CN110373428A - 一种促进细胞移植和基因表达的转基因载体***及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种促进细胞移植和基因表达的转基因载体***及其应用。该***包括筛选基因***、目的基因表达***及用于承载上述两***的载体，其中筛选基因***为抑制***或促进细胞死亡的基因的沉默***。本发明与现有技术相比，首先不受目的基因是否具有生长优势的限制；其次筛选既发生在干细胞水平也发生在分化细胞水平，因此基因修饰细胞能终身稳定保持或增加数量；再次不需要使用药物筛选，避免了药物毒性的影响；再次因使用了只抑制***或促进细胞死亡的突变体，便没有致癌的风险。

Description

一种促进细胞移植和基因表达的转基因载体***及其应用

原申请日：2016-10-08，原申请号：201610877184.9

原专利名称：一种促进细胞移植和基因表达的转基因载体***及其应用

技术领域

本发明涉及一种转基因载体***，尤其是能促进细胞移植和基因表达的载体***。

背景技术

基因治疗或建立基于成体(干)细胞的动物生物反应器或动物模型需要在受体病人或动物体内有稳定的目的基因表达量和稳定的目的基因表达阳性细胞数量。可是在现实中却普遍发生在单个细胞中表达目的基因效率的下降和表达目的基因的细胞比例的下降。解决上述缺陷的途径是进行体内筛选。目前有三类体内筛选的方法：1)目的基因具有使宿主细胞持续***和促进存活的能力，从而在没有施加任何筛选压力的情况下自然发生体内筛选，但是这种目的基因的特性并不常见，也就是并非所有的目的基因都具备能使宿主细胞持续***和促进存活的能力；2)除目的基因外，再同时导入一个筛选基因，该基因使宿主细胞具有药物依赖的促进存活的能力(所谓的细胞生长开关cell growth switches)，不过该方法在大动物上表现为筛选只发生在短期存活的细胞水平，以至于不能持久保持足够的表达目的基因的细胞，因此限制了其使用；3)除目的基因外，再同时导入一个抵抗筛选压力(通常为有毒药物)的筛选基因，致使药物只清除未经基因修饰的细胞而不清除基因修饰的细胞，但是该***因毒性药物而阻碍了其应用。4)当使用具有生长优势的基因作为筛选基因时，具有导致肿瘤发生的可能。如目前研究最多的为HOXB4基因，就被发现有致癌的风险。到目前为止，能克服上述缺陷的体内筛选***还未见到。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种既能进行自然体内筛选从而避免筛选药物的使用，又能使筛选既发生在干细胞水平又发生在分化细胞水平上的筛选***，可以使得目的基因在宿主体内有稳定的基因表达量和稳定的表达目的基因的细胞数量，为基因治疗、细胞治疗、制作基于成体(干)细胞的动物生物反应器或动物模型提供新的平台。

本发明所述的筛选***包括筛选基因***、目的基因表达***及承载上述两***的载体，筛选基因***为促进细胞***或促进细胞存活的基因或其突变体的表达***，或为抑制***或促进细胞死亡的基因的沉默***，可分为非诱导型、诱导型和条件性基因敲除型。

所述的促进细胞***或促进细胞存活的基因及其突变体的表达***，包括启动子、促进细胞***或促进细胞存活的基因或其突变体序列、转录终止序列。

所述的促进细胞***或促进细胞存活的基因及其突变体序列为Survivin、BCL2、BCLxL、MCL1、BCL-W、A1、Boo/DIVA、BCL2L13、BCL2L12等基因及其突变体序列。

所述的bcl2突变体序列为不能促进细胞致瘤的突变序列，包括AAA、S70A、S69AS70A、S70AT87A、Y28A等突变体。这些突变体因为保留了抗凋亡能力但是降低了对DNA修复能力的抑制、不影响P53诱导细胞凋亡以及/或去除了使c-Myc稳定而促使肿瘤发生的能力，因此能起到使转入该基因的细胞在体内具有存活优势但又不至于引发肿瘤的发生，所以是体内筛选基因极好的候选者。

