CN110339392A - 一种生物活性的慢性创面辅料的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物活性的慢性创面辅料的制备方法及应用,该方法首先制备出ε‑多聚赖氨酸或聚乙烯亚氨功能化聚醚F127高分子;随后通过高碘酸钠氧化海藻酸钠或普鲁兰多糖得到具有醛基的多糖;接着通过阳离子功能化F127高分子与醛基化聚多糖之间的席夫碱反应形成一种具有三维网络结构的水凝胶;最后外泌体通过与阳离子聚合物之间的静电作用负载到水凝胶中,制备出一种生物活性抗菌抗光损伤的慢性创面辅料。该方法制得的生物活性抗菌抗光损伤的创面辅料具有优异的温敏、可注射和自愈合等力学性能,良好的抗菌、抗光损伤以及促进创面愈合的作用,因此该水凝胶在抗菌、抗光损伤和促进慢性创面愈合中有着很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于可降解生物医用材料技术领域,具体涉及一种生物活性的慢性创面辅料的制备方法及应用。
背景技术
糖尿病的高发病率已成为威胁患者健康和生活质量的严重问题。高血糖引起的微血管功能障碍作为糖尿病并发症的主要原因之一,经常导致患者的伤口缺血和愈合迟缓。伤口愈合一般需要经历了四个的阶段,即凝血期、炎症期、细胞增生期和新生组织重塑期,同时也需要血管提供的营养和氧气。因此,加强糖尿病伤口的血管生成和再血管化对加速慢性伤口愈合至关重要。糖尿病伤口的传统临床治疗方法是控制血糖,手术清创,移植和伤口敷料,其中移植物的早期再血管化决定了手术后伤口愈合的成功。目前使用的生长因子治疗例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等会促进糖尿病伤口血管形成,但也存在着生长因子的递送,剂量和价格等问题。因此,通过新的策略来促进伤口组织中的血管生成和新血管形成从而治疗糖尿病伤口已成为一种迫切的需求。
近年来,外泌体作为一种重要的生物活性分子,在伤口愈合中的应用备受关注。间充质干细胞(MSCs)衍生的外泌体是纳米级的细胞外囊泡,具有与MSCs相似的有益功能。但与MSCs相比,外泌体显示出独有的优势,例如引起免疫反应的几率低,稳定性高,易于储存。此外相关研究表明外泌体具有作为伤口愈合治疗药物的潜力。例如,来自人类脂肪间充质干细胞(HASCs)的外泌体通过优化成纤维细胞的功能加速皮肤伤口愈合;另有研究证实了人脐带血浆(UCB-Exos)通过促进血管生成对伤口愈合的有益作用。但是在体内清除速度过快和相对短的半衰期,使得外泌体在治疗伤口愈合中仍然面临挑战。此外,由于伤口愈合需要较长的时间,导致它们在体内的功能可能受到损害,以及不能维持游离外泌体的活性。因此,开发能够负载并持续释放外泌体的生物活性支架对于伤口愈合的治疗是至关重要的。
生物医学水凝胶敷料已被广泛研究可作为有效递送药物或细胞的支架,从而达到治疗伤口愈合和重建皮肤组织的功能。水凝胶具有独特的三维网络,高的药物或细胞的包埋率以及局部持续药物或细胞的优点。然而,大多数传统的水凝胶常常缺乏动态特性,例如自愈合和可注射等性能。另一方面,目前大多数水凝胶不具有多功能特性,使它们无法成为在伤口愈合和皮肤重建中可以包封药物或细胞的理想支架。伤口愈合中理想的水凝胶敷料应具有多功能特性,包括一定的机械性能和孔结构,抗菌,抗光损伤,止血能力,组织粘附,可注射和自愈合,可控的生物降解,持续生物活性分子释放和优良的生物相容性等。例如,水凝胶的可注射性和粘附能力保证其具有良好的可操作性,并且在愈合过程中不会从伤口脱落;自愈合能力可以赋予敷料损伤后的快速自我恢复能力,并在伤口愈合过程中保持稳定结构;抗菌活性使得水凝胶辅料具有抗感染的能力;止血能力保证水凝胶辅料在组织损伤后,可迅速控制血液渗出;水凝胶敷料的抗光损伤性能可以保护细胞免受伤口愈合过程中紫外线辐射的伤害。此外,水凝胶辅料持续释放生物活性因子可以有效地促进糖尿病创面的早期血管生成,加速愈合。但是,上述糖尿病创面愈合的多功能水凝胶敷料尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物活性的慢性创面辅料的制备方法及应用,该方法工艺简单,制得的水凝胶辅料具有优异的温敏、可注射和自愈合等力学性能、良好的抗菌性能、抗光损伤、止血以及促进慢性创面愈合的作用。
为达到上述目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
一种生物活性的慢性创面辅料的制备方法,包括以下步骤:
聚醚F127和ε-多聚赖氨酸或聚乙烯亚氨合成阳离子功能化聚醚高分子;
通过高碘酸钠氧化海藻酸钠或普鲁兰多糖得到醛基化聚多糖高分子;
通过阳离子功能化聚醚高分子与醛基化聚多糖高分子之间的席夫碱反应形成具有三维网络结构的水凝胶;
将外泌体通过静电作用负载到水凝胶中,制备出具有生物活性的慢性创面辅料。
作为本发明的进一步改进,阳离子功能化聚醚高分子合成具体包括以下步骤:
将聚醚F127、对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于无水二氯甲烷中,氮气条件下反应,通过萃取,沉淀得到预聚物;随后将预聚物和阳离子聚合物完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中,搅拌反应后反应产物透析纯化得到阳离子功能化聚醚高分子;阳离子聚合物为ε-多聚赖氨酸或聚乙烯亚氨。
作为本发明的进一步改进,聚醚F127、对甲苯磺酰氯和三乙胺的摩尔比为1:(8~12):(8~12),预聚物和阳离子聚合物的摩尔比1:(1.5~4.5)。
作为本发明的进一步改进,醛基化聚多糖高分子的合成具体包括以下步骤:
