CN110291403B - 通过质谱法测定braf突变和野生型braf蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于测定生物样品中野生型(WT)BRAF蛋白与其蛋白变体之间的摩尔比的方法，其包括以下步骤：a)通过使用丝氨酸蛋白酶消化所述样品，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C‑端切割成谷氨酸残基或将肽键C‑端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基，以获得包含由所述蛋白酶消化所述肽产生的肽片段的组合物，其中所述片段的质量在所述野生型(WT)B‑raf蛋白与一种所述BRAF蛋白变体之间不同。b)使用质谱技术定量测定消化野生型(WT)B‑raf蛋白产生的所述肽片段的摩尔量和消化野生型(WT)B‑raf蛋白的变体产生的所述肽片段的摩尔量。以及，c)基于所述定量评估，计算所述WT BRAF蛋白与其所述变体之间的至少一个具体比值。此外，公开了一种用于评估受试者对BRAF相关疾病的给定药物治疗的敏感性的方法。另外，公开了一种治疗患有BRAF相关疾病的受试者的方法。

Description

通过质谱法测定BRAF突变和野生型BRAF蛋白的方法
技术领域
本发明在广义上涉及医学诊断和靶向治疗领域。更具体地，本发明涉及测定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶BRAF序列的氨基酸形态的具体方法；通过质谱方法学研究野生型和突变形式。更具体地，所述方法涉及分析具有诸如第600位氨基酸的点突变的BRAF序列的能力。此外，本发明涉及提供了一种用于制定用激酶抑制剂对黑色素瘤患者进行个性化治疗的决策的临床应用。
背景技术
已知地，当今对癌症医疗日益增加的需求给研究机构带来强的预测和指引去开发能提高成本效率以改善临床结果的新解决方案。为了应对这些挑战，现代医疗正在寻找对患者更有效且更有益、同时更节省成本的治疗患者的方法。监管指令的方针对我们的研究机构来说至关重要，以使研究机构设法满足癌症患者期望更安全、更低死亡率且药物起效更快的药物的要求。
国家卫生研究所(National Institutes of Health)的下属单位国家癌症研究所(National Cancer Institute)和地方的临床医生和科学家已经在研究出和提供蛋白生物标志物发现和验证策略方面取得了广泛进展。这些监管准则为监管机构(例如美国食品和药物管理局；FDA)的批准流程提供了高质量、标准化、灵敏、特异、定量且易于获取的蛋白、肽，或者健康、疾病或治疗反应的其它生物标志物。
众所周知，大约22％的癌症死亡的原因是由于烟草的使用。另外有10％是由于超重和肥胖、不良饮食以及经常缺乏体育锻炼和过度饮酒。其它因素包括某些感染和/或暴露于感染和环境污染。在发展中国家，近20％的癌症是由于感染如乙型肝炎、丙型肝炎和人类***状瘤病毒造成的。这些因素至少部分是通过改变细胞的基因和蛋白起作用的。在癌症发病之前，通常需要诸多这样的基因变化。从统计学上说，大约5％至10％的癌症是由于遗传自父母的遗传缺陷造成的。
个性化医疗是针对个体患者量身定制的医学治疗模式。在个性化医疗中，优化的治疗法通常被应用于基于患者遗传背景或其它分子或细胞分析的情况来选择适当的治疗手段。遗传信息、药物遗传学的使用在个性化医疗的某些方面发挥了主要作用，尽管“个性化医疗”这一术语最初是在遗传学背景下产生的，但是其已经扩大到了涵盖所有类型的定向个体读数诊断测试。
以个体为基础筛查和测量每一和各个患者，将能够提供更精确的诊断和个性治疗方案。现代的基因分型提供了个体DNA序列的详细说明；随后可以将该基因组与参考基因组进行比较，以评估可以解释可能的疾病状态的已有遗传变异。
使用“个性化医疗”，通过靶向疗法的精确治疗能够极大地帮助预防性护理的进步。这一点多年来已经得到证实，其中通过对女性分别进行针对BRCA1和BRCA2基因中的某些突变的基因分型，研究了黑色素瘤、乳腺癌或卵巢癌家族史原因的倾向性。
通过对疾病表观的多个源进行识别，其根据基因组内存在的突变进行绘制，表明了在个体中其识别越容易，成功治疗的机会越大。伴随诊断定义为被用于测试针对目标患者组或亚组的药物功效和安全性。在许多情况下，伴随诊断测定有助于提高治疗疗法的效率。
如今，在现代医疗中，通常医生会经常使用试错策略，直到他们找到对其患者最有效的治疗方法。因此，考虑个体的改进治疗方法对于这样的新方法是有利的，即该新方法能够有助于指导高复杂度的疾病生物学中的治疗。
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导和相应的途径激活，在细胞生长、分化和应激反应中起着核心作用。在癌症疾病中，MAPK途径激活与许多类型的癌症发病有关。该途径通常由细胞外生长因子与膜结合受体的结合激活，然后其将细胞内蛋白募集到细胞膜上，导致小的三磷酸鸟苷结合蛋白RAS的激活。因此，RAS采用激活的构象，其刺激下游信号传导。这将导致ERK的磷酸化和激活，其控制着细胞内广泛的功能过程。该途径还可以由特定蛋白包括BRAF的突变来激活。与野生型蛋白相比，这样的激活突变似乎可模拟调控BRAF的磷酸化，并增加其激酶活性。
恶性黑色素瘤是全球第六大常见癌症，其在北欧国家和澳大利亚发病率越来越高。根据世界卫生组织(World Health Organization)的统计，全球每年诊断出的黑色素瘤新病例约为132 000例。大多数黑色素瘤的早期病例都是手术治愈的；然而，一些原发性肿瘤会复发并转移。美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer)(AJCC)对肿瘤的分期是基于肿瘤厚度、有丝***速率和溃疡以及区域扩散和远距离扩散。恶性黑色素瘤本身难以治疗，其中5年生存率非常低 (<15％)。
BRAF突变在恶性黑色素瘤中的发生率很高，所述BRAF突变组成性地触发MAPK信号传导并绕过对上游刺激的需求。相应地，通过药物影响对BRAFV600E激酶活性进行细胞抑制会导致MEK和ERK磷酸化的降低。在人类癌症中鉴定的所有BRAF突变中，约90％是外显子15中的T1799A颠换，其导致V600E氨基酸替换和BRAF激酶活化。肿瘤中激活突变的高频率和随之而来的MAPK途径倾向使得 BRAF成为有吸引力的治疗靶标，其中抑制BRAFV600E和其它激活的 BRAF突变体的激酶活性能够提供有效的治疗。
具有不同选择性水平的BRAF抑制剂已经得到鉴定和临床测试。癌症扩散和疾病的起始阶段可以通过一些征兆和症状或诊断测试检测出来。然后，通常通过诸如X射线计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)、磁共振成像(MRI)或质谱成像的多种类型的医学成像平台进行进一步研究，并通过活组织检查的病理学诊断进行确诊。乳腺癌筛查的成效对于患者和社会都是有价值的，正如对患乳腺癌的女性以及患***癌的男性进行治疗所证明的，在这两种疾病中，诊断的发展在过去十年中已经显著地降低了死亡率。
男性最常见的癌症类型是肺癌、***癌、结肠直肠癌和胃癌。女性最常见的事件是乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌和***。然而，如果包括皮肤癌和所有类型的恶性黑色素瘤，那么这将占病例的大约 40％。就儿童而言，癌症类型各不相同，最常见的是急性成淋巴细胞白血病和脑肿瘤。然而，在非洲，最常见的癌症是非霍奇金淋巴瘤。截至2010年，癌症的财政花费估计为每年1.16万亿美元。
大多数黑色素瘤在BRAF、NF1、RAS、MDM2(KIT)基因中都有变化，其导致MAPK和RAS途径的活化，通过重新编程关键细胞周期和凋亡细胞功能而赋予生存优势。临床和病理性质部分地反映了黑色素瘤的已鉴定的(BRAF、RAS、NF1、三重野生型)基因组亚型，但从临床和遗传学角度两者来看，这些群组仍然是异质性的。
允许靶向治疗的新开发药物如激酶抑制剂或调节免疫反应的药物提供了更多的希望。两种化合物维莫非尼(Vemurafenib)和达拉非尼 (Dabrafenib)(激酶抑制剂)已获得FDA批准用于治疗转移性和不可切除的BRAF突变的(V600E)黑色素瘤。曲美替尼(Trametinib)是有丝***原激活的细胞外信号调节激酶(MEK)抑制剂，也是FDA批准的。然而，这些新的治疗物也受到了耐药性发展的影响。最近， FDA批准了纳武单抗(Nivolumab)(PD1抗体)与易普利姆玛 (Ipilimumab)(CTLA-4抗体)结合来治疗同时患有BRAF V600野生型和BRAF突变的不可切除的转移性黑色素瘤的患者。
因此，在开始用靶向激酶抑制剂药物对恶性黑色素瘤患者进行专门治疗之前，非常需要在个体基础上研究BRAF突变及其结果。
发明内容
因此，本发明优选地为了单独地或以任何结合方式减轻、缓解或消除本领域中一种或多种上述缺陷和缺点，并且通过提供一种用于测定生物样品中野生型(WT)BRAF蛋白与其蛋白变体之间的摩尔比的方法来至少解决上述问题，其包括以下步骤：a)通过使用丝氨酸蛋白酶消化所述样品，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C-端切割成谷氨酸残基或将肽键C-端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基，以获得包含由蛋白酶消化所述肽产生的肽片段的组合物，其中所述片段的质量在所述野生型(WT)B-raf蛋白与BRAF蛋白变体之间不同。b)使用质谱技术定量测定由野生型(WT)B-raf蛋白消化产生的肽片段的摩尔量和由野生型(WT)B-raf蛋白的变体消化产生的肽片段的摩尔量。以及，c) 基于定量评估，计算所述WT BRAF蛋白与其变体之间的至少一个具体比值。
