的建立

本研究中选用FRI程序来进行训练,实验训练时间(Session Time)为120分钟,训练中最大注射次数为50次,每次注射***0.75mg/kg，自主给药***如图3所示。实验的设置为:实验动物触碰无效鼻触没有响应,碰触有效鼻触获得药物,进行药物注射,同时鼻触灯亮起和室灯关闭,自主给药箱中的风扇在实验过程中始终开启。造模分为3个阶段,即预备期、手术恢复期、***自身给药期。

1)预备期

开始实验之前,自然饲养实验动物3-5天,实验人员每天抚摸动物,减少因应激作用而对实验结果造成的干扰。

2)手术及恢复期

动物接受颈静脉置管手术后，每天进行肝素钠冲管，保证给药管道通畅。恢复5-7天后，选取恢复良好的动物进行入组实验。

3)***自主给药期

实验动物随机分为两组,***组(n＝16)和生理盐水组(n＝8)。

实验前检查鼻触器、输液***以及注射器中的药物是否足量等。实验时,将动物放入自主给药箱,将颈部导管与输液***连接,关闭箱体的门,让动物在箱中适应15-20分钟后，再开始训练实验。实验动物行为监控***自动记录和保存实验结果,记录有效鼻触次数、无效鼻触次数、***注射次数。

成瘾模型建立成功的标准:

1)形成操作式条件反射；

2)***注射频率稳定；

3)同一组动物连续三天打药次数,在其平均值的10％范围以内。

2.9.3***自发活动模型的建立

小鼠自发活动装置如图4所示：

1)开始试验前3-5天，实验人员抚摸小鼠，让动物适应操作者。

2)将小鼠放入自发活动箱内，适应性训练3天，适应训练和测试时间均为30分钟。

3)适应性训练结束后，将动物分为***组和对照组，每天检测之前给药，给药次数为7次。

4)注意事项：训练动物应该动作轻缓；结束训练之后应该对箱体进行清洁，消除动物气味的影响。

5)结果采用SPSS统计软件分析实验结果，差值以均数±标准差表示，p<0.05为有统计学差异。

2.10伏隔核取材和准备

行为学测试结束后30分钟内快速断头处死C57小鼠，然后迅速分离大脑，用4℃生理盐水冲洗3遍后，按照脑解剖图谱分离取出伏隔核(图5。并放入液氮速冻，取样完成后将样本储存在-80℃环境。

2.11微量注射过程

小鼠进行脑立体定位，头部剔毛并消毒，用剪刀剪开头部皮肤，坐标定位注射部位，注射器针头刺破头盖骨，将注射针按照坐标刺入小鼠脑部，然后将抑制剂或病毒载体注射到伏隔核。慢病毒的注射以0.1μl/分钟的速度注射，10分钟，共lμl。注射完毕后微量注射针置于原位置3-5分钟，以便注射物在注射针的尖端充分扩散。

2.12冰冻切片制备

动物用10％水合氯醛腹腔麻醉后迅速暴露心脏，由左心室快速进针，右心耳及右心房部剪开缺口，先后用生理盐水及含4％多聚甲醛的PBS先后经体循环迅速灌注。取出小鼠大脑，用含4％多聚甲醛的PBS后固定(4℃，2-4h)后，先后浸泡于20％(4℃，20-24h)和30％(4℃，24-48h)的蔗糖溶液中脱水，直至鼠脑沉底。脱水后的大脑以冠状面，在前脑平面，用冰冻切片机切取10μm厚脑切片，-20℃保存在保护液中(含30％蔗糖和30％乙二醇的PBS)。

2.13 Western Blotting

2.13.1核蛋白与胞浆蛋白提取和定量

按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天生物科技有限公司，P0027)说明书提取伏隔核核蛋白和浆蛋白。主要步骤包括：解剖取材前几分钟配制含有1mM PMSF蛋白酶抑制剂的抽提试剂A液，将新鲜的伏隔核组织放入500ml的PBS(1mM PMSF)溶液中，用200μl枪头反复吹打组织，破碎组织至细微颗粒，然后离心，收集组织沉淀，然后加入蛋白抽提试剂A和B的混合液(20:1比例混合，1mM PMSF)100μl，最高速剧烈涡旋5秒，把细胞沉淀完全炫富并分散开，冰浴15min，最高速剧烈涡旋5秒，冰浴1min，最高速剧烈涡旋5秒，4℃ 13,000g离心5min，然后立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白，冻存于-80℃(注意：在转移上清液时，千万不要触及沉淀，可以在沉淀的上方保留极小体积的上清，一面触及沉淀)。

