CN110372803B - 一种具有降血糖、提高免疫力作用的口服液 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有降血糖、提高免疫力作用的口服液，属于生物制剂领域，该口服液的风味配方为：褐藻淀粉溶液中加入0.13‑0.17％的β‑环糊精、13‑17％的木糖醇、0.13‑0.17％的柠檬酸及适量的香精。其中，褐藻淀粉，分离自海带，并用抗坏血酸磷酸酯钠进行化学修饰，其制备方法包括，超声波提取海带多糖；分级醇沉法进行纯化，包含向海带多糖溶液中加入90‑95％的乙醇至浓度为28‑32％，静置、过滤，取沉淀。该口服液中的褐藻淀粉对PTP1B抑制率较高，增加胰岛素敏感性，从而提高其降低血糖的能力，并且其制备过程中具有较高的多糖保留率。

Description

一种具有降血糖、提高免疫力作用的口服液

技术领域

本发明属于生物制剂领域，具体涉及一种具有降血糖、提高免疫力作用的口服液。

背景技术

海带，又名昆布、海草、江白菜，属褐藻门、褐藻纲、海带目、海带科、海带属，是一种药食两用的大型海洋植物。目前，海带中生物活性物质的分离纯化与营养保健研究以及新型海带系列产品的开发是国内外学者们研究的热点。海带作为兼具食用价值和药用价值的“天然保健食品”，活性物质丰富。到目前为止，发现的海带生物活性物质主要有：海带多糖、酸性聚糖类物质、岩藻半乳多糖硫酸酯、昆布氨酸、半乳糖醛酸、牛磺酸、大叶藻素、双歧因子。在诸多的活性物质中，海带多糖对海带的营养与保健功能作用最为突出。研究发现，海带多糖在调节免疫、抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、降血糖等方面都发挥着独特的作用。海带中多糖物质丰富，不同多糖物质结构和性质的差异，也使其具有不同的生物活性，目前从海带中发现的多糖有三种：褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉。褐藻淀粉又称昆布多糖，在海带中的含量约占1％，褐藻淀粉为中性葡聚糖的一种，其磺化产物为褐藻淀粉硫酸酯，研究发现，这两种多糖都能够促进机体的免疫功能，对血清胆固醇都有明显的降低作用，褐藻淀粉与人工磺化的褐藻淀粉硫酸酯相比，对机体的免疫调节作用更强。

现有技术如授权公告号为CN 102153669 B的中国发明专利，公开了一种低分子褐藻葡聚糖的制备方法。通过碱金属碳酸盐溶液将海藻组织和细胞解体，并用酸调节适当pH值，提取出其中的褐藻酸、褐藻多糖和褐藻淀粉，再将此淀粉用过氧化氢降解，使其成为平均分子量在800-1000道尔顿的褐藻葡聚糖。据报道，该种低分子量褐藻葡聚糖可增强人体的免疫力及植物的抗逆性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种褐藻淀粉，该褐藻淀粉能够与蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)的活性部位结合，使酶失去活性，增加胰岛素敏感性，同时部分磷酸酯基能和糖环上的羟基形成酯键，在糖链局部形成螺旋结构呈有活性的高级构象，增大有序性，提高药理活性。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

提供一种褐藻淀粉，分离自海带，其特征在于：褐藻淀粉用抗坏血酸磷酸酯钠进行化学修饰。褐藻淀粉，是一种普遍存在于褐藻体内的一种多糖。它的主要组成是由C₁和C₃结合的β-D吡喃葡萄糖多聚化合物，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)是胰岛素信号转导通路的负调节因子，用抗坏血酸磷酸酯钠对褐藻淀粉进行修饰后，磷酸酯能够与PTP1B的活性部位结合，准确捕获酶，从而对酶侧链上的羧基进行修饰，改变酶的空间构象，使酶失去活性，从而增加胰岛素敏感性，增加组织对葡萄糖的利用，提高降低血糖的能力。三股螺旋构型是多糖最具活性的空间构象，并且修饰后，连接在侧链上，增加分支侧链数，分子结构发生变化，糖环构象发生扭曲或转变，容易形成非共价键，而这些阴离子基团间的排斥作用使糖链链段伸长，部分磷酸酯基又可能会和糖环上的羟基形成酯键，因此在糖链局部形成螺旋结构呈有活性的高级构象，且有序性增大，从而药理活性更高。