还提供了一种用于评估受试者对BRAF相关疾病的给定药物治疗的敏感性的方法，其包括以下步骤：(i)提供来自患有BRAF相关疾病的受试者的样品；以及通过根据权利要求1至9中任一项所述的方法测定WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比。(ii)将WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比(molar specific ratio)与WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比的参考值进行比较，所述参考值是由来自已知患有所述BRAF相关疾病并对所述给定药物治疗敏感的受试者的大量样品测定的。(iii)基于所述比较，确定受试者对给定药物治疗的敏感性，其中所述样品中WT BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值高于WTBRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值参考值表示对给定药物治疗的敏感性增加。
还提供了一种治疗患有BRAF相关疾病的受试者的方法，包括以下步骤：(i)提供来自患有BRAF相关疾病的受试者的样品；以及通过根据权利要求1至9中任一项所述的方法测定WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比。(ii)将WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比与WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比的参考值进行比较，所述参考值是由来自已知患有所述BRAF相关疾病并对所述给定药物治疗敏感的受试者的大量样品测定的。(iii)基于所述比较，确定受试者对给定药物治疗的敏感性，其中所述样品中WT BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值高于WT BRAF与所述至少一种BRAF 蛋白变体的比值参考值表示对给定药物治疗的敏感性增加。以及， (iv)如果发现患者对给定药物治疗具有敏感性，则以规定或限定的日剂量(DDD)施用所述药物治疗的药物持续规定的治疗期，或者如果发现患者对给定药物治疗不敏感，则开始替代治疗，如手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法和/或对所述BRAF相关疾病有益的其它治疗。
附图说明
参考附图，根据本发明实施方案的以下描述，本发明能够实现的这些和其它方面、特征和优点将变得显而易见并得以阐明，其中：
图1显示了BRAF(野生型和突变形式)的基于SRM的定量的一般实验过程，
图2显示了来自新鲜冷冻肿瘤样品的肿瘤组织裂解物中GluC产生的肽，BRAF的野生型和四种突变变体，的SRM特征前体色谱峰。 WT、V600E、V600D、V600R和V600K的保留时间分别为19.9分钟、 23.2分钟、18,3分钟、15.9分钟和15.8分钟，
图3示出了特征性转换离子，其定义来自新鲜冷冻肿瘤样品的肿瘤组织裂解物中肽的SRM特征。这里示出了两个实例：A)野生型和B) V600E，以及
图4说明了在第600位氨基酸的BRAF突变之一(V600E)，以及 BRAFV600E激酶活性的细胞抑制导致MEK磷酸化降低。
具体实施方式
最近，癌症领域已经发现了在传统疾病病理学中呈现的癌症类型的众多遗传多样性。癌症患者之间的肿瘤异质性的定义为单一肿瘤内的遗传多样性。这些发现的前景之一是其提高了识别的可能性，应用于普通人群结果不好的药物也可能对具有具体基因谱的一部分病例成功。
有了个性化医疗，治疗能够更专门地为个体量身定制，并深入了解其身体将对药物的反应，以及药物是否会基于其基因组和随后最终表达为蛋白的转录物而发挥作用。基因分型是个性化医疗的有价值的工具，其中通过检查个体的DNA序列并将其与参考序列进行比较，可以确定个体的遗传组成(基因型)的差异。尽管这能够发现个体中基因突变的存在，但众所周知，基因表达很多时候与细胞的蛋白水平不一致。此外，有可能存在多个基因表达突变的蛋白和野生型蛋白二者。
通过蛋白测序进行的表型分析是在定量水平上确保真实突变和野生型状态的唯一方式，提供了对BRAF的非突变和突变形式的化学计量测量。
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导和相应的途径激活，在细胞生长、分化和应激反应中起着核心作用。在癌症疾病中，MAPK途径活性与许多类型的癌症发病有关。该途径通常由细胞外生长因子与膜结合受体的结合激活，然后其将细胞内蛋白募集到细胞膜上，导致小的三磷酸鸟苷结合蛋白RAS的激活。因此，RAS采用激活的构象，其刺激下游信号传导。这将导致ERK的磷酸化和激活，其控制着细胞内广泛的功能过程。该途径还可以由特定蛋白包括BRAF的突变来激活。与野生型蛋白相比，这样的激活突变似乎可模拟调控BRAF的磷酸化，并增加了其激酶活性。
BRAF突变在恶性黑色素瘤中的发生率高，所述BRAF突变组成性地触发MAPK信号传导并绕过对上游刺激的需求。相应地，通过药物影响对BRAFV600E激酶活性进行细胞抑制将导致MEK和ERK磷酸化的降低。这些翻译后修饰的功能性作用将通过最初的G1细胞周期停滞导致细胞增殖的抑制，然后是细胞死亡。
迄今为止，已经鉴定了超过45种癌症相关的BRAF突变在具体癌症中发生频率较高，其中40％至60％与恶性黑色素瘤有关。在人类癌症中鉴定的所有BRAF突变中，约90％是外显子15中的T1799A颠换，其导致V600E氨基酸替换和BRAF激酶激活。据报道，黑色素瘤癌症和痣(皮肤或粘膜的界限分明的且慢性的病变)的突变变异大于 80％。也有报道，发生率范围较低；在其它肿瘤中范围为0％至18％ (Namba H,Nakashima M,Hayashi T,HayashidaN,Maeda S, Rogounovitch TI,Ohtsuru A,Saenko VA,Kanematsu T,Yamashita S(September 2003)."Clinical implication of hot spot BRAF mutation,V599E, inpapillary thyroid cancers".J.Clin.Endocrinol.Metab.88(9):4393–7.)。
在患者诊断中，已经发现在90％的病例中，胸腺嘧啶在第1799位核苷酸处被腺嘌呤替换。这将导致氨基酸变换；从缬氨酸(V)替换为谷氨酸(E)。这将发生在前面详细描述的激活段中的第600位(Tan YH, Liu Y,Eu KW,Ang PW,Li WQ,Salto-Tellez M,IacopettaB,Soong R(April 2008)."Detection of BRAF V600E mutation by pyrosequencing".Pathology.40(3):295-8.)。
肿瘤中激活突变的高频率和随之而来的MAPK途径倾向使BRAF 成为有吸引力的治疗靶标，其中抑制BRAFV600E和其它激活的BRAF 突变体的激酶活性有可能提供有效的治疗。
将有些药物设计成靶向具有V600E突变的癌症，如维莫非尼 (Vemurafenib)，其导致黑色素瘤细胞系的程序性细胞死亡。然而，最近在一项针对患者的维莫非尼的2期研究中报道的反应效率的结果是，患有转移性黑色素瘤的患者，其在V600-BRAF突变至E600-BRAF处具有突变位置，显示出确认的、独立重复的53％的总体反应率。无进展生存期的中位值为6.8个月，总生存期的中位值为15.9个月(J.A. Sosman,K.B.Kim,L.Schuchter,et al.,“Survival in BRAF V600-mutant advanced melanoma treated with vemurafenib”TheNew England Journal Medicine,2012,366；8 707-714)。
这表明，即使在确定的E600-BRAF突变的病例中，反应率也只有患者的一半(53％)。因此，对于其它47％对治疗没有反应的患者来说，获得治疗是否有效的指示，以给出时间使用其它治疗方法来代替，不仅将是有益的，而且可能也是至关重要的。在维莫非尼的情况下，其通过中断B-Raf/MEK/ERK通路上的B-Raf/MEK步骤起作用。实际上，蛋白酶体抑制剂的易损性依赖于持续的BRAF信号传导。因此，发明人推断V600E BRAF的实际蛋白水平及其与野生型BRAF的比值对于治疗对肿瘤有作用至关重要。因此，在开始用激酶抑制剂治疗恶性黑色素瘤之前，非常需要研究BRAF蛋白的异质性，WT相对于突变变体。具体蛋白分析是绝对重要的原因是激酶抑制剂药物是针对蛋白的三维结构的具体区域开发的。在许多情况下，药物分子与靶蛋白(BRAF)之间的亲和相互作用和结合常数具有对于这种特异性结合最佳的给定能量阈值水平，并且由操作窗口确定，这意味着癌症药物对正确的三维结构非常特异。BRAF蛋白结构和药物的任何改变都可能无法正确结合，导致药物分子在异质BRAF蛋白环境中仅正确结合并抑制具体部分(specific fraction)的BRAF蛋白。
以下描述集中于本发明的实施方案，所述实施方案适用于测量 BRAF蛋白序列、野生型和/或突变变体的状态的质谱方法。然而，应当理解，本发明不限于该应用，而是可以应用于测量组织样品中分子性质和相互作用的其它应用。BRAF突变形式和非突变的BRAF(野生型)的定量在该方法中确定，从而提供BRAF蛋白形式的定量读数。
质谱是有价值的分析技术，因为其以非常高的灵敏度测量任何给定分子的固有性质，其质量。因此，MS可用于测量多种分子类型和多种样品类型/生物材料。在该解离过程中，在形成的一些碎片离子在阱内不稳定的条件下，通过加速将前体离子激活至质量选择性线性离子阱中。经过一段时间延迟后，离子阱的稳定性参数发生变化，以允许捕获此前不稳定的碎片。形成源自具有改进的内能态分布的前体离子的产物离子光谱。在将前体离子导入线性离子阱之后，可能跟随前体内能态分布的演变若干毫秒。时延的碎片化产物离子谱通常显示减少的连续碎片化产物，产生更容易解释的谱。已识别出对时延碎片很重要的几个重要的实验参数，并且该技术可应用于小前体离子和多电荷分子。
