CN110283820B - 抑制细粒棘球蚴原头节dna氧化损伤修复基因表达的干扰rna及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药工程技术领域,是一种抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA及其应用,该抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA的靶序列为正向CCGUGUUCGUAAGCAGCUUTT、反向AAGCUGCUUACGAACACGGTT。本发明首次公开了抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA的靶序列,也首次公开了其在制备细粒棘球蚴病药物中的应用。本发明通过干扰RNA抑制EgRPS9基因表达,影响细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤的修复作用来抑制和杀灭细粒棘球蚴原头节的生长,从而有效治疗细粒棘球蚴病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域,是一种抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA及其应用。
背景技术
细粒棘球蚴病(cystic echinococcosis,CE),又称为囊型包虫病,是由细粒棘球绦虫的幼虫寄生于人体或宿主动物而引起的一种危害严重的***共患寄生虫病,被WHO列为被忽视的热带病(Neglected Tropical Diseases,NTDs)之一,是全球性的公共卫生问题。家犬是主要的传染源和终宿主(棘球绦虫病),家犬排出成熟节片及大量虫卵时,污染草地、水源、家居环境或附着在其皮毛上,食草动物和人因食入虫卵而被感染。
细粒棘球蚴病在畜牧业发达的国家和地区较为常见,主要流行国家有东亚的中国、蒙古,中亚的土耳其、土库曼斯坦,西亚的***、叙利亚、黎巴嫩,南美的阿根廷、巴西、智利,大洋洲的澳大利亚、新西兰,以及非洲北部、东部和南部的一些国家。我国是世界上细粒棘球蚴病高发的国家之一,主要流行于西北的牧区和半农半牧区,其中以新疆、西藏、宁夏、甘肃、青海、内蒙古、四川等七省(区)最为严重,覆盖国土面积达44%,受威胁人数约6600万,每年被感染家畜在5000万头以上,因家畜死亡和脏器废弃等造成的直接经济损失逾30亿元,因此被列为我国需要重点防治的寄生虫病之一。
细粒棘球蚴病主要治疗方法有外科手术治疗、药物治疗、免疫预防和放射疗法等。目前,临床治疗首选外科手术,以摘除内囊和彻底切除脏器感染部位达到治疗目的。但是由于该病的复杂性,无法做到外囊的完整切除,导致含有活性的细粒棘球蚴原头节的外囊仍留于患者体内,术后复发率高,因此仅适用于包囊数量少和细粒棘球蚴病早期患者,但对患者损伤严重且治疗费用高昂,对于改善复发、多发、晚期患者的生活质量来说,药物治疗的地位不可取代。
目前,经批准上市用于临床治疗细粒棘球蚴病的药物只有苯并咪唑类药物,临床研究发现,该类药物虽然都可以延长患者的生命,减轻临床症状,但不能完全治愈。该类药物存在肠道吸收率差、血液药物浓度和肝脏药物浓度低等缺点,导致作用于病灶部位的有效药物浓度远达不到应有的治疗浓度,减弱了治疗效果。因此,新型高效的治疗细粒棘球蚴病药物的开发和研究刻不容缓。
细粒棘球蚴以包囊形式在人和其它中间宿主的内脏器官中生长,在其早期发育阶段,包囊自身和宿主的新陈代谢及对感染产生的免疫应答都会使活性氧簇(reactiveoxygen species,ROS)快速释放并在体内过度蓄积,当氧化应激超出机体抗氧化能力时会对蛋白、膜脂和DNA造成直接的损伤,产生严重的生物学效应。DNA氧化损伤修复是指当DNA分子遭受到ROS攻击发生氧化损伤时,机体可通过自身修复机制将受损的DNA分子修复的一种针对性反应,能够将损伤的DNA结构恢复原样,重新执行其原来的功能,从而维持基因组的稳定和遗传信息的完整性。
核糖体蛋白S9(ribosomal protein S9,RPS9)是核糖体小亚基40S的组成部分,由RPS9基因所编码,属于核糖体蛋白S4p家族,广泛分布于酵母、细菌、寄生虫、哺乳动物和人类等多种生物体中。研究表明,RPS9基因是一个高度保守的基因,可能具有DNA损伤修复、自体翻译调控、发育调控和正常细胞的恶性转化及其他还未发现的功能。有研究发现RPS9参与P53通路来调节细胞的增殖分化与凋亡,沉默RPS9会引发多种细胞反应,可抑制癌细胞被激活后的生长,RPS9敲除也会激活P53通路,引起肿瘤细胞的衰老、分化、凋亡等一系列生物学过程,为抗肿瘤药物的设计提供了新思路。同时发现RPS9与细胞凋亡有关,认为RPS9在神经细胞的氧化损伤中具有保护作用。RPS9与核磷蛋白B23/NPM结合蛋白相互作用,对正常细胞增殖有一定影响。RPS9还参与mRNA的翻译,改变其C末端后,核糖体很多基因的表达会发生显著改变。
