CN110317278A - Svv和fmdv的融合蛋白及其编码基因、表达载体、细胞系、工程菌和疫苗与应用 - Google Patents

Svv和fmdv的融合蛋白及其编码基因、表达载体、细胞系、工程菌和疫苗与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，提供了一种SVV和FMDV的融合蛋白及其编码基因、表达载体、细胞系、工程菌和疫苗与应用。本发明提供的融合蛋白为将能够诱导机体产生中和抗体的表位替换诱骗表位获得的融合蛋白，包括SVV VP1蛋白片段、FMDV VP1蛋白片段和补体C3d蛋白片段。该融合蛋白将SVV和FMDV两种病原诱导机体产生中和抗体的抗原结合起来，保留了SVV和FMDV二者的抗原表位同时提高了抗原的安全性。其中，补体C3d分子可激发体内非特异性的体液和细胞免疫反应，对提高疫苗的抗体滴度，激活机体的细胞免疫应答具有重要的作用。该融合蛋白制备得到的疫苗安全有效，可以有效预防水疱病和***。

Description

SVV和FMDV的融合蛋白及其编码基因、表达载体、细胞系、工程 菌和疫苗与应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种SVV和FMDV的融合蛋白及其编码基因、表达载体、细胞系、工程菌和疫苗与应用。
背景技术
***(foot-and-mouth disease，FMD)，是由***病毒(FMDV)所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害偶蹄兽，偶见于人和其他动物。其临诊特征为口腔粘膜、蹄部和***皮肤发生水疱。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。目前，有三分之二的OIE成员国流行FMD，时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。
塞内加谷病毒(Seneca valley virus A，SVV)属于小RNA病毒科，塞内加谷病毒属，病毒基因组为单股正链RNA，约由7800个核苷酸组成。在美洲、中国引起猪的水疱病和仔猪死亡。
SVV所致猪水疱性临床症状与***(FMD)等水疱性疫病相似，难以区分。上述两种疾病的诊断与治疗都具有一定的困难，并且目前没有良好的技术手段可以同时避免感染两种疾病，因此，结合两种疾病病原的特性，设计SVV和FMD重组亚单位疫苗以应对疫病防控至关重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种SVV和FMDV的融合蛋白，以缓解现有技术中缺少可以同时预防SVV和FMDV的疫苗抗原的技术问题。
本发明的第二目的在于提供上述融合蛋白的应用。
本发明的第三目的在于提供一种上述融合蛋白的编码基因以及含有编码基因的表达载体、细胞系和工程菌，以提供可以快速大量获得上述融合蛋白的生物模块。
本发明的第四目的在于提供一种SVV和FMDV二联亚单位疫苗，以缓解现有技术中缺少一种可以使得动物同时免疫SVV和FMDV的产品。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种SVV和FMDV的融合蛋白，所述融合蛋白包括SVV VP1蛋白片段、FMDV VP1蛋白片段和补体C3d蛋白片段；
编码所述SVV VP1蛋白片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
编码所述FMDV VP1蛋白片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；
编码所述补体C3d蛋白片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
进一步地，SVV VP1蛋白片段、FMDV VP1蛋白片段和补体C3d蛋白片段之间通过柔性氨基酸Linker连接；
所述柔性氨基酸Linker的氨基酸序列为SEQ ID NO.6；
优选地，编码所述柔性氨基酸Linker的核苷酸序列为SEQ ID NO.7。
进一步地，所述融合蛋白包括如下a)或b)：
a)序列表中SEQ IDNO.5的氨基酸序列；
b)将SEQ IDNO.5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加且具有与SEQ IDNO.5相同活性的由SEQ IDNO.5衍生的氨基酸序列。
进一步地，所述融合蛋白为序列表中的SEQ IDNO.5。
上述融合蛋白在如下A)-D)中的至少一种的应用：
A)制备SVV和FMDV二联亚单位疫苗；
B)制备SVV和FMDV的抗体；
C)制备检测SVV和FMDV的试剂盒；
D)制备SVV和FMDV诊断抗原。
一种上述融合蛋白的编码基因，所述编码基因包括如下1)或2)：
1)序列表中SEQ IDNO.4的核苷酸序列；
2)与SEQ IDNO.4的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
含有上述编码基因的克隆载体或表达载体；
优选地，所述克隆载体包括pMD18-T；
优选地，所述表达载体包括pcDNA3.1。
含有上述编码基因或表达载体的细胞系；
优选地，所述细胞系包括CHO细胞系。
含有上述编码基因或克隆载体或表达载体的工程菌；
优选地，所述工程菌为含有pMD18-T的大肠杆菌DH5α；
优选地，所述工程菌为含有pcDNA3.1的大肠杆菌TOP10。
一种SVV和FMDV二联亚单位疫苗，活性成分包括上述的融合蛋白；
优选地，所述SVV和FMDV二联亚单位疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的至少一种；
优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或ISA206，优选包括ISA206。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的SVV和FMDV的融合蛋白为将能够诱导机体产生中和抗体的表位替换诱骗表位获得的融合蛋白，包括SVV VP1蛋白片段、FMDV VP1蛋白片段和补体C3d蛋白片段。该融合蛋白将SVV和FMDV两种病原诱导机体产生中和抗体的抗原结合起来，保留了SVV和FMDV二者的抗原表位同时提高了抗原的安全性。其中，补体C3d分子可激发体内非特异性的体液和细胞免疫反应，对提高疫苗的抗体滴度，激活机体的细胞免疫应答具有重要的作用。
本发明提供上述融合蛋白的编码基因以及有编码基因的表达载体、细胞系和工程菌作为表达上述融合蛋白的生物模块，利用上述生物模块可以从不同层面快速大量的获得高纯度的融合蛋白，便于试验操作和保藏。
本发明提供一种以上述融合蛋白为活性成分的SVV和FMDV二联亚单位疫苗，该疫苗安全性好，免疫效果好，扩大了疫病防控范围，节省了劳力，提高了工作效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中pcDNA3.1-SVV/VP1-FMDV/VP1-C3d构建示意图；
图2为实施例2中pcDNA3.1-SVV/VP1-FMDV/VP1-C3d PCR鉴定结果，其中，M：DL2000DNA marker；1：阳性质粒；
