CN110295249B - 一种用于苹果果实糖含量表型筛选的ssr分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于苹果果实糖含量表型筛选的SSR分子标记及其应用。本发明通过基因分型关联糖含量表型数据确定候选分子标记，成功开发了一个SSR分子标记SugarA3。利用SugarA3进行PCR扩增并结合测序确定(AG)n简单序列重复单位，据此预估果实糖含量。通过SugarA3可产生三种基因型，包括(AG)9/9、(AG)6/9和(AG)6/6 or 11，其中一个或两个(AG)9基序表明对应苹果果实中的果糖和葡萄糖含量显著低于没有(AG)9基序的苹果品种。因此，该SugarA3分子标记的应用有助于实现苹果幼苗期甜度筛选，缩短满足市场需求的优良品种育种年限，提高苹果品质育种效率。

Description

一种用于苹果果实糖含量表型筛选的SSR分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种用于苹果果实糖含量表型筛选的SSR分子标记及其应用。

背景技术

将分子遗传手段应用于农作物育种打破了自然演化以及传统物理化学方法的局限性，具有广阔的发展前景。然而育种相关的早期研究集中于构建遗传连锁图谱，此外，由于缺乏高精度的基因组参考信息，重要农艺性状的基因定位难以应用于生产实践。随着现代基因组学的飞跃发展，涌现了一批高质量基因组序列和注释信息，搭建了基于全基因组关联分析和分子标记辅助育种的强大平台，推动了未来的育种进程。

苹果是我国重要的经济果树，其果实品质的改良，特别是作为决定果实风味品质核心元素之一的可溶性糖含量改变，对于促进苹果产业的提质增效以及提升出口竞争力极具现实意义。然而，苹果的高度杂合、自交不亲和以及童期长等特点严重制约了其育种进程。因此，简单高效的品质改良方案势在必行，而仅通过一个SSR分子标记筛查苹果品种的幼苗预测其果实的可溶性糖含量，将有助于实现了高效分子辅助育种的现实目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于苹果果实糖含量表型筛选的SSR分子标记及其应用。

本发明的用于苹果果实糖含量表型筛选的SSR分子标记SugarA3，用于PCR扩增SSR分子标记SugarA3的引物对为：

正向引物：5'-CACAATTCAAGGGCATTTCAGTC-3'和

反向引物：5'-TCTGCTTCTGGAGCTGGCAT-3'。

本发明的用于苹果果实糖含量表型筛选的SSR分子标记SugarA3是通过以下方法获得的：测定苹果群体成熟果实中的可溶性糖含量，保存该糖含量表型数据。提取上述待筛查苹果品种叶片中的DNA作为常规PCR模板，参考高精度的第三代苹果全基因组序列(GDDH13)设计分子标记进行扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因分型，根据带型位置初步判断(AG)n简单序列重复单位并结合DNA测序以确认具体数目，采用关联分析确定候选SSR分子标记SugarA3。利用SSR分子标记SugarA3可产生三种基因型，包括(AG)9/9、(AG)6/9和(AG)6/6 or 11，其中一个或两个(AG)9基序表明对应苹果果实中的果糖和葡萄糖含量显著低于没有(AG)9基序的苹果品种。

本发明还提供所述的用于苹果果实糖含量表型筛选的SSR分子标记SugarA3在苹果果实甜味品种筛选中的应用，具体是在苹果果实糖含量表型筛选中的应用。

本发明还提供一种利用SSR分子标记SugarA3筛选苹果果实高糖含量品种的方法，其包括以下步骤：

(1)提取待筛查苹果品种叶片中的DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的SSR分子标记SugarA3的PCR扩增引物对进行扩增，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因分型；

(3)根据电泳带型位置初步判断(AG)_n简单序列重复单位并结合DNA测序予以确认简单序列重复单位数目，得到PCR扩增产物的基因型；

(4)通过比对SSR分子标记SugarA3的相应基因型预测苹果果实糖含量，筛选苹果果实高糖含量品种。

具体的，是通过比对SSR分子标记SugarA3的三种基因型(AG)9/9、(AG)6/9和(AG)6/6 or 11预测苹果果实糖含量，其中，一个或两个(AG)9基序表明对应苹果果实中的果糖和葡萄糖含量显著低于没有(AG)9基序的苹果品种。