串联质谱分析(MS/MS)是复杂混合物的大多数现代质谱研究的核心。碎片化涉及通过与目标气体的碰撞来激活前体离子，并且可能产生带电的碎片和中性的碎片。碎片离子的性质及其强度通常指示前体离子的结构，因此可以为未知分析物的识别生成有用的信息，并为不同类别的分析物提供有用的筛选技术。经多次碰撞的激活可延长激活时间并使较高的能量能够沉积至前体离子中。更高的碰撞气体压力也意味着更高的碰撞弛豫速率(collision relaxation rate)。
电喷雾电离(ESI)是质谱中最常用的电离技术，其在临床实验室中已成为定量测量复杂生物样品中的生物标志物的越来越重要的技术。传统的ESI-MS是多步骤的过程，其中首先将分析物引入质谱仪的电离源中，其中首先使分析物电离以获得正电荷或负电荷。然后带电离子穿过质量分析器，并且根据离子的质荷比(m/z值)对离子进行分类和分离。然后将经分离的离子传递到检测器***以测量其浓度，并且通过计算机***将结果显示在称为质谱的图表上。
当ESI-MS与在质谱分析前用于分析物分级的高效液相色谱 (HPLC)联用时，HPLC/ESI-MS已成为分析复杂生物样品的非常强大的技术。所述仪器将记录分子物质如药物化合物和代谢药物分子的空间分布。此后，可以使用合适的图像处理软件从质谱仪导入数据，以允许可视化并与样品的光学图像进行比较。
在本发明中，发明人使用具有高pH梯度的HPLC或静电色谱分离，然后使用在SRM测定中与MS/MS连接的第二尺寸纳米HPLC预先分级样品、消化的新鲜冷冻肿瘤、***固定和石蜡包埋的肿瘤以及生物流体(即，体液)。BRAF肽的定量分析揭示了肿瘤在蛋白水平上的BRAF状态，并获得了野生型BRAF蛋白与突变的BRAF蛋白之间的比值。野生型与突变之间的BRAF比值可对用激酶抑制剂治疗恶性黑色素瘤的反应具有关键影响。根据该比值，这可作为谁将受益和对治疗有反应的预测工具。
丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶最常用于蛋白消化，因为其产生高度适合于MS(/MS)分析的肽。在消化过程中蛋白被酶促地切割成有限数量的较短片段，将这些片段称为肽，并允许用其特征质量和模式鉴定蛋白。然而，进一步的研究发现，所获得的比值并未模拟细胞中WTV600与突变的V600BRAF肽之间的真实比值。事实上，在肿瘤细胞中发现的其它蛋白产生的片段与使用胰蛋白酶消化从野生型BRAF获得的片段具有相同的序列，因此造成WT与突变的V600BRAF的比值不正确，其可能导致不正确的治疗决策。常用的酶，胰蛋白酶，不会为BRAF的野生型形式产生独特的肽。例如，在两种其它蛋白ARAF (Swizz prot.P10398)和RAF1(Swizz prot.P04049)中也发现了所产生的序列IGDFGLATVK(SEQ ID 11)。BRAF蛋白参考序列见于Swizz prot.P15056。
在本发明中，发现使用在谷氨酸和天冬氨酸的C-端处以高特异性切割的丝氨酸蛋白酶(这里为丝氨酸蛋白酶Glu-C，产生BRAF的野生型和突变变体两者的独特肽。内蛋白酶GluC选择性地将肽键C-端切割成谷氨酸残基。内蛋白酶GluC还在天冬氨酸残基处切割，但速率比谷氨酸残基处的慢100至300倍，因此称为谷氨酸特异性内蛋白酶。
在本发明的一个实施方案中，用于测定生物样品中野生型(WT) BRAF蛋白与其蛋白变体之间的摩尔比的方法，包括以下步骤：(a) 通过使用丝氨酸蛋白酶消化所述样品，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C-端切割成谷氨酸残基或将肽键C-端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基。这是为了获得包含由蛋白酶消化肽产生的肽片段的组合物，其中所述片段的质量在所述野生型(WT)B-raf蛋白与BRAF蛋白变体之间不同。其后(b)使用质谱技术定量测定消化野生型(WT)B-raf蛋白产生的肽片段的摩尔量和消化野生型(WT)B-raf蛋白的变体产生的肽片段的摩尔量。(c)基于定量评估，计算所述WT BRAF蛋白与其变体之间的至少一个具体比值。
在一个实施方案中，BRAF蛋白变体是在对应于WT BRAF中第 600位氨基酸的位置上突变的变体，所述位置在WT BRAF中为缬氨酸。在另一个实施方案中，BRAF蛋白变体是BRAF V600E、V600D、 V600R和/或V600K。
在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶是谷氨酰内肽酶(Glu-C)，如丝氨酸内蛋白酶Glu-C(EC 3.4.21.19)，如属于肽酶家族S1B的丝氨酸内蛋白酶Glu-C，如来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的 GluC，如来自金黄色葡萄球菌V8的GluC，如来自金黄色葡萄球菌V8 的测序级GluC(Promega，Madison，WI)。来自金黄色葡萄球菌菌株 V8的内蛋白酶Glu-C的平均分子量为29.02kDa。
已发现，微环境和催化特异性需要被控制，并且通过测定的缓冲条件进行确定。谷氨酸特异性丝氨酸蛋白酶的特异性取决于所用的缓冲液和pH以及潜在切割位点周围的结构。在乙酸铵(约pH4)或碳酸氢铵(约pH8)中，GluC丝氨酸蛋白酶优先切割谷氨酰键。发明人发现通过使用碳酸氢铵为BRAF产生独特的肽，其随后在测定中产生独特的MS/MS片段：
SEQ ID 1：DLTVKIGDFGLATVKSRWSGSHQFE(WT)，
SEQ ID 2：DLTVKIGDFGLATE(V600E)，
SEQ ID 3：DLTVKIGDFGLATKKSRWSGSHQFE(V600K)，
SEQ ID 4：DLTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE(V600R)以及
SEQ ID 5：DLTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE(V600D)。
类似地，发明人还发现，通过使用磷酸盐缓冲液(约pH8)，GluC 丝氨酸蛋白酶将特异性地切割谷氨酰键和天冬氨酰键两者，因此发明人能够产生突变的较小的肽；根据以下BRAF蛋白序列
SEQ ID 6：FGLATE(V600E)，
SEQ ID 7：GLATD(V600D)，
为稍长的特异性BRAF肽序列的补充；
SEQ ID 8：FGLATVKSRWSGSHQFE(WT)，
SEQ ID 9：FGLATKKSRWSGSHQFE(V600K)，以及
SEQ ID 10：FGLATRKSRWSGSHQFE(V600R)。
在一个实施方案中，消化步骤包括用乙酸铵、碳酸氢铵和/或磷酸盐缓冲液处理所述样品。
在一个实施方案中，消化步骤包括在3.6至5.6，如3.8至4.6，如约4的pH下(在25℃下)，用乙酸铵处理所述样品。
在一个实施方案中，消化步骤包括在8.0至11.3，如8.2至9.5，如约8.5的pH下(在25℃下)，用碳酸氢铵处理所述样品。
在一个实施方案中，消化步骤包括在5.7至8，如7.0至8.0，如约 7.6的pH下(在25℃下)，用磷酸盐缓冲液处理所述样品。
在一个实施方案中，消化定量评估步骤中使用的野生型(WT)B-raf 蛋白产生的多肽片段是根据SEQ ID 1和/或SEQ ID 8的多肽。
在一个实施方案中，消化定量评估步骤中使用的野生型(WT) BRAF蛋白的蛋白变体产生的多肽片段是根据SEQ ID 2、SEQ ID 3、 SEQ ID 4、SEQ ID 5、SEQ ID 6、SEQ ID 7、SEQ ID 9和/或SEQ ID 10的多肽。
在一个实施方案中，消化定量评估步骤中使用的野生型(WT) BRAF蛋白的V600EBRAF蛋白变体产生的多肽片段是根据SEQ ID 2 和/或SEQ ID 6的多肽。
在一个实施方案中，消化定量评估步骤中使用的野生型(WT) BRAF蛋白的V600KBRAF蛋白变体产生的多肽片段是根据SEQ ID 3 和/或SEQ ID 9的多肽。
在一个实施方案中，消化定量评估步骤中使用的野生型(WT) BRAF蛋白的V600RBRAF蛋白变体产生的多肽片段是根据SEQ ID 4 和/或SEQ ID 10的多肽。
在一个实施方案中，消化定量评估步骤中使用的野生型(WT) BRAF蛋白的V600DBRAF蛋白变体产生的多肽片段是根据SEQ ID 5 和/或SEQ ID 7的多肽。
因此，提供了来源于包含WT(V600)和突变(V600E、V600D、 V600R和V600K)的BRAF序列的具体肽。将每种肽的肽序列和碎片化离子用于使用液相色谱质谱(LC-MS/MS)的选择性反应监测测定 (SRM)。在一个实施方案中，质谱技术是HPLC/ESI-MS。
由于蛋白酶不总是产生蛋白的100％完全切割，所以在消化过程中这样的替代切割可能导致其它可能的肽片段。然而，使用质谱方法进行分析，这是可以解释的，因为由替代切割产生的肽仍然是独特的，因此允许WT和/或其突变变体的检测和定量。与其它变体相比，一些替代肽将更频繁地被观察到和/或出现。已发现，替代切割主要产生以下片段：
SEQ ID 11：LTVKIGDFGLATVKSRWSGSHQFE(WT)
SEQ ID 12：DFGLATVKSRWSGSHQFE(WT)
SEQ ID 13：DLTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFE(V600E)
SEQ ID 14：DFGLATEKSRWSGSHQFE(V600E)
SEQ ID 15：FGLATEKSRWSGSHQFE(V600E)
SEQ ID 16：LTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFE(V600E)