图3为实施例3中pcDNA3.1-SVV/VP1-FMDV/VP1-C3d酶切鉴定结果；其中，M1：DL15000 DNA marker；M2：DL2000 DNA Marker；1-4：阳性质粒酶切。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明提供一种SVV和FMDV的融合蛋白，包括SVV VP1蛋白片段、FMDV VP1蛋白片段和补体C3d蛋白片段，其中，编码SVV VP1蛋白片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，编码FMDV VP1蛋白片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，编码补体C3d蛋白片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
该融合蛋白将SVV和FMDV两种病原诱导机体产生中和抗体的抗原结合起来，保留了SVV和FMDV二者的抗原表位同时提高了抗原的安全性。其中，补体C3d分子可激发体内非特异性的体液和细胞免疫反应，对提高疫苗的抗体滴度，激活机体的细胞免疫应答具有重要的作用。
编码SVV VP1蛋白片段的核苷酸序列：
atgtcagtttattctgctgatggttggtttagcctgcacaagctgactaaaattactctaccacctgactgcccacagagtccctgcattctctttttcgcctctgctggtgaggattacaccctacgtctccctgttgattgtaatccttcctacgtgttccactccaccgacaacgccgagactggggttattgaggcgggtaacactgacaccgatttctctggtgagctggcggctcctggctctaaccacactaatgtcaagttcctgtttgatcgatctcgattactgaatgtaattaaggtactggagaaggacgccgtcttcccccgtcctttccccacagcaacaggtgcacagcaggacgatggttacttttgccttctaacaccccgcccaacagtcgcttcccgacccgccactcgtttcggcctgtacgtcaatccgtctgacagtggcgttctcgctaacacttcactggatttcaatttttacagcttggcctgtttcacttactttagatcagaccttgaagtcacggtggtctcactggagccagatctggaattcgctgtagggtggttcccctctggcagtgagtaccaggcttccagctttgtctacgaccaactgcatgtgccttaccactttactgggcgcactccccgcgctttcaccagcaagggtggaaaggtatctttcgtgcttccttggaactctgtctcatccgtgcttcccgtgcgctgggggggcgcttccaagctttcttccgccacgcggggtctaccggctcatgctgactgggggaccatttacgccttcatcccccgtcctaatgagaagaaaagcaccgctgtaaagcacgtggcggtgtacgttcggtacaagaacgcgcgtgcctggtgccccagcatgctccccttccgcagctacaagcagaagatgctgatgcaatca(SEQ ID NO.1)。
编码FMDV VP1蛋白片段的核苷酸序列：
accactactactggggagtccgcagaccctgtcaccaccaccgtggagaactacggcggtgatacacaagtccagagacgtcaccacacggacgtcggcttcattatggaccgatttgtgaagataaacagcctgagccccacacatgtcattgacctcatgcaaacccacaaacacgggatcgtgggtgcgttactgcgtgcagccacgtactacttctccgacttggagattgttgtgcggcacgatggtaatctgacctgggtgcccaacggtgcccccgaggcagccctgtcaaacaccagcaaccccactgcctacaacaaggcaccgttcacgagacttgctctcccttacactgcgccacaccgcgtgttggcaactgtgtacgacgggacaaacaagtactccgcaagcgattcgagatcaggcgacctggggtccatcgcggcgcgagtcgcgacacaacttcctgcttcctttaactacggtgcaatccaggcacaggccatccacgagcttctcgtgcgcatgaaacgggccgagctctactgtcccaggccacttctagcaataaaggtgacttcgcaagacaggtacaagcaaaagattattgcgcccgcaaaacagctgttg(SEQ ID NO.2)。
编码补体C3d蛋白片段的核苷酸序列：
accccctccggctgtggggagcagaacatgatcggcatgacgcccacagtcatcgctgtgcactacctggacagcaccgaacaatgggagaagttcggcctggagaagaggcaggaagccttggagctcatcaagaaggggtacacccagcaactggccttcagacaaaagaactcagcctttgccgccttccaggaccggctgtccagcaccctgctgacagcctatgtggtcaaggtcttcgctatggcagccaacctcatcgccatcgactcccaggtcctctgtggggccgtcaaatggctgatcctggagaagcagaagcctgatggagtcttcgaggagaatgggcccgtgatacaccaagaaatgattggtggcttcaagaacactgaggagaaagacgtgtccctgacagcctttgttctcatcgcgctgcaggaggctaaagacatctgtgaaccacaggtcaatagcctgttgcgcagcatcaataaggcaagagacttcctcgcagactactacctagaattaaaaagaccatatactgtggccattgctggttatgccctggctctatctgacaagctggatgagcccttcctcaacaaacttctgagcacagccaaagaaaggaaccgctgggaggaacctggccagaagctccacaatgtggaggccacatcctacgccctcttggctctgctggtagtcaaagactttgactctgtccctcctattgtgcgctggctcaatgagcagagatactacggaggtggctatggatctacccaggccactttcatggtgttccaagccttggcccaataccagaaggatgtccctgatcacaaggatctgaacctggatgtgtccatccacctgcccagccgcagcgctccagtcaggcatcgtatcctctgggaatctgctagccttctgcgg(SEQ ID NO.3)。