所述的bcl2突变体序列为具有增强的抗凋亡能力的BCL2突变体，包括EEE、S70E等突变体。

所述的抑制***或促进细胞死亡的基因沉默***，包括启动子、抑制***或促进细胞死亡的基因序列为靶序列的siRNA或shRNA或miRNA的DNA模板序列、以及转录终止序列；其中miRNA的DNA模板序列也可以插在目的基因表达盒中目的基因的3’端或5’端。该沉默***可以是单个基因单个靶点或单个基因多个靶点沉默，也可以是多个基因同时沉默。

所述的抑制***或促进细胞死亡的基因序列为bcl2家族及其他家族的促凋亡的基因序列，包括Bax、Bak、Bok/Mtd、Bcl-xs、Bcl-g/Bcl2L14、Bfk/Bcl2L15、Bid、Bad、Bik/Nbk、Hrk、Bim/Bod、Bmf、Mule/ARF-BP3、Nix/Bnip3、Puma、Noxa等基因序列。

所述的诱导型筛选基因***，其中的启动子为诱导型启动子。

所述的条件性基因敲除型筛选基因***，筛选基因***两侧包含有条件性基因敲除的特定序列(如LOXP或FRT序列)，以便条件性去除筛选基因***。

上述筛选基因***能保证目的基因***在靶细胞或靶器官中高效持久地表达。

所述的载体为病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)等中的一种。

本发明通过筛选基因***的引入，利用过表达促细胞***或促细胞存活的基因或利用沉默掉抑制***或促进细胞死亡，使得转有筛选基因***的细胞在体内自然筛选过程中获得优势，从而使得转有筛选基因***的细胞获得稳定的数量，同时也可能使与筛选基因偶联表达的(治疗性)目的基因的表达增加，使基因、细胞治疗和基于成体(干)细胞的动物生物反应器或动物模型的制作变得容易成功。如果采用诱导型和条件性基因敲除型的筛选基因***，则可以在筛选完成后消除筛选基因的过表达或沉默造成的对宿主细胞的长久影响。

本发明的另一个目的是提供上述***，在制作动物生物反应器、制作人源化小鼠、基因治疗、细胞治疗中的应用。

本发明与现有技术相比，所具有的优点、特点或积极效果，说明现有技术之缺陷：

如背景技术中所述，现有技术存在的缺陷主要有：1)当治疗性或转入的目的基因自身具有生长或存活优势时，能使宿主细胞自发在体内竞争中获得优势而使细胞在体内有稳定的数量，但是毕竟这样具有生长或存活优势的目的基因毕竟是少数，当目的基因不具备这样的能力时，就有可能在体内不能获得稳定的基因修饰细胞数量，从而使基因、细胞治疗或制作基于成体(干)细胞的动物生物反应器或动物模型失败；2)当导入的筛选基因为能使宿主细胞具有药物依赖的促进存活的能力(所谓的细胞生长开关cell growthswitches)基因时，实验发现在大动物的应用上表现为筛选只发生在短期存活的细胞水平，也就是没有发生在干细胞水平，以至于不能持久保持足够的基因修饰细胞，因短期存活细胞为非干细胞，自我更新能力弱，因此容易耗尽，当基因修饰的短期存活细胞耗尽(exhaust)后，便无法再获得基因修饰细胞，因此限制了其使用；3)当导入一个抵抗筛选压力(通常为有毒药物)的筛选基因时，需使用药物来清除未被基因修饰的细胞，但是该***因毒性药物而阻碍了其应用；4)当使用具有生长优势的基因作为筛选药物时，目前研究最多的为HOXB4基因，但被发现有致癌的风险。

本发明与现有技术相比，首先不受目的基因是否具有生长优势的限制；其次筛选既发生在干细胞水平也发生在分化细胞水平，因此基因修饰细胞能终身稳定保持或增加数量；再次不需要使用药物筛选，避免了药物毒性的影响；再次因使用了只促进细胞存活但不促进细胞突变的突变体，便没有致癌的风险，比如使用bcl2的突变体aaa或S70A等。因此在基因、细胞治疗和基于成体(干)细胞的动物生物反应器或动物模型的制作中具有很大的应用价值。

