CN110283334A - 一种提高槐木生物降解效果的预处理方法 - Google Patents

一种提高槐木生物降解效果的预处理方法 Download PDF

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Abstract

一种提高愈创木基‑紫丁香基木质素类农林废弃物生物降解效果的预处理方法，涉及一种槐木预处理方法。是要解决由于槐木中愈创木基‑紫丁香基木质素含量高难于生物降解的问题。方法：一、对槐木进行研磨，过20目筛，得到槐木碎屑；二、将槐木碎屑加入无机盐进行处理；三、然后滤去无机盐溶液，蒸馏水洗涤，经抽滤后，调节pH值，烘干至恒重，即完成。本发明通过化学预处理方法，无机盐预处理使得天然木质纤维素的表面光滑致密结构变得粗糙不规则，表面纤维束被破坏，原料变得疏松多孔，使后续生物处理更容易进入到内部，增加了物料与酶的接触面积、酶的接触位点及酶载荷量，进而提高生物降解效果。本发明用于天然木质纤维素降解领域。

Description

一种提高槐木生物降解效果的预处理方法
技术领域
本发明涉及一种槐木预处理方法。
背景技术
到20世纪末，可再生能源能源产生的能量占到世界总能耗的13％，其中很大一部分是基于生物质材料提供的能源。世界各国在木质素生物质的应用已经用一定的规模，在木材资源丰富的加拿大，生物质材料产生的能源占居民总能源的5％，占整个工业消耗的17％。木质纤维素是廉价、丰富的可再生资源，充分利用将有利于改善目前资源紧张、环境污染等问题，对社会实现可持续发展具有重要的意义。
槐树是一种常见树种，在中国分布广泛，在北方一带尤为多见，广东，台湾，甘肃，四川，云南等地也广泛种植。中国北方多用作行道树，是防风固沙，用材及经济林兼用的树种。因其木材平直，加工性能良好，不易老化，防腐防虫，稳定性好，宜做家具、地板等。槐木是一种典型阔叶型天然木质纤维素(其木质素由松柏醇和芥子醇的脱氢聚合物构成愈创木基-紫丁香基木质素)，在天然条件下的降解难度远大于秸秆以及常见的乔木等实验室材料，对其进行微生物降解，所产生的降解酶系也呈现较低的酶活性。现有研究表明化学预处理可以提高微生物降解天然木质纤维素过程中相关酶活，但大多为强酸强碱类，存在处理成本较高并会产生大量副产物，对环境造成二次无污染等问题。因此获得高效、经济的槐木生物降解方式可对愈创木基-紫丁香基木质素类农林废弃物无害化处理有显著的影响。
发明内容
本发明是要解决由于槐木中愈创木基-紫丁香基木质素含量高，难于生物降解的问题，提供一种提高槐木生物降解效果的预处理方法。
本发明提高槐木生物降解效果的预处理方法，包括以下步骤：
一、研磨处理：
去除槐木中杂质，对槐木进行物理研磨，过筛，得到粒径为20目的槐木碎屑；
二、无机盐预处理：
将经过步骤一处理后的槐木碎屑中加入无机盐溶液，于55～65℃下处理46～50h；所述无机盐为质量浓度9％～13％的FeCl2溶液；其中槐木碎屑与无机盐溶液的固液比为1:(9～11)g/mL；
三、然后滤去无机盐溶液，蒸馏水洗涤残渣至pH值不再发生变化，经抽滤后，调节pH值至6～7，于55～65℃下烘干至恒重，即完成。
步骤三使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节pH值，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.1mol/L，pH值为3。
步骤三中烘干的具体方法为：放入鼓风干燥箱中干燥。
本发明的有益效果：
本发明通过化学预处理方法，无机盐预处理使得天然木质纤维素的表面光滑致密结构变得粗糙不规则，表面纤维束被破坏，原料变得疏松多孔，使后续生物处理更容易进入到内部，增加了物料与酶的接触面积、酶的接触位点及酶载荷量，进而提高生物降解效果。
无机盐预处理去除木质素和半纤维素改变木质纤维素基质的结构，促进产酶量的提高。无机盐预处理过程中，连接多糖和木质素之间的阿魏酸、对羟基苯甲酸和对羟基肉桂酸等关键性酯键都被打断，并削弱半纤维素和纤维素之间的氢键结合，这些官能团的变化明显促进木质素的溶解，导致更为有效的木质素酶的接触。经过无机盐处理后的物料增加了纤维比表面积，更具多孔性，因此，无机盐处理后的基质更适合丝状真菌的生长。
经过探究烟曲霉高效降解槐木的最佳无机盐种类为FeCl2，浓度为11％，此时菌株产木质素酶活性最高，其中锰过氧化物酶酶活最大值为2244U/L，较对照组提高了3倍；木质素过氧化物酶活最大值为292.3U/L，较对照组提高了2.1倍，且提前3d出现酶活性最高值。
附图说明
图1为各种预处理方式对烟曲霉G-13产木质素降解酶活的影响。
图2为不同浓度FeCl2预处理槐木后锰过氧化物酶的酶活变化。
图3为不同浓度FeCl2预处理槐木后木质素过氧化物酶的酶活变化。
图4为槐木未经过预处理且未进行生物降解的扫描电镜图像。
图5为预处理效果最佳未进行生物降解的扫描电镜图像。
图6为未进行预处理进行生物降解的扫描电镜图像。
图7为经过最佳预处理进行生物降解的扫描电镜图像。
图8是槐木在不同预处理及生物降解前后的傅里叶红外光谱图。
图9为槐木在不同预处理及生物降解前后的XRD结晶度谱图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式提高槐木生物降解效果的预处理方法，包括以下步骤：