SEQ ID 17：DLTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFE(V600E)
SEQ ID 18：LTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFE(V600E)
SEQ ID 19：DFGLATEKSRWSGSHQFE(V600E)
SEQ ID 20：FGLATEKSRWSGSHQFE(V600E)
SEQ ID 21：LTVKIGDFGLATE(V600E)
SEQ ID 22：DFGLATE(V600E)
SEQ ID 23：DFGLATKKSRWSGSHQFE(V600K)
SEQ ID 24：FGLATKKSRWSGSHQFE(V600K)
SEQ ID 25：LTVKIGDFGLATKKSRWSGSHQFE(V600K)
SEQ ID 26：DLTVKIGDFGLATKSRWSGSHQFE(V600K)
SEQ ID 27：LTVKIGDFGLATKKSRWSGSHQFE(V600K)
SEQ ID 28：DFGLATKKSRWSGSHQFE(V600K)
SEQ ID 29：DFGLATRKSRWSGSHQFE(V600R)
SEQ ID 30：FGLATRKSRWSGSHQFE(V600R)
SEQ ID 31：ITVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE(V600R)
SEQ ID 32：DLTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE(V600R)
SEQ ID 33：LTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE(V600R)
SEQ ID 34：DFGLATRKSRWSGSHQFE(V600R)
SEQ ID 35：DFGLATDKSRWSGSHQFE(V600D)
SEQ ID 36：FGLATDKSRWSGSHQFE(V600D)
SEQ ID 37：LTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE(V600D)
SEQ ID 38：DLTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE(V600D)
SEQ ID 39：LTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE(V600D)
SEQ ID 40：DFGLATDKSRWSGSHQFE(V600D)
SEQ ID 41：FGLATDKSRWSGSHQFE(V600D)
SEQ ID 42：DLTVKIGDFGLATD(V600D)
SEQ ID 43：LTVKIGDFGLATD(V600D)
SEQ ID 44：DFGLATD(V600D)
SEQ ID 45：FGLATD(V600D)
在另一个实施方案中，将在消化野生型(WT)B-raf蛋白过程中由替代切割产生的多肽片段用于定量评估步骤。在消化野生型(WT) B-raf蛋白的过程中由这样的替代切割产生的多肽片段可以是根据SEQ ID 11和/或SEQ ID 12的多肽。
在另一个实施方案中，将在消化野生型(WT)B-raf蛋白的蛋白变体的过程中由替代切割产生的多肽片段用于定量评估步骤。在消化野生型(WT)B-raf蛋白的蛋白变体的过程中由这样的替代切割产生的多肽片段可以是根据SEQ ID 13、SEQ ID 14、SEQ ID 15、SEQID 16、 SEQ ID 17、SEQ ID 18、SEQ ID 19、SEQ ID 20、SEQ ID 21、SEQ ID 22、SEQ ID 23、SEQ ID 24、SEQ ID 25、SEQ ID 26、SEQ ID 27、 SEQ ID 28、SEQ ID 29、SEQ ID 30、SEQ ID31、SEQ ID 32、SEQ ID 33、SEQ ID 34、SEQ ID 35、SEQ ID 36、SEQ ID 37、SEQ ID 38、 SEQID 39、SEQ ID 40、SEQ ID 41、SEQ ID 42、SEQ ID 43、SEQ ID 44和/或SEQ ID 45的多肽。
在另一个实施方案中，将在消化野生型(WT)B-raf蛋白的V600E 蛋白变体的过程中由替代切割产生的多肽片段用于定量评估步骤。在消化野生型(WT)B-raf蛋白的V600E蛋白变体的过程中由这样的替代切割产生的多肽片段可以是根据SEQ ID 13、SEQ ID 14、SEQID 15、SEQ ID 16、SEQ ID 17、SEQ ID 18、SEQ ID 19、SEQ ID 20、 SEQ ID 21和/或SEQ ID22的多肽。
在另一个实施方案中，将在消化野生型(WT)B-raf蛋白的V600K 蛋白变体的过程中由替代切割产生的多肽片段用于定量评估步骤。在消化野生型(WT)B-raf蛋白的V600K蛋白变体的过程中由这样的替代切割产生的多肽片段可以是根据SEQ ID 23、SEQ ID 24、SEQID 25、SEQ ID 26、SEQ ID 27和/或SEQ ID 28的多肽。
在另一个实施方案中，将在消化野生型(WT)B-raf蛋白的V600R 蛋白变体的过程中由替代切割产生的多肽片段用于定量评估步骤。在消化野生型(WT)B-raf蛋白的V600R蛋白变体的过程中由这样的替代切割产生的多肽片段可以是根据SEQ ID 29、SEQ ID 30、SEQID 31、SEQ ID 32、SEQ ID 33和/或SEQ ID 34的多肽。
在另一个实施方案中，将在消化野生型(WT)B-raf蛋白的V600D 蛋白变体的过程中由替代切割产生的多肽片段用于定量评估步骤。在消化野生型(WT)B-raf蛋白的V600D蛋白变体的过程中由这样的替代切割产生的多肽片段可以是根据SEQ ID 35、SEQ ID 36、SEQID 37、SEQ ID 38、SEQ ID 39、SEQ ID 40、SEQ ID 41、SEQ ID 42、 SEQ ID 43、SEQ ID 44和/或SEQ ID 45的多肽。
在一个实施方案中，所述比值是一种单一BRAF野生型与一种单一BRAF蛋白变体之间的。在一个替代实施方案中，所述比值是一种单一BRAF野生型与至少两种BRAF蛋白变体之间的，如两种、三种、四种或五种BRAF蛋白变体。
然而，使用所提供的方法，可以衍生出更多的肽。以下在材料和方法中描述了BRAF蛋白的肽的定量分析。可将该SRM测定用于定量从生物样品获得的蛋白制剂中BRAF蛋白的WT或突变肽的相对水平或绝对水平，所述生物样品如消化的新鲜冷冻肿瘤、***固定和石蜡包埋的肿瘤以及生物流体(即体液)。肿瘤组织可以来自恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结肠直肠癌、肺癌、低级神经胶质瘤或卵巢癌肿瘤。生物流体可以是血浆(EDTA、柠檬酸盐、肝素)、血清、全血、血沉棕黄层、血小板、尿液和唾液(salivia)。
因此，在本发明的一个实施方案中，所述样品是肿瘤组织样品或体液。在另一个实施方案中，所述样品是肿瘤组织，所述肿瘤组织优选为来自恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结肠直肠癌、肺癌、低级神经胶质瘤或卵巢癌肿瘤的组织。在另一个实施方案中，所述样品是体液，优选地，所述体液是血浆(EDTA、柠檬酸盐、肝素)、血清、全血、血沉棕黄层和血小板。
目前的肽还可以用作产生和生产新抗体文库的基础，所述新抗体文库将为BRAF及其突变的蛋白形式提供新的抗体，以提高灵敏度和特异性。
可将来自SRM测定的结果用于生物样品(例如，癌组织)中BRAF 蛋白的突变变体和WT变体的精确定量水平，以及生物样品中WT相对于突变的异质性程度。关于生物样品中的BRAF肽的异质性的信息可以使医生或其它医学专业人员更准确地为患者确定适当的疗法。这样的SRM测定可以预测哪个患者最有可能对激酶抑制剂产生反应。将激酶抑制剂，如维莫非尼，开发为特异性地作用并结合第600位氨基酸，其中将结合特性优化至突变的第600位，而不是野生型。这通过图4中所示的第600位氨基酸处的BRAF突变来举例说明。
在本发明的一个实施方案中，质谱技术是与质谱技术连接的液相色谱。在另一个实施方案中，与质谱技术连接的质谱液相色谱是 HPLC/ESI-MS。
在一个实施方案中，通过以下步骤估计受试者对BRAF相关疾病的给定药物治疗的敏感性；提供了一种来自患有BRAF相关疾病的受试者的样品。测定WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比。将WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比与WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比的参考值进行比较，所述参考值是由来自已知患有所述 BRAF相关疾病并对所述给定药物治疗敏感的受试者的大量样品测定的。基于所述比较，确定受试者对给定药物治疗的敏感性，其中所述样品中WT BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值高于WTBRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值参考值表示对给定药物治疗的敏感性增加。
在另一个实施方案中，药物治疗是使用激酶抑制剂如维莫非尼或索拉非尼(Sorafenib)的治疗。
对于黑色素瘤患者，治疗后诊断也是高度未满足的需求，其中确定突变状态以及在蛋白水平上与WT的比值结果的方法是能够提供有效性的患者状态的患者读数测试。在患者携带有包含具有异质性突变谱的细胞的肿瘤的情况下，这可能是重要的，其中治疗仅特异性地针对部分肿瘤细胞，导致整体肿瘤缩小，但留下对药物治疗无反应的较小肿瘤。