附图说明

图1为实施例1所采用的含有Bcl-2突变体S70A的逆转录病毒载体MIGR1-S70A质粒示意图，其中各元件如下：

图2为实施例1移植基因修饰骨髓细胞小鼠外周血白细胞和红细胞的GFP阳性细胞百分比随时间的变化。“前”代表移植前供体骨髓细胞GFP阳性细胞百分比，1.5、2、2.5、6代表移植后1.5、2、2.5、6个月，采用三个独立实验的数据；

图3为实施例2所采用的含有bcl2突变体S70A的自我失活的猫科动物免疫缺陷疾病毒(FIV)慢病毒载体质粒示意图，其中各元件如下：

图4为实施例3中5-FU非清髓性预处理的受体小鼠外周血白细胞GFP阳性细胞比例。受体小鼠在移植前5天按150毫克/千克体重的五氟尿嘧啶静脉给药，5天后移植经逆转录病毒感染的Sca-1阳性骨髓细胞，移植后六个月流式细胞测定外周血白细胞GFP阳性细胞比例。

图5为实施例4中移植基因修饰骨髓细胞小鼠外周血白细胞和红细胞的GFP阳性细胞百分比随时间的变化。“前”代表移植前供体骨髓细胞GFP阳性细胞百分比，1.5、2、2.5、6代表移植后1.5、2、2.5、6个月，采用三个独立实验的数据。

图6为实施例7所采用的含有Bax miRNA和Bak miRNA表达序列的逆转录病毒载体质粒示意图，其中各元件如下：

元件	功能
		5’LTR	包含逆转录病毒MSCV启动子，起始转录
Ψ<sup>+</sup>	包装信号
		GFP	编码报告基因绿色荧光蛋白的cDNA
miRNA(Bax)	针对Bax的miRNA模板序列
		miRNA(Bak)	针对Bak的miRNA模板序列
3’LTR	转录终止
		Ori	Col E1中复制起始点
AMPr	氨苄青霉素抗性基因

；

图7为实施例8动物血液生物反应器中GFP蛋白在红细胞中的表达。A道为MIGR1-Bcl2小鼠红细胞裂解液电泳道，B道为对照(未感染病毒骨髓移植小鼠)小鼠红细胞裂解液电泳道，M道为分子量标记道。

图8为实施例9所采用的pCDH-Bcl2-MSCV慢病毒载体质粒示意图，其中各元件如下：

图9为实施例11所采用的所有元件在一个载体上的诱导表达Bcl-2突变体S70A的FIV慢病毒载体质粒示意图，其中各元件如下：

图10为实施例11中，经过Dox处理1.5个月后，其外周血白细胞、骨髓细胞、lin-sca1^highckit^high骨髓细胞(LSK细胞)中GFP阳性细胞率，以及撤掉Dox 4.5个月后、8.5个月后，外周血GFP阳性百分率。

图11为实施例12移植基因修饰骨髓细胞小鼠外周血白细胞的GFP阳性细胞百分比随时间的变化。“前”代表移植前供体骨髓细胞GFP阳性细胞百分比，1.5、3、6代表移植后1.5、3、6个月基因修饰血液细胞经体内筛选后的百分比变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。

实施例1.以BCL2突变体S70A作为筛选基因的体内筛选***

在本实施例1中，采用BCL2的突变体S70A作为筛选基因，同时利用逆转录病毒载体MIGR1作为载体。如前所述，S70A保留了部分BCL2的抗凋亡能力，但是去除了其促瘤能力，因此特别适合作为体内自然筛选基因。