一、研磨处理：
去除槐木中杂质，对槐木进行物理研磨，过筛，得到粒径为20目的槐木碎屑；
二、无机盐预处理：
将经过步骤一处理后的槐木碎屑中加入无机盐溶液，于55～65℃下处理46～50h；所述无机盐为质量浓度9％～13％的FeCl2溶液；其中槐木碎屑与无机盐溶液的固液比为1:(9～11)g/mL；
三、然后滤去无机盐溶液，蒸馏水洗涤残渣至pH值不再发生变化，经抽滤后，调节pH值至6～7，于55～65℃下烘干至恒重，即完成。
将槐木物理研磨处理至20目后采用化学预处理手段处理槐木。研磨处理的目的是通过降低其粒径或破坏其结构的规律性，增加与木质素降解酶接触面积。天然木质素被粉碎之后，提高了一些化学试剂对木质素作用，促进木质素酶对木质素的降解。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中于60℃下处理47～49h。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中所述无机盐溶液为质量浓度9％～13％的FeCl2溶液。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中所述无机盐溶液为质量浓度11％的FeCl2溶液。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中槐木碎屑与无机盐溶液的固液比为1:11g/mL。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节pH值。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.1mol/L，pH值为3。其它与具体实施方式六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中烘干的具体方法为：放入鼓风干燥箱中干燥。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤三中调节pH值至6.5。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤三中于60℃下烘干至恒重。其它与具体实施方式一至九之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
本实施例提高槐木生物降解效果的预处理方法，包括以下步骤：
一、研磨处理：
去除槐木中杂质，对槐木进行物理研磨，过筛，得到粒径为20目的槐木碎屑；
二、无机盐预处理：
将经过步骤一处理后的槐木碎屑中加入无机盐溶液，于55～65℃下处理46～50h；所述无机盐为质量浓度9％～13％的FeCl2溶液；其中槐木碎屑与无机盐溶液的固液比为1:(9～11)g/mL；
三、然后滤去无机盐溶液，蒸馏水洗涤残渣至pH值不再发生变化，经抽滤后，调节pH值至6～7，于55～65℃下烘干至恒重，即完成。
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.1mol/L，pH值为3。
对上述方法得到的槐木进行以下实验：
(一)采用固态培养方式培养，于150mL锥形瓶中添加预处理后的槐木样品3g，依据槐木与大量元素营养盐溶液固液比为1:1.5添加大量元素营养盐溶液，并加入体积约为大量营养盐溶液0.1％的微量元素营养盐溶液，于120℃高压灭菌20min。后接入孢子悬液3.5mL，在30℃下进行培养，分别于培养第3、6、9、12、15、18、21d取样进行发酵液木质素酶活测定。每组3个平行样。
孢子悬液的制备：用接种环挑取烟曲霉菌G-13，接入无菌水中，制成浓度为106个/mL的孢子悬液，4℃冰箱保存备用；所述烟曲霉菌G-13已经发表在文章《木质素降解真菌菌丝球自固定化细胞体系的建立》中。
(二)粗酶液制备：取发酵后固态基质至离心管，并按照1g底物添加5mL200mmol/L乙酸-乙酸钠(pH值4.5)缓冲溶液，于30℃100r/min振荡浸提40min。于6000r/min室温下离心10min，所得上清液即为粗酶液。
(三)木质素酶活力测定：
锰过氧化物酶活力测定：反应体系内加入3.4mL 200mmol/L pH值为4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液，0.1mL 1.6mmol/L MnSO4溶液和0.4mL粗酶液，最后加入0.1mL 1.6mmol/L H2O2溶液启动反应，在30℃下反应3min，于240nm测定吸光度的变化值。1个酶活单位(U/L)定义为：反应前3min内，每min氧化1μmol Mn2+成为Mn3+的平均需酶量。每个样品平行测定3次求平均值。
木质素过氧化物酶活力测定：反应体系内加入1.5mL 250mmol/L pH值为3酒石酸-酒石酸钠缓冲液，1mL 15mmol/L藜芦醇溶液和0.4mL的粗酶液，最后加入0.1mL 20mmol/L的H2O2溶液启动反应，在30℃下反应3min，于310nm测定吸光度的变化值。1个酶活单位(U/L)定义为：反应前3min内，每min氧化1μmol藜芦醇成为藜芦醛的平均需酶量。每个样品平行测定3次取平均值。