将多糖和高碘酸钠完全溶解于去离子水中,搅拌反应,再加入乙二醇终止反应,反应产物在去离子水中透析纯化得到醛基化聚多糖高分子。
作为本发明的进一步改进,多糖和高碘酸钠的摩尔比为1:(0.5~2),乙二醇与高碘酸钠摩尔比2:(0.5~1.5)。
作为本发明的进一步改进,水凝胶制备具体包括以下步骤:
阳离子功能化聚醚高分子与醛基化聚多糖高分子溶解在PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在水浴中温育形成水凝胶。
作为本发明的进一步改进,水凝胶中,阳离子功能化F127与醛基化聚多糖高分子的质量比为:(1:0.19)~(1:0.38)。
作为本发明的进一步改进,将水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在水浴中温育形成带有外泌体的水凝胶。
作为本发明的进一步改进,水凝胶与外泌体按照体积质量比为100μl:(1~10)μg比例混匀。
上述的制备方法制得的生物活性的慢性创面辅料在抗菌、抗光损伤和促进慢性创面愈合中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明针对现有创面敷料所存在的易感染、易受光损伤等缺点,提供了一种生物活性抗菌抗光损伤的慢性创面辅料的制备方法,该方法首先制备出ε-多聚赖氨酸或聚乙烯亚氨功能化聚醚F127高分子;随后通过高碘酸钠氧化海藻酸钠或普鲁兰多糖得到具有醛基的多糖;接着通过阳离子功能化F127高分子与醛基化聚多糖之间的席夫碱反应形成一种具有三维网络结构的水凝胶;最后外泌体通过与阳离子聚合物之间的静电作用负载到水凝胶中,制备出一种生物活性抗菌抗光损伤的慢性创面辅料。本发明的制备方法简单,所使用的化学合成方法环保、操作方便、原料成本低且无有机溶剂残留。试验结果表明:该方法制得的生物活性抗菌抗光损伤的慢性创面辅料具有优异的温敏、可注射和自愈合等力学性能,良好的抗菌性能以及促进创面愈合的作用。
本发明还具有以下优点:
(1)本发明所使用的ε-多聚赖氨酸和聚乙烯亚氨是一种可降解高分子聚合物,具有很好的抗菌性能且廉价易得;
(2)本发明所使用的海藻酸钠和普鲁兰多糖是可降解多糖,具有很多优异的特性、生物相容性好且廉价易得,在生物医学领域得到广泛的应用;
(3)本发明中通过高碘酸钠对海藻酸钠或普鲁兰多糖进行氧化,使其成为带有醛基的多糖,能够有效的通过席夫碱反应与带氨基的阳离子聚合物发生反应形成一种具有三维网络结构的水凝胶;
(4)本发明中制备的是一种通过静电作用将外泌体负载在阳离子聚合物上,并利用三维网络结构的水凝胶将其包裹在内的水凝胶辅料。
(6)本发明中制备的生物活性抗菌抗光损伤的水凝胶辅料具有优异的温敏、可注射和自愈合等力学性能、良好的抗菌性能、抗光损伤、止血以及促进慢性创面愈合的作用。
本发明的制备方法简单,所使用的化学合成方法环保、操作方便、原料成本低且无有机溶剂残留。该方法制得的生物活性抗菌抗光损伤的创面辅料具有优异的温敏、可注射和自愈合等力学性能,良好的抗菌、抗光损伤以及促进创面愈合的作用,因此该水凝胶在抗菌、抗光损伤和促进慢性创面愈合中有着很好的应用前景。
附图说明
图1是本发明一种生物活性的慢性创面辅料的制备方法流程图。
图2是本发明制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶(FEP)及其单体、前聚体的傅里叶红外光谱图谱。
图3是本发明制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶(FEP)的流变性能。
图4是本发明制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶(FEP)的可注射性和自愈合性质。
图5是本发明制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶(FEP)的抗菌性能。
图6是本发明制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶(FEP)的抗光损伤性能。
图7是本发明制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶辅料(FEP@exo)对皮肤创面修复愈合的作用。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步详细描述:
本发明致力于制备一种生物活性抗菌抗光损伤的创面辅料,并能够有效防止细菌感染和光损伤以及促进慢性创面愈合。F127是一种由聚氧乙烯PEO和聚丙乙烯PPO形成的三嵌段聚合物(PEO-PPO-PEO),其制备的水凝胶具有温敏特性;ε-多聚赖氨酸和聚乙烯亚氨阳离子聚合物具有很好的抗菌性能;海藻酸钠和普鲁兰多糖具有很好的生物相容性,在生物医学领域具有广泛的应用前景;外泌体是一种具有RNA和蛋白质的囊泡,参与细胞间通讯,在创面愈合中有了很好的应用。因此,在本发明中,首先制备出ε-多聚赖氨酸或聚乙烯亚氨功能化聚醚F127高分子;随后通过高碘酸钠氧化海藻酸钠或普鲁兰多糖得到具有醛基的多糖;接着通过阳离子功能化F127高分子与醛基化聚多糖之间的席夫碱反应形成一种具有三维网络结构的水凝胶;最后外泌体通过与阳离子聚合物之间的静电作用负载到水凝胶中,制备出一种生物活性抗菌抗光损伤的慢性创面辅料。
如图1所示,本发明的制备方法具体包括以下步骤:
1)阳离子功能化聚醚高分子合成。将摩尔比为1:(8~12):(8~12)的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100~150mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应18~24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:(1.5~4.5)的预聚物和阳离子聚合物完全溶解于100~150mL N,N-二甲基甲酰胺中,60~65℃条件下搅拌48~60小时后,反应产物在去离子水中透析纯化2~3天,冷冻干燥留做后用;