(1)把S70A***到MIGR1的IRES前，为MIGR1-S70A质粒，如图1所示。

(2)用MIGR1-S70A质粒和包装细胞BOSC23制备逆转录病毒上清液。具体地，将BOSC23细胞培养在6孔细胞培养板中的改良杜氏伊格尔培养基(Dulbecco's ModifiedEagle's Medium，DMEM)完全培养基(添加了10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺等)中(37℃,5﹪CO₂)，待细胞90﹪汇合时，用含5﹪FBS、不含抗生素的DMEM新鲜培养基替换掉老培养基，每孔加1.5ml培养基，放入37℃,5﹪CO培养箱备用。取两个1.5ml离心管，每管加入预先37℃加热的OPTI-MEM培养基250μl，然后在其中一管中加入经纯化的2.5μg构建好的MIGR1-S70A质粒，混匀，常温5分钟；同时在另一管中加入Lipofectamine 2000脂质体5μl，混匀，常温5分钟。把两管内容物加在一起混匀，常温放置20分钟，然后加到细胞培养孔中，轻轻摇晃均匀，然后置于37℃,5﹪CO₂培养，6小时后用新鲜完全DMEM培养基(在DMEM培养基中添加了10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺等)置换掉老培养基，再培养约30个小时后收集上清液，500g离心5分钟，取上清，-80度贮藏备用。

(3)常规从雄性8周龄C57BL/6小鼠的前后腿骨取出骨髓，根据使用说明用Sca-1磁珠分离试剂盒分离出Sca-1阳性骨髓细胞，并培养于添加有50纳克/毫升干细胞因子(SCF)、20纳克/毫升白介素3、50纳克/毫升白介素6、15％胎牛血清、2毫摩尔/升谷氨酰胺、0.1毫摩尔/升非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素(100x,Gibco)的高糖改良杜氏伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)，48小时后用制备好的逆转录病毒上清液进行病毒感染，感染方法为离心感染法，即在细胞中加好含有6微克每毫升polybrene的病毒上清液，然后在离心机上900g离心45分钟，连续两天进行两次离心感染。第二次感染后换上新鲜含有细胞因子的完全培养基，培养24小时。取小部分上流式细胞仪测量GFP阳性细胞含量表达情况，其余用于移植。

(4)移植前雌性8周龄C57BL/6小鼠经过9Gy 137Cs源放射线照射，从尾静脉注入步骤(3)感染好的Sca-1阳性骨髓细胞。移植后受体小鼠用含抗生素的水进行喂养1个月，然后用普通水喂养。

移植后1.5、2、2.5、6个月后尾静脉取外周血白细胞和红细胞上流式细胞仪测量GFP阳性细胞。与移植前相比，GFP阳性细胞比例随时间而上升，一直上升到90％左右或以上(见图2)。对照(含有GFP基因但没有S70A基因)因为没有S70A的表达，GFP阳性细胞比例随时间而下降(见图2)。这些结果说明S70A能提高基因修饰细胞的比例。同时与对照相比，代表转入基因表达强度的GFP的平均荧光强度(MFI)也是S70A小鼠比对照小鼠显著提高，说明S70A也促进修饰基因的表达量。有价值的是S70A小鼠能终身高表达转入的基因GFP，因此对于需要持久高效表达转入基因的基因治疗特别有价值。

然后通过实验来证明基因修饰发生在造血干细胞水平。首先在移植后6个月检测移植受体小鼠的骨髓和外周血GFP阳性细胞比例，发现GFP阳性细胞比例从移植前供体细胞的44.52％上升到骨髓细胞中的93.15±2.64％(p<0.0001)，或者骨髓中LSK细胞中上升到83.68±3.33％(p<0.0001)(LSK细胞是公认的初级的造血细胞，为Lin阴性、Sca-1阳性、c-kit阳性细胞)；而对照小鼠GFP阳性细胞比例却从移植前供体细胞中的31.36％下降到骨髓细胞中的5.39±3.55％(p<0.0001)，或者LSK细胞中下降到0.39±0.29％(p<0.0001)。在LSK细胞中GFP阳性细胞比例比在骨髓中低说明该体内筛选不仅发生在干细胞水平，也发生在正在分化的造血前体细胞水平，因为正在分化的细胞更加需要依赖抗凋亡分子来存活下来，而干细胞因为大部分处于静息状态，它们的存活对抗凋亡分子的依赖性较低。然后我们在第一次移植后6个月进行了第二次移植，分别进行了全骨髓移植和GFP+LSK细胞移植。结果发现第二次移植的受体小鼠外周血红细胞中分别含有93.23±2.33％和99.54±0.13％的GFP阳性细胞，说明基因修饰细胞能够稳定转移到第二次移植受体小鼠中。这些结果说明该体内筛选不但发生在造血干细胞水平也发生在分化细胞水平。