与其它任何需氧生物一样,寄生虫在宿主体内寄生过程中不可避免地存在氧胁迫的问题,虫体自身在有氧条件下通过呼吸过程将氧气还原为水,当氧气还原不完全时则会生成ROS,有研究发现在体外培养条件下,细粒棘球蚴原头节可代谢H2O2,同时宿主的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞均可以产生ROS,会破坏寄生虫细胞乃至整个虫体。采用电穿孔法将EgRPS9-siRNA转染细粒棘球蚴原头节,特异性干扰EgRPS9基因的表达,再以H2O2干预构建氧化损伤模型,从而研究EgRPS9基因对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤的修复作用。
发明内容
本发明提供了一种抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA及其应用,克服了上述现有技术之不足,其通过干扰RNA抑制EgRPS9基因表达影响细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤的修复作用来抑制和杀灭细粒棘球蚴原头节的生长,从而有效治疗细粒棘球蚴病。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的:一种抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA,干扰RNA的靶序列为正向CCGUGUUCGUAAGCAGCUUTT、反向AAGCUGCUUACGAACACGGTT。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的:一种抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的:一种抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA在制备治疗抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复药物中的应用。
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的:一种抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA在制备治疗抑制细粒棘球蚴原头节RPS9基因表达药物中的应用。
本发明首次公开了抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA的靶序列,也首次公开了其在制备细粒棘球蚴病药物中的应用。本发明通过干扰RNA抑制EgRPS9基因表达,影响细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤的修复作用来抑制和杀灭细粒棘球蚴原头节的生长,从而有效治疗细粒棘球蚴病。
附图说明
附图1为本发明中EgRPS9-siRNA电穿孔转染效率图。
附图2为本发明中粒棘球蚴原头节体外耐受H2O2干预最大浓度的确定图。
附图3为本发明中干扰EgRPS9基因表达后细粒棘球蚴活力变化图。
附图4为本发明中细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤单细胞凝胶电泳图像图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制,可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明,均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品;本发明中的百分数如没有特殊说明,均为质量百分数;本发明中的溶液若没有特殊说明,均为溶剂为水的水溶液,例如,盐酸溶液即为盐酸水溶液;本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度,一般定义为25℃。
下面结合实施例对本发明作进一步描述:
实施例1:该抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA,干扰RNA的靶序列为正向CCGUGUUCGUAAGCAGCUUTT、反向AAGCUGCUUACGAACACGGTT。
本发明抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA(可简称siRNA)能够特异性靶向细粒棘球绦虫的RPS9基因,特异性下调细粒棘球绦虫RPS9基因的表达,干扰RNA序列转染细粒棘球蚴原头节,进而影响细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤的修复作用和降低棘球蚴原头节的活力,来实现抑制和杀灭细粒棘球蚴原头节的生长,从而有效治疗细粒棘球蚴病。
实施例2:该抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用。