因此，在一个实施方案中，在治疗前和治疗后监测受试者对给定药物治疗的敏感性，其中WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比的变化被确定，表示肿瘤组织的突变状态的变化。因此，具体摩尔比的变化可表示，治疗已经成功地根除了对给定治疗敏感的肿瘤细胞；然而，可能需要进行后续治疗以根除其它剩余的肿瘤细胞。因此，本发明的方法可用于探测对初始肿瘤细胞以及治疗后剩余的肿瘤细胞两者的BRAF治疗的敏感性。
该方法还涉及比值测定，其中除了与WT BRAF相关的BRAF 600V至E突变之外，其它突变可能存在于肿瘤组织中。因此，与该方法和创新中的测量的比值相关的测定读数也指纯合WT相对于突变 BRAF患者，以及杂合WT相对于突变BRAF患者。现在，将使用分子测试的诊断用于从患者材料中分离的DNA中的V至E-BRAF的检测中对V至E-BRAF突变有选择性的那些抑制剂。这是目前标准的临床实践，其中通常从患者分离活组织检查材料并将其固定在***中并包埋在石蜡中。该测试特定于该环境，并经FDA批准。V至E-BRAF 突变的这些测定中的接合性没有进行常规评估。因此，在另一个实施方案中，WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比也指纯合WT相对于突变的BRAF患者，以及杂合WT相对于突变的BRAF患者。
已经示出，在含有纯合BRAF V600E突变而没有杂合或野生型 BRAF的黑色素瘤细胞中，维莫非尼可以增强IFNs对MHC分子的诱导。MHC分子对于肿瘤细胞与淋巴细胞之间的相互作用至关重要，并且通过维莫非尼增强的MHC表达可以促进肿瘤细胞免疫识别。维莫非尼对免疫***相关基因表达的影响可能取决于BRAF V600E的接合性，这在黑色素瘤患者中并不常见。
(Sapkota B,Hill CE,Pollack BP.Vemurafenib enhances MHC induction inBRAF(V600E)homozygous melanoma cells.Oncoimmunology. 2013；2:e22890)。黑色素瘤中纯合V至E-BRAF突变的百分比尚不清楚，但在遗传水平上经常发生。已经知道，如通过常规测序程序评估的，大约50％的含有V至E-BRAF突变的黑色素瘤患者是纯合的(Rubinstein JC,Sznol M,Pavlick AC,Ariyan S,Cheng E,Bacchiocchi A, etal.Incidence of the V600K mutation among melanoma patients with BRAFmutations,and potential therapeutic response to the specific BRAF inhibitorPLX4032.J Transl Med.2010；8:67)。此外，V至E-BRAF的接合性能够随时间从杂合变为纯合，这表现在来自不同解剖位置的异时黑色素瘤转移中。一旦黑色素瘤达到转移阶段，突变状态似乎在随后的黑色素瘤转移中保持不变。V至E-BRAF在早期(也存在于良性痣中)突变事件中表现稳定(Sigalotti L,Fratta E,Parisi G,Coral S,Maio M. Stability ofBRAF V600E mutation in metastatic melanoma:new insights for therapeuticsuccess？Br J Cancer.2011；105:327-8)。
因此，在一个实施方案中，在受试者的WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比中BRAF蛋白变体随时间的增加可表明杂合和纯合突变的变化或积累，这是疾病处理的基础。
使用本发明所述的方法，医生将能够做出更好的治疗决策，以对患有BRAF相关疾病的个体进行针对性治疗。因此，在一个实施方案中，治疗患有BRAF相关疾病的受试者的方法包括提供来自患有BRAF 相关疾病的受试者的样品的步骤。测定WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比。将WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比与WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比的参考值进行比较，所述参考值是由来自已知患有所述BRAF相关疾病并对所述给定药物治疗敏感的受试者的大量样品测定的。基于所述比较，确定受试者对给定药物治疗的敏感性，其中所述样品中WT BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值高于WT BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值参考值表示对给定药物治疗的敏感性增加。如果发现患者对给定药物治疗具有敏感性，则以规定的或限定的日剂量(DDD)施用所述药物治疗的药物。对于维莫非尼，这样的规定剂量可以是500mg至2000mg，如每天两次口服960mg。对于达拉非尼，这样的规定剂量可以是50mg至 300mg，如每天两次150mg。对于索拉非尼，这样的规定剂量可以是 200mg至800mg，如每天两次400mg。治疗持续时间通常直到达到疗效为止，或发生不可接受的毒性。如果发现患者对给定的药物治疗不敏感，则表明必须使用其它治疗替代，如手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法和对所述BRAF相关疾病有益的其它治疗。
在一个替代实施方案中，测定WT BRAF蛋白与其至少两种蛋白变体之间的具体摩尔比。将所述WT BRAF蛋白与所述其至少两种变体之间的具体摩尔比与WT BRAF蛋白与其至少两种变体之间的具体摩尔比的参考值进行比较，所述参考值是由来自已知患有所述BRAF相关疾病并对所述给定药物治疗敏感的受试者的大量样品测定的。基于所述比较，确定受试者对给定药物治疗的敏感性，其中所述样品中 WT BRAF与所述至少两种BRAF蛋白变体的比值高于WT BRAF与所述至少两种BRAF蛋白变体的比值参考值表示对给定药物治疗的敏感性增加。
如果发现患者对给定的药物治疗敏感，则所述药物的施用可以以结合治疗的形式。这样的结合治疗可包括结合疗法，如达拉非尼与曲美替尼结合。这样的结合治疗还可以是施用发现患者具有敏感性的药物与其它治疗如手术、放射疗法、化学疗法和免疫疗法结合。因此，在一个实施方案中，治疗是以结合治疗的形式。在另一个实施方案中，这样的结合治疗是以使用两种药物的结合疗法的形式，或者以一种药物和一种其它治疗形式如手术、放射疗法、化学疗法和免疫疗法的结合疗法的形式。
还可以将WT BRAF蛋白和其蛋白变体之间的具体摩尔比分类为低、中和高，其中低包括>10:1的比值，中为10:1至1:10并且高为1:> 10。因此，在一个实施方案中，将WT BRAF蛋白和其蛋白变体之间的具体摩尔比分类为低、中和高，其中低包括>10:1的比值、中为10:1 至1:10并且高为1:>10。
在肿瘤BRAF变体显著占主导地位的情况下，预计治疗会更有效。在肿瘤BRAF野生型显著占主导地位的情况下，预计治疗效果较差。在一个实施方案中，一种治疗患有BRAF相关疾病的受试者的方法包括提供来自患有BRAF相关疾病的受试者的样品的步骤。测定WTBRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比。在一个实施方案中，所述样品中WT BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的低比值(>10:1)表示对给定药物治疗的敏感性低。在一个实施方案中，所述样品中WT BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的中比值(10:1至1:10)表示对给定药物治疗具有至少部分敏感性。其还可以表示含有具有WT BRAF 和不具有WT BRAF的两种细胞群的异质性肿瘤。在一个实施方案中，所述样品中WT BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的高比值 (1:>10)表示对给定药物治疗的敏感性高。如果发现患者对给定药物治疗具有敏感性，则以规定的或限定的日剂量(DDD)施用所述药物治疗的药物。
材料和方法
以下实施例是更多实施例，不应解释为限制本发明的范围。相反，本发明仅受所附权利要求的限制。
人组织的样品制备
使用低温恒温器将来自肿瘤的冷冻组织样品切成10×10μm厚的切片，在-20℃下进行。将切片在200μl 50mM碳酸氢铵和6M尿素中进行裂解。将***固定的石蜡包埋的肿瘤组织用切片机切片，或者从石蜡包埋的块中切出核心。使用EnVision TM FLEX靶向恢复(target retrival)溶液(高pH)(Dako，Glostrup，Denmark)对切片或核心进行脱石蜡化，并在98℃下加热10分钟。将样品在4℃下以14000×g离心10分钟。移除漂浮在表面上的石蜡并吸出恢复溶液。将该步骤重复一次。向样品中添加300μL在50mM碳酸氢铵中的6M氯化胍。将样品用Branson Sonifier 250(输出4，10％占空比)超声处理2分钟，然后以10 000g离心5分钟。
通过BCA方法(Pierce，Rockford，IL)测定样品中蛋白的量。用 10mM DTT(在37℃下1小时)还原固定量(150μg)的蛋白，并使用 40mM碘乙酰胺进行烷基化(30分钟，在室温下保持黑暗)，然后用 50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 7.6)进行缓冲液交换。然后将样品在37℃下用测序级GluC(Promega，Madison，WI)以1:20w/w(酶：蛋白) 的比值消化过夜。通过添加30μL 1％甲酸终止消化。使用离心蒸发器干燥样品，并将其重悬于150μL 1％甲酸中，以10000g离心5分钟。将上清液储存在-80℃直到进一步使用。