为进一步验证SugarA3应用于生产实践的可行性，本发明将SSR分子标记SugarA3对应的MdSUT4.1进行草莓果实和苹果愈伤体系的转化，结果显示过表达MdSUT4.1影响可溶性糖的积累(图3，图4)。因此，该SSR分子标记SugarA3应用的可行性毋庸置疑，而且其应用将有助于实现早期苹果幼苗的甜度筛选，缩短满足市场需求的优良品种育种年限，提高苹果品质育种效率。

本发明的有益效果为：

(1)将PacBio三代测序所得的高质量双单倍体苹果全基因组(GDDH13)作为参考序列，与传统基于苹果基因组草图设计简并引物方法相比，其结果更加准确可靠。

(2)本发明的SSR分子标记SugarA3可直接应用于生产辅助育种实践，在苹果杂交育种以及转基因体系初期实现高效筛选。

(3)通过该SSR分子标记定位的苹果糖转运体MdSUT4.1是SUT家族中的关键成员，并借助草莓瞬时转化和苹果愈伤稳定转化体系验证了其糖转运功能，该方案为解析苹果果实糖积累机理奠定了基础，为果实甜度的遗传改良提供了新思路。

附图说明

图1为SSR分子标记SugarA3基因分型的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图2为苹果群体中由SSR分子标记SugarA3确定的三种基因型对应的可溶性糖含量，其中，(AG)n表示简单序列重复单位，其中下标n为测序所得的简单序列重复单位数目。

图3为过表达MdSUT4.1基因的草莓果实中可溶性糖含量的变化。

图4为过表达MdSUT4.1基因的苹果愈伤组织中可溶性糖含量的变化。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：通过SSR分子标记分型检测糖积累相关基因

(1)群体表型数据测定

采摘成熟苹果果实并除去其果皮果核，切成小块的苹果果肉经液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱保存。将-80℃超低温冰箱冻存的果肉样品研磨成粉末状，称取1g果肉粉末样品于15mL离心管中并添加6mL超纯水予以充分混匀，样品经超声15min后，再于4℃高速离心机中离心15min，转速为5000rpm。通过0.22μm Sep-Pak微孔滤膜过滤经离心产生的上清液，保存滤液备用于糖含量测定。糖测定的色谱条件为：CarboSep CHO-620钙型糖柱(300×6.5mm，孔径10μm)和CarboSep CHO-620保护柱芯，运行温度为90℃，流动相为超纯水，流速为0.5mL/min。mg/g FW用于表示果实中的糖含量。

(2)等位基因多态性确认

①DNA提取：通过液氮研磨法将新鲜苹果叶片磨成粉末状，称取100mg叶片粉末待用于苹果基因组DNA提取，详细DNA提取步骤根据天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒进行。

②分子标记片段扩增：使用宝日医生物技术(北京)有限公司的TaKaRa Ex

试剂盒，以稀释后的基因组DNA作为模板，利用SSR分子标记SugarA3的PCR扩增引物对扩增含SSR片段，所述的引物对为：正向引物：5'-CACAATTCAAGGGCATTTCAGTC-3'和反向引物：5'-TCTGCTTCTGGAGCTGGCAT-3'。15μL PCR反应体系如下：

PCR反应程序为：

③等位基因多态性确认

PCR产物变性：将上述PCR产物与上样缓冲液1:1混匀，然后置于98℃处理10min，冰浴5min予以变性。

聚丙烯酰胺凝胶制板：配制8％聚丙烯酰胺凝胶(51mL尿素-TBE、9mL 40％丙烯酰胺、400μL10％过硫酸铵、30μL四甲基乙二胺)，混匀后灌注北京君意JY-JX5L垂直电泳槽。

多态性检测：取1μL已变性的PCR产物进行上样检测，1×TBE作为电泳缓冲液。电泳条件为100w恒定功率，电压1000V，电流200mA，电泳时间90min。

银染显色及结果记录：用自来水冲洗电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，然后将其置于定影液(2g AgNO₃溶解于2L超纯水中)中浸泡10min，自来水冲洗聚丙烯酰胺凝胶后，再将聚丙烯酰胺凝胶置于显影液(将40g NaOH、0.8g Na₂CO₃以及8mL甲醛溶解于2L超纯水中)中浸泡直至出现肉眼可见的条带，然后再用自来水冲洗聚丙烯酰胺凝胶并拍照记录多态性条带，聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图1所示。