对于沉淀，完全吸尽残余的上清(如果不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染)，加入30μl添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。最高速剧烈涡旋30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开，然后放回冰浴中，每个2min再高速剧烈涡旋30秒，共30min；4℃ 13,000g离心10min，立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白，冻存于-80℃。

2.13.1总蛋白提取和定量

(1)取解剖后冻存的组织，加入RAPA裂解液，置于冰上裂解5分钟。如果是组织提取蛋白，根据组织大小加入RIPA，伏隔核组织加入的RIPA量约为100μl左右。

(2)超声10次，2秒/次(置与冰上)，目的是把细胞破碎。

(3)13,000g，15分钟，4℃离心后，取出上清液，放冰上。

(4)蛋白定量

A)将BSA稀释至1，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.05，0mg/ml浓度梯度(表3)。

B)将提取的蛋白液稀释10-20倍。BSA和蛋白样品分别吸10μl加入另外孔。

C)将加入了BSA和蛋白样品的孔中加入200μl的考马斯亮蓝G250。

D)595nm测定吸光度，线性相关性为R2>0.99，算出对应的蛋白浓度。

E)用最小浓度为基准，将其余样本加入适量的RIPA，稀释为同一浓度。

F)每个样本加入5×loading buffer(含beta-巯基乙醇)，量为蛋白体积的1/5。

(5)煮沸样品5分钟，分装，体积和浓度算出最终量为30μg左右。

注意事项：整个操作在冰上进行。蛋白定量时要准确，加入考马斯亮蓝G250后，尽量避光。

表3 蛋白定量时BSA稀释比例表

2.13.2制备分离胶(表2-2)

表4 分离胶制备配制表

注意：最后依次快速加入10％APS及TEMED，充分混匀但不要产生气泡。立即灌胶，每块胶需要约5ml左右；然后沿玻璃板加入去离子水隔绝空气。凝固时间为15-30分钟。

2.13.3制备浓缩胶(表5)

表5 浓缩胶制备配制表

注意：最后依次快速加入10％APS及TEMED，充分混匀但不要产生气泡。将浓缩胶加入玻璃板中，插上梳子，凝固15-30分钟。

2.13.4电泳准备

将凝固了胶的玻璃板放入电泳槽中，加入30％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺。

30％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺配制：丙烯酰胺：29g；甲叉丙烯酰胺：1g

先用50ml双蒸水溶解，搅拌知道溶液透明，补加双蒸水至终体积100ml，过滤除菌，查证该溶液PH<7.0，棕色瓶4℃保存。

2.13.5点样

每个孔加入的蛋白量约为30μg，0.75mm点样约为20μl，1mm点样量约为30μl。

2.13.6电泳

浓缩胶电压80V，蛋白到浓缩胶分离胶界限处，电压加为120V，直至蛋白跑完(根据蛋白大小决定)，时间大约为60分钟。

2.13.7转膜

将转膜液到处铁盘中，把胶放入转膜液中分离胶。转膜夹上下放上海绵并各放滤纸一张，完全浸润后将切下的胶放入滤纸上。另准备一个培养皿加入甲醇，将需要的PVDF膜浸泡入其中，然后盖在胶上。转膜电压设定为100V，时间根据蛋白大小而定。

2.13.8封闭

用TBST配制5％的脱脂牛奶，25ml/块胶。放入平皿中，将PVDF膜完全浸润在牛奶中，放在摇床上晃动1小时。

2.13.9孵一抗

将一抗按照需要的比例稀释，用杂交带封好，4℃过夜或者37℃，1-2小时。用TBST洗膜三次，每次5-10分钟。

2.13.10孵二抗

用1：5000将抗体稀释在脱脂牛奶中，37℃摇床1-2小时，用TBST洗膜二次，每次5-10分钟，然后用TBS洗膜一次，5-10分钟。

2.13.11配制发光液并压片

在暗室中将PVDF膜置于发光液中反应1分钟。将PVDF膜取出，用滤纸吸干多余发光液，将PVDF膜放入暗盒中，将膜正面朝上与胶片接触，压紧曝光(时间长短决定了条带亮度)，洗片。

