CN110295137A

CN110295137A - 一种乌斑鳢肾细胞系及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN110295137A
Application number: CN201910626036.3A
Authority: CN
Inventors: 王英英; 王庆; 曾伟伟; 李莹莹; 尹纪元; 刘春�; 常藕琴; 石存斌
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2019-10-01
Anticipated expiration: 2039-07-11
Also published as: CN110295137B

Abstract

本发明公开了一种乌斑鳢肾细胞系，其分类命名为乌斑鳢肾细胞系CAMK，于2019年5月8日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏登记编号为CCTCC NO:C201994，上述乌斑鳢肾细胞系的构建方法为：取乌斑鳢消毒后取肾，于含青霉素‑链霉素双抗溶液的培养基中浸泡后剪成小块，胰酶消化液消化，完全培养基重悬混匀，得到重悬混匀液于细胞培养瓶中恒温培养至细胞铺满板子，用胰酶‑EDTA消化液消化后，加入完全培养基继续培养，传代3次后，冻存即得乌斑鳢肾细胞系。本发明中首次成功在体外培养了乌斑鳢肾细胞系，所使用的是鱼类细胞培养的最常用的培养基、且在简单的条件进行原代细胞筛选培养，保证最终获得的细胞无需特殊试剂和条件就能增殖，为其今后的应用提供更好的空间。

Description

一种乌斑鳢肾细胞系及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种细胞系及其构建方法和应用，具体涉及一种乌斑鳢肾细胞系及其构建方法和应用，属于医学生物技术领域。

背景技术

关于鱼类细胞系的研究，国内外取得了很大的研究进展。1962年由Wolf和Quimby建立的虹鳟性腺细胞系(RGT-2)开始，胖头鱼肌肉细胞系、剑尾鱼胚胎细胞系SWT、大西洋鳟内脏组织细胞系AS和巴拉圭鲹幼鱼细胞系等多种包括海淡水鱼类细胞系也陆续建立起来。鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性，所以建立一株需要鱼类细胞系有效的途径是以数量对质量，即制备大批量的原代细胞株，从而筛选出敏感的细胞系。

乌鳢(Channa argus)和斑鳢(Channa maculata)为我国鱼类重要的养殖品种，因其适应性特别强，而被俗称为生鱼，它们同属鲈形目(Perciformes)、攀鲈亚目(Anabantoidei)、鳢科(Channidae)、鳢属(Channa)。乌斑鳢是乌鳢和斑鳢通过鱼类远缘杂交的种间杂交后代，综合了二者的优点，并且在实际的养殖生产过程中体现出本身的杂种优势，具有生长速度快、抗逆性强、成活率高、耐运输、易驯食膨化颗粒饲料等方面的优点。由于鳢科鱼类抗病能力较强，在中国对鳢科鱼类的病害及其防治方面的研究相对较少。随着鳢科鱼类养殖的集约化程度不断提高、养殖规模和养殖密度的逐步扩大，致使鳢科鱼类发生传染病的情况日趋增多，各种病害，尤其是病毒性病害频繁发生，制约了鳢科鱼类养殖业的发展和更快的推广。

世界卫生组织(OIE)推荐检测水产动物病毒的“黄金标准”是通过细胞来分离病毒。为了能够更好有效的分离到水产动物的病毒，及早的检测出病毒，预防疾病的爆发，许多国内外的学者仍然在进行鱼类细胞系的研究。目前尚无关于建立乌斑鳢肾细胞系的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种乌斑鳢肾细胞系及其构建方法和应用，具体采用如下技术方案：

一种乌斑鳢肾细胞系，其分类命名为乌斑鳢肾细胞系CAMK，于2019年5月8日保存在中国典型培养物保藏中心，并证明存活，保藏登记编号为CCTCC NO:C 201994，保藏地址为中国武汉,武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