多态性条带数据处理：采用相同编号记录胶图同一位置的条带，据此完成多态性读带。将纯合带型对应的PCR产物测序以确认SSR短序列重复单位(AG)n数目。

(3)候选分子标记确认

输入糖含量表型数据、多态性条带、群体结构以及亲缘关系矩阵数据，通过Tassel软件中的混合线性模型(MLM)检测苹果自然群体资源的果实糖含量性状及其相应SSR分子标记的关联性，其中p<0.01表示该SSR分子标记与果实糖含量显著相关，由此确定候选SSR分子标记SugarA3，利用SSR分子标记SugarA3可产生三种基因型，包括(AG)9/9、(AG)6/9和(AG)6/6 or 11，其中一个或两个(AG)9基序表明对应苹果果实中的果糖和葡萄糖含量显著低于没有(AG)9基序的苹果品种。

苹果群体中由SSR分子标记SugarA3确定的三种基因型(AG)9/9、(AG)6/9和(AG)6/6 or 11对应的可溶性糖含量见图2所示。

实施例2：草莓果实和苹果愈伤体系验证候选基因功能

将SSR分子标记SugarA3对应的MdSUT4.1基因的编码序列***至pSAK277双元载体的多克隆位点，以构建pSAK277-MdSUT4.1表达载体并用热激法转化至EHA105农杆菌感受态细胞。在28℃摇床中用含相应抗生素的LB液体培养基培养菌株至OD600＝1.0，收集菌体并制备农杆菌侵染液。用农杆菌侵染液A(5mg/mL葡萄糖、50mM MES、2mM Na₃PO₄·12H₂O和100μM乙酰丁香酮)重悬菌体至OD600＝0.2，通过1mL注射器将菌液从“红颜”草莓绿果基部注入，将已转化草莓植株置于16℃温室中培养9天，摘取草莓果实通过PCR确认转基因材料并按前述高效液相色谱法检测转基因草莓的糖含量变化。并以不含MdSUT4.1基因的农杆菌侵染液作为对照组。结果显示，过表达MdSUT4.1基因的草莓果实中蔗糖含量相对于对照组减少了23％(图3)。

而用于苹果愈伤组织转化的农杆菌则重悬于含100μM乙酰丁香酮的5％蔗糖溶液(pH 5.8)至OD600＝2.0，侵染愈伤组织15min后，通过无菌滤网收集愈伤并将其转移至共培养基(MS+3％蔗糖+1mg/L 6-BA+1mg/L 2,4-D)于25℃下暗培养2天，然后再用含400mg/L头孢霉素的无菌水清洗愈伤后，将其置于筛选培养基(MS+3％蔗糖+1mg/L 6-BA+1mg/L 2,4-D+400mg/L头孢霉素+50mg/L卡那霉素)于25℃暗培养，每20天继代一次，继代5次后通过PCR确认转基因愈伤组织并采用高效液相色谱法检测转基因苹果愈伤的糖含量变化。结果显示，过表达MdSUT4.1基因的苹果愈伤组织中蔗糖含量显著增加1.77mg/g FW，而葡萄糖、果糖和总糖含量则分别显著减少27.96mg/g FW、20.68mg/g FW和48.88mg/g FW(图4)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种利用SSR分子标记SugarA3筛选苹果果实高糖含量品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待筛查苹果品种叶片中的DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用SSR分子标记SugarA3的PCR扩增引物对进行扩增，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因分型；

(3)根据电泳带型位置初步判断(AG)_n简单序列重复单位并结合DNA测序予以确认简单序列重复单位数目，得到PCR扩增产物的基因型；

(4)通过比对SSR分子标记SugarA3的相应基因型预测苹果果实糖含量，筛选苹果果实高糖含量品种；

通过比对SSR分子标记SugarA3的三种基因型(AG)9/9、(AG)6/9和(AG)6/6or 11预测苹果果实糖含量，其中，一个或两个(AG)9基序表明对应苹果果实中的果糖和葡萄糖含量显著低于没有(AG)9基序的苹果品种；

所述的SSR分子标记SugarA3的PCR扩增引物对为：

正向引物：5'-CACAATTCAAGGGCATTTCAGTC-3'和

反向引物：5'-TCTGCTTCTGGAGCTGGCAT-3'。

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