2.13.12灰度值采集

将免疫印迹胶片用Image-Pro Plus 6.0***读取灰度值，用beta-actin条带灰度值作为内参进行标准化比较。

2.14数据分析

所有数据均采用标准差分析，ANOVA用来预测数据的统计学意义。所有分析均采用SPSS11.5软件，p<0.05为数据在统计学上有意义。

3实验结果

3.1***诱导C57小鼠条件性位置偏好

C57小鼠进行3天的适应性训练和6天的条件性位置偏好训练，3个***剂量组(n＝12)(20mg/kg、10mg/kg和3mg/kg)与生理盐水对照组(n＝12)条件位置偏好效应如图6所示。通过***的条件性位置偏好训练后，小鼠在***训练箱体停留的时间显著增长(P<0.05)，这表明动物已产生药物依赖，形成了在某一环境中会获得***奖赏的条件反射，其中20mg/kg***剂量组CPP效应最强。

3.2 TLR3基因敲除小鼠***条件性位置偏好减弱

TLR3基因敲除小鼠和MyD88基因敲除小鼠进行***CPP检测，***剂量分别为20mg/kg,10mg/kg和3mg/kg,对照组为野生型小鼠(WT)(图7-图9)。由图中可见，与对照组相比，TLR3基因敲除小鼠和MyD88基因敲除小鼠在不同剂量***条件位置偏好造模中的CPP效应均有差异，其中TLR3基因敲除小鼠在***偏好诱导箱停留的时间比野生型小鼠更短，TLR3基因敲除小鼠条件位置偏好效应显著降低，与野生型小鼠相比具有统计学意义(p<0.05)。20mg/kg***剂量下，TLR3基因敲除小鼠条件位置偏好效应降低更为明显。以上结果表明，TLR3基因敲除小鼠对***的成瘾效应显著降低，提示了TLR3可能在***成瘾过程的形成中发挥一定的作用。

在3个不同剂量的实验中，对于MyD88组，与野生型相比***条件偏好位置效应均有所降低，但是所有实验中两组之间均无统计学差异。以上实验结果表明，MyD88缺失对于***引起的条件位置偏好效应没有产生显著影响，***产生的药物奖赏效应可能与TLRs/MyD88依赖途径关联不大，因此，往后的实验我们针对TLR3/MyD88非依赖途径进行研究。

3.3 TLR3基因敲除小鼠***自发活动减弱

我们继续采用自发活动试验研究TLR3基因在***成瘾行为中的作用。TLR3基因敲除小鼠适应性训练3天，每天30分钟。测试当天前3个十分钟动物的活动量作为基线，第4个十分钟开始前小鼠腹腔注射给予3、10、20mg/kg***，然后连续测注射后10min、20min直到90min等9个时间点，每个时间点间隔10min。

试验结果(图10-图12)表明，***注射后，野生型小鼠行为活动量逐渐上升，在给药后20-30分钟达到高峰，之后逐渐减少。TLR3基因敲除小鼠在给予***后自发活动量也增加，但在部分时间点自发活动量低于野生型小鼠组，并有统计学差异(p<0.05)。其中，20mg/kg***剂量下，TLR3基因敲除小鼠自发活动量降低更为明显。以上结果表明，TLR3基因敲除小鼠对***行为敏化效应降低，提示了TLR3基因在参与***成瘾效益中的作用。

3.4 TLR3基因敲除小鼠***自主给药行为减弱

实验开始前3天，动物进行自主给药***环境适应，每天30min，以减小因环境导致的实验误差。实验第1天,四个指标之间没有差异,表明在***作用初期成瘾效应还没有形成,动物的鼻触行为是其本身的探究行为，随着后续实验的推进,发现动物***有效鼻触次数不断增加(图13),而生理盐水组有效鼻触次数在实验过程中没有发生显著变化(图14。训练3-4天后,与TLR3基因敲除小鼠相比，野生型小鼠***有效鼻触次数显著增加(p<0.05),而无效鼻触次数与初始水平无差异,说明野生型小鼠在***的作用下具备了辨别有效鼻触器和无效鼻触器的能力,建立起操作性条件反射，相反，这恰恰说明TLR3基因敲除小鼠通过碰触有效鼻触器来获得药物奖赏的行为显著减少。在生理盐水组动物的实验中，TLR3基因敲除小鼠和野生型小鼠的有效鼻触次数和无效鼻触次数在整个实验进程中没有明显差异,说明两者均不能辨别有效鼻触器和无效鼻触器(图15)。此外,从实验第5天开始,野生型小鼠***有效鼻触次数(药物注射次数)保持在一个比较稳定的水平,说明自身给药训练使得***对动物碰触有效鼻触器来获得药物奖赏这一行为进行了加强和巩固，然而，生理盐水则没有发挥上述作用。由图15得出，TLR3基因敲除小鼠和野生型小鼠对***的需求均呈现出逐渐增长的趋势，到第5天开始趋于平稳，出现一个平台期(同一组动物连续三天打药次数在其平均值的10％范围以内)，但是，与野生型小鼠相比，TLR3基因敲除小鼠***的摄入量明显减少(p<0.05)。以上实验结果说明TLR3基因敲除导致小鼠对***的需求减弱。

