CN110327056B - 一种用于可视化血糖检测的智能水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于可视化血糖检测的智能水凝胶及其制备方法。该用于可视化血糖检测的智能水凝胶由光敏感性水凝胶、pH响应水凝胶和葡萄糖氧化酶混合后光固化制备而成，所述光敏性水凝胶和pH响应水凝胶体积比为0.5‑6:1。本发明的用于可视化血糖检测的智能水凝胶，实现葡萄糖溶液中或糖尿病患者体内葡萄糖水平的可视化检测。具体地，本发明的智能水凝胶将葡萄糖氧化酶整合到pH响应双重水凝胶体系中，当本发明的智能水凝胶放入葡萄糖溶液或植入到体内之后，在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖反应产生葡萄糖酸，使本发明的智能水凝胶置于不同酸性环境中。

Description

一种用于可视化血糖检测的智能水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于可视化血糖检测的智能水凝胶及其制备方法。
背景技术
糖尿病是当前最具有挑战性的健康问题之一，其典型临床病理特征是葡萄糖调节紊乱。糖尿病是一种由于体内胰岛素分泌不足或胰岛素生物作用受损，导致体内高血糖的代谢性疾病。其中，1型糖尿病是由于自身免疫性破坏胰腺细胞导致胰岛素分泌不足，2型糖尿病则是胰岛素抵抗和胰岛素分泌受损的组合。近年来糖尿病日益严重地危害世界公共健康安全。据统计，2017年，全球共有1型和2型糖尿病成年患者约有4.25亿。对于1型糖尿病患者和中晚期2型糖尿病患者，缺乏严格控制血糖水平的患者常会引发严重的并发症,如肢体截肢，失明，肾功能衰竭和致命性低血糖等病症。
血糖检测在糖尿病诊断和治疗中占有非常重要的地位。传统血糖检测常用手指采血、利用血糖仪进行检测。本发明中，我们发展了一种新颖的双重水凝胶体系，用于可视化血糖检测。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于可视化血糖检测的智能水凝胶，实现葡萄糖溶液中或糖尿病患者体内葡萄糖水平的可视化检测。
本发明的目的之二在于提供一种用于可视化血糖检测的智能水凝胶的制备方法，制备方法简单，便于操作，通经过光固化成型，形成pH响应的智能型双重水凝胶体系。
本发明实现目的之一所采用的方案是：一种用于可视化血糖检测的智能水凝胶，由光敏感性水凝胶、pH响应水凝胶和葡萄糖氧化酶混合后光固化制备而成，所述光敏性水凝胶和pH响应水凝胶体积比为0.5-6:1。
本发明的智能水凝胶将葡萄糖氧化酶整合到pH响应双重水凝胶体系中，当本发明的智能水凝胶放入葡萄糖溶液或植入到体内之后，在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖反应产生葡萄糖酸，使本发明的智能水凝胶置于不同酸性环境中。若将本发明的智能水凝胶置于正常浓度的葡萄糖溶液或正常血糖的体内，智能水凝胶周围酸性弱，其体积会膨胀且膨胀程度大；若将本发明的智能水凝胶置于高浓度的葡萄糖溶液中或糖尿病体内(血糖高)，智能水凝胶周围酸性强，其体积变化膨胀程度小，通过本发明智能水凝胶在环境中的体积变化，可以实现可视化的检测葡萄糖/血糖的浓度。
本发明采用原料中，一种是光敏感性水凝胶,具有光固化成型特性；另一种是pH响应功能水凝胶，具有pH响应性变形特性，将两种水凝胶混合并制备成双重水凝胶体系。
优选地，所述光敏感性水凝胶为甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶混合光引发剂制备而成，所述pH响应性水凝胶是由羧甲基纤维素和丙烯酸-2-羟乙基酯在过硫酸钾和聚乙二醇二丙烯酸酯的共同作用下制备而成的水凝胶。