优选地,步骤1)中的阳离子功能化聚醚F127为ε-多聚赖氨酸或聚乙烯亚氨功能化聚醚F127,其中阳离子聚合物与F127的摩尔比为:2.5:1。
2)醛基化聚多糖高分子的合成。将摩尔比为1:(0.5~2)的多糖和高碘酸钠完全溶解于120~150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12~18小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:(0.5~1.5)的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2~4小时后,反应产物在去离子水中透析纯化2~3天,冷冻干燥留做后用;
优选地,步骤2)中的醛基化多糖为海藻酸钠或普鲁兰多糖。
3)水凝胶制备。将质量体积比13.3%F127修饰的阳离子聚合物与2.5%,3.4%和5.0%不同质量体积比的醛基化多糖溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在30~37℃水浴中温育30~40分钟形成水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
优选地,步骤3)中水凝胶配方组成为:阳离子功能化F127、醛基化聚多糖高分子,其质量比为:1:0.19~1:0.38。
4)生物活性水凝胶制备。将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在30~37℃水浴中温育30~40分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种生物活性抗菌抗光损伤的慢性创面辅料。
优选地,步骤4)中制备的生物活性水凝胶创面辅料配方组成为:阳离子功能化F127、醛基化聚多糖高分子、脂肪干细胞来源的外泌体,其中外泌体占水凝胶总体积的浓度范围是1%~10%。
其中,原料的结构式为:
本申请制备了一种热敏、可注射、自愈合和粘性多糖基水凝胶辅料,其表现出有效的抗菌,抗光损伤,快速止血能力和pH响应性外泌体释放,用于促进糖尿病伤口愈合。通过阳离子聚合物功能化聚醚F127和醛基化聚多糖之间的可逆席夫碱反应制备出水凝胶。F127和多糖分别赋予支架的热响应能力和良好的生物相容性。阳离子聚合物中大量氨基和醛基化聚多糖中的醛基通过氢键和希夫碱反应能与组织反应,从而表现出良好的组织粘附能力。可逆的席夫碱键可以提供水凝胶一定的自愈合和可注射能力。此外,脂肪间充质干细胞(AMSCs)衍生的外泌体可以通过静电作用和阳离子聚合物结合并负载在水凝胶中,且具有一定的pH响应性释放。因此,这种具有生物活性,抗菌和抗光损伤等多功能的创面辅料在血管生成和慢性伤口愈合方面的具有很好的应用前景。
为了更好的理解本发明,下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
1)F127-PEI聚合物的制备:将摩尔比为1:10:10的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:2.5的预聚物和聚乙烯亚胺完全溶解于100mL N,N-二甲基甲酰胺中,60℃条件下搅拌48小时后,反应产物F127-PEI在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
2)APu聚合物的制备:将摩尔比为1:1的普鲁兰多糖和高碘酸钠完全溶解于150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物APu在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
3)FEP-1水凝胶的制备:将质量体积比13.3%的F127-PEI与2.5%的APu溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟形成水凝胶(FEP-1),得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶创面辅料。
实施例2
1)F127-PEI聚合物的制备:将摩尔比为1:10:10的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:2.5的预聚物和聚乙烯亚胺完全溶解于100mL N,N-二甲基甲酰胺中,60℃条件下搅拌48小时后,反应产物F127-PEI在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
2)APu聚合物的制备:将摩尔比为1:1的普鲁兰多糖和高碘酸钠完全溶解于150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物APu在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
3)FEP-2水凝胶的制备:将质量体积比13.3%的F127-PEI与3.4%的APu溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟形成水凝胶(FEP-2),得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶创面辅料。