在优选地实施方式中，SVV VP1蛋白片段、FMDV VP1蛋白片段和补体C3d蛋白片段之间通过柔性氨基酸Linker连接，其中，柔性氨基酸Linker的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。该柔性氨基酸可以促进融合蛋白分别形成正确的空间结构，发挥更好的生物学活性，避免SVV VP1蛋白片段和FMDV VP1蛋白片段相互影响功能，提高融合蛋白的产量。
需要说明的是，融合蛋白的组成依次为SVV VP1蛋白片段、FMDV VP1蛋白片段和补体C3d蛋白片段的序列顺序，通过柔性氨基酸Linker连接。
柔性氨基酸Linker的氨基酸序列：PPSPSPPSPS(SEQ ID NO.6)。
在优选地实施方式中，编码柔性氨基酸Linker的核苷酸序列为SEQ ID NO.7。编码柔性氨基酸Linker的核苷酸序列：cctcccagccccagccctcccagccccagc(SEQ ID NO.7)。
在优选地实施方式中，融合蛋白包括如下a)或b)：
a)序列表中SEQ IDNO.5的氨基酸序列；
b)将SEQ IDNO.5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加且具有与SEQ IDNO.5相同活性的由SEQ IDNO.5衍生的氨基酸序列。
融合蛋白优选为序列表中的SEQ IDNO.5：
MSVYSADGWFSLHKLTKITLPPDCPQSPCILFFASAGEDYTLRLPVDCNPSYVFHSTDNAETGVIEAGNTDTDFSGELAAPGSNHTNVKFLFDRSRLLNVIKVLEKDAVFPRPFPTATGAQQDDGYFCLLTPRPTVASRPATRFGLYVNPSDSGVLANTSLDFNFYSLACFTYFRSDLEVTVVSLEPDLEFAVGWFPSGSEYQASSFVYDQLHVPYHFTGRTPRAFTSKGGKVSFVLPWNSVSSVLPVRWGGASKLSSATRGLPAHADWGTIYAFIPRPNEKKSTAVKHVAVYVRYKNARAWCPSMLPFRSYKQKMLMQSPPSPSPPSPSTTTTGESADPVTTTVENYGGDTQVQRRHHTDVGFIMDRFVKINSLSPTHVIDLMQTHKHGIVGALLRAATYYFSDLEIVVRHDGNLTWVPNGAPEAALSNTSNPTAYNKAPFTRLALPYTAPHRVLATVYDGTNKYSASDSRSGDLGSIAARVATQLPASFNYGAIQAQAIHELLVRMKRAELYCPRPLLAIKVTSQDRYKQKIIAPAKQLLPPSPSPPSPSTPSGCGEQNMIGMTPTVIAVHYLDSTEQWEKFGLEKRQEALELIKKGYTQQLAFRQKNSAFAAFQDRLSSTLLTAYVVKVFAMAANLIAIDSQVLCGAVKWLILEKQKPDGVFEENGPVIHQEMIGGFKNTEEKDVSLTAFVLIALQEAKDICEPQVNSLLRSINKARDFLADYYLELKRPYTVAIAGYALALSDKLDEPFLNKLLSTAKERNRWEEPGQKLHNVEATSYALLALLVVKDFDSVPPIVRWLNEQRYYGGGYGSTQATFMVFQALAQYQKDVPDHKDLNLDVSIHLPSRSAPVRHRILWESASLLR(SEQ IDNO.5)。
具有SEQ IDNO.5的融合蛋白抗原活性高，能够高效促进机体产生SVV和FMDV抗体，抗体效价高，提高机体的免疫原性。
本发明提供的融合蛋白可以在如下A)-D)中的至少一种应用：
A)制备SVV和FMDV二联亚单位疫苗；
B)制备SVV和FMDV的抗体；
C)制备检测SVV和FMDV的试剂盒；
D)制备SVV和FMDV诊断抗原。
本发明提供的融合蛋白具有良好的抗原活性，可以应用于SVV和FMDV相关的各种领域中。例如，融合蛋白制备成二联亚单位疫苗，用于动物免疫，避免感染SVV和FMDV，具有良好的免疫效果；融合蛋白用于制备SVV和FMDV抗体，产量高并且效果好，并且抗体可应用于SVV和FMDV检测试剂盒等，效价高并且稳定。
本发明提供一种上述融合蛋白的编码基因，包括如下1)或2)：
1)序列表中SEQ IDNO.4的核苷酸序列；
2)与SEQ IDNO.4的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
编码基因优选为序列表中SEQ IDNO.4的核苷酸序列：
atgtcagtttattctgctgatggttggtttagcctgcacaagctgactaaaattactctaccacctgactgcccacagagtccctgcattctctttttcgcctctgctggtgaggattacaccctacgtctccctgttgattgtaatccttcctacgtgttccactccaccgacaacgccgagactggggttattgaggcgggtaacactgacaccgatttctctggtgagctggcggctcctggctctaaccacactaatgtcaagttcctgtttgatcgatctcgattactgaatgtaattaaggtactggagaaggacgccgtcttcccccgtcctttccccacagcaacaggtgcacagcaggacgatggttacttttgccttctaacaccccgcccaacagtcgcttcccgacccgccactcgtttcggcctgtacgtcaatccgtctgacagtggcgttctcgctaacacttcactggatttcaatttttacagcttggcctgtttcacttactttagatcagaccttgaagtcacggtggtctcactggagccagatctggaattcgctgtagggtggttcccctctggcagtgagtaccaggcttccagctttgtctacgaccaactgcatgtgccttaccactttactgggcgcactccccgcgctttcaccagcaagggtggaaaggtatctttcgtgcttccttggaactctgtctcatccgtgcttcccgtgcgctgggggggcgcttccaagctttcttccgccacgcggggtctaccggctcatgctgactgggggaccatttacgccttcatcccccgtcctaatgagaagaaaagcaccgctgtaaagcacgtggcggtgtacgttcggtacaagaacgcgcgtgcctggtgccccagcatgctccccttccgcagctacaagcagaagatgctgatgcaatcacctcccagccccagccctcccagccccagcaccactactactggggagtccgcagaccctgtcaccaccaccgtggagaactacggcggtgatacacaagtccagagacgtcaccacacggacgtcggcttcattatggaccgatttgtgaagataaacagcctgagccccacacatgtcattgacctcatgcaaacccacaaacacgggatcgtgggtgcgttactgcgtgcagccacgtactacttctccgacttggagattgttgtgcggcacgatggtaatctgacctgggtgcccaacggtgcccccgaggcagccctgtcaaacaccagcaaccccactgcctacaacaaggcaccgttcacgagacttgctctcccttacactgcgccacaccgcgtgttggcaactgtgtacgacgggacaaacaagtactccgcaagcgattcgagatcaggcgacctggggtccatcgcggcgcgagtcgcgacacaacttcctgcttcctttaactacggtgcaatccaggcacaggccatccacgagcttctcgtgcgcatgaaacgggccgagctctactgtcccaggccacttctagcaataaaggtgacttcgcaagacaggtacaagcaaaagattattgcgcccgcaaaacagctgttgcctcccagccccagccctcccagccccagcaccccctccggctgtggggagcagaacatgatcggcatgacgcccacagtcatcgctgtgcactacctggacagcaccgaacaatgggagaagttcggcctggagaagaggcaggaagccttggagctcatcaagaaggggtacacccagcaactggccttcagacaaaagaactcagcctttgccgccttccaggaccggctgtccagcaccctgctgacagcctatgtggtcaaggtcttcgctatggcagccaacctcatcgccatcgactcccaggtcctctgtggggccgtcaaatggctgatcctggagaagcagaagcctgatggagtcttcgaggagaatgggcccgtgatacaccaagaaatgattggtggcttcaagaacactgaggagaaagacgtgtccctgacagcctttgttctcatcgcgctgcaggaggctaaagacatctgtgaaccacaggtcaatagcctgttgcgcagcatcaataaggcaagagacttcctcgcagactactacctagaattaaaaagaccatatactgtggccattgctggttatgccctggctctatctgacaagctggatgagcccttcctcaacaaacttctgagcacagccaaagaaaggaaccgctgggaggaacctggccagaagctccacaatgtggaggccacatcctacgccctcttggctctgctggtagtcaaagactttgactctgtccctcctattgtgcgctggctcaatgagcagagatactacggaggtggctatggatctacccaggccactttcatggtgttccaagccttggcccaataccagaaggatgtccctgatcacaaggatctgaacctggatgtgtccatccacctgcccagccgcagcgctccagtcaggcatcgtatcctctgggaatctgctagccttctgcggtaa(SEQ IDNO.4)。
本发明提供含有上述编码基因的表达载体、细胞系、和工程菌，其中，克隆载体优选为pMD18-T，表达载体优选为pcDNA3.1，细胞系优选为CHO细胞系，工程菌优选为含有pMD18-T的大肠杆菌DH5α或含有pcDNA3.1的大肠杆菌TOP10。由于CHO细胞具有准确的转录后修饰功能，能够表达出与天然蛋白分子相接近的融合蛋白，并且外源基因表达稳定，能够进行分泌表达，抗原产量高等优点，因此选择该细胞系进行疫苗抗原的制备。
本发明提供上述融合蛋白的编码基因以及含有编码基因的表达载体、细胞系和工程菌作为表达上述融合蛋白的生物模块，利用上述生物模块可以从不同层面快速大量的获得高纯度的融合蛋白，便于试验操作和保藏。
本发明又提供一种SVV和FMDV二联亚单位疫苗，该疫苗活性成分包括本发明提供的融合蛋白。该疫苗安全性好，免疫效果好，扩大了疫病防控范围，节省了劳力，提高了工作效率。
在一些实施方式中，SVV和FMDV二联亚单位疫苗还包括辅料，辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的至少一种。
在优选地实施方式中，疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或ISA206，优选使用ISA206。
本发明最后提供一种SVV和FMDV融合蛋白的构建、高产表达及制备二联亚单位疫苗的方法，包括以下步骤：
(1)将编码SVV VP1蛋白片段的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)、编码FMDV VP1蛋白片段的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)和编码补体C3d蛋白片段的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)用编码柔性氨基酸Linker的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)连接为重组片段，将重组片段***pMD18-T克隆载体中，经酶切鉴定及测序，筛选出阳性重组载体，并转化到DH5α感受态细胞，获得重组质粒pMD18-VP1/SVV-VP1/FMDV-C3d。
(2)将含VP1/SVV-VP1/FMDV-C3d基因序列的重组质粒和表达质粒pcDNA3.1经限制性内切酶酶切后，回收基因重组片段和线性表达质粒，连接过夜，获得阳性重组表达质粒，命名为pcDNA3.1-SVV/VP1-FMDV/VP1-C3d。
(3)将获得的重组阳性质粒pcDNA3.1-SVV/VP1-FMDV/VP1-C3d转染CHO细胞，CHO细胞拥有单加压***，有利于高表达细胞的筛选，通过单细胞克隆筛选和生物反应器全悬浮无血清培养获得阳性细胞系，使其表达含有SVV和FMDV的融合蛋白，纯化获得该融合蛋白；
其中全悬浮无血清培养方法为：采用CHO无血清培养基培养适应高pH培养基的CHO细胞，使其密度达到3.6×106活细胞/mL，采用摇瓶或者搅拌式生物反应器在高pH条件下进行培养，125mL通气摇瓶接种35mL，2L的通气摇瓶接种300mL，培养温度为37℃、转速80～100rpm，培养48～96h，期间加入1N NaOH，不断取样用校准的pH计监测使培养基pH维持在7.0～7.4。
(4)将步骤(3)纯化得到的融合蛋白与ISA206佐剂混合，制备得到塞内加谷病毒和***病毒二联亚单位疫苗。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1通过CHO细胞表达***表达融合蛋白
1材料和方法
1.1细胞培养
CHO细胞系与遗传霉素(50mg/ml)购自美国Invitrogen公司，培养温度为37℃，培养基(Hycell CHO medium)购自美国Hyclone公司。CHO表达***以及相关试剂购自美国Invitrogen公司。
细胞密度和活力采用台盼蓝染色计数和观察。以感染后不同时间活细胞占总细胞的百分比计算细胞活力。细胞悬浮培养，细胞密度5×106/ml，细胞活力为大于95％时进行感染。
1.2VP1基因合成与重组阳性质粒的构建