作为优选，褐藻淀粉具有降血糖和提高免疫力的作用。褐藻淀粉能够明显增强小鼠溶血素的生成，增强体液免疫，从而对机体免疫力有增强作用。褐藻淀粉对糖尿病小鼠的血糖有肯定的降低效应，能够调节糖尿病小鼠的蛋白质代谢，并且对胰岛β细胞的损伤有保护作用，促进胰岛细胞分泌胰岛素，在褐藻淀粉浓度为1.3mg/mL时，对PTP1B的抑制率可达91％，增加了胰岛素敏感性。

本发明的另一个目的在于提供一种上述褐藻淀粉的制备方法，该制备方法能够与蛋白质形成酰胺键，在脱蛋白过程中抑制多糖与蛋白质形成氨基共价键，提高多糖的保留率。本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

提供一种褐藻淀粉的制备方法，包括以下步骤：

S1、超声波提取海带多糖；

S2、分级醇沉法进行纯化：向海带多糖溶液中加入90-95％的乙醇至浓度为28-32％，静置，过滤，取沉淀。海带中多糖物质丰富，目前发现的多糖有褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉三种。要得到单一的多糖组分，须对该混合物进行纯化，乙醇分级沉淀法是利用不同多糖在不同浓度的乙醇中具有不同溶解度，改变乙醇的浓度，分次沉淀。本发明提供的乙醇加量以及乙醇质量分数为最佳醇析条件，褐藻淀粉得率较高。

作为优选，步骤S1的提取方法为：按照固液比1:70-75(g/mL)的比例向蒸馏水中加入干海带粉，62-68℃下超声波处理55-65min。海带具有很强的溶胀性，固液比太高时溶胀不充分，提取率低，超过适当溶胀度的固液比时，溶胀过度亦导致提取率下降；超声波是通过机械剪切力来辅助提取的，超声时间太短，机械剪切作用不充分，提取率不高，超声时间太长，会使大分子多糖断链，亦使提取率降低；温度升高会使液体介质的表面张力和粘度降低，加快溶液的扩散，促使细胞内的多糖向外扩散，但温度过高时，多糖结构的局部会遭到破坏。

作为优选，步骤S1提取海带多糖之前进行脱脂处理。多糖是极性强的大分子化合物，对原料进行脱脂可以使水溶液更容易深入原料内部，有利于多糖的溶出。

作为优选，海带粉的目数为70-90目。海带目数越大，多糖的溶出率越高，但当目数过大时，容易板结，不利于多糖的溶出。

作为优选，褐藻淀粉纯化前采用Sevage法进行脱蛋白处理。海带中含有较多蛋白质，蛋白质和多糖都是亲水大分子，都具有结构复杂性，组成的多样性，使得多糖的分离纯化比较困难。利用Sevage法脱蛋白，条件温和，可避免多糖的降解，获得的多糖纯度、保留率和回收率均较好。

作为优选，Sevage法脱蛋白前用乙酰乙酸乙酯进行处理。在相同脱蛋白处理条件下，随着蛋白除去率的增加，蛋白质中的氨基处于非聚集的反应状态，能够提供反应基团与多糖分子中还原末端的羟基通过美拉德反应形成氨基共价键，蛋白质多糖形成网状复合结构，结构稳定，不易破坏，对蛋白质脱除时，使多糖保留率发生下降。脱蛋白前用乙酰乙酸乙酯对粗多糖进行处理，蛋白质上的氨基与乙酰乙酸乙酯反应，形成酰胺键，从而在后期脱蛋白的过程中抑制多糖与蛋白质形成氨基共价键，进一步提高了多糖的保留率。

本发明还提供一种褐藻淀粉在制备具有降血糖、提高免疫力作用的口服液中的用途。目前用于治疗三高的常用临床药物有药二甲双胍片、复方降压片、立普妥，虽然对有治疗三高有明显的效果但是也有一定的毒副作用，因此，研制出无毒副作用且治疗效果理想的新型药物对于人类来说至关重要。海带作为天然绿色植物具有无毒无害的天然优势，同时，口服液是汤剂、糖浆剂和注射剂三种剂型相结合的一种新型制剂；它具有服用剂量小、吸收较快、质量稳定、携带和服用方便、易保存等优点。

作为优选，口服液的风味配方为：褐藻淀粉溶液中加入0.13-0.17wt％的β-环糊精、13-17wt％的木糖醇、0.13-0.17wt％的柠檬酸及适量的香精。本发明提供的风味调制技术，从味觉、嗅觉、视觉等方面调整产品的颜色、香味、使产品酸甜适口，口感纯正。