肽
肽由Read Glead Discovery AB(Lund，Sweden)提供，纯度大于 95％。
转换列表的生成
在Skyline v3.1.0软件(MacCoss Lab Software，Seattle，WA)中创建转换列表。首先，在2+、3+和4+电荷态下，为每个肽选择大量的转换，所有符合标准的可能y-离子系列(从m/z>前体-2到最后离子-2，前体m/z排除窗口：20Th)。
利用TSQ Vantage三重四极杆MS的SRM测定开发
使用TSQ Vantage三重四极杆质谱仪(Thermo Scientific， Waltham，MA)通过纳米LC-MS/MS分析肽混合物。TSQ配备有Easy n-LC II泵(Thermo Scientific，Waltham，MA)。将样品注射到预柱 Acclaim PepMap100 C8(5×0.3mm，5μm)(Thermo Scientific，Waltham，MA)上，在线上脱盐和浓缩后，在Acclaim PepMap100 C8 (150μm×0.075mm，3μm)(Thermo Scientific，Waltham，MA))上分离肽。以含有0.1％甲酸的10％至35％乙腈的35分钟线性梯度进行分离；流速为300nL/分钟。MS分析以正离子模式进行，其中将喷雾电压和去簇电位分别设定为1750V和0。将转移毛细管温度设定为270℃， S-透镜的振幅为143。在以单位分辨率(0.7FWHM)下操作的Q1和 Q3中获得SRM转换，将Q2中的碰撞气体压力设定为1.2m Torr。循环时间为3.0秒。通过手动检查Skyline中的数据来选择每个前体的转换，并为最终的测定创建预定的转换列表。通过将肽混合物掺加到人 MM组织消化物中，在真实基质(real matrix)中测试了所选择的转变。
利用QExactive MS的SRM测定开发
使用QExactive质谱仪(Thermo Scientific，Waltham，MA)通过纳米LC-MS/MS分析肽混合物。QExactive配备有Easy n-LC 1000泵 (Thermo Scientific，Waltham，MA)。将样品注射到预柱Acclaim PepMap100 C8(5×0.3mm，5μm)(Thermo Scientific，Waltham，MA)上，在线上脱盐和浓缩后，在Acclaim PepMap100 C8(150μm× 0.075mm，3μm)(ThermoScientific，Waltham，MA))上分离肽。以含有0.1％甲酸的5％至40％乙腈的60分钟线性梯度进行分离；流速为 300nL/分钟。在Orbitrap质量分析仪中以m/z 400至1600范围获得全MS扫描，分辨率为70,000(在m/z 200处)。目标值为1.00E+06。在所述方法包括BRAF肽的包括列表，电荷态≥2的15个最强峰在归一化碰撞能量为30％的HCD碰撞池中碎片化，并且在Orbitrap质量分析仪中获得串联质谱，其中在m/z 200处分辨率17,500。目标值为 1.00E+05。离子选择阈值为3.30E+05计数，全MS扫描的最大允许离子累积时间为100ms，串联质谱为60ms。通过手动检查Skyline中的数据来选择每个前体的转换，并为最终的测定创建预定的转换列表。通过将肽混合物掺加到人MM组织消化物中，在真实基质(real matrix) 中测试了所选择的转变。
结果
因此，发现了V600WT、V600E、V600D、V600R和V600K的10 个独特肽片段，其中部分如图2所示，其中示出了来自新鲜冷冻肿瘤样品的肿瘤组织裂解物中GluC产生的肽、BRAF的野生型和四种突变变体的SRM特征前体色谱峰。获得了肽的相应SRM特征，其示出于图3中的A)野生型和B)V600E。列表 进一步总结了这些肽的 SRM/MRM特征色谱峰的特性(SEQ ID 1至SEQ ID 5)。
单氨基酸诱变使得潜在蛋白序列的结合在功能上影响患者的疾病状态和分期。这通过图4中所示的第600位氨基酸处的BRAF突变来举例说明。
下面列出了GluC肽序列和BRAF肽的选定SRM转换的列表：
SEQ ID NO：1：DLTVKIGDFGLATVKSRWSGSHQFE
单同位素质量：2779.10
前体m/z：1389.714(电荷态：2)
转换m/z：1548.7554(y13)，1447.7077(y12)，1348.6393(y11)， 1220.5443(y10)，1133.5123(y9)，977.4112(y8)，791.3319(y7)，704.2998(y6)， 647.2784(y5)，560.2463(y4)，423.1874(y3)，1332.2006(y24)，1275.6586(y23)， 1225.1348(y22)，1175.6006(y21)，1111.5531(y20)，1055.0111(y19)，1026.5003 (y18)，968.9868(y17)，895.4526(y16)，866.9419(y15)，810.3999(y14)，774.8813 (y13)，724.3575(y12)，674.8233(y11)，610.7758(y10)，567.2598(y9)，489.2092(y8)， 396.1696(y7)，352.6536(y6)，324.1428(y5)。
前体m/z：926.8118(电荷态：3)
转换m/z：1548.7554(y13)，1447.7077(y12)，1348.6393(y11)， 1220.5443(y10)，1133.5123(y9)，977.4112(y8)，791.3319(y7)，704.2998(y6)， 647.2784(y5)，560.2463(y4)，423.1874(y3)，1332.2006(y24)，1275.6586(y23)， 1225.1348(y22)，1175.6006(y21)，1111.5531(y20)，1055.0111(y19)，1026.5003 (y18)，968.9868(y17)，895.4526(y16)，866.9419(y15)，810.3999(y14)，774.8813 (y13)，724.3575(y12)，674.8233(y11)，610.7758(y10)，567.2598(y9)，489.2092(y8)， 396.1696(y7)，352.6536(y6)，324.1428(y5)，888.4695(y24)，850.7748(y23)， 817.0923(y22)，784.0695(y21)，741.3711(y20)，703.6765(y19)，684.6693(y18)， 646.3270(y17)，597.3042(y16)，578.2970(y15)，540.6023(y14)，516.9233(y13)， 483.2407(y12)，450.2179(y11)，407.5196(y10)，378.5089(y9)，326.4752(y8)。
前体m/z：695.3607(电荷态：4)
转换m/z：1548.7554(y13)，1447.7077(y12)，1348.6393(y11)， 1220.5443(y10)，1133.5123(y9)，977.4112(y8)，791.3319(y7)，704.2998(y6)， 647.2784(y5)，560.2463(y4)，423.1874(y3)，1332.2006(y24)，1275.6586(y23)， 1225.1348(y22)，1175.6006(y21)，1111.5531(y20)，1055.0111(y19)，1026.5003 (y18)，968.9868(y17)，895.4526(y16)，866.9419(y15)，810.3999(y14)，774.8813 (y13)，724.3575(y12)，674.8233(y11)，610.7758(y10)，567.2598(y9)，489.2092(y8)，396.1696(y7)，352.6536(y6)，324.1428(y5)，888.4695(y24)，850.7748(y23)， 817.0923(y22)，784.0695(y21)，741.3711(y20)，703.6765(y19)，684.6693(y18)， 646.3270(y17)，597.3042(y16)，578.2970(y15)，540.6023(y14)，516.9233(y13)， 483.2407(y12)，450.2179(y11)，407.5196(y10)，378.5089(y9)，326.4752(y8)。
SEQ ID NO：2：DLTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE
单同位素质量：2795.06
前体m/z：1397.693(电荷态：2)
转换m/z：1564.7139(y13)，1463.6662(y12)，1348.6393(y11)， 1220.5443(y10)，1133.5123(y9)，977.4112(y8)，791.3319(y7)，704.2998(y6)， 647.2784(y5)，560.2463(y4)，423.1874(y3)，1340.1799(y24)，1283.6379(y23)， 1233.1140(y22)，1183.5798(y21)，1119.5323(y20)，1062.9903(y19)，1034.4796 (y18)，976.9661(y17)，903.4319(y16)，874.9212(y15)，818.3791(y14)，782.8606 (y13)，732.3367(y12)，674.8233(y11)，610.7758(y10)，567.2598(y9)，489.2092(y8)， 396.1696(y7)，352.6536(y6)，324.1428(y5).