本发明中使用的光敏感性水凝胶原料为甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)，也可以是其它的光敏感性水凝胶。GelMA由甲基丙烯酸酐(MA)与明胶(Gelatin)制备获得，是一种光敏性的生物水凝胶材料。该材料具有优异的生物相容性，且可由紫外光或可见光激发固化反应，形成具有一定强度的三维结构。其生物相容性远优于基质胶、纤维蛋白胶，而与胶原性能相近；同时成形性能远优于胶原。
本发明中使用的pH响应水凝胶缩写为CMC-pHEA，也可以是其它类型的pH响应性水凝胶。该pH响应性水凝胶是由羧甲基纤维素(CarboxyMethyl Cellulose)和丙烯酸-2-羟乙基酯(2-HydroxyEthyl Acrylate)在枝接剂过硫酸钾和交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的共同作用下制备而成，具有良好的生物相容性。
本发明中，首先制备了pH响应水凝胶CMC-pHEA，在其交联成型后，通过超声破碎仪对其进行超声破碎，然后将其加入到含有光引发剂的GelMA中，再在一定波长的光照的照射下，经过光固化成型，形成pH响应的智能型双重水凝胶体系。
优选地，所述光引发剂为I2959紫外光引发剂或LAP蓝光引发剂，所述光引发剂的质量百分数为0.05％-0.1％。
当采用LAP蓝光引发剂时，在405nm光源下照射混合水凝胶溶液使其固化，当采用I2959紫外光引发剂时，在360nm光源下照射混合水凝胶溶液使其固化。
优选地，该用于可视化血糖检测的智能水凝胶中，葡萄糖氧化酶的浓度为0.02-0.05g/ml。
优选地，该用于可视化血糖检测的智能水凝胶中还包含染料，所述染料的浓度为0.001-0.075g/ml。
染料包括颜色染料和荧光染料，当采用体外可视化应用时，采用颜色染料染色，所述颜色染料一般采用的浓度为0.025-0.075g/ml，当采用体内可视化应用时，采用荧光染料染色(注意不能使用在酸性条件下易发生荧光淬灭的荧光染料，例如FTIC荧光染料在酸性条件下易发生荧光淬灭，本发明的使用环境中产生的葡萄糖酸使得FTIC发生荧光淬灭，不能用于本发明)，所述荧光染料一般采用的浓度为0.001-0.002g/ml。
本发明实现目的之二所采用的方案是：一种所述的用于可视化血糖检测的智能水凝胶的制备方法，包括以下步骤：A1、在28-45℃下，将甲基丙烯酸酐化明胶以质量百分比为8％-12％溶解在水中，得到甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶溶液；
A2、避光条件下，将光引发剂以质量百分比为0.05％-0.1％溶解于所述步骤A1的甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶溶液中并混合均匀，得到光敏感性水凝胶溶液；
A3、避光条件下，将pH响应性水凝胶按照与光敏感性水凝胶溶液的体积比为1:0.5-6加入到所述步骤A2得到的溶液中，混合均匀，得到双重体系水凝胶溶液；
A4、避光条件下，将一定质量的葡萄糖氧化酶加入到所述步骤A3的双重体系水凝胶溶液中，混合均匀；
A5、将步骤A4得到的混合溶液进行光固化，得到所述用于可视化血糖检测的智能水凝胶。
优选地，所述步骤A3中，pH响应性水凝胶的制备包括以下步骤：B1、在50-100℃和搅拌速度为300-500r/min下，将羧甲基纤维素溶于水中；
B2、惰性气体存在下，将引发剂加入所述步骤B1得到的溶液中混合并反应；
B3、向所述步骤B2的溶液中加入丙烯酸-2-羟乙基酯，继续反应至溶液成乳白色；
B4、向所述步骤B3的溶液总加入交联剂，继续反应至结束；
B5、将所述步骤B4得到的反应产物透析，去除未反应的反应物，得到所述pH响应水凝胶。