(四)发酵底物处理：取离心残渣用蒸馏水洗涤抽滤，直至滤液颜色不再变化，然后向滤渣加水，于5000r/min下离心10min，洗涤3次，沉淀物于60℃烘干至恒重，用于后续的扫描电镜、红外光谱和X-射线衍射的表征。
结果如图1所示。图1显示了各种预处理方式对烟曲霉(A.Fumigatus)G-13产木质素降解酶活的影响。
图1中数据分别为各种预处理的发酵底物培养21d内所产各种木质素酶活的最高值，其中Mnp和Lip酶活15d达到最大，其中经11％FeCl2和11％FeCl3预处理的槐木，其Lip酶活在12d达到最大。由图2可以看出11％浓度的FeCl2，FeSO4和ZnCl2溶液对酶活提高较为显著，Mnp分别较对照组提高了3倍、2.7倍、2.1倍；Lip分别较对照组提高了2.1倍、2.4倍、2.3倍。虽然FeCl2预处理Lip酶活较FeSO4和ZnCl2处理低，但是FeCl2预处理提前3d出现Lip酶活性最高值。经实验筛选可知A.Fumigatus G-13发酵槐木的最佳预处理无机盐是FeCl2。
图2和图3分别为不同浓度FeCl2预处理槐木后Mnp和Lip酶活变化趋势图。不同时间条件下，研究木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶活性的变化，以槐木固态培养基质，在30℃下连续测试21天。结果显示2种木质素降解酶活性均呈现先上升后下降的趋势，在15d附近达到酶活最大值，其中浓度为11％的FeCl2溶液预处理后较2％和8％FeCl2处理酶活有明显提升，且Mnp活性提高较Lip明显。槐木的Mnp和Lip分别在15d和12d达到最大值，最大值分别为2244U/L和292.3U/L。结果表明，11％浓度FeCl2溶液预处理槐木能促进产酶且提升产酶速度。
(五)扫描电镜分析
图4为槐木未经过预处理且未进行生物降解的扫描电镜图像；图5为预处理效果最佳未进行生物降解的扫描电镜图像；图6为未进行预处理进行生物降解的扫描电镜图像；图7为经过最佳预处理进行生物降解的扫描电镜图像。如图4～7所示，未经过预处理的槐木表面片状物质或覆盖，理化结构致密均匀，排列紧密整齐；经FeCl2溶液预处理并用烟曲霉菌株生物降解的槐木表面致密结构已经被破坏，表面结构变得粗糙不规则，疏松化明显，槐木表面纤维束出现剥落甚至断裂的现象，并呈现出一系列不规则的微孔洞和裂痕。这些结构变化增加了纤维比表面积，从而增加了与酶的接触面积、酶的接触位点及酶载荷量。提高了木质素酶对物料的可及度，破坏了木质纤维素天然屏障，从而提高了酶解效率。
(六)红外分析
图8是槐木在预处理及生物降解前后的傅里叶红外光谱图，测定波数范围为4000-400cm-1。图8中曲线A为槐木未经过预处理且未进行生物降解，曲线B为预处理效果最佳未进行生物降解，曲线C为未进行预处理进行生物降解，曲线D为经过最佳预处理进行生物降解的红外光谱图。
由图8可知，4个光谱有很多相似之处，表明处理后槐木结构中的主要基团没有发生明显变化。但各基团透射率的相对强度却改变了，说明槐木的成分在量上发生了明显变化。1736cm-1处的酯键(C＝O)吸收峰在未处理的槐木中较为明显，而经过最佳预处理后此峰的强度减弱，说明连接多糖和木质素之间的阿魏酸、对羟基苯甲酸和对羟基肉桂酸等关键性酯键都被打断，进一步对预处理后的样品进行生物处理会使得该峰强度显著减弱，说明联合处理能断裂更多木质素和多糖之间的关键性酯键。原槐木在1618cm-1和1507cm-1附近处有较强特征吸收峰，此峰是苯环骨架的伸缩振动，代表木质素组分的伸展，FeCl2预处理后经A.Fumigatus发酵处理的槐木在此吸收峰不明显，说明除去了大部分木质素。并且1618cm-1，1507cm-1及1319cm-1附近为典型的木质素红外吸收峰，对比A与B、C、D可以看出随处理手段的运用峰强呈现了明显的减弱，说明预处理促进菌株产木质素酶，诱导菌株对槐木的进一步降解。
(七)X射线衍射分析
纤维素结晶度反映的是纤维素中结晶区所占的相对比例，而不是绝对比例。研究表明无定形木质素和半纤维素的减少也同样会影响样品中纤维素结晶区的比例。如图9所示，图9中曲线A为槐木未经过预处理且未进行生物降解，曲线B为经过最佳预处理未进行生物降解，曲线C为未进行预理进行生物降解，曲线D为经过最佳预处理进行生物降解的扫描电镜图像。
根据XRD分析和相关计算得出槐木结晶度。槐木经过预处理后，纤维素结晶度(CrI)下降，说明FeCl2破坏了晶体结构；不经预处理直接用烟曲霉发酵的槐木的结晶度反而高于未处理槐木的CrI，可能原因是在烟曲霉发酵过程中产生的木质素酶降解无定形木质素，但结晶纤维素保留在槐木结构中，导致直接发酵处理的槐木的CrI增加。预处理后经烟曲霉发酵的槐木的结晶度降低，这是由于FeCl2预处理能够打断连接多糖和木质素之间的关键性酯键和醚键的联接，削弱半纤维素和纤维素之间的氢键结合，预处理后木质素和半纤维素等无定型物质的降解溶出；随后烟曲霉发酵产生的木质素酶能够有效地降解木质素，从而使纤维素的非结晶区暴露出来，槐木中的纤维素显著润胀，木质纤维素结构的结晶指数降低，纤维素结晶区被破坏，从而结晶度降低。