前体m/z：932.1313(电荷态：3)
转换m/z：1564.7139(y13)，1463.6662(y12)，1348.6393(y11)， 1220.5443(y10)，1133.5123(y9)，977.4112(y8)，791.3319(y7)，704.2998(y6)， 647.2784(y5)，560.2463(y4)，423.1874(y3)，1340.1799(y24)，1283.6379(y23)， 1233.1140(y22)，1183.5798(y21)，1119.5323(y20)，1062.9903(y19)，1034.4796 (y18)，976.9661(y17)，903.4319(y16)，874.9212(y15)，818.3791(y14)，782.8606 (y13)，732.3367(y12)，674.8233(y11)，610.7758(y10)，567.2598(y9)，489.2092(y8)， 396.1696(y7)，352.6536(y6)，324.1428(y5)，893.7890(y24)，856.0943(y23)， 822.4118(y22)，789.3890(y21)，746.6907(y20)，708.9960(y19)，689.9888(y18)， 651.6465(y17)，602.6237(y16)，583.6165(y15)，545.9219(y14)，522.2428(y13)， 488.5603(y12)，450.2179(y11)，407.5196(y10)，378.5089(y9)，326.4752(y8)。
前体m/z：699.3503(电荷态：4)
转换m/z：1564.7139(y13)，1463.6662(y12)，1348.6393(y11)， 1220.5443(y10)，1133.5123(y9)，977.4112(y8)，791.3319(y7)，704.2998(y6)， 647.2784(y5)，560.2463(y4)，423.1874(y3)，1340.1799(y24)，1283.6379(y23)， 1233.1140(y22)，1183.5798(y21)，1119.5323(y20)，1062.9903(y19)，1034.4796 (y18)，976.9661(y17)，903.4319(y16)，874.9212(y15)，818.3791(y14)，782.8606 (y13)，732.3367(y12)，674.8233(y11)，610.7758(y10)，567.2598(y9)，489.2092(y8)， 396.1696(y7)，352.6536(y6)，324.1428(y5)，893.7890(y24)，856.0943(y23)， 822.4118(y22)，789.3890(y21)，746.6907(y20)，708.9960(y19)，689.9888(y18)，651.6465(y17)，602.6237(y16)，583.6165(y15)，545.9219(y14)，522.2428(y13)， 488.5603(y12)，450.2179(y11)，407.5196(y10)，378.5089(y9)，326.4752(y8)。
SEQ ID NO：3：DLTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE
单同位素质量：2836.16
前体m/z：1418.23(电荷态：2)
转换m/z：1504.7404(y12)，1348.6393(y11)，1220.5443(y10)， 1133.5123(y9)，977.4112(y8)，791.3319(y7)，704.2998(y6)，647.2784(y5)，560.2463 (y4)，423.1874(y3)，1360.7170(y24)，1304.1750(y23)，1253.6511(y22)，1204.1169 (y21)，1140.0694(y20)，1083.5274(y19)，1055.0167(y18)，997.5032(y17)，923.9690 (y16)，895.4583(y15)，838.9162(y14)，803.3977(y13)，752.8738(y12)，674.8233 (y11)，610.7758(y10)，567.2598(y9)，489.2092(y8)，396.1696(y7)，352.6536(y6)， 324.1428(y5)。
前体m/z：945.8227(电荷态：3)
m/z：1504.7404(y12)，1348.6393(y11)，1220.5443(y10)， 1133.5123(y9)，977.4112(y8)，791.3319(y7)，704.2998(y6)，647.2784(y5)，560.2463 (y4)，423.1874(y3)，1360.7170(y24)，1304.1750(y23)，1253.6511(y22)，1204.1169 (y21)，1140.0694(y20)，1083.5274(y19)，1055.0167(y18)，997.5032(y17)，923.9690 (y16)，895.4583(y15)，838.9162(y14)，803.3977(y13)，752.8738(y12)，674.8233 (y11)，610.7758(y10)，567.2598(y9)，489.2092(y8)，396.1696(y7)，352.6536(y6)， 324.1428(y5)，907.4804(y24)，869.7857(y23)，836.1032(y22)，803.0804(y21)， 760.3820(y20)，722.6874(y19)，703.6802(y18)，665.3379(y17)，616.3151(y16)， 597.3079(y15)，559.6132(y14)，535.9342(y13)，502.2516(y12)，450.2179(y11)， 407.5196(y10)，378.5089(y9)，326.4752(y8)。
前体m/z：709.6189(电荷态：4)
转换m/z：1504.7404(y12)，1348.6393(y11)，1220.5443(y10)， 1133.5123(y9)，977.4112(y8)，791.3319(y7)，704.2998(y6)，647.2784(y5)，560.2463 (y4)，423.1874(y3)，1360.7170(y24)，1304.1750(y23)，1253.6511(y22)，1204.1169 (y21)，1140.0694(y20)，1083.5274(y19)，1055.0167(y18)，997.5032(y17)，923.9690 (y16)，895.4583(y15)，838.9162(y14)，803.3977(y13)，752.8738(y12)，674.8233 (y11)，610.7758(y10)，567.2598(y9)，489.2092(y8)，396.1696(y7)，352.6536(y6)， 324.1428(y5)，907.4804(y24)，869.7857(y23)，836.1032(y22)，803.0804(y21)， 760.3820(y20)，722.6874(y19)，703.6802(y18)，665.3379(y17)，616.3151(y16)， 597.3079(y15)，559.6132(y14)，535.9342(y13)，502.2516(y12)，450.2179(y11)， 407.5196(y10)，378.5089(y9)，326.4752(y8)。
SEQ ID NO：4：DLTVKIGDFGLATKKSRWSGSHQFE
单同位素质量：2808.15
前体m/z：1404.227(电荷态：2)
转换m/z：1577.7819(y13)，1476.7342(y12)，1348.6393(y11)， 1220.5443(y10)，1133.5123(y9)，977.4112(y8)，791.3319(y7)，704.2998(y6)， 647.2784(y5)，560.2463(y4)，423.1874(y3)，1346.7139(y24)，1290.1719(y23)， 1239.6480(y22)，1190.1138(y21)，1126.0664(y20)，1069.5243(y19)，1041.0136 (y18)，983.5001(y17)，909.9659(y16)，881.4552(y15)，824.9132(y14)，789.3946 (y13)，738.8708(y12)，674.8233(y11)，610.7758(y10)，567.2598(y9)，489.2092(y8)， 396.1696(y7)，352.6536(y6)，324.1428(y5)。
前体m/z：936.4874(电荷态：3)
转换m/z：1577.7819(y13)，1476.7342(y12)，1348.6393(y11)， 1220.5443(y10)，1133.5123(y9)，977.4112(y8)，791.3319(y7)，704.2998(y6)，647.2784(y5)，560.2463(y4)，423.1874(y3)，1346.7139(y24)，1290.1719(y23)， 1239.6480(y22)，1190.1138(y21)，1126.0664(y20)，1069.5243(y19)，1041.0136 (y18)，983.5001(y17)，909.9659(y16)，881.4552(y15)，824.9132(y14)，789.3946 (y13)，738.8708(y12)，674.8233(y11)，610.7758(y10)，567.2598(y9)，489.2092(y8)， 396.1696(y7)，352.6536(y6)，324.1428(y5)，898.1450(y24)，860.4504(y23)， 826.7678(y22)，793.7450(y21)，751.0467(y20)，713.3520(y19)，694.3448(y18)， 656.0025(y17)，606.9797(y16)，587.9725(y15)，550.2779(y14)，526.5988(y13)， 492.9163(y12)，450.2179(y11)，407.5196(y10)，378.5089(y9)，326.4752(y8)。
前体m/z：702.6173(电荷态：4)
转换m/z：1577.7819(y13)，1476.7342(y12)，1348.6393(y11)， 1220.5443(y10)，1133.5123(y9)，977.4112(y8)，791.3319(y7)，704.2998(y6)， 647.2784(y5)，560.2463(y4)，423.1874(y3)，1346.7139(y24)，1290.1719(y23)， 1239.6480(y22)，1190.1138(y21)，1126.0664(y20)，1069.5243(y19)，1041.0136 (y18)，983.5001(y17)，909.9659(y16)，881.4552(y15)，824.9132(y14)，789.3946 (y13)，738.8708(y12)，674.8233(y11)，610.7758(y10)，567.2598(y9)，489.2092(y8)， 396.1696(y7)，352.6536(y6)，324.1428(y5)，898.1450(y24)，860.4504(y23)， 826.7678(y22)，793.7450(y21)，751.0467(y20)，713.3520(y19)，694.3448(y18)， 656.0025(y17)，606.9797(y16)，587.9725(y15)，550.2779(y14)，526.5988(y13)， 492.9163(y12)，450.2179(y11)，407.5196(y10)，378.5089(y9)，326.4752(y8)。
SEQ ID NO：5：DLTVKIGDFGLATE
单同位素质量：1478.66
前体m/z：739.8905(电荷态：2)
转换m/z：1363.7468(y13)，1250.6627(y12)，1149.6150(y11)， 1050.5466(y10)，922.4516(y9)，809.3676(y8)，752.3461(y7)，637.3192(y6)， 490.2508(y5)，433.2293(y4)，320.1452(y3)，682.3770(y13)，625.8350(y12)， 575.3111(y11)，525.7769(y10)，461.7295(y9)，405.1874(y8)，376.6767(y7)， 319.1632(y6)。
前体m/z：493.5961(电荷态：3)
转换m/z：1363.7468(y13)，1250.6627(y12)，1149.6150(y11)，1050.5466(y10)，922.4516(y9)，809.3676(y8)，752.3461(y7)，637.3192(y6)， 490.2508(y5)，433.2293(y4)，320.1452(y3)，682.3770(y13)，625.8350(y12)， 575.3111(y11)，525.7769(y10)，461.7295(y9)，405.1874(y8)，376.6767(y7)， 319.1632(y6)，455.2538(y13)，417.5591(y12)，383.8765(y11)，350.8537(y10)， 308.1554(y9)。
前体m/z：370.4489(电荷态：4)
转换m/z：1363.7468(y13)，1250.6627(y12)，1149.6150(y11)， 1050.5466(y10)，922.4516(y9)，809.3676(y8)，752.3461(y7)，637.3192(y6)， 490.2508(y5)，433.2293(y4)，320.1452(y3)，682.3770(y13)，625.8350(y12)， 575.3111(y11)，525.7769(y10)，461.7295(y9)，405.1874(y8)，376.6767(y7)， 319.1632(y6)，455.2538(y13)，417.5591(y12)，383.8765(y11)，350.8537(y10)， 308.1554(y9)。
尽管上文参照一个或多个具体实施例描述了本发明，但是其并不意在限于本文所阐述的具体形式。相反，本发明仅由所附的权利要求限定，并且除上述具体实施方案以外的例如与上述具体实施方案不同的其它实施方案在所附的权利要求的范围内具有相同的可能性。
在权利要求中，术语“包括/包含”不排除存在其它要素或步骤的存在。此外，虽然多个装置、要素或方法步骤单独列出，但其可以通过例如单个元件或处理器执行。另外，虽然各个特征可以被包括在不同的权利要求中，但是这些特征可能有利地被结合，并且包含在不同的权利要求中并不意味着特征的结合是不可行的和/或不利的。另外，单数引用不排除多个。术语“一个”(a)、“一个”(an)、“第一”、“第二”等不排除多个。权利要求中的参考标记仅作为明示的例子，并且不应被解释为以任何方式限制权利要求的范围。
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
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1 5 10 15
Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20 25
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
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1 5 10
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Lys Lys Ser
1 5 10 15
Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20 25
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
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1 5 10 15
Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20 25
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Asp Lys Ser
1 5 10 15
Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20 25
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
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1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
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Gly Leu Ala Thr Asp
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 8
Phe Gly Leu Ala Thr Val Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe
1 5 10 15
Glu
<210> 9
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 9
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1 5 10 15
Glu
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 10
Phe Gly Leu Ala Thr Arg Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe
1 5 10 15
Glu
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 11
Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Lys Ser Arg
1 5 10 15
Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 12
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1 5 10 15
Phe Glu
<210> 13
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 13
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1 5 10 15
Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
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<210> 14