优选地，所述步骤B2中，引发剂为过硫酸钾，所述步骤B4中，交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯。
优选地，所述步骤B5中，透析取分子量大于3000的反应产物，所述pH响应水凝胶的含水量为20％-40％。
优选地，所述羧甲基纤维素、丙烯酸-2-羟乙基酯、引发剂和交联剂的摩尔比为：1：((5.48-8.62)×103)：(2.65-3.60)：(28.77-86.33)。
本发明的有益效果如下：本发明的用于可视化血糖检测的智能水凝胶，实现葡萄糖溶液中或糖尿病患者体内葡萄糖水平的可视化检测。具体地，本发明的智能水凝胶将葡萄糖氧化酶整合到pH响应双重水凝胶体系中，当本发明的智能水凝胶放入葡萄糖溶液或植入到体内之后，在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖反应产生葡萄糖酸，使本发明的智能水凝胶置于不同酸性环境中。若将本发明的智能水凝胶置于正常浓度的葡萄糖溶液或正常血糖的体内，智能水凝胶周围酸性弱，其体积会膨胀且膨胀程度大；若将本发明的智能水凝胶置于高浓度的葡萄糖溶液中或糖尿病体内(血糖高)，智能水凝胶周围酸性强，其体积变化膨胀程度小，通过本发明智能水凝胶在环境中的体积变化，可以实现可视化的检测葡萄糖/血糖的浓度。
本发明的制备方法，制备步骤简单，工艺条件易达到，通过将光敏感性水凝胶和pH响应性水凝胶按照一定体积混合后，利用光固化成型，制备出本发明的智能水凝胶，为双重水凝胶体系。
附图说明
图1a为本发明实施例1的葡萄糖与氧气在葡萄糖氧化酶的催化作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢的反应过程示意图；图1b为本发明实施例1的不同浓度的葡萄糖溶液在葡萄糖氧化酶的作用下的酸性变化情况；
图2为本发明实施例1的GelMA:CMC-pHEA水凝胶以不同比例混合，混合后进行光固化的速度对比效果图；
图3a为本发明实施例3的3D打印的花朵形状的模板；图3b为本发明实施例3的在模板中固化形成花朵形状的双重水凝胶的效果图；图3c为本发明实施例3的置于酸性条件下6分钟后的水凝胶的效果图；图3d为本发明实施例3的置于中性条件下6分钟后的水凝胶的效果图；
图4a为本发明实施例4的3D打印方法制备的长条形模板槽；图4b为本发明实施例4的利用405nm的蓝紫光对水凝胶进行固化的效果图；图4c为本发明实施例4的固化后形成的长条形的双重水凝胶的效果图；
图5a为本发明实施例4的在不同浓度的葡萄糖溶液中反应前后的水凝胶的效果图；图5b为本发明实施例4的在不同浓度葡萄糖溶液中水凝胶的膨胀比；图5c为本发明实施例4的在不同浓度葡萄糖溶液中反应后的水凝胶的颜色强度变化；
图6a为本发明实施例5的水凝胶在不同血糖浓度小鼠体内荧光强度效果图；图6b为本发明实施例5的水凝胶在不同血糖浓度小鼠体内的膨胀比；图6c为本发明实施例5的水凝胶在不同血糖浓度小鼠体内的荧光强度变化。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
1.葡萄糖反应产生酸性微环境的验证
葡萄糖溶液与氧气在葡萄糖氧化酶的催化作用下发生反应产生葡萄糖酸和过氧化氢(图1a)，使葡萄糖溶液显酸性。为了检验该酸性微环境的反应过程，分别配置100mg/dl，200mg/dl，300mg/dl，400mg/dl的葡萄糖溶液各5ml,并加入过量的葡萄糖氧化酶，在37℃的水浴条件下搅拌反应。每隔5分钟，用移液枪取出20μl溶液、并用pH试纸测量溶液的实时pH值,连续检测一个小时，并在两个小时测最终pH。结果表明，葡萄糖溶液在葡萄糖氧化酶的作用下pH值下降(图1b)；并且葡萄糖浓度越大，pH下降的速度越快(图1b)。
2.pH响应水凝胶CMC-pHEA的制备