本发明的乌斑鳢肾细胞系具有以下生物学特性：

(1)特性稳定、形态均一，细胞呈现典型的上皮细胞形态，连续传代培养70代仍保持该形态特点；

(2)细胞具有较强的增殖能力，按1：4的比率进行传代，24小时可铺满瓶底。连续培养70代仍保持该增殖和生长特性。

本发明还提供了上述乌斑鳢肾细胞系的构建方法，包括以下步骤：

(1)取乌斑鳢以75％的酒精浸泡1-2min，于无菌条件下剪取乌斑鳢的肾，放置于浓度为含1000u/ml的青霉素-链霉素双抗溶液的培养基中3-5min备用；

(2)将乌斑鳢的肾剪成小块，胰酶消化液消化，完全培养基重悬混匀，得到重悬混匀液；

(3)将重悬混匀液加入到细胞培养瓶中，27℃培养箱中培养至细胞铺满板子，用胰酶-EDTA消化液消化后，加入完全培养基继续培养；

(4)传代3次后，冻存即得乌斑鳢肾细胞系。

本发明中首次成功在体外培养了乌斑鳢肾细胞系，所使用的是鱼类细胞培养的最常用的培养基、且在简单的条件进行原代细胞筛选培养，保证最终获得的细胞无需特殊试剂和条件就能增殖，为其今后的应用提供更好的空间。该细胞在培养3天时，明显出现延伸生长；7天后铺满板子，进行消化后，具有较强的繁殖能力，呈现典型的上皮细胞形态。细胞连续传代培养13个月已传至70代，仍然保持上述形态特点、生长和增殖特性。因此，该细胞是一种特性稳定、形态均一的乌斑鳢肾细胞系，是研究水产动物病毒的良好材料。

进一步，还包括补充完全培养基的操作，具体为：步骤(2)中将重悬混匀液于培养箱中培养至细胞铺到板子1/3的时候，补充完全培养基。

进一步，完全培养基为含有浓度为100u/ml青霉素-链霉素双抗溶液和20％特级胎牛血清的M199培养基。

本发明还提供了上述的乌斑鳢肾细胞系在水产动物病毒分离中的应用。

进一步，上述的乌斑鳢肾细胞系在水产动物病毒分离中作为研究水产动物病毒宿主细胞使用。

附图说明

图1为本发明实施例1乌斑鳢肾细胞系实验结果；

图2为本发明实施例3乌斑鳢肾细胞系的最适条件探究实验结果；

图3为本发明实施例4乌斑鳢肾细胞的染色体分析结果；

图4为本发明实施例5乌斑鳢肾细胞系对不同水生动物病毒的敏感性实验结果；

图5为本发明实施例6CAMK对罗湖病毒(TiLV)的敏感性实验结果；

图6为本发明实施例6TiLV接种E-11和CAMK细胞的TCID50测定结果；

图7为本发明实施例6间接免疫荧光检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

乌斑鳢肾细胞的分离和原代培养

1.实验材料和试剂

实验动物：150g-300g的乌斑鳢(经过反复分子方法验证未感染水产动物病毒的健康乌斑鳢)。

实验器具：解剖刀、眼科剪刀、眼科镊子、青霉素小瓶、酒精棉和纱布等。

培养基和相关试剂：

青霉素-链霉素双抗溶液浓度为10000u/ml；

培养基：含有浓度为100U/ml青霉素-链霉素双抗溶液和20％胎牛血清(Gibco)的M199培养基(gibco公司)；胰酶消化液(gibco公司)；0.01M的PBS缓冲液(NaCl 80g，Na2HPO4·12H2O 29g，KH2PO4 2g，KCl 25 2g，水1000ml)。

2.实验方法

经过检测的健康乌斑鳢，在实验室内暂养15天，经检测无疾病，开始实验，具体步骤如下：

鲜活乌斑鳢于75％酒精中浸泡1～2min，置于超净台中无菌取下脑组织，用PBS漂洗2遍后，置于5ml的无菌青霉素小瓶中(含5％胎牛血清的M199培养液)，用手术剪将其剪成约1mm³碎块，加入5ml PBS收集至15ml离心管，以600转/min离心1分钟，弃上清，此步骤反复操作3次，可使细胞碎片等蛋白成分充分除去，以免影响消化液的消化作用，加入组织块约5倍体积的Ⅰ型胶原酶，37℃下消化15-25分钟，直至含组织小块的消化液浑浊可终止消化。去掉消化液，PBS洗两次，再加入0.25％胰蛋白酶，室温消化3-5min，加入完全培养液终止消化，用200目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，加入5ml细胞培养液冲洗纱网再过滤一次，将滤过液收集至15ml离心管中，低速离心去上清，收集细胞。纱网上的组织块可以再重复消化，过滤。用含20％FBS的M199培养液充分悬浮细胞，均匀接种于25cm²的培养瓶中，培养条件为27℃。待细胞铺满板子(约7天)，用胰酶消化液进行初步消化后，加入新的培养基进行培养；

传代3次后，冻存，复苏后能够继续稳定增殖生长，该细胞系命名为CAMK；每隔3天传代1次，实验结果如图1，图中，图1A表示原代细胞，图1B表示5代乌斑鳢肾细胞，图1C表示15代乌斑鳢肾细胞，图1D表示50代乌斑鳢肾细胞。