Claims (10)

1.一种提高槐木生物降解效果的预处理方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、研磨处理：
去除槐木中杂质，对槐木进行物理研磨，过筛，得到粒径为20目的槐木碎屑；
二、无机盐预处理：
将经过步骤一处理后的槐木碎屑中加入无机盐，于55-65℃下处理46-50 h；所述无机盐的质量浓度为9%~13%；其中槐木碎屑与无机盐溶液的固液比为1:（9~11）g/mL；
三、然后滤去无机盐溶液，蒸馏水洗涤残渣至pH值不再发生变化，经抽滤后，调节pH值至6~7，于55~65 ℃下烘干至恒重，即完成。
2.根据权利要求1所述的一种提高槐木生物降解效果的预处理方法，其特征在于步骤二中于60 ℃下处理46~50 h。
3.根据权利要求1所述的一种提高槐木生物降解效果的预处理方法，其特征在于步骤二中所述无机盐溶液为质量浓度10%~12%的FeCl2溶液。
4.根据权利要求1所述的一种提高槐木生物降解效果的预处理方法，其特征在于步骤二中所述无机盐为质量浓度11%的FeCl2溶液。
5.根据权利要求1所述的一种提高槐木生物降解效果的预处理方法，其特征在于步骤二中槐木碎屑与无机盐溶液的固液比为1:11 g/mL。
6.根据权利要求1所述的一种提高槐木生物降解效果的预处理方法，其特征在于步骤三中使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节pH值。
7.根据权利要求1所述的一种提高槐木生物降解效果的预处理方法，其特征在于所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.1mol/L，pH值为3。
8.根据权利要求1所述的一种提高槐木生物降解效果的预处理方法，其特征在于步骤三中烘干的具体方法为：放入鼓风干燥箱中干燥。
9.根据权利要求1所述的一种提高槐木生物降解效果的预处理方法，其特征在于步骤三中调节pH值至6.5。
10.根据权利要求1所述的一种提高槐木生物降解效果的预处理方法，其特征在于步骤三中于60℃下烘干至恒重。
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