首先，将50ml蒸馏水和羧甲基纤维素(CarboxyMethyl Cellulose，CMC)(5.56×10-6mol)放入250ml三颈圆底烧瓶中，以75℃(50-100℃，优选75℃)和400rpm(300-500rpm，优选400rpm)的速度在水浴中搅拌至CMC充分溶解。然后将氮气注入装有CMC溶液的分压瓶中持续20分钟，使溶液中氧的含量充分降低，然后将添加过硫酸钾(KPS,1.85×10-5mol)作为引发剂加到溶液中混合反应20分钟。接下来，添加3.92×10-2mol的丙烯酸-2-羟乙基酯(2-HydroxyEthyl Acrylate，2-HEA)。当反应混合物变成了乳白色,加入0.32×10-3mol交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA，继续反应3h，反应结束后，室温下充分冷却。在合成过程中调整搅拌速度以诱导均相合成。用5L蒸馏水对该化合物进行3天以上的透析，去除未反应的交联剂和单体形成pH响应水凝胶CMC-pHEA。然后利用超声破碎仪将水凝胶破碎，用于下一步应用。
3.甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶(GelMA)光响应水凝胶的制备
把GelMA原料以质量百分比10％(8％-12％，优选10％)溶解在去离子水中。LAP蓝光引发剂以质量百分比0.05％-0.1％的比例溶解在10％的GelMA溶液中。在避光条件下操作，防止GelMA在自然光下交联。并且在避光条件下，在37℃(28-45℃，优选37℃)超声5分钟，使之充分混合；然后在37℃热水中浸泡半小时，使之充分溶解。在405nm光源下照射混合溶液，瞬间(大约1-2s)固化，光固化的GelMA光敏感性水凝胶可用于不同的应用。
未使用完的GelMA溶液使用密封条密封，在4℃避光保存，保质期为15天。下次使用前，可在37℃(28-45℃，优选37℃)的水浴中加热30分钟至液态，进行使用。
4.双重水凝胶体系的制备
利用CMC-pHEA水凝胶的pH响应特性和GelMA光敏感性水凝胶的光固化成型特性，将步骤2和3中制备的两种水凝胶进行共混，将GelMA与CMC-pHEA水凝胶分别按照1:3、1:2、1:1、2:1、3:1和6:1的体积比例混合(图2)，利用波长为405nm的蓝紫光对混合水凝胶进行固化(图2)。GelMA：CMC-pHEA的比例在1:3混合时，无法进行光固化(图2)。两种水凝胶GelMA：CMC-pHEA的比例按照1:2、1:1、2:1混合时，随着GelMA百分含量的增加，固化时间依次缩短(图2)，GelMA:CMC-pHEA按照3:1混合时，固化时间进一步缩短至1秒(图2)，并且水凝胶成型后的形状较好，力学性能良好，可以进行夹取等操作。当GelMA：CMC-pHEA混合比例增大到6:1时，固化时间为1秒(图2)，没有进一步缩短。所以，后续应用实验中，我们采用GelMA：CMC-pHEA以3:1比例来共混制备后续的双重水凝胶体系。
实施例2
5.利用模板制备双重水凝胶体系的试样
利用CMC-pHEA水凝胶的pH响应特性和GelMA光敏感性水凝胶的光固化成型特性，GelMA：CMC-pHEA按照3:1比例混合，将溶液浇筑/填充到不同形状的模板里面，通过405nm的蓝紫光对混合水凝胶进行光固化，形成双重水凝胶体系。
利用不同的模板，我们可以自备形状、大小各式各样的双响应水凝胶，例如长条形结构，花瓣结构，圆柱结构等水凝胶。
实施例3
6.双重水凝胶体系的pH响应性测试
利用3D打印的方法制备出花朵形状的模板(图3a)，然后按照上述工艺，通过光固化制备出具有花朵形状的双重水凝胶体系，双重水凝胶体系中的CMC-pHEA成分具有pH响应性。我们将制备的花朵形状的双重水凝胶分别放置在酸性环境(pH 4.5)和中性环境(pH7.0)中。6分钟后，置于酸性环境中的花朵变形较小、花朵颜色较深；但是，置于中性环境中的水凝胶发生了较大变形，花朵的颜色变得较浅(图3)。验证了该双重水凝胶体系的确具有酸响应性。