3.5 TLR3基因敲除小鼠脑内注射TLR3表达慢病毒后增强***CPP效应

TLR3基因敲除小鼠脑内定位注射TLR3表达慢病毒载体，注射点为双侧伏隔核。动物创伤恢复后，心脏灌注并固定大脑，冰冻切片，荧光显微镜下观察病毒注射位置(图16)。动物进行3天适应性训练，每天15-20min。通过***的条件性位置偏好检测，与脑内注射病毒载体对照的动物相比，注射了TLR3慢病毒载体的小鼠在***诱导箱体停留的时间显著增长(P<0.05)，这说明脑内注射TLR3表达慢病毒后，TLR3敲除小鼠的***成瘾效应明显增强，该结果(图17)表明：当TLR3敲除小鼠伏隔核TLR3重新表达后，可以恢复***成瘾行为效应。

3.6 TLR3基因敲除小鼠脑内注射TLR3表达慢病毒增加***自发活动

TLR3基因敲除小鼠脑内双侧伏隔核注射TLR3表达慢病毒载体，动物创伤恢复后，随机分组并进行环境适应训练，每次30min，以减小环境对实验结果的影响。正式开始实验前3天测自发活动基线，实验第4天开始腹腔给予***。由图18可见，四组动物前3天的活动量处于同一水平，基础活动量没有明显差异，但从第4天给药开始，脑定位注射TLR3表达慢病毒载体动物的自发活动量有明显的增加，并且与注射慢病毒载体对照的动物相比具有显著的统计学意义(P<0.05)。为使实验结果更加客观，消除因各组动物基础活动量不同对实验结果造成的影响，将每组动物给药后每天的自发活动量与给药前自身基础活动量作比值，如图19所示，脑定位注射TLR3表达慢病毒载体动物的自发活动量与注射慢病毒载体对照的动物相比显著增加，且同样具有统计学意义(P<0.05)。以上实验结果表明：TLR3基因敲除动物脑内伏隔核区域重新表达TLR3之后，动物的自发活动增加，***引起的行为敏化更加明显。

3.7 C57小鼠TLR3抑制剂脑内注射***CPP效应减弱

将C57小鼠进行TLR3抑制剂脑定位注射，动物创伤恢复后，随机分组并进行***CPP训练。对于腹腔注射***的两组动物，脑定位注射TLR3抑制剂小鼠条件位置偏好效应明显减弱(P<0.05)(图20)；然而，腹腔注射生理盐水的两组动物无条件位置偏好效应。以上实验结果表明：C57小鼠脑定位注射TLR3抑制剂后，动物在***诱导箱的停留时间显著减少，动物对***的需求和依赖明显减弱，提示TLR3基因在***成瘾形成中发挥作用。

3.8 C57小鼠TLR3抑制剂脑内注射***自发活动降低

C57小鼠脑内伏隔核注射TLR3抑制剂，进行自发活动检测。由图21可见，4组动物前3天的活动量处于同一水平，动物活动量基线没有明显差异。从第4天开始，伏隔核定位注射TLR3抑制剂的***给药小鼠活动量增加明显低于溶剂对照组，两组具有统计学差异(P<0.05)。该结果说明：抑制TLR3后，可减弱***行为敏化效应。为使实验结果更加客观，消除因各组动物基础活动量不同对实验结果造成的影响，将每组动物给药后每天的自发活动量与给药前自身基础活动量作比值，如图22所示，脑定位注射TLR3抑制剂动物的自发活动增加量明显低于对照组的动物，且同样具有统计学意义(P<0.05)。