实施例3
1)F127-PEI聚合物的制备:将摩尔比为1:10:10的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:2.5的预聚物和聚乙烯亚胺完全溶解于100mL N,N-二甲基甲酰胺中,60℃条件下搅拌48小时后,反应产物F127-PEI在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
2)APu聚合物的制备:将摩尔比为1:1的普鲁兰多糖和高碘酸钠完全溶解于150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物APu在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
3)FEP-3水凝胶的制备:将质量体积比13.3%的F127-PEI与5.0%的APu溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟形成水凝胶(FEP-3),得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶创面辅料。
实施例4
1)F127-PEI聚合物的制备:将摩尔比为1:10:10的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:2.5的预聚物和聚乙烯亚胺完全溶解于100mL N,N-二甲基甲酰胺中,60℃条件下搅拌48小时后,反应产物F127-PEI在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
2)ASA聚合物的制备:将摩尔比为1:1的海藻酸钠和高碘酸钠完全溶解于150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物ASA在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
3)FES-1水凝胶的制备:将质量体积比13.3%的F127-PEI与2.5%的ASA溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟形成水凝胶(FES-1),得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶创面辅料。
实施例5
1)F127-PEI聚合物的制备:将摩尔比为1:10:10的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:2.5的预聚物和聚乙烯亚胺完全溶解于100mL N,N-二甲基甲酰胺中,60℃条件下搅拌48小时后,反应产物F127-PEI在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
2)ASA聚合物的制备:将摩尔比为1:1的海藻酸钠和高碘酸钠完全溶解于150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物ASA在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
3)FES-2水凝胶的制备:将质量体积比13.3%的F127-PEI与3.4%的ASA溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟形成水凝胶(FES-2),得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶创面辅料。
实施例6
1)F127-PEI聚合物的制备:将摩尔比为1:10:10的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:2.5的预聚物和聚乙烯亚胺完全溶解于100mL N,N-二甲基甲酰胺中,60℃条件下搅拌48小时后,反应产物F127-PEI在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
2)ASA聚合物的制备:将摩尔比为1:1的海藻酸钠和高碘酸钠完全溶解于150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物ASA在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
3)FES-3水凝胶的制备:将质量体积比13.3%的F127-PEI与5.0%的ASA溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟形成水凝胶(FES-3),得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶创面辅料。
实施例7
1)F127-EPL聚合物的制备:将摩尔比为1:10:10的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:2.5的预聚物和ε-多聚赖氨酸完全溶解于100mL N,N-二甲基甲酰胺中,60℃条件下搅拌48小时后,反应产物F127-EPL在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
2)APu聚合物的制备:将摩尔比为1:1的普鲁兰多糖和高碘酸钠完全溶解于150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物APu在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