实施例4
7.体外葡萄糖溶液的可视化检测
利用3D打印制作模板，如图4a所示，每个模板槽长10毫米，宽1毫米，厚度为0.5毫米。在未固化的双重水凝胶溶液中添加少许的红色染料和葡萄糖氧化酶，染料的浓度为0.045g/ml(0.025-0.075g/ml，优选0.045g/ml)，葡萄糖氧化酶的浓度为利用0.030g/ml(0.02-0.05g/ml，优选0.030g/ml)，20μl移液枪分别将每个模板槽滴满混合溶液，然后用载玻片按压，用波长为405nm的蓝紫光进行固化1-2s(图4b)。形成的样条如图4c所示。
在体外的不同浓度的葡萄糖溶液作用下，观察智能水凝胶样条的响应变化情况。
将以上制备的长条形水凝胶分别置于不同浓度(0,100,200,300,400mg/dl)的葡萄糖溶液中(图5a)。6分钟之后，在浓度为0mg/dl葡萄糖溶液的作用下，水凝胶膨胀最大，面积最大，但是颜色变得最浅(图5a)。在浓度为400mg/dl的葡萄糖溶液的作用下，水凝胶的膨胀最小，相对面积最小，但是颜色最深(图5a)。
统计结果表面，在不同浓度的葡萄糖溶液作用下，水凝胶的尺寸大小和颜色深浅随着葡萄糖溶液浓度的变化而呈现出梯度、线性变化(图5b-c)。随着葡萄糖溶液浓度的增加，水凝胶的膨胀比减小(图5b)，而水凝胶的颜色由浅变深(图5c)。因此，可以根据水凝胶的体积膨胀比和颜色深浅来推算未知葡萄糖溶液的浓度。
实施例5
8.体内血糖浓度的可视化检测
采用C57小黑鼠或Balb/c裸鼠，在小鼠体内腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病模型小鼠。通过STZ注射次数和注射剂量，可以得到体内不同血糖浓度的小鼠(体内低糖，中糖，和高糖的小鼠等)。
在未固化的双重水凝胶溶液中加入荧光染料，荧光染料的浓度为0.0015g/ml(0.001-0.002g/ml，优选的0.0015g/ml)(注意，不能是易发生酸敏感而淬灭的荧光分子，如FITC需要排除)和葡萄糖氧化酶。在透光性较好的塑料管中，通过405nm的蓝紫色光的照射，固化成型而制备出圆柱形的双重水凝胶体系。在套管针的帮助下，将成型后的双重水凝胶植入到上述诱导的糖尿病小鼠和正常小鼠的皮下组织。在小动物活体成像仪(BRUKER，XTREME BI)中观察不同时间段小鼠体内的水凝胶的变化情况。
植入6分钟之后，低血糖小鼠(4mM)体内的水凝胶呈现出体积大但是荧光弱的状态(图6a)，而高血糖小鼠(23mM)体内的水凝胶呈现出体积小但是荧光强的状态(图6a)。对水凝胶植入小鼠体内的体积膨胀比进行分析(图6b)，并且对植入小鼠体内的水凝胶的荧光强度进行分析(图6c)。在血糖浓度低的小鼠中，植入体内的水凝胶体积膨胀较大，但是荧光强度较低(图6c)。随着小鼠体内血糖浓度的升高，植入的水凝胶体积膨胀率逐渐降低，水凝胶的平均荧光强度逐步升高(图6c)。当小鼠体内血糖很高时(23mM，模拟糖尿病的高血糖)，小鼠体内的水凝胶体积膨胀程度最小，但是荧光强度最强(图6c)。小鼠体内实验和第7步中体外葡萄糖溶液中的实验趋势相吻合。同样的，也可以根据植入小鼠体内的水凝胶的体积膨胀率和荧光强度的强弱来推导未知小鼠体内的血糖浓度。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于可视化血糖检测的智能水凝胶，其特征在于：由光敏感性水凝胶、pH响应水凝胶和葡萄糖氧化酶混合后光固化制备而成，所述光敏性水凝胶和pH响应水凝胶体积比为0.5-6:1；所述光敏感性水凝胶为甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶混合光引发剂制备而成，所述pH响应性水凝胶是由羧甲基纤维素和丙烯酸-2-羟乙基酯在过硫酸钾和聚乙二醇二丙烯酸酯的共同作用下制备而成的水凝胶；在pH响应性水凝胶交联成型后，通过超声破碎仪对其进行超声破碎。