按照SVV和FMDV全基因组，人工合成VP1基因序列(GenBank登录号MF615510.1与NC_001623)与C3d序列，基因连接后***pMD18-T的KpnI和XbaI酶切位点之间获得质粒pMD18-VP1/SVV-VP1/FMDV-C3d。
根据基因序列设计引物，目的片段533bp。上游引物位于SVV序列位置，下游引物位于FMDV序列位置，扩增质粒，筛选鉴定阳性质粒。引物序列如下：
上游引物P1：5’-TCCCCCGTCCTAATGAGAAGAAAA-3’(SEQ ID NO.8)；
下游引物P2：5’-GTGTGGCGCAGTGTAAGGGAGAGC-3’(SEQ ID NO.9)。
1.3pcDNA3.1-VP1/(SVV/FMDV)-C3d表达载体的构建及鉴定
将pMD18-VP1/SVV-VP1/FMDV-C3d克隆载体、pcDNA3.1表达载体，分别使用Kpn I和Xba I双酶切，酶切产物电泳后使用DNA回收试剂盒回收VP1/SVV-VP1/FMDV-C3d，pcDNA3.1基因片段，使用DNA连接试剂盒，将VP1/SVV-VP1/FMDV-C3d与pcDNA3.1酶切片段基因连接过夜，将表达载体导入TOP10感受态细胞并使用LB培养基培养过夜。构建
pcDNA3.1-VP1/(SVV/FMDV)-C3d表达载体。
pcDNA3.1-VP1/(SVV/FMDV)-C3d(即
pcDNA3.1-SVV/VP1-FMDV/VP1-C3d)表达载体构建示意图如图1所示。使用质粒提取试剂盒提取培养菌质粒，使用鉴定引物进行目的片段的PCR扩增，目的基因大小为533bp，结果如图2所示；并使用Kpn I和Xba I双酶切鉴定，鉴定结果显示:酶切后，出现5400bp左右的载体片段和2600bp左右的目的条带，结果如图3所示。将阳性质粒送基因公司进行测序分析。
1.3表达细胞的建立与筛选
1.3.1转染
质粒的准备:将重组构建的质粒利用提取试剂盒进行提取(依照试剂盒说明书)，得到的质粒12000rpm下离心10min后待用；CHO细胞的收集:将悬浮培养的CHO细胞进行离心，并利用PBS溶液清洗一次后离心收集；
电转反应体系(200μL)：3×106个CHO细胞、20μg质粒；电转条件及培养：将含有细胞和质粒的电转反应体系加入电击杯中，以1500V、10ms条件电击三次，电击后细胞转入两个含有10mL贴壁培养基的10cm平板中，以37℃、5％CO2培养1天。
1.3.2阳性克隆挑选
药物筛选：将培养1天的电击细胞培养平板换液，培养2天后加入终浓度1.8mg/mL的G418，培养2天后换入新的培养基培养7天；
阳性克隆挑选和检测：培养7天后的平板中，将贴壁生长的细胞挑至96孔板中，37℃、5％CO2培养7天后，加入100μL悬浮培养基表达培养3天，空板中培养基用于点杂交检测，将其中高表达克隆转至24孔板，培养基用于蛋白质印迹法(Western blot，WB)检测，根据实验结果最终得到高表达克隆。
1.3.3重组阳性克隆细胞的摇瓶培养
500mL锥形瓶悬浮培养：摇瓶中以转速120rpm，37℃、5％CO2条件下培养；然后将悬浮培养的重组CHO细胞以1×106个/mL终浓度接入装有120mL悬浮培养基的500mL锥形瓶中，培养基中加入终浓度1mg/L维生素K，以转速120rpm，37℃、5％CO2，每天取样检测培养基中细胞密度、融合蛋白浓度和葡萄糖浓度。
1.3.4融合蛋白的表达、鉴定
蛋白质凝胶电泳：SDS-PAGE胶为上层5％浓缩胶和下层12％分离胶，以100V电压、400mA条件电泳10min，然后以150V电压、400mA电泳1h。
免疫印迹：将样品经SDS-PAGE凝胶分离后在转膜缓冲液中转至PDVF膜中，转膜条件为100V电压、400mA电流1h，PDVF膜经封闭和孵育Cap蛋白单克隆抗体作用4h后，加入HRP标记羊抗鼠二抗稀释液，室温孵育2h，经PBST清洗三次，每次10min，最后利用DAB显色液进行显色检测。
1.3.5融合蛋白的纯化
将表达的融合蛋白样品8000rpm离心10min，收集上清后，使用Ni+亲和层析柱进行纯化，纯化蛋白使用生理盐水进行透析，使用SDS-PAGE对其进行鉴定。鉴定结果表明：纯化产物经SDS-PAGE电泳后，目的蛋白片段与预期大小相符。融合蛋白含量为0.8mg/mL，于-80℃冻存。
实施例2改造哺乳动物CHO细胞提高重组抗原的产量
1方法
表达量最高的重组质粒的构建如实施例1所示。
1.1.1质粒的准备:将重组构建的质粒利用提取试剂盒进行提取(依照试剂盒说明书)，得到的质粒加入75％乙醇，进行无菌处理，保证转染进细胞的质粒无菌，使用浓度检测仪测质粒浓度。
1.1.2脂质体转染：5×106个CHO细胞/ml、1μg/μl终浓度质粒；转染条件与培养：配制A液，将质粒DNA轻柔加入900μl OptiPRO SFM稀释，放置5-10min；配制B液，将脂质体试剂80μl加入920μl OptiPRO SFM稀释，放置5-10min，将B液加入A液，轻柔颠倒混匀，放置3-5min，加入待转染细胞，37℃、5％CO2培养48h。
1.1.3阳性克隆筛选
药物筛选：将培养48h的转染细胞移入培养瓶，加入0.6mg/mL的G418筛选抗生素，分瓶以5×105个CHO细胞/ml继续培养7天；
阳性克隆挑选和检测：37℃、5％CO2培养7天后的细胞瓶中，将生长的存活细胞传代培养，提高G418浓度为0.8mg/ml终浓度，稳定2-3代，细胞传代培养5-7天后，收取样品上清，蛋白质印迹法(Western blot，WB)检测，根据实验结果最终得到高表达克隆。
1.2 CHO单细胞克隆筛选
将高表达传代细胞，细胞活率>90％，进行梯度稀释种于96孔细胞培养板，平均0.5-1.0个细胞/孔，每孔200μl细胞培养基，待细胞长至80-100％后进行Elisa检测分析，筛选高表达单细胞克隆，进行扩大体积培养至24孔板、6孔板与细胞瓶，扩大体积培养过程中持续进行Elisa检测分析，筛选稳定更高表达株。
1.3 CHO单细胞克隆株的适应与培养
采用TPP管放于37℃、5％CO2培养箱以20ml 200rpm条件悬浮培养，每次传代进行细胞计数，阳性细胞培养并检测，稳定表达2-3代，收集传代样品进行检测，保留稳定更高表达样品继续传代。
1.4 CHO阳性细胞悬浮培养
选择表达较高的3-5株阳性细胞，进行传代培养，稳定后，选择最高表达量的细胞株进行无血清扩大培养，在透气的摇瓶(购自Corning公司)，以37℃、转速120rpm条件下，以3×105个细胞/ml浓度维持和扩增培养。
1.5 5L生物反应器发酵培养：将悬浮培养的重组CHO细胞以1×106个/mL终浓度接入装有3L悬浮培养基的生物反应器中，一般进行5～8倍放大，放大到特定体积时进行抗原的表达，在37℃培养至第5日将温度降至32℃，pH调整至7.5±0.1，并以适宜转速进行培养，在第4日和第9日加入10％起始工作体积的Efficient Feed，每日检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2.5g/L时，补充葡萄糖到3～4g/L。当细胞活率低于75％时，收获上清即为所需抗原。
通过优化该细胞株的培养条件、补料时间，补料量最终获得了1.0mg/ml的融合蛋白表达。