本发明的有益效果为：

1)本发明通过对褐藻淀粉进行修饰，增加胰岛素敏感性，增加组织对葡萄糖的利用，提高降低血糖能力，并在糖链局部形成螺旋结构呈有活性的高级构象，增大有序性，提高药理活性；

2)本发明通过对多糖进行脱蛋白处理，提高了多糖的纯度，并通过在脱蛋白前进行预处理，在脱蛋白的过程中抑制多糖与蛋白质形成氨基共价键，提高多糖的保留率；

3)本发明通过对海带脱脂处理，对超声波处理条件、醇沉条件进行优化，提高了多糖的提取率和褐藻淀粉的得率。

附图说明

图1为本发明的褐藻淀粉对PTP1B的抑制率的示意图；

图2为本发明的褐藻淀粉给药后2型糖尿病小鼠血清中FBG水平的示意图；

图3为本发明的褐藻淀粉给药后小鼠的半数溶血值的示意图；

图4为本发明的多糖保留率、蛋白质除去率的示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

一种褐藻淀粉的制备方法：

取海带干粉，加入5倍体积的95％的乙醇，超声波脱脂25min，真空条件下进行抽滤，收集滤渣，重复3次，烘干滤渣，粉粹过70-90目筛。

称取70-90目海带干粉，按照固液比1:70-75(g/mL)的比例向蒸馏水中加入干海带粉，62-68℃下超声波处理55-65min，加入乙酰乙酸乙酯进行处理，后加入1/3体积的sevage试剂，磁力搅拌器搅拌30min后，1000rpm离心15min，收集上清，重复5次，用截流量为3500膜透析，减压浓缩至1/5体积，加入90-95％的乙醇至浓度为28-32％，静置，过滤，取沉淀，减压浓缩冻干，得褐藻淀粉。

取褐藻淀粉溶于2％的抗坏血酸磷酸酯钠溶液中，75℃水浴条件下搅拌30min，冷却至室温后加入冰水，加入三倍体积的95％的乙醇，静置，析出沉淀，离心收集沉淀后溶于水中，流水透析2d，蒸馏水透析2d，将透析袋内液体减压浓缩冻干，得到修饰后的褐藻淀粉。褐藻淀粉，是一种普遍存在于褐藻体内的一种多糖。它的主要组成是由C₁和C₃结合的β-D吡喃葡萄糖多聚化合物，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)是胰岛素信号转导通路的负调节因子，用抗坏血酸磷酸酯钠对褐藻淀粉进行修饰后，磷酸酯能够与PTP1B的活性部位结合，准确捕获酶，从而对酶侧链上的羧基进行修饰，改变酶的空间构象，失去活性，从而增加胰岛素敏感性，增加组织对葡萄糖的利用，提高降低血糖的能力。三股螺旋构型是多糖最具活性的空间构象，并且修饰后，连接在侧链上，增加分支侧链数，分子结构发生变化，糖环构象发生扭曲或转变，容易形成非共价键，而这些阴离子基团间的排斥作用使糖链链段伸长，部分磷酸酯基又可能会和糖环上的羟基形成酯键，因此在糖链局部形成螺旋结构呈有活性的高级构象，且有序性增大，从而活性更高。

实施例2：

一种褐藻淀粉的制备方法：

取80g海带干粉，加入5倍体积的95％的乙醇，超声波脱脂25min，真空条件下进行抽滤，收集滤渣，重复3次，烘干滤渣，粉粹过80目筛。

称取80目海带干粉5g，加入蒸馏水312.5mL后，65℃下超声波超声处理60min，后加入1/3体积的sevage试剂，磁力搅拌器搅拌30min后，1000rpm离心15min，收集上清，重复5次，用截流量为3500膜透析，减压浓缩至1/5体积，加入95％的乙醇至浓度为30％，取沉淀，减压浓缩冻干，即为褐藻淀粉。

实施例3：

一种褐藻淀粉的制备方法：

取实施例2制得的2g褐藻淀粉溶于100mL质量分数为2％的抗坏血酸磷酸酯钠溶液中，75℃水浴条件下搅拌30min，冷却至室温后加入30mL冰水，加入三倍体积的95％的乙醇，静置，析出沉淀，离心收集沉淀后溶于水中，流水透析2d，蒸馏水透析2d，将透析袋内液体减压浓缩冻干，得到修饰后的褐藻淀粉。