S70A小鼠除了脾脏和外周血白细胞比对照大和多1-2倍、CD4/CD8比例颠倒外，白细胞中各类细胞亚群与对照相比没有显著地变化，说明S70A基本上不影响造血。另外对第一次移植受体小鼠和第二次移植小鼠进行观察，没有见到移植受体小鼠发生白血病等血液***肿瘤疾病，说明S70A是一个安全的筛选基因。

本***能使外源转入基因的细胞在移植受体动物体内持久高效地表达转入的基因，而且转基因细胞还不会发生恶性转化，因此是基因治疗的理想载体***。

实施例2.基于诱导***及慢病毒载体的以Bcl-2突变体S70A作为筛选基因的体内筛选***

慢病毒有比逆转录病毒更安全的特性。因此用自身失活型猫科动物免疫缺陷病毒来重复实施例1的研究(图3，空病毒载体来自SBI公司)。制病毒使用的包装细胞为293T细胞，除了慢病毒载体外，还要在293T细胞中转入另两个包装质粒(pFIV-34N、pVSV-G)。慢病毒包装方法、骨髓细胞获取、病毒感染以及细胞移植同实施例1。

移植后6个月，发现基于慢病毒的S70A能增加GFP阳性细胞比例，但是不像逆转录病毒S70A那样，慢病毒S70A只能增加GFP阳性细胞比例到一个较低的水平，大约30％左右。通过比较移植受体小鼠骨髓中GFP表达的荧光强度值，发现慢病毒S70A感染的供体小鼠骨髓细胞中GFP阳性细胞的荧光强度值(MFI)为10.57，极大地低于逆转录病毒感染的供体小鼠骨髓中GFP阳性细胞的荧光强度值96.07，说明慢病毒S70A的表达极大地低于逆转录病毒S70A的表达，这可能源于慢病毒中驱动S70A和GFP表达的是内部启动子MSCV，而逆转录病毒的启动子为逆转录病毒的LTR启动子，后者比前者强，所以导致了慢病毒S70A只能使GFP阳性细胞比例达到30％左右。因为S70A及GFP的表达水平取决于整合到染色体DNA中的病毒的拷贝数及启动子强度，因此GFP细胞比例高低应该可以通过使用不同的启动子(包括诱导型启动子)和不同的病毒感染倍数量(MOI)进行控制。基于本结果，持久并低水平的S70A表达似乎对该体内筛选是必须的。其他结果(包括造血影响、筛选是否发生在干细胞水平等)与实施例1中的逆转录病毒差不多。值得注意的是在第一次和第二次移植受体小鼠中(观察了6-24个月)没有发现白血病等造血***肿瘤疾病，说明本方法应用于基因治疗等是安全的。

实施例3.通过5-FU处理的非清髓性移植前预处理

临床应用中移植受体病人往往不能使用致死剂量的射线照射清髓，因此用药物进行非清髓性移植前处理是否可行是非常关键的。在移植前对受体小鼠注射150毫克/公斤体重的五氟尿嘧啶(5-FU)，移植6个月后发现该预处理足于使逆转录病毒MIGR1-S70A感染的骨髓细胞移植成功(图4)，因此本方法对临床应用非常适合。

实施例4.以BCL2突变体EEE作为筛选基因的体内筛选***，对EEE突变体进行研究

方法同实施例1，结果也与实施例1相似(图5)，但发现白血病等血液肿瘤疾病的发生。说明EEE在一定条件下也可作为体内筛选***的筛选基因。

实施例5.基于CD34细胞的人源化小鼠的制备

MIGR1-S70A逆转录病毒的制备基本同实施例1，只是BOSC23病毒包装细胞换成PT67包装细胞，其余步骤同实施例1的制备病毒，制备出的病毒能感染人体细胞。制备好的病毒于-80℃保存备用。