3.8***多次给药激活小鼠IKBα/NF-κB信号通路

C57小鼠经过***CPP训练后,断颈处死,取出伏隔核(NAc)脑区，提取蛋白，用抗IKKβ、pIKBα和NF-κB抗体进行Western blot检测。结果发现,***CPP训练后，胞浆内IKKβ、pIKBα和NF-κB的表达明显上调(P<0.05)(图23--图25)。对核蛋白中NF-κB进行检测，发现核内NF-κB表达量同样上调(图26)(P<0.05)，说明胞浆中NF-κB与磷酸化IκB分离并进入核内启动下游信号转导。以上结果表明，***CPP训练使小鼠脑内IKKβ、pIkBα和细胞核内外的NF-κB表达量发生变化，***CPP训练可激活NF-IkB通路。以上实验结果表明TLR3参与调节***成瘾的过程，并且提示其很可能是通过TLR3/NF-kB途径来实现的。

3.9抑制或敲除TLR3减弱IKBα/NF-κB信号转导

为确证TLR3参与小鼠***成瘾过程的调节，对C57小鼠伏隔核定位注射TLR3抑制剂并进行***CPP检测。小鼠断颈处死,取出伏隔核，提取蛋白，用抗pIKBα和NF-κB抗体进行Western blot检测。结果发现,***CPP训练后，胞浆内pIKBα的表达明显上调(图27)(P<0.05)，同时核内NF-κB表达量上调且具有统计学意义(图28)(P<0.05)。以上结果表明抑制伏隔核内TLR3可下调IKBα/NF-κB通路中关键蛋白的表达量，即抑制TLR3可减弱IKBα/NF-κB的信号转导。

TLR3基因敲除小鼠伏隔核定位注射TLR3表达慢病毒，并进行***CPP检测，取出伏隔核样本，用抗pIKBα和NF-κB的抗体进行Western blot检测。结果发现,***CPP训练后，脑定位注射TLR3表达慢病毒的动物胞浆内pIKBα的表达明显上调(图29)(P<0.05)，同时，核内NF-κB表达量同样上调且具有统计学意义,(图30)(P<0.05)，以上结果表明TLR3基因敲除小鼠伏隔核内TLR3基因恢复表达后，***CPP训练上调了pIKBα和核内NF-κB的表达，说明TLR3基因恢复表达后***CPP激活了IKBα/NF-κB通路。

4结论

本课题主要采用行为学观察及遗传学和药理学干预等手段探究TLR3在小鼠***成瘾机制中的作用。

我们发现，TLR3基因敲除小鼠***CPP效应显著降低，表明其对***的依赖减弱。与野生型小鼠相比，TLR3基因敲除小鼠对***诱导的行为敏化效应减弱。在自主给药试验中，TLR3基因敲除小鼠自主给药次数明显少于，表明对***渴求减弱。

我们构建了TLR3表达慢病毒载体，并在TLR3基因敲除小鼠伏隔核定位注射该病毒载体以恢复TLR3表达，然后进行相关神经行为学试验。试验结果表明：TLR3敲除小鼠伏隔核注射TLR3慢病毒载体后对***成瘾性显著升高。

我们继续采用TLR3抑制剂定位注射于C57小鼠伏隔核，然后进行成瘾行为学评价。结果发现，TLR3抑制剂可减弱C57小鼠对***的成瘾性。

最后，对成瘾小鼠TLR3/IKKβ/NF-κB通路的关键蛋白进行检测。结果发现，***CPP训练使小鼠脑内IKKβ、pIkBα和细胞核内外NF-κB表达水平均上调表达。但当C57小鼠脑定位注射TLR3抑制剂后，胞浆pIKBα和核内NF-kB均下调表达，此外，TLR3基因敲除小鼠通过脑定位注射慢病毒载体恢复表达TLR3后，胞浆pIKBα和核内NF-κB上调表达。以上结果说明TLR3参与***成瘾过程，且可能是通过TLR3/IKBα/NF-κB通路参与调解。

综上，TLR3抑制剂可以有效减弱对***的依赖和渴求，减弱***诱导的行为敏化效应，能够治疗***成瘾。

Claims (4)

1.TLR3抑制剂在制备治疗***成瘾的药物中的用途；所述TLR3抑制剂为化合物I，其结构式如下：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述治疗***成瘾的药物是降低pIKBα和NF-kB表达水平的药物。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是以TLR3抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述制剂是注射制剂。