实施例3:该抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA在制备治疗抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复药物中的应用。
实施例4:该抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA在制备治疗抑制细粒棘球蚴原头节RPS9基因表达药物中的应用。
本发明可实现干扰RNA作为药物活性成分直接进入病灶来防治细粒棘球蚴病。根据实际使用的需要,将含有上述干扰RNA序列的病毒载体或质粒载体作为活性成分,通过对载体进行酶切,然后将干扰RNA与酶切后的载体连接得到连接产物,将所述连接产物转化至感受态细胞中筛选出阳性克隆即可。
本发明抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用,具体到临床应用时,一般采用在手术过程中注射的方式,干扰RNA通过浸泡或转染的方式进入细粒棘球蚴,从而消灭其生长过程。干扰RNA对细粒棘球蚴原头节进行转染时,脱除通过本领域技术人员现有公知的电穿孔转染的方法,例如通过电穿孔仪进行。
为了说明本发明抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA的效果,进行了体外细粒棘球蚴原头节的杀灭实验,具体的实验过程如下:
实验1:细粒棘球蚴原头节的采集和培养
细粒棘球蚴原头节取自新疆乌鲁木齐华凌屠宰场感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏包囊,无菌条件下抽取包囊内的囊液,分离原头节,经1%胃蛋白酶消化30min后,用加入1%青霉素和链霉素的无菌生理盐水清洗5次,1%伊红染色法检测活性>98%的原头节可用于试验,培养体系为RPMI1640:胎牛血清:青链霉素=89:10:1,于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。
实验2:RNA干扰序列的设计与合成
合成与鉴定EgRPS9-siRNA有效序列:根据EgRPS9基因序列(GeneBank:AGY97023),设计EgRPS9-siRNA的序列,由上海吉玛制药技术有限公司合成小分子的EgRPS9-siRNA,并筛选得到本发明所用的siRNA(小分子干扰RNA)分子(绿色荧光修饰),靶序列为(siRNA正义链和反义链与靶序列碱基配对):正向CCGUGUUCGUAAGCAGCUUTT,反向AAGCUGCUUACGAACACGGTT,阴性对照干扰序列亦由该公司合成提供。
实验3:细粒棘球蚴原头节电穿孔方法转染EgRPS9-siRNA
实验分组:EgRPS9-siRNA干扰组,阴性对照组(非特异性siRNA)及空白对照组(未加siRNA进行转染)。
实验方法:设置100μL转染体系,将在实验室体外驯化培养2d的细粒棘球蚴原头节用磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗3次,按以上分组,将约2000个原头节加入上述组的电转缓液,siRNA干扰序列终浓度为5μM于电击杯中。用Bio-Rad公司MicroPulser型电穿孔仪,设置电穿孔参数为:方波,125V,20ms,4mm电击杯,脉冲1次,分别对细粒棘球蚴原头节进行转染。电穿孔后迅速将电击杯放入37℃恒温培养箱中孵育10min,再转移至加入1mL正常培养基的24孔板中继续培养3d。
转染1h后,每组收集约250个细粒棘球蚴原头节,磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗3遍后涂片,倒置荧光显微镜下观察各组原头节体内绿色荧光强度(荧光强度与转染效率成正比),并采集荧光图像。
实验4:细粒棘球蚴原头节体外耐受H2O2干预最大浓度的确定
将细粒棘球蚴原头节加入96孔细胞培养板中,密度为250个/孔,每组设置3个复孔。向培养基中加入H2O2使其终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mM,干预1h后收集细粒棘球蚴原头节,1%伊红染液染色5min后涂片并采集图像(活:拒染;死:红色),确定细粒棘球蚴原头节体外耐受H2O2干预的最大浓度。
实验5:EgRPS9-siRNA对细粒棘球蚴原头节活性的影响
1)存活率检测
转染3d后,加入自然状态下细粒棘球蚴原头节耐受H2O2干预的最大浓度处理1h,每组细粒棘球蚴原头节分别用1%伊红染液染色5min后,涂片、计数,倒置荧光显微镜下观察活性并计算存活率。
2)碱性磷酸酶活性检测
电转染3d后,加入自然状态下细粒棘球蚴原头节耐受H2O2干预的最大浓度处理1h,收集每组细粒棘球蚴原头节的培养液上清,在96孔板中设置标准品孔、对照孔和样品孔,标准品的用量分别为4、8、16、24、32、40μL,加样品至总体积50μL,按表1所示加样。37℃孵育10min后,每孔加入100μL反应终止液终止反应,用酶标仪测吸光度(A405值),计算碱性磷酸酶活性。
实验6:EgRPS9-siRNA干扰后EgRPS9-mRNA的表达水平变化