人脐带血来自健康供体，单个核细胞通过Ficoll-Hyaque密度离心获得。CD34+细胞根据操作手册用miniMACS(Miltenyi Biotec,Gladbach,Germany)进行富集。1×10e5富集的CD34+细胞培养在培养基[高糖DMEM培养基(Gibco,Grand Island,NY,USA),15％胎牛血清(胚胎干细胞专用,Gibco,Auckland,NZ),2mM L-谷氨酰胺(Gibco,Grand Island,NY,USA),0.1mM非必需氨基酸(Gibco,Grand Island,NY,USA),1μM氢化可的松,0.1μMβ-巯基乙醇,1％青霉素/链霉素(100x,Gibco,Grand Island,NY,USA)]另外添加100ng/ml的干细胞因子(rhSCF,from R&D Systems Inc.),100ng/mL Flt3配体(Flt3-L,from R&D SystemsInc.),50ng/mL促血小板生成素(Tpo,from R&D Systems Inc.)。培养48小时后，细胞用PBS洗一遍，重新重悬于含有SCF、Flt3-L和Tpo的逆转录病毒S70A上清中，转移到经retronectin(Takara)包覆的24孔板中，900g离心45分钟，然后在33℃孵育2小时。病毒上清用含有SCF、Flt3-L和Tpo的新鲜培养基置换，再在37℃培养48小时。细胞然后用胰酶-EDTA消化，取小部分上流式细胞仪检测GFP表达情况，其余用于移植进免疫缺陷小鼠。

NSG(NOD-SCID IL-2 receptor gamma null)小鼠是比NOD/SCID小鼠更能成功移植人类CD34造血细胞的小鼠。8周龄NSG小鼠先经亚致死剂量射线(2.4Gy；137Cs源)照射，然后通过尾静脉注射1×10e5经病毒感染的CD34细胞。移植后10周，流式细胞术检测移植小鼠外周血中人CD45细胞的含量。与对照组(仅表达GFP的病毒感染的CD34细胞移植的小鼠)相比，S70A小鼠人源GFP阳性细胞(CD45+GFP+)达到了55.64±4.37％，总人源化细胞达66.21±4.89％；而对照小鼠人源化GFP阳性细胞为9.68±3.33％,总人源化细胞为37.65±2.79％，说明S70A促进人源化小鼠的人源化细胞比例。

实施例6.基于人外周血单个核细胞(PBMC)的人源化小鼠的建立

使用的慢病毒载体、病毒制备同实施例2。

从健康人获取外周血，用PBS缓冲液按1∶2稀释，铺于Ficoll分离液表面,1 700转/分钟离心30分钟,吸取分离液界面的细胞层，即为人外周血单个核细胞(PBMC),PBS洗涤3次，重悬于含有8微克/毫升凝聚胺的慢病毒上清，转移到经retronectin(Takara)包覆的6孔板中，900g离心50分钟，去掉病毒上清，用含有15％胎牛血清、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、2mM L-谷氨酰胺、100纳克/毫升白介素2的1640培养基重悬细胞，培养24小时，然后重复感染1次，再培养在1640培养基中24小时，上流式细胞仪进行GFP阳性细胞分选。8周龄NSG小鼠经尾静脉注射分选好的GFP阳性的人外周血单个核细胞20×10e6/只。移植后4周取小鼠外周血检测人CD45细胞，发现FIV-S70A小鼠比FIV-GFP小鼠的CD45阳性细胞比例由显著提高(65.44±5.35％vs 36.83±3.95％,p<0.01)。