1.6抗原纯化将表达的融合蛋白样品8000rpm离心10min，收集上清后，使用Ni+亲和层析柱进行纯化，纯化蛋白使用生理盐水进行透析，使用SDS-PAGE对其进行鉴定。鉴定结果表明：纯化产物经SDS-PAGE电泳后，目的蛋白片段与预期大小相符。融合蛋白含量为0.8mg/mL，于-80℃冻存。
实例3 SVV-FMDV二联疫苗的配制
将表达收获的SVV-FMDV融合蛋白使用PBS溶液稀释成不同的浓度，将稀释后的融合蛋白溶液与SEPPIC ISA206佐剂按抗原组分与佐剂1:1比例混合在一起，最终配制成0.5μg/头份、5μg/头份、10μg/头份、30μg/头份不同抗原梯度疫苗。以8000r/min的转速搅拌8-10min，在终止搅拌前加入0.01％(体积比)硫柳汞溶液，充分振荡混匀后，按照《中国兽药典》(现行版)附录要求无菌检验、粘度测定、稳定性测定合格后，放置于4℃备用。
实例4重组二联亚单位疫苗安全性和抗体检测
4.1方法
4.1.1动物和免疫
21日龄的新生仔猪经猪***、猪水泡口炎病、猪水泡炎病毒抗体试剂盒检测均为阴性者，PCR检测SVV为阴性。实施例3制备得到的疫苗。新生仔猪每组10只，分成5组，1组为生理盐水对照组，2-5组新生仔猪分别肌肉注射0.5μg/头份、5μg/头份、10μg/头份、30μg/头份疫苗。在免疫前取血。新生仔猪免疫完成后21天进行二次免疫。二免后14日每周取血，检测FMDV和SVV抗体水平。在免疫前后观察每组猪的体重变化，观察是否有发热、厌食等现象。
4.1.2血清抗体检测
抗体检测方法按照猪***(FMD)ELISA抗体检测试剂盒(货号：SBJ-Z180)和猪塞内卡病毒抗体检测试剂(Biostone)说明书进行。二免后两周，每周采集血液，分离血清进行抗体检测。
4.2结果:
4.2.1 FMD抗体检测：50头免疫仔猪，二免后14日进行每周采血检测FMD ELISA抗体水平，检测结果见表1。
表1实验仔猪FMD抗体检测情况
4.2.2SVV抗体检测仔猪二免后14日，5μg/头剂量组所有仔猪抗体水平均转阳(SP值>0.3)。10μg/头剂量组和30μg/头剂量组所有仔猪，二免后14日抗体水平持续升高，明显优于其他低剂量组。具体检测结果见表2。
表2实验仔猪SVV抗体检测情况
上述结果可知，疫苗中抗原含量的增加，对应抗体效价相应的升高，说明抗原免疫仔猪后能够产生良好的免疫原性。
4.2.3免后观察仔猪免疫后体重与对照组仔猪体重增长无明显差异,也无观察到发热、厌食等现象，表明本发明的疫苗安全，见表3。
表3疫苗免疫后安全性试验临床观察情况
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 天康生物(上海)有限公司
天康生物股份有限公司
<120> SVV和FMDV的融合蛋白及其编码基因、表达载体、细胞系、工程菌和疫苗与
应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtcagttt attctgctga tggttggttt agcctgcaca agctgactaa aattactcta 60
ccacctgact gcccacagag tccctgcatt ctctttttcg cctctgctgg tgaggattac 120
accctacgtc tccctgttga ttgtaatcct tcctacgtgt tccactccac cgacaacgcc 180
gagactgggg ttattgaggc gggtaacact gacaccgatt tctctggtga gctggcggct 240
cctggctcta accacactaa tgtcaagttc ctgtttgatc gatctcgatt actgaatgta 300
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gccactcgtt tcggcctgta cgtcaatccg tctgacagtg gcgttctcgc taacacttca 480
ctggatttca atttttacag cttggcctgt ttcacttact ttagatcaga ccttgaagtc 540
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<212> DNA
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gcgcgagtcg cgacacaact tcctgcttcc tttaactacg gtgcaatcca ggcacaggcc 1500
atccacgagc ttctcgtgcg catgaaacgg gccgagctct actgtcccag gccacttcta 1560
gcaataaagg tgacttcgca agacaggtac aagcaaaaga ttattgcgcc cgcaaaacag 1620
ctgttgcctc ccagccccag ccctcccagc cccagcaccc cctccggctg tggggagcag 1680
aacatgatcg gcatgacgcc cacagtcatc gctgtgcact acctggacag caccgaacaa 1740
tgggagaagt tcggcctgga gaagaggcag gaagccttgg agctcatcaa gaaggggtac 1800
acccagcaac tggccttcag acaaaagaac tcagcctttg ccgccttcca ggaccggctg 1860
tccagcaccc tgctgacagc ctatgtggtc aaggtcttcg ctatggcagc caacctcatc 1920
gccatcgact cccaggtcct ctgtggggcc gtcaaatggc tgatcctgga gaagcagaag 1980
cctgatggag tcttcgagga gaatgggccc gtgatacacc aagaaatgat tggtggcttc 2040
aagaacactg aggagaaaga cgtgtccctg acagcctttg ttctcatcgc gctgcaggag 2100
gctaaagaca tctgtgaacc acaggtcaat agcctgttgc gcagcatcaa taaggcaaga 2160
gacttcctcg cagactacta cctagaatta aaaagaccat atactgtggc cattgctggt 2220
tatgccctgg ctctatctga caagctggat gagcccttcc tcaacaaact tctgagcaca 2280
gccaaagaaa ggaaccgctg ggaggaacct ggccagaagc tccacaatgt ggaggccaca 2340
tcctacgccc tcttggctct gctggtagtc aaagactttg actctgtccc tcctattgtg 2400
cgctggctca atgagcagag atactacgga ggtggctatg gatctaccca ggccactttc 2460
atggtgttcc aagccttggc ccaataccag aaggatgtcc ctgatcacaa ggatctgaac 2520
ctggatgtgt ccatccacct gcccagccgc agcgctccag tcaggcatcg tatcctctgg 2580