实施例2

乌斑鳢肾细胞系的传代培养和冻存保种

待细胞生长至90﹪时，弃掉旧的培养基，加入1ml胰酶消化液进行消化；待细胞呈现“白雾”状的时候，加入5ml的冻存液，以终止胰酶的作用，轻轻幌动，使细胞混匀，计数。离心后，加入冻存液。收集细胞到冻存管中，于冻存管上注明细胞的名称、细胞数和冻存日期。

一个月后，按照常规细胞复苏的方法，进行细胞复苏，细胞增殖能力仍然很强，状态良好。

获得的乌斑鳢肾细胞系(CAMK)已于2019年5月8日保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，并证明存活，其保藏登记编号为CCTCC NO:C C201994。

实施例3

乌斑鳢肾细胞系的最适条件确定

1.乌斑鳢肾细胞最佳培养基的确定

选择DMEM、M199、MEM、L-15四种细胞培养基，并添加终浓度为10％的FBS制备细胞培养液。调整细胞密度为2×10⁵mL^-1，四种培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线。确定其最适培养基为M199或L-15培养基(图2A)。

2.乌斑鳢肾细胞最适血清浓度的确定

分别配制FBS浓度为5％、10％、15％、20％的培养液，调整细胞密度为2×10⁵mL^-1，四种血清浓度培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线，发现FBS浓度为10％～20％均适合乌斑鳢肾细胞的培养(图2B)。

3.乌斑鳢肾细胞最适培养温度的确定

选择15℃、22℃、27℃、32℃四个不同培养温度，使用添加10％FBS的DMEM培养液，调整细胞密度为2×10⁵mL^-1，细胞悬液按2.5mL/孔的量接种于6孔板并置于于四个不同培养温度培养箱里。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线，发现22℃、27℃均适合乌斑鳢肾细胞的培养(图2C)。收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线。

由图2可知，乌斑鳢肾细胞系在特级胎牛血清20％的M199培养基中，27℃生长，增殖最好。

实施例4

乌斑鳢肾细胞的染色体分析

第60代乌斑鳢肾细胞于对数生长期加入终浓度为10μg/mL的秋水仙素，27℃处理12h后收集细胞，用0.075mol/L的KCl低渗处理20min，加入1mL预冷的卡诺固定液，1000r/min离心5min去上清后，用预冷的卡诺固定液固定3次，每次15min。冷滴片法滴片，干燥后，用5％的Giemsa染色25min。镜检，分别选择100个***相进行核型分析和统计。结果显示(图3，图中，A表示乌斑鳢肾细胞染色体，B表示乌斑鳢肾细胞P60代染色体)，第60代的乌斑鳢肾细胞43％的染色体为2n＝45，与乌斑鳢体细胞的染色体数目一致。

实施例5

乌斑鳢肾细胞系对不同水生动物病毒的敏感性实验(接TiLV、FV3、LMBV、GCRV、SVCV)

将特定浓度的不同病毒(罗非鱼湖病毒TiLV、蛙虹彩病毒FV3、大口黑鲈病毒LMBV、草鱼呼肠孤病毒GCRV、鲤春病毒SVCV)接种于本发明的乌斑鳢肾细胞系，接种后观察细胞产生CPE情况，并用PCR进行定性检测，结果如图4所示(A表示空白对照组，B表示TiLV组，C表示FV3组，D表示GCRV组，E表示SVCV组，F表示LMBV组)，细胞内出现明显的细胞病变(CPE)，说明乌斑鳢肾细胞系能够增殖病毒TiLV、FV3、LMBV、GCRV、SVCV，为水生动物的研究提供了有力的材料。

实施例6

CAMK对罗非鱼湖病毒敏感性实验

1.CAMK对罗湖病毒(TiLV)的敏感性

将细胞接种于25cm²培养瓶中细胞单层达到80％-90％时，用PBS清洗细胞2次加入罗湖病毒(TiLV)悬液1mL，静置吸附1h，吸弃病毒悬液用无血清的培养基清洗细胞表面2次，加入含3％FBS的培养基，在倒置显微镜下观察细胞变化并拍照记录。当CPE(细胞致病作用)出现作为病毒敏感性指标，表明细胞对该病毒敏感。

结果表明：用罗非鱼湖病毒(TiLV)感染CAMK汇合单层细胞，感染后第3d，细胞出现收缩变圆、折光度增加，细胞单层收缩现象。感染后第5d，细胞碎片增多，细胞脱落，单层呈破渔网状，出现典型细胞病变效应(CPE)(图5.B)，而对照组正常(图5.A)。电镜下可观察到TiLV的病毒粒子(图5.C,D)。