实施例7.以促凋亡基因作为筛选基因的体内筛选***

在本实施例中，采用表达miRNA的方式沉默靶细胞中的Bax和Bak基因表达。首先构建好载体，各元件排列如图6所示。从GENEBANK获得人种属的Bax和Bak的cDNA序列，作为设计miRNA的模板。选择使用invitrogen公司的在线设计软件设计出miRNA模板序列(包括5’miR侧翼序列，与BAX或BAK基因完全互补的反义链，19个核苷酸的loop环，两个核苷酸缺失的正义链，再接着是3’miR侧翼序列)。如图5所示，逆转录病毒的LTR中的MSCV启动子驱动GFP基因以及针对BAX基因的miRNA和针对BAK基因的miRNA表达。为了筛选出沉默效率高的miRNA模板序列，用构建好的载体质粒瞬时转染HEK293细胞，经流式细胞仪分离出GFP阳性细胞，用western blot试验检测细胞的Bax和Bak表达情况，以大于85％的Bax或Bak表达被抑制的miRNA模板序列作为有效的miRNA模板序列，该筛选出的有效的BAX和BAK的miRNA模板序列委托DNA合成公司合成，如图5所示的序列串联***到GFP的下游，完成载体的构建。病毒制备方法同实施例1，唯包装细胞由BOSC23换成PT67细胞，以便包装好的逆转录病毒能感染人源细胞，制备好的病毒贮存于-80℃备用。

人脐带血CD34细胞获取、培养、感染病毒、移植方法同实施例5。与对照组相比，BAX-BAK miRNA小鼠的人源化细胞更高(70.43±6.46％vs35.65±4.13％)，说明沉默了BAX和BAK促使人源化细胞具有体内竞争性优势，使其比例极大增高。

实施例8.动物血液生物反应器的建立

以实施例1的MIGR1-Bcl2质粒和C57BL/6小鼠来建立小鼠血液生物反应器。方法和过程同实施例1。

移植后6个月，用Ficoll-paque密度离心分离出红细胞。分离出的红细胞用冷PBS洗三遍，然后重悬于添加了蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(50mM Tris-HCl[pH 8.0],0.5％NP-40；1mM EDTA；150mM氯化钠；10％甘油；1mM钒酸钠；50mM氟化钠；10mM焦磷酸钠；1mMβ巯基乙醇)中，在4度温度下裂解。裂解后提取液经14000转/分钟离心10分钟。离心上清进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶经考马斯亮蓝染色，结果发现移植小鼠的红细胞中有约血红蛋白量的1％的GFP蛋白(图7)，说明用此方法也能快速成功地建成表达外源蛋白的动物血液生物反应器。

实施例9.动物乳腺生物反应器的建立

为了建立乳腺生物反应器，使用慢病毒pCDH-MSCV(购自SBI公司)，在此我们把山羊Bcl2(野生型)基因置于T2A下游，而把GFP置于T2A上游，同时在GFP前连上分泌信号(kappa分泌信号序列：ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGGT)，见图8，该质粒命名为pCDH-Bcl2-MSCV。病毒制备：293T/17细胞接种于10厘米细胞培养皿中，第二天等细胞有90％汇合后用lipofectamine 2000脂质体瞬时转染18微克pCDH-Bcl2-MSCV和12微克包装质粒混合液。转染后6小时用新鲜完全DMEM培养基(在DMEM培养基中添加了10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺等)置换掉老培养基，再培养约30个小时后收集上清液，500g离心5分钟，取上清，-80℃贮藏备用。

在病毒上清中加入80微克/毫升的聚凝胺(polybrene)，用注射器(22号针头)从雌山羊***把加好凝聚胺的逆转录病毒打入山羊乳腺。山羊在1、3、5、7、9、11、13天时肌肉注射0.25毫克/千克体重的***和0.75毫克/千克体重的孕酮，病毒液分别在注射激素的3、5、7、9、11、13天注入乳腺。泌乳后收集乳汁，-80贮存备用。

收集的乳汁用GFP绿色荧光蛋白定量试剂盒检测GFP的表达量，结果显示最初3天GFP表达较高，达到102.34±25.54纳克/毫升，后面几天有所降低但稳定表达到泌乳结束，说明乳腺动物生物反应器成功建成。