2.根据权利要求1所述的用于可视化血糖检测的智能水凝胶，其特征在于：所述光引发剂为I2959紫外光引发剂或LAP蓝光引发剂，所述光引发剂的质量百分数为0.05%-0.1%。
3. 根据权利要求1所述的用于可视化血糖检测的智能水凝胶，其特征在于：该用于可视化血糖检测的智能水凝胶中，葡萄糖氧化酶的浓度为0.02-0.05 g/ml。
4. 根据权利要求1所述的用于可视化血糖检测的智能水凝胶，其特征在于：该用于可视化血糖检测的智能水凝胶中还包含染料，所述染料的浓度为0.001-0.075 g/ml。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的用于可视化血糖检测的智能水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、在28-45℃下，将甲基丙烯酸酐化明胶以质量百分比为8%-12%溶解在水中，得到甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶溶液；
A2、避光条件下，将光引发剂以质量百分比为0.05%-0.1%溶解于所述步骤A1的甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶溶液中并混合均匀，得到光敏感性水凝胶溶液；
A3、避光条件下，将pH响应性水凝胶按照与光敏感性水凝胶溶液的体积比为1:0.5-6加入到所述步骤A2得到的溶液中，混合均匀，得到双重体系水凝胶溶液；
A4、避光条件下，将一定质量的葡萄糖氧化酶加入到所述步骤A3的双重体系水凝胶溶液中，混合均匀；
A5、将步骤A4得到的混合溶液进行光固化，得到所述用于可视化血糖检测的智能水凝胶。
6.根据权利要求5所述的用于可视化血糖检测的智能水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤A3中，pH响应性水凝胶的制备包括以下步骤：B1、在50-100℃和搅拌速度为300-500r/min下，将羧甲基纤维素溶于水中；
B2、惰性气体存在下，将引发剂加入所述步骤B1得到的溶液中混合并反应；
B3、向所述步骤B2的溶液中加入丙烯酸-2-羟乙基酯，继续反应至溶液成乳白色；
B4、向所述步骤B3的溶液总加入交联剂，继续反应至结束；
B5、将所述步骤B4得到的反应产物透析，去除未反应的反应物，得到所述pH响应水凝胶。
7.根据权利要求6所述的用于可视化血糖检测的智能水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤B2中，引发剂为过硫酸钾，所述步骤B4中，交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯。
8.根据权利要求6所述的用于可视化血糖检测的智能水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤B5中，透析取分子量大于3000的反应产物，所述pH响应水凝胶的含水量为20%-40%。
9.根据权利要求6所述的用于可视化血糖检测的智能水凝胶的制备方法，其特征在于：所述羧甲基纤维素、丙烯酸-2-羟乙基酯、引发剂和交联剂的摩尔比为：1：（（5.48-8.62）×103）：（2.65-3.60）：（28.77-86.33）。
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