1)总RNA提取及cDNA的合成
电转染3d后,加入自然状态下原头节耐受H2O2的最大耐受浓度处理1h后液氮速冻,TRIzol法提取总RNA,核酸定量仪测定总RNA浓度。逆转录使用Takara公司PrimeScriptTM RTReagent Kit试剂盒,配制好的反应体系置PCR仪中37℃孵育15min,85℃加热5s终止反应,取出后-20℃保存待用。
2)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
以上述逆转录合成cDNA为模板进行qRT-PCR,检测EgRPS9-mRNA的表达,以β-actin为内参,EgRPS9基因上、下游引物为F:AGAAGAGTGGCGATGGCGATGA,R:CCGTGTGATGGGTAGGCGAAGA。反应程序为:95℃30s;95℃5s、60℃30s,共40循环;72℃10min;从95℃起,以20.0℃/s的速度降温至65℃;65℃孵育15s后,以20.0℃/s的速度升温至95℃,用于溶解曲线分析。
实验7:单细胞凝胶电泳试验检测干扰EgRPS9基因表达后细粒棘球蚴原头节DNA损伤情况
电转3d后,加入自然状态下原头节耐受H2O2的最大耐受浓度处理1h,吸去培养液,预冷PBS缓冲液洗1遍,收集虫体。采用双层铺胶法,将离心沉淀的原头节用低熔点琼脂糖重悬,铺于第一层胶板上,凝固后将胶板浸入新配置的细胞裂解液中裂解4.5h后取出胶板,用PBS冲洗2次,浸入新配置的碱性电泳缓冲液碱解旋20min,25V电泳30min。电泳完成后将胶板置于Tris-HCl(pH 7.5)中和15min,PI染液避光染色15min,超纯水脱色5min,倒置荧光显微镜下观察并采集图像,用CASP软件测定OTM值(OTM值与DNA损伤程度成正比)。
实验8:干扰EgRPS9基因后细粒棘球蚴原头节体内活性氧(ROS)含量检测
电转3d后,加入自然状态下原头节耐受H2O2的最大耐受浓度处理1h,将原头节收集至1.5mL EP管中,用无血清RPMI1640培养基清洗1遍。ROS检测试剂盒中的荧光染料DCFH-DA用无血清RPMI1640培养基以1:500比例稀释,每EP管加40μL,37℃水浴30min,用无血清RPMI1640培养基清洗3遍,再加200μL无血清RPMI1640培养基,转移至黑色96孔板进行检测,全波长扫描式多功能酶标仪检测荧光强度。检测条件为:激发波长485nm,检测波长525nm。
实验结果如下
转染效果的评价:倒置荧光显微镜观察转染后的细粒棘球蚴原头节,结果如图1(A、B:EgRPS9-siRNA干扰组;C、D:阴性对照组;E、F:空白对照组)所示。图1中EgRPS9-siRNA干扰组和阴性对照组显示细粒棘球蚴原头节体内有明亮的绿色荧光斑点(即为图1中显示的灰色斑点);而空白对照组细粒棘球蚴原头节体内无绿色荧光斑点。图1说明采用上述转染参数和转染体系通过电穿孔仪可将绿色荧光干扰序列成功导入细粒棘球蚴原头节体内,且转染效果较好。
细粒棘球蚴原头节体外耐受H2O2干预的最大浓度:不同浓度H2O2体外干预自然状态下的细粒棘球蚴原头节1h,通过1%伊红拒染试验检测原头节活性,结果如图2(A:0.2mM;B:0.4mM;C:0.6mM;D:0.8mM;E:1.0mM;F:2.0mM)所示,图2显示原头节在0.2、0.4mM H2O2终浓度干预后均不着色,表明活性良好;在0.6mM H2O2终浓度干预后部分开始着色,随着H2O2干预终浓度升高,着色率增加;在2.0mM H2O2终浓度干预后全部着色,示为细粒棘球蚴原头节全部死亡。图2说明H2O2诱发了细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤,H2O2干预终浓度逐渐升高,其自身的修复作用开始无法完全抵御H2O2造成的DNA氧化损伤。因此确定细粒棘球蚴原头节体外耐受H2O2干预的最大浓度为0.4mM,干预时间为1h。
特异性干扰EgRPS9基因表达后细粒棘球蚴原头节活性检测结果
1)伊红拒染试验检测细粒棘球蚴原头节存活率结果
EgRPS9-siRNA干扰组细粒棘球蚴原头节的存活率为(26.59±2.76)%,与阴性对照组[(92.97±1.87)%]和空白对照组[(95.31±1.46)%]相比差异有统计学意义(χ2=14.618、15.973,均P<0.01),结果如图3(A:EgRPS9-siRNA干扰组;B:阴性对照组;C:空白对照组)所示,图3说明干扰EgRPS9基因表达后,原头节对H2O2的耐受能力下降,故EgRPS9基因对于原头节的生长存活及在宿主内寄生十分重要(Eg为细粒棘球绦虫的拉丁学名简称)。
2)碱性磷酸酶活性检测结果
酶标法绘制的碱性磷酸酶标准工作液线性方程为:Y=0.1585X-0.0524,R2=0.9989(n=5),线性关系良好。将各组A405值带入线性方程,得到EgRPS9-siRNA干扰组原头节体内碱性磷酸酶活性为0.008±0.001,与阴性对照组(0.094±0.001)和空白对照组(0.098±0.001)相比,差异均有统计学意义(t=9.257和9.946,均P<0.01),表明原头节EgRPS9基因经干扰后对其活性影响较大。