实施例4：

一种褐藻淀粉的制备方法：

脱蛋白前加入6mL 3mmol/L的乙酰乙酸乙酯处理40min，其余部分和实施例2完全一致。

实施例5：

一种具有降血糖、提高免疫力作用的口服液的制备方法，包括：

溶解：取上述实施例得到的褐藻淀粉加水溶解，得到10mg/mL的褐藻淀粉溶液；

过滤：过滤掉溶液中的不溶性物质；

风味调配：在过滤后的溶液中中加入0.15wt％的β-环糊精、15wt％的木糖醇、0.15wt％的柠檬酸及适量的香精，搅拌均匀；

灭菌：采用高压蒸汽灭菌，121℃杀菌30min；

灌装：采用20mL棕色口服液玻璃瓶进行灌装，灌装前需对空瓶和瓶盖进行清洗消毒。

制得的口服液海带腥味胶轻，色泽呈深褐色或棕褐色，味道酸甜适度，口感细腻，没有异味，外观澄清透明，无肉眼可见杂质，允许有少量浑浊或沉淀，感官评价98分。

试验例1：

对蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制活性的测定：

Stock buffer的配制：50mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，0.05％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，调节pH至7.2，4℃保存。

Buffer A的配制：100mmol/LHepes，1mmol/LEDTA，调节pH至7.0，4℃保存。

反应终止液：NaOH 10mol/L。

用stock buffer将PTP1B稀释至2μg/mL，用buffer A溶解底物PNPP至17.6mmol/L；在96孔板的每个孔中加入170μL底物溶液；在样本组和空白组中，每孔加入10μL样本，在对照组中，每孔加入10μL二甲基亚砜(DMSO)，37℃下温育10min；将96孔板置于冰上，在样本组和对照组中每孔加入20μL酶液，在空白组中加入20μL stock buffer，37℃下反应30min；加入20μL 10mol/LNaOH，终止反应。用酶标仪测定405nm处的吸光度，计算对PTP1B的抑制率。对PTP1B抑制率的计算公式如下：

PTP1B抑制率(％)＝(A-A_b)/A_c

其中，A、A_b、A_c分别为样本组、空白组、对照组的吸光度。对PTP1B的抑制率测定结果见图1。

降糖能力的测定：

取24-26g的雄性小鼠80只，普通饲料喂养1周，随机取20只作为对照组，饲养普通饲料。其余60只喂高脂饲料4周，建立高血脂血症小鼠模型，然后腹腔注射四氧嘧啶建立2型糖尿病小鼠模型。用生理盐水将四氧嘧啶配制成2.5g/L注射液，对高脂饲料喂养的小鼠腹腔注射四氧嘧啶，每1kg小鼠给药50mg，隔日1次，连续3次，对照组注射等量的生理盐水。最后一次注射后第3天，剪尾采血检测基础空腹血糖(FBG)水平，将大于对照组均数2个标准差的小鼠随机分为模型组和给药组，每组20只。用生理盐水将褐藻淀粉配制成浓度为150mg/mL混合液，给药组给予每日1.50g/kg褐藻淀粉灌胃，对照组和模型组给予每日1mL/50g生理盐水灌胃，普通饲料喂养2周。治疗结束后，各组动物禁食(自由饮水)12h，次日早晨剪尾检测FBG水平。血清中空腹血糖(FBG)水平的测定结果见图2。

由图1可以看出，随着褐藻淀粉浓度的升高对PTP1B的抑制率升高，前期增加较快，后期增加，实施例3中的褐藻淀粉对PTP1B的抑制率高于实施例2，这说明，用抗坏血酸磷酸酯钠对褐藻淀粉进行修饰后，对PTP1B的抑制率明显提高。

由图2可以看出，实施例3中的褐藻淀粉给药后小鼠的FBG水平下降幅度明显高于实施例2，即实施例3中的降血糖能力更高，这说明，用抗坏血酸磷酸酯钠对褐藻淀粉进行修饰后，提高了对PTP1B的抑制率，增加了胰岛素敏感性，增加组织对葡萄糖的利用，提高了降低血糖的能力。

试验例2：

提高免疫力能力的测定：

取体重18-22g的雄性小鼠30只，随机分为3组，用生理盐水将褐藻淀粉配制成浓度为5mg/mL混合液，给药组给予每日100mg/kg褐藻淀粉灌胃，对照组给予每日1mL/50g生理盐水灌胃，连续给药8d，每天1次，末次给药24h后小鼠称重，眼球取血，3000rpm离心10min，取血清待用。