gaatctgcta gccttctgcg gtaa 2604
<210> 5
<211> 867
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Ser Val Tyr Ser Ala Asp Gly Trp Phe Ser Leu His Lys Leu Thr
1 5 10 15
Lys Ile Thr Leu Pro Pro Asp Cys Pro Gln Ser Pro Cys Ile Leu Phe
20 25 30
Phe Ala Ser Ala Gly Glu Asp Tyr Thr Leu Arg Leu Pro Val Asp Cys
35 40 45
Asn Pro Ser Tyr Val Phe His Ser Thr Asp Asn Ala Glu Thr Gly Val
50 55 60
Ile Glu Ala Gly Asn Thr Asp Thr Asp Phe Ser Gly Glu Leu Ala Ala
65 70 75 80
Pro Gly Ser Asn His Thr Asn Val Lys Phe Leu Phe Asp Arg Ser Arg
85 90 95
Leu Leu Asn Val Ile Lys Val Leu Glu Lys Asp Ala Val Phe Pro Arg
100 105 110
Pro Phe Pro Thr Ala Thr Gly Ala Gln Gln Asp Asp Gly Tyr Phe Cys
115 120 125
Leu Leu Thr Pro Arg Pro Thr Val Ala Ser Arg Pro Ala Thr Arg Phe
130 135 140
Gly Leu Tyr Val Asn Pro Ser Asp Ser Gly Val Leu Ala Asn Thr Ser
145 150 155 160
Leu Asp Phe Asn Phe Tyr Ser Leu Ala Cys Phe Thr Tyr Phe Arg Ser
165 170 175
Asp Leu Glu Val Thr Val Val Ser Leu Glu Pro Asp Leu Glu Phe Ala
180 185 190
Val Gly Trp Phe Pro Ser Gly Ser Glu Tyr Gln Ala Ser Ser Phe Val
195 200 205
Tyr Asp Gln Leu His Val Pro Tyr His Phe Thr Gly Arg Thr Pro Arg
210 215 220
Ala Phe Thr Ser Lys Gly Gly Lys Val Ser Phe Val Leu Pro Trp Asn
225 230 235 240
Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Val Arg Trp Gly Gly Ala Ser Lys Leu
245 250 255
Ser Ser Ala Thr Arg Gly Leu Pro Ala His Ala Asp Trp Gly Thr Ile
260 265 270
Tyr Ala Phe Ile Pro Arg Pro Asn Glu Lys Lys Ser Thr Ala Val Lys
275 280 285
His Val Ala Val Tyr Val Arg Tyr Lys Asn Ala Arg Ala Trp Cys Pro
290 295 300
Ser Met Leu Pro Phe Arg Ser Tyr Lys Gln Lys Met Leu Met Gln Ser
305 310 315 320
Pro Pro Ser Pro Ser Pro Pro Ser Pro Ser Thr Thr Thr Thr Gly Glu
325 330 335
Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Asp Thr
340 345 350
Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val Gly Phe Ile Met Asp Arg
355 360 365
Phe Val Lys Ile Asn Ser Leu Ser Pro Thr His Val Ile Asp Leu Met
370 375 380
Gln Thr His Lys His Gly Ile Val Gly Ala Leu Leu Arg Ala Ala Thr
385 390 395 400
Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val Arg His Asp Gly Asn Leu
405 410 415
Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Ser Asn Thr Ser
420 425 430
Asn Pro Thr Ala Tyr Asn Lys Ala Pro Phe Thr Arg Leu Ala Leu Pro
435 440 445
Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asp Gly Thr Asn
450 455 460
Lys Tyr Ser Ala Ser Asp Ser Arg Ser Gly Asp Leu Gly Ser Ile Ala
465 470 475 480
Ala Arg Val Ala Thr Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile
485 490 495
Gln Ala Gln Ala Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met Lys Arg Ala Glu
500 505 510
Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile Lys Val Thr Ser Gln Asp
515 520 525
Arg Tyr Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Pro Pro
530 535 540
Ser Pro Ser Pro Pro Ser Pro Ser Thr Pro Ser Gly Cys Gly Glu Gln
545 550 555 560
Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala Val His Tyr Leu Asp
565 570 575
Ser Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu Lys Arg Gln Glu Ala
580 585 590
Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln Leu Ala Phe Arg Gln
595 600 605