2.TiLV接种CAMK细胞的TCID₅₀测定

目前国际上公认的TiLV的敏感细胞系是来自纹月鳢的E-11细胞，为了比较CAMK和E-11对TiLV的敏感性，根据Reed-Muench法测定病毒效价的原理，取生长良好的CAMK和E-11细胞经消化后取样计数，用M199将细胞按照5×10⁴个/mL的浓度进行稀释，以100μL/孔的初始量接种到96孔板培养24h使细胞充分贴壁。次日，取出细胞板弃尽生长液，每孔添加100μL含3％FBS的M199维持液，然后将待检病毒样品按稀释倍数由低到高的顺序以100μL/孔分别添加到96孔板的1～10列各孔中，11～12列各添加100μL含3％FBS的L-15维持液作为阴性对照，该实验设3个重复。将细胞板于37℃、5％CO₂培养箱中培养96h后观察细胞病变(cytopathic effect,CPE)并记录终点,按Reed-Muench法计算病毒的效价，设置两个平行实验。公式为：

病毒效价＝10lgCPE>50％的病毒最高稀释度+(CPE>50％的百分数-50％)/(CPE>50％的百分数-<50％的百分数)TCID₅₀/100μL

结果显示：TiLV感染CAMK细胞系的病毒滴度范围为10^0.125TCID₅₀/ml(感染后2d)-10^7.3TCID₅₀/ml(感染后9d)，高于E-11细胞10^6.7TCID₅₀/ml(感染后9d)。结果如图6。

3.间接免疫荧光实验

接种CAMK细胞至96孔板中，待长至90％满时，每孔加入30μL病毒上清液，在22℃培养箱中孵育，直至出现典型CPE；除去培养液，加入预冷的(-20℃)甲醇在室温下固定10min，用PBS洗3次；加入0.5％Triton进行透化处理10min，用PBS洗3次；加5％BSA 37℃封闭30min，用PBS洗3次；加入鼠抗CAMK一抗，37℃孵育1h，用PBS洗3次；加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，用PBS洗3次；最后于倒置荧光显微镜下观察。

间接免疫荧光实验结果表明，利用针对TiLV的抗体作为一抗孵育细胞，用FITC标记的二抗可以检测到大量的绿色荧光，而对照组未发现特异性绿色荧光，TiLV可以感染CAMK细胞，并被TiLV特异性抗体检测到，结果如图7(A表示对照组，B表示感染TiLV的CAMK细胞)。

用TiLV感染该研究建立的乌斑鳢肾组织细胞后，可导致细胞出现典型细胞病变效应(CPE)，所培养的TiLV经连续传代感染，均能产生典型CPE。经电镜观察，可见到大量的病毒粒子。该细胞可应用于研究TiLV的致病机理、检测方法、疫苗制备、与宿主细胞相互作用及疾病防控等研究。

Claims

1.一种乌斑鳢肾细胞系，其特征在于，所述乌斑鳢肾细胞系为乌斑鳢肾细胞系CAMK，于2019年5月8日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏登记编号为CCTCC NO:C 201994。

2.一种权利要求1所述的乌斑鳢肾细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取乌斑鳢进行消毒，于无菌条件下剪取乌斑鳢的肾，放置于含青霉素-链霉素双抗溶液的培养基中备用；

(4)传代3次后，冻存即得乌斑鳢肾细胞系。

3.根据权利要求2所述的一种乌斑鳢肾细胞系的构建方法，其特征在于，还包括补充完全培养基的操作，所述操作具体为：步骤(2)中将重悬混匀液于培养箱中培养至细胞铺到板子1/3的时候，补充完全培养基。

4.根据权利要求2或3所述的一种乌斑鳢肾细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述消毒的操作为以75％的酒精浸泡1-2min。

5.根据权利要求2或3所述的一种乌斑鳢肾细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述放置于含青霉素-链霉素双抗溶液的培养基中，操作为放置于浓度为含1000u/ml的青霉素-链霉素双抗溶液的培养基中3-5min。

6.根据权利要求2或3所述的一种乌斑鳢肾细胞系的构建方法，其特征在于，所述完全培养基为含有浓度为100u/ml青霉素-链霉素双抗溶液和20％特级胎牛血清的M199培养基。

7.一种权利要求1所述的乌斑鳢肾细胞系在水产动物病毒分离中的应用。