将血清用生理盐水稀释500倍，取1mL稀释后的血清，加入0.5mL 10％压积绵羊红细胞(SRBC)混悬液，冰浴，加入1mL生理盐水稀释10倍的豚鼠血清，空白组不加血清，37℃水浴保温10min，后立即冰浴，终止反应。2000rpm离心10min，取1mL上清，3mL都氏试剂，混匀放置10min，取上清液，测定540nm处的吸光度。取0.25mL 10％SRBC混悬液，加入3.75mL都氏试剂，测定其在540nm处的吸光度，作为半数溶血值。血清溶血素含量以半数溶血值HC₅₀表示。半数溶血值HC₅₀的计算公式如下：

HC₅₀＝(样品OD值/SRBC半数溶血时的OD值)×稀释倍数

半数溶血值HC₅₀的测定结果见图3。

由图3可以看出，实施例3中的褐藻淀粉给药后小鼠的半数溶血值明显高于实施例2，这说明，用抗坏血酸磷酸酯钠对褐藻淀粉进行修饰后，在糖链局部形成螺旋结构呈有活性的高级构象，且有序性增大，从而药理活性更高，提高免疫力的能力更强。

试验例3：

取200mL超声浸提液，加入4倍体积的质量分数为95％的乙醇，静置过夜，2000rpm离心15min，收集沉淀，冷冻干燥后得到海带粗多糖，计算其多糖含量及蛋白含量。脱蛋白后将透析液减压浓缩并冻干得到脱蛋白多糖，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，采用双缩脲法测定蛋白质含量，计算多糖保留率、蛋白质除去率。计算公式如下：

蛋白质除去率(％)＝(A₀-A₁)/A₀×100％

其中，A₀，A₁分别为脱蛋白前后样品中蛋白含量；

多糖保留率(％)＝B₁/B₀×100％

其中，B₀，B₁分别为脱蛋白前后样品中多糖含量。多糖保留率、蛋白质除去率的测定结果见图4。

由图4可以看出，在保证蛋白质除去率的同时，实施例4的多糖保留率明显高于实施例2，这说明，脱蛋白前用乙酰乙酸乙酯进行处理，在后期脱蛋白的过程中抑制多糖与蛋白质形成氨基共价键，进一步提高了多糖的保留率。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (8)

1.一种褐藻多糖的衍生物，其特征在于：所述褐藻多糖的衍生物由褐藻多糖用抗坏血酸磷酸酯钠进行化学修饰所得；

所述褐藻多糖的制备方法，包括以下步骤：

S1、超声波提取得海带多糖；

S2、分级醇沉法进行纯化：向海带多糖溶液中加入90-95％的乙醇至浓度为28-32％，静置，过滤，取沉淀。

2.根据权利要求1所述的一种褐藻多糖的衍生物，其特征在于：所述褐藻多糖具有降血糖和提高免疫力的作用。

3.权利要求1或2所述的褐藻多糖的衍生物的制备方法，其特征在于：所述褐藻多糖的制备方法，包括以下步骤：

S1、超声波提取得海带多糖；

S2、分级醇沉法进行纯化：向海带多糖溶液中加入90-95％的乙醇至浓度为28-32％，静置，过滤，取沉淀；

所述褐藻多糖纯化前采用Sevage法进行脱蛋白处理；

所述Sevage法脱蛋白前用乙酰乙酸乙酯进行处理；

所述褐藻多糖的衍生物的制备方法包括：取所述褐藻多糖溶于2％的抗坏血酸磷酸酯钠溶液中，75℃水浴条件下搅拌30min，冷却至室温后加入冰水，加入三倍体积的95％的乙醇，静置，析出沉淀，离心收集沉淀后溶于水中，流水透析2d，蒸馏水透析2d，将透析袋内液体减压浓缩冻干，得到褐藻多糖的衍生物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S1的提取方法为：按照1:70-75(g/mL)的比例向蒸馏水中加入干海带粉，62-68℃下超声波处理55-65min。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S1提取海带多糖之前进行脱脂处理。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述海带粉的目数为70-90目。

7.权利要求1或2所述的褐藻多糖的衍生物在制备具有降血糖、提高免疫力作用的口服液中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述口服液的风味配方为：褐藻多糖溶液中加入0.13-0.17wt％的β-环糊精、13-17wt％的木糖醇、0.13-0.17wt％的柠檬酸及适量的香精。

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