实施例10.本发明***在过继免疫***中的应用

使用的慢病毒载体、病毒制备同实施例2。

使用8周龄健康BALB/C雌性小鼠，3％琉基乙酸钠培养基2毫升/鼠腹腔注射，3天后，以4℃D-Hanks液灌洗法收集腹腔巨噬细胞，悬于含15％胎牛血清、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、2mM L-谷氨酰胺的1640培养基中培养，3hr后，洗去非贴壁细胞，剩下贴壁细胞，按上述1640培养基和病毒液1:2比例混合好培养基，并且加入1000单位/毫升粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、200单位/毫升的伽马干扰素(IFN-γ)和6微克/毫升凝聚胺，培养细胞48小时，中间换液一次，胰酶消化，流式细胞仪分选出GFP阳性细胞，备用。

BALB/C小鼠经腹壁右侧皮下接种5×10e5个S180肿瘤细胞，6小时后在接种肿瘤细胞部位皮下注射入分选好的巨噬细胞，隔三天一次，共3次，每次1×10e6个细胞。观察肿瘤的生长情况，测量肿瘤直径，计算肿瘤体积。与感染FIV-GFP病毒的巨噬细胞相比，感染FIV-S70A病毒的巨噬细胞能有效抑制肿瘤的生长(肿瘤抑制率：66.73±9.53％vs 31.44±7.37％，p<0.05)。

实施例11.以BCL2突变体S70A作为筛选基因的诱导筛选***

为了避免S70A的组成性表达(constitutive expression)，使用了诱导***。该诱导***使用的骨架为自我失活的猫科动物免疫缺陷疾病毒(SIN FIV慢病毒)，加入四环素诱导的原件，形成一个多合一的载体，载体构建见示意图9。载体构建、慢病毒制备、骨髓SCA-1细胞富集、病毒感染、干细胞移植均同实施例2。移植前小鼠喂养含1000毫克/升Dox及1％葡萄糖的水，移植后继续喂养45天。流式细胞术检测显示，经过Dox处理1.5个月后，其外周血白细胞、骨髓细胞、lin-sca1^highckit^high骨髓细胞(LSK细胞)中GFP阳性细胞率比移植前增加了一倍多(图10)。撤掉Dox 4.5个月后，GFP阳性细胞比刚撤掉Dox时要下降，撤掉Dox8.5个月后，下降趋缓(图10)。这些结果说明该诱导***应用于基因治疗是可行的，是能保持转基因持续表达的。

实施例12.以Bcl-xL作为筛选基因的诱导筛选***

试验方法同实施例1，唯有以Bcl-xL替换质粒上的S70A。结果发现，Bcl-xL也能使GFP阳性细胞比例增高，见图11。说明Bcl-xL也可作为体内筛选***的筛选基因。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例的动物中的应用，也包含人类的应用，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种促进细胞移植和基因表达的转基因载体***，该***包括筛选基因***、目的基因表达***及用于承载上述两***的载体，其特征在于筛选基因***为抑制***或促进细胞死亡的基因的沉默***，包括启动子、抑制***或促进细胞死亡的基因序列为靶序列的siRNA或shRNA或miRNA的DNA模板序列、以及转录终止序列；其中miRNA的DNA模板序列也可以插在目的基因表达盒中目的基因的3’端或5’端；所述的抑制***或促进细胞死亡的基因序列为bcl2家族及其他家族的促凋亡的基因序列，包括Bax、Bak、Bok/Mtd、Bcl-xs、Bcl-g/Bcl2L14、Bfk/Bcl2L15、Bid、Bad、Bik/Nbk、Hrk、Bim/Bod、Bmf、Mule/ARF-BP3、Nix/Bnip3、Puma、Noxa等基因序列。

2.如权利要求1所述的***，其特征在于沉默***可以是单个基因单个靶点或单个基因多个靶点沉默，也可以是多个基因同时沉默。

3.如权利要求1所述的***，其特征在于筛选基因***采用诱导型或条件性基因敲除型，筛选基因可选择性进行过表达或沉默，避免对宿主细胞的长久影响。