3)FPP-1水凝胶的制备:将质量体积比13.3%的F127-EPL与2.5%的APu溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟形成水凝胶(FPP-1),得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶创面辅料。
实施例8
1)F127-EPL聚合物的制备:将摩尔比为1:10:10的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:2.5的预聚物和ε-多聚赖氨酸完全溶解于100mL N,N-二甲基甲酰胺中,60℃条件下搅拌48小时后,反应产物F127-EPL在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
2)APu聚合物的制备:将摩尔比为1:1的普鲁兰多糖和高碘酸钠完全溶解于150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物APu在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
3)FPP-2水凝胶的制备:将质量体积比13.3%的F127-EPL与3.4%的APu溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟形成水凝胶(FPP-2),得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶创面辅料。
实施例9
1)F127-EPL聚合物的制备:将摩尔比为1:10:10的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:2.5的预聚物和ε-多聚赖氨酸完全溶解于100mL N,N-二甲基甲酰胺中,60℃条件下搅拌48小时后,反应产物F127-EPL在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
2)APu聚合物的制备:将摩尔比为1:1的普鲁兰多糖和高碘酸钠完全溶解于150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物APu在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
3)FPP-3水凝胶的制备:将质量体积比13.3%的F127-EPL与5.0%的APu溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟形成水凝胶(FPP-3),得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶创面辅料。
实施例10
1)F127-EPL聚合物的制备:将摩尔比为1:10:10的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:2.5的预聚物和ε-多聚赖氨酸完全溶解于100mL N,N-二甲基甲酰胺中,60℃条件下搅拌48小时后,反应产物F127-EPL在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
2)ASA聚合物的制备:将摩尔比为1:1的海藻酸钠和高碘酸钠完全溶解于150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物ASA在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
3)FPS-1水凝胶的制备:将质量体积比13.3%的F127-EPL与2.5%的ASA溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟形成水凝胶(FPS-1),得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶创面辅料。
实施例11
1)F127-EPL聚合物的制备:将摩尔比为1:10:10的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:2.5的预聚物和ε-多聚赖氨酸完全溶解于100mL N,N-二甲基甲酰胺中,60℃条件下搅拌48小时后,反应产物F127-EPL在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
2)ASA聚合物的制备:将摩尔比为1:1的海藻酸钠和高碘酸钠完全溶解于150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物ASA在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
3)FPS-2水凝胶的制备:将质量体积比13.3%的F127-EPL与3.4%的ASA溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟形成水凝胶(FPS-2),得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶创面辅料。
实施例12