干扰EgRPS9基因表达后细粒棘球蚴原头节EgRPS9-mRNA表达水平变化
qRT-PCR检测各组EgRPS9-mRNA表达水平的变化,EgRPS9-siRNA干扰组EgRPS9-mRNA表达量为0.223±0.060,与阴性对照组(1.001±0.013)和空白对照组(1.001±0.009)相比均显著下调(t=8.026、7.939,均P<0.01)。
干扰EgRPS9基因表达后细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤程度变化
各组DNA氧化损伤单细胞凝胶电泳图像如图4(A:空白对照组;B:阴性对照组;C:EgRPS9-siRNA干扰组)所示,相同电泳条件下,EgRPS9-siRNA干扰组细粒棘球蚴原头节DNA碎片离开核向阳极迁移,形成拖尾;而阴性对照组和空白对照组细粒棘球蚴原头节细胞核结构紧密,无拖尾现象。EgRPS9-siRNA干扰组彗星尾距OTM值为14.357±2.005,与阴性对照组(0.087±0.031)和空白对照组(0.065±0.028)相比,差异有统计学意义(t=12.959、13.285,均P<0.01)。图4说明干扰EgRPS9基因表达后导致了原头节较为严重的DNA氧化损伤,即EgRPS9基因无法发挥其修复DNA氧化损伤的功能。
干扰EgRPS9基因表达后细粒棘球蚴原头节体内ROS含量检测
经EgRPS9-siRNA序列干扰后,细粒棘球蚴原头节体内ROS含量为14.105±0.247,与阴性对照组(2.633±0.059)和空白对照组(2.396±0.021)相比,差异有统计学意义(t=10.003、10.978,均P<0.01)。表明EgRPS9-siRNA干扰组原头节的氧化损伤程度较其他两组更为严重,因此干扰EgRPS9基因表达后会导致DNA氧化损伤程度的加重。
因此综合上述结果我们可以看出,本发明针对EgRPS9目的基因,设计干扰序列,采用电穿孔转染技术,特异性下调EgRPS9的表达细粒棘球蚴原头节体内存在一套抗氧化酶系,包括超氧化物酶、过氧化氢酶等,能够清除代谢过程中不断产生的ROS,使机体内ROS处于一个相对稳定的水平。采用H2O2诱发细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤,使这种平衡状态被打破,便会引发一系列过氧化反应导致细粒棘球蚴原头节DNA受损,而ROS含量的增加是过氧化反应中的关键环节。应用EgRPS9-siRNA后,EgRPS9基因修复细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤的作用被抑制,降低了原头节的活力,增加了原头节DNA氧化损伤的程度,基于上述实验结果可以发现本发明的干扰RNA能成功抑制EgRPS9基因表达并抑制EgRPS9基因的作用。
综上所述,本发明首次公开了抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA的靶序列,也首次公开了其在制备细粒棘球蚴病药物中的应用。本发明通过干扰RNA抑制EgRPS9基因表达,影响细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤的修复作用来抑制和杀灭细粒棘球蚴原头节的生长,从而有效治疗细粒棘球蚴病。
以上技术特征构成了本发明的实施例,其具有较强的适应性和实施效果,可根据实际需要增减非必要的技术特征,来满足不同情况的需求。
表1
空白对照 | 标准品 | 样品 | |
检测缓冲液 | 50μL | (100-X)μL | (50-Y)μL |
显色底物 | 50μL | - | 50μL |
样品 | - | - | YμL |
标准品工作液 | - | XμL | - |
Claims (4)
1.一种抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA,其特征在于干扰RNA的靶序列为正向CCGUGUUCGUAAGCAGCUUTT、反向AAGCUGCUUACGAACACGGTT。
2.一种根据权利要求1所述的抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用。
3.一种根据权利要求1所述的抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA在制备治疗抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复药物中的应用。
4.一种根据权利要求1所述的抑制细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤修复基因表达的干扰RNA在制备治疗抑制细粒棘球蚴原头节RPS9基因表达药物中的应用。
Priority Applications (1)
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