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 14
Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln
1 5 10 15
Phe Glu
<210> 15
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 15
Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe
1 5 10 15
Glu
<210> 16
<211> 24
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 16
Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg
1 5 10 15
Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20
<210> 17
<211> 25
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 17
Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser
1 5 10 15
Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20 25
<210> 18
<211> 24
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 18
Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg
1 5 10 15
Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20
<210> 19
<211> 18
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
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Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln
1 5 10 15
Phe Glu
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 20
Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe
1 5 10 15
Glu
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 21
Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 22
Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu
1 5
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 23
Asp Phe Gly Leu Ala Thr Lys Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln
1 5 10 15
Phe Glu
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 24
Phe Gly Leu Ala Thr Lys Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe
1 5 10 15
Glu
<210> 25
<211> 24
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
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Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Lys Lys Ser Arg
1 5 10 15
Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20
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<211> 24
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 26
Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Lys Ser Arg
1 5 10 15
Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20
<210> 27
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 27
Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Lys Lys Ser Arg
1 5 10 15
Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20
<210> 28
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 28
Asp Phe Gly Leu Ala Thr Lys Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln
1 5 10 15
Phe Glu
<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 29
Asp Phe Gly Leu Ala Thr Arg Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln
1 5 10 15
Phe Glu
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 30
Phe Gly Leu Ala Thr Arg Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe
1 5 10 15
Glu
<210> 31
<211> 24
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 31
Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Arg Lys Ser Arg
1 5 10 15
Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 32
Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Arg Lys Ser
1 5 10 15
Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20 25
<210> 33
<211> 24
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 33
Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Arg Lys Ser Arg
1 5 10 15
Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20
<210> 34
<211> 18
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 34
Asp Phe Gly Leu Ala Thr Arg Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln
1 5 10 15
Phe Glu
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 35
Asp Phe Gly Leu Ala Thr Asp Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln
1 5 10 15
Phe Glu
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 36
Phe Gly Leu Ala Thr Asp Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe
1 5 10 15
Glu
<210> 37
<211> 24
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 37
Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Asp Lys Ser Arg
1 5 10 15
Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20
<210> 38
<211> 25
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 38
Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Asp Lys Ser
1 5 10 15
Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
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<210> 39
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<213> 人(Homo sapiens)
<400> 39
Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Asp Lys Ser Arg
1 5 10 15
Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu
20
<210> 40
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 40
Asp Phe Gly Leu Ala Thr Asp Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln
1 5 10 15
Phe Glu
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 41
Phe Gly Leu Ala Thr Asp Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe
1 5 10 15
Glu
<210> 42
<211> 14
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 42
Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Asp
1 5 10
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 43
Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Asp
1 5 10
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 44
Asp Phe Gly Leu Ala Thr Asp
1 5
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 45
Phe Gly Leu Ala Thr Asp
1 5

Claims (23)

1.丝氨酸蛋白酶在制备用于测定生物样品中野生型BRAF蛋白与其蛋白变体之间的摩尔比的剂中的用途，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C-端切割成谷氨酸残基或将肽键C-端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基，其中所述BRAF蛋白变体是在对应于野生型BRAF中第600位氨基酸的位置上突变的变体，所述位置在所述野生型BRAF中为缬氨酸，其中测定野生型BRAF蛋白与其蛋白变体之间的摩尔比包括以下步骤：
a）通过使用丝氨酸蛋白酶消化所述样品，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C-端切割成谷氨酸残基或将肽键C-端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基，以获得包含通过所述蛋白酶消化所述肽产生的肽片段的组合物，其中所述片段的质量在所述野生型B-raf蛋白与BRAF蛋白变体之间不同；
b）使用质谱技术定量测定消化野生型B-raf蛋白产生的肽片段的摩尔量和消化所述野生型B-raf蛋白的变体产生的肽片段的摩尔量；以及
c）基于定量评估，计算所述野生型BRAF蛋白与其变体之间的至少一个具体比值。
2. 权利要求1的用途，其中所述BRAF蛋白变体是BRAF V600E、V600D、V600R和/或V600K。
3.权利要求1或2中任一项的用途，其中所述丝氨酸蛋白酶是谷氨酰内肽酶。
4.权利要求1或2中任一项的用途，其中所述消化步骤包括用乙酸铵、碳酸氢铵和/或磷酸盐缓冲液处理所述样品。
5.权利要求1或2中任一项的用途，其中所述样品是肿瘤组织样品或体液。
6.权利要求1或2中任一项的用途，其中所述样品是肿瘤组织，所述肿瘤组织是来自恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑肿瘤癌、低级神经胶质瘤或卵巢癌肿瘤的组织。
7. 权利要求1或2中任一项的用途，其中由消化所述定量评估步骤中使用的野生型B-raf蛋白产生的多肽片段是根据SEQ ID 1和/或SEQ ID 8的多肽。
8. 权利要求2的用途，由消化所述定量评估步骤中测量的所述野生型B-raf蛋白的蛋白变体产生的多肽片段是根据SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5、SEQ ID 6、SEQ ID7、SEQ ID 9和/或SEQ ID 10的多肽。
9.权利要求1或2中任一项的用途，其中所述质谱技术是与质谱技术连接的液相色谱。
10.权利要求9的用途，其中所述与质谱技术连接的质谱液相色谱是HPLC/ESI-MS。
11.丝氨酸蛋白酶在制备用于评估受试者对BRAF相关疾病的给定药物治疗的敏感性的剂中的用途，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C-端切割成谷氨酸残基或将肽键C-端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基，其中评估受试者对BRAF相关疾病的给定药物治疗的敏感性包括以下步骤：
（i）提供来自患有BRAF相关疾病的受试者的样品；以及通过根据权利要求1至8中任一项的方法测定野生型BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比；
（ii）将野生型BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比与野生型BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比的参考值进行比较，所述参考值是由来自已知患有所述BRAF相关疾病并对所述给定药物治疗敏感的受试者的大量样品测定的；
（iii）基于所述比较，确定所述受试者对给定药物治疗的敏感性，
其中所述样品中野生型BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值高于野生型BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值参考值表示对给定药物治疗的敏感性增加。
12.权利要求11的用途，其中所述药物治疗是使用激酶抑制剂如维莫非尼、达拉非尼或索拉非尼进行治疗。
13.权利要求11或12的用途，其中在治疗前和治疗后监测受试者对给定药物治疗的敏感性，其中野生型BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比在操作前与操作后的变化表示所述肿瘤组织的突变状态的变化。
14.用于测定生物样品中野生型BRAF蛋白与其蛋白变体之间的摩尔比的方法，其中所述BRAF蛋白变体是在对应于野生型BRAF中第600位氨基酸的位置上突变的变体，所述位置在所述野生型BRAF中为缬氨酸，所述方法包括以下步骤：
a）通过使用丝氨酸蛋白酶消化所述样品，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C-端切割成谷氨酸残基或将肽键C-端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基，以获得包含通过所述蛋白酶消化所述肽产生的肽片段的组合物，其中所述片段的质量在所述野生型B-raf蛋白与BRAF蛋白变体之间不同；
b）使用质谱技术定量测定消化野生型B-raf蛋白产生的肽片段的摩尔量和消化所述野生型B-raf蛋白的变体产生的肽片段的摩尔量；以及
c）基于定量评估，计算所述野生型BRAF蛋白与其变体之间的至少一个具体比值；
其中所述方法用于非诊断目的。
15. 权利要求14的方法，其中所述BRAF蛋白变体是BRAF V600E、V600D、V600R和/或V600K。
16.权利要求14或15中任一项的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶是谷氨酰内肽酶。
17.权利要求14或15中任一项的方法，其中所述消化步骤包括用乙酸铵、碳酸氢铵和/或磷酸盐缓冲液处理所述样品。
18.权利要求14或15中任一项的方法，其中所述样品是肿瘤组织样品或体液。
19.权利要求14或15中任一项的方法，其中所述样品是肿瘤组织，所述肿瘤组织是来自恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑肿瘤癌、低级神经胶质瘤或卵巢癌肿瘤的组织。
20. 权利要求14或15中任一项的方法，其中由消化所述定量评估步骤中使用的野生型B-raf蛋白产生的多肽片段是根据SEQ ID 1和/或SEQ ID 8的多肽。
21. 权利要求15的方法，由消化所述定量评估步骤中测量的所述野生型B-raf蛋白的蛋白变体产生的多肽片段是根据SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5、SEQ ID 6、SEQID 7、SEQ ID 9和/或SEQ ID 10的多肽。
22.权利要求14或15中任一项的方法，其中所述质谱技术是与质谱技术连接的液相色谱。
23.权利要求22的方法，其中所述与质谱技术连接的质谱液相色谱是HPLC/ESI-MS。
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