1)F127-EPL聚合物的制备:将摩尔比为1:10:10的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于100mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应24小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:2.5的预聚物和ε-多聚赖氨酸完全溶解于100mL N,N-二甲基甲酰胺中,60℃条件下搅拌48小时后,反应产物F127-EPL在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
2)ASA聚合物的制备:将摩尔比为1:1的海藻酸钠和高碘酸钠完全溶解于150mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌12小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物ASA在去离子水中透析纯化3天,冷冻干燥留做后用;
3)FPS-3水凝胶的制备:将质量体积比13.3%的F127-EPL与5.0%的ASA溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟形成水凝胶(FPS-3),得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)将体积质量比(μl/μg)为100:1的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在37℃水浴中温育30分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶慢性创面辅料。
实施例13
1)阳离子功能化聚醚高分子合成。将摩尔比为1:8:12的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于120mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应18小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:1.5的预聚物和阳离子聚合物完全溶解于120mL N,N-二甲基甲酰胺中,63℃条件下搅拌50小时后,反应产物在去离子水中透析纯化2天,冷冻干燥留做后用;
2)醛基化聚多糖高分子的合成。将摩尔比为1:0.5的多糖和高碘酸钠完全溶解于120mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌15小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:0.5的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌2小时后,反应产物在去离子水中透析纯化2天,冷冻干燥留做后用;
3)水凝胶制备。将质量体积比13.3%F127修饰的阳离子聚合物与1%质量体积比的醛基化多糖溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在30℃水浴中温育35分钟形成水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)生物活性水凝胶制备。将体积质量比(μl/μg)为100:5的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在30℃水浴中温育35分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种生物活性抗菌抗光损伤的慢性创面辅料。
实施例14
1)阳离子功能化聚醚高分子合成。将摩尔比为1:12:8的聚醚F127,对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于150mL无水二氯甲烷中,氮气条件下,室温反应20小时后,通过萃取,沉淀得到预聚物,随后将摩尔比1:4.5的预聚物和阳离子聚合物完全溶解于150mL N,N-二甲基甲酰胺中,65℃条件下搅拌60小时后,反应产物在去离子水中透析纯化2.5天,冷冻干燥留做后用;
2)醛基化聚多糖高分子的合成。将摩尔比为1:2的多糖和高碘酸钠完全溶解于130mL去离子水中,室温,避光条件下搅拌16小时后;加入与高碘酸钠摩尔比2:1.5)的乙二醇终止反应,室温条件下搅拌4小时后,反应产物在去离子水中透析纯化2.5天,冷冻干燥留做后用;
3)水凝胶制备。将质量体积比13.3%F127修饰的阳离子聚合物与10.0%不同质量体积比的醛基化多糖溶解在10mM,pH 7.4的PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在35℃水浴中温育40分钟形成水凝胶,得到一种抗菌抗光损伤的水凝胶。
4)生物活性水凝胶制备。将体积质量比(μl/μg)为100:10的上述制备的水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在35℃水浴中温育40分钟,形成带有外泌体的水凝胶,得到一种生物活性抗菌抗光损伤的慢性创面辅料。
本发明制得的生物活性抗菌抗光损伤的慢性创面辅料具有优异的温敏、可注射和自愈合等力学性能、良好的抗菌性能、抗光损伤、止血以及促进慢性创面愈合的作用,下面结合实验数据详细分析。
图2是本发明制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶(FEP)及其单体、前聚体的傅里叶红外光谱图谱。与普鲁兰多糖(Pu)相比,醛基化普鲁兰多糖(APu)中1735cm-1处吸收峰的出现表明普鲁兰多糖中醛基(-CHO)的形成,为进一步的化学反应提供可能;1562cm-1处的吸收峰来源于聚乙烯亚胺的氨基(-NH-);1100cm-1处的吸收峰归属于F127的醚键(-C-O-C-);此外,FEP水凝胶中1735cm-1处吸收峰的消失表明F127-PEI和APu之间的成功了发生了席夫碱反应。