Lys Asn Ser Ala Phe Ala Ala Phe Gln Asp Arg Leu Ser Ser Thr Leu
610 615 620
Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ala Met Ala Ala Asn Leu Ile
625 630 635 640
Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala Val Lys Trp Leu Ile Leu
645 650 655
Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Glu Glu Asn Gly Pro Val Ile
660 665 670
His Gln Glu Met Ile Gly Gly Phe Lys Asn Thr Glu Glu Lys Asp Val
675 680 685
Ser Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile Ala Leu Gln Glu Ala Lys Asp Ile
690 695 700
Cys Glu Pro Gln Val Asn Ser Leu Leu Arg Ser Ile Asn Lys Ala Arg
705 710 715 720
Asp Phe Leu Ala Asp Tyr Tyr Leu Glu Leu Lys Arg Pro Tyr Thr Val
725 730 735
Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Leu Ser Asp Lys Leu Asp Glu Pro
740 745 750
Phe Leu Asn Lys Leu Leu Ser Thr Ala Lys Glu Arg Asn Arg Trp Glu
755 760 765
Glu Pro Gly Gln Lys Leu His Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Leu
770 775 780
Leu Ala Leu Leu Val Val Lys Asp Phe Asp Ser Val Pro Pro Ile Val
785 790 795 800
Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Thr
805 810 815
Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala Leu Ala Gln Tyr Gln Lys Asp
820 825 830
Val Pro Asp His Lys Asp Leu Asn Leu Asp Val Ser Ile His Leu Pro
835 840 845
Ser Arg Ser Ala Pro Val Arg His Arg Ile Leu Trp Glu Ser Ala Ser
850 855 860
Leu Leu Arg
865
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Pro Pro Ser Pro Ser Pro Pro Ser Pro Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cctcccagcc ccagccctcc cagccccagc 30
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcccccgtcc taatgagaag aaaa 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtgtggcgca gtgtaaggga gagc 24

Claims (10)

1.一种SVV和FMDV的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括SVV VP1蛋白片段、FMDVVP1蛋白片段和补体C3d蛋白片段；
编码所述SVV VP1蛋白片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
编码所述FMDV VP1蛋白片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；
编码所述补体C3d蛋白片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，SVV VP1蛋白片段、FMDV VP1蛋白片段和补体C3d蛋白片段之间通过柔性氨基酸Linker连接；
所述柔性氨基酸Linker的氨基酸序列为SEQ ID NO.6；
优选地，编码所述柔性氨基酸Linker的核苷酸序列为SEQ ID NO.7。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括如下a)或b)：
a)序列表中SEQ ID NO.5的氨基酸序列；
b)将SEQ ID NO.5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.5相同活性的由SEQ ID NO.5衍生的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为序列表中的SEQ IDNO.5。
5.权利要求1-4任一项所述融合蛋白在如下A)-D)中的至少一种的应用：
A)制备SVV和FMDV二联亚单位疫苗；
B)制备SVV和FMDV的抗体；
C)制备检测SVV和FMDV的试剂盒；
D)制备SVV和FMDV诊断抗原。
6.一种权利要求1-4任一项所述融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括如下1)或2)：
1)序列表中SEQ ID NO.4的核苷酸序列；
2)与SEQ ID NO.4的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
7.含有权利要求6所述编码基因的克隆载体或表达载体；
优选地，所述克隆载体包括pMD18-T；
优选地，所述表达载体包括pcDNA3.1。
8.含有权利要求6所述编码基因或权利要求7所述的表达载体的细胞系；
优选地，所述细胞系包括CHO细胞系。
9.含有权利要求6所述编码基因或权利要求7所述的克隆载体或表达载体的工程菌；
优选地，所述工程菌为含有pMD18-T的大肠杆菌DH5α；
优选地，所述工程菌为含有pcDNA3.1的大肠杆菌TOP10。
10.一种SVV和FMDV二联亚单位疫苗，其特征在于，活性成分包括权利要求1-4任一项所述的融合蛋白；
优选地，所述SVV和FMDV二联亚单位疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的至少一种；
优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或ISA206，优选包括ISA206。
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