图3是本发明制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶(FEP)的流变性能。从图3A中可以看出,随着温度逐渐从4℃上升到38℃,水凝胶的储存模量(G')逐渐高于损耗模量(G”),即水凝胶逐渐从溶液状态转变为凝胶状态,说明该水凝胶具有一定的温度敏感效应,并且图3B中也可以看出水凝胶在经过三次高低剪切力之后,G'和G”均表现出良好的稳定性,说明水凝胶具有良好的自愈合能力。
图4是本发明制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶(FEP)的可注射性和自愈合性质。从图4A中可以看出,FEP水凝胶能够顺利的从内径0.9mm,直径38mm的注射器针头中挤出并不会堵塞,表明其具有良好的可注射性;从图4B中可以看出,被切割成两份的水凝胶经过一段时间后可以完全愈合成一块水凝胶,说明其具有很好的自愈合能力。
图5是本发明制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶(FEP)的抗菌性能。采用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和耐药的金黄色葡萄球菌评估水凝胶的表面抗菌活性,结果表明,水凝胶组的三种细菌已被杀死99%以上,表明了该水凝胶具有良好的抗菌能力,且对耐药菌也有一定的杀伤能力。
图6是本发明制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶(FEP)的抗光损伤性能。从结果中可以看出,在经过紫外照射30分钟后,FEP水凝胶覆盖处的皮肤具有很好的完整性,而裸露和F127覆盖处的皮肤表现出严重的胶原纤维的缺损,说明该水凝胶具有很好的抗光损伤的能力。
图7是本发明制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶辅料(FEP@exo)对皮肤创面修复愈合的作用。从伤口愈合的结果中可以看出,在整个愈合过程中,FEP@exo组的愈合率比其他组快;在第21天时,FEP@exo组的皮肤已经基本愈合完全;此外,与纯外泌体对比,FEP@exo组的愈合效果明显提高,表明了FEP水凝胶能够通过外泌体的持续释放从而达到更好的创面愈合作用。
本发明中所制备的生物活性抗菌抗光损伤的创面水凝胶辅料,制备过程简单,制得的水凝胶辅料具有优异的温敏、可注射和自愈合等力学性能、良好的抗菌性能、抗光损伤、止血以及促进慢性创面愈合的作用。因此该水凝胶在抗菌、抗光损伤和促进慢性创面愈合中有着很好的应用前景。
以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生物活性的慢性创面辅料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
聚醚F127和ε-多聚赖氨酸或聚乙烯亚氨合成阳离子功能化聚醚高分子;
通过高碘酸钠氧化海藻酸钠或普鲁兰多糖得到醛基化聚多糖高分子;
通过阳离子功能化聚醚高分子与醛基化聚多糖高分子之间的席夫碱反应形成具有三维网络结构的水凝胶;
将外泌体通过静电作用负载到水凝胶中,制备出具有生物活性的慢性创面辅料。
2.根据权利要求1所述的生物活性的慢性创面辅料的制备方法,其特征在于,阳离子功能化聚醚高分子合成具体包括以下步骤:
将聚醚F127、对甲苯磺酰氯和三乙胺完全溶解于无水二氯甲烷中,氮气条件下反应,通过萃取,沉淀得到预聚物;随后将预聚物和阳离子聚合物完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中,搅拌反应后反应产物透析纯化得到阳离子功能化聚醚高分子;阳离子聚合物为ε-多聚赖氨酸或聚乙烯亚氨。
3.根据权利要求2所述的生物活性的慢性创面辅料的制备方法,其特征在于,聚醚F127、对甲苯磺酰氯和三乙胺的摩尔比为1:(8~12):(8~12),预聚物和阳离子聚合物的摩尔比1:(1.5~4.5)。
4.根据权利要求1所述的生物活性的慢性创面辅料的制备方法,其特征在于,醛基化聚多糖高分子的合成具体包括以下步骤:
将多糖和高碘酸钠完全溶解于去离子水中,搅拌反应,再加入乙二醇终止反应,反应产物在去离子水中透析纯化得到醛基化聚多糖高分子。
5.根据权利要求4所述的生物活性的慢性创面辅料的制备方法,其特征在于,多糖和高碘酸钠的摩尔比为1:(0.5~2),乙二醇与高碘酸钠摩尔比2:(0.5~1.5)。
6.根据权利要求1所述的生物活性的慢性创面辅料的制备方法,其特征在于,水凝胶制备具体包括以下步骤:
阳离子功能化聚醚高分子与醛基化聚多糖高分子溶解在PBS缓冲液中,在冰浴中剧烈振荡使其充分混匀,在水浴中温育形成水凝胶。
7.根据权利要求1或6所述的生物活性的慢性创面辅料的制备方法,其特征在于,水凝胶中,阳离子功能化F127与醛基化聚多糖高分子的质量比为:(1:0.19)~(1:0.38)。
8.根据权利要求1所述的生物活性的慢性创面辅料的制备方法,其特征在于,将水凝胶与外泌体在冰浴中振荡使其充分混匀,在水浴中温育形成带有外泌体的水凝胶。
9.根据权利要求1或8所述的生物活性的慢性创面辅料的制备方法,其特征在于,水凝胶与外泌体按照体积质量比为100μl:(1~10)μg比例混匀。
10.权利要求1至9任一所述的制备方法制得的生物活性的慢性创面辅料在抗菌、抗光损伤和促进慢性创面愈合中的应用。
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