CN110283238A - 水稻抗病蛋白rwr1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻抗病蛋白RWR1及其应用。本发明提供了如下1)‑3)中任一种物质在调控植物抗病性中的应用:1)蛋白RWR1;2)编码蛋白RWR1的DNA分子;3)含有编码蛋白RWR1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。本发明的实验证明,RWR1基因过量表达的转基因水稻在受到稻瘟菌侵害时,相比野生型水稻,稻瘟菌菌丝的生长受到明显的抑制,使其对稻瘟菌的抗性显著提高。因此,RWR1基因与水稻对稻瘟菌的抗性相关;RWR1蛋白及其编码基因可用于农业和生态环境治理所需的抗病植物品种的培育与鉴定,在植物抗病育种领域中具有重要作用。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域,涉及一种水稻抗病蛋白RWR1及其应用。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物,由病原微生物引起的水稻病害严重影响水稻产量和品质。随着人们对水稻-病原菌互作机制研究的不断深入,利用抗病基因培育水稻抗病品种已成为水稻育种专家们防治水稻病害最有效、最安全、最经济的方式。
预测水稻抗病相关基因:利用比较生物信息学方法,选取AA基因型野生稻Oryza_glaberrima、FF基因型野生稻Oryza_brachyanth和两个亚洲栽培稻(粳稻日本晴和籼稻9311)这四个全基因组测序水稻作比较基因组分析研究,利用PanOCT软件对四个品种的水稻基因组进行共线性分析,确定共线性区域,鉴定出抗病相关基因,得到目标基因共线性区域和重复基因簇Cluster;结合OrthMCL同源蛋白分析得到同源蛋白;对共线性区域中预测的邻近目标基因划分Cluster基因家族(相邻两个目标基因小于10个基因间隔);结合***树分析判断同一基因家族中哪些目标基因是同源串联重复,哪些是异源串联重复;最后通过RDP3软件分析基因家族中目标基因同源重组发生的历史事件。
筛选水稻广谱抗病基因:基于比较生物基因信息结果,按照目前已经报道的水稻抗病基因的进化方式及抗病基因的特点,选取了可能具有抗病功能的多个基因进行功能验证(其中包含已经发表的、有功能的抗病基因的同源基因基因8个)。
利用基因芯片分析技术,大规模筛选克隆水稻抗病基因,通过转基因技术转化水稻后,鉴定转基因水稻植株对稻瘟病等病菌的抗性,明确了目标基因在广谱抗病性的作用,为培育具有持久和广谱性的水稻抗病性提供新基因和材料资源。
发明内容
本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。
本发明提供了如下1)-3)中任一种物质在调控植物抗病中的应用:
1)蛋白RWR1;
2)编码蛋白RWR1的DNA分子;
3)含有编码蛋白RWR1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌;
所述蛋白RWR1为如下(1)或(2):
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
上述应用中,所述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子:
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子;
2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子;
3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子;
4)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
上述应用中,所述抗病为抗稻瘟病。
上述应用中,所述植物为双子叶植物或单子叶植物;
或所述植物为单子叶植物,所述单子叶植物具体为水稻。
上述1)-3)中任一种物质在培育抗病植物中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中,所述抗病为抗稻瘟病;
或,所述植物为双子叶植物或单子叶植物;
或所述植物为单子叶植物,所述单子叶植物具体为水稻。
本发明第二个目的是提供一种培育抗病转基因植物的方法。
本发明提供的一种培育抗病转基因植物的方法,包括如下步骤:提高目的植物中编码蛋白RWR1的DNA分子的表达量和/或活性,得到转基因植物,所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物;
所述蛋白RWR1为如下(1)或(2):
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
上述方法中,所述提高目的植物中编码蛋白RWR1的DNA分子的表达量和/或活性为将所述编码蛋白RWR1的DNA分子导入目的植物。
上述方法中,所述抗病为抗稻瘟病;
上述方法中,所述植物为双子叶植物或单子叶植物;
或所述植物为单子叶植物,所述单子叶植物具体为水稻。
上述所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物体现在如下至少一种:
1)所述转基因植物的坏死斑少于所述目的植物;
2)所述转基因植物的感病级数小于所述目的植物;
3)所述转基因植物的MoPot2的DNA相对表达量低于所述目的植物;
所述转基因植物为转基因水稻的纯合植株(+/+)。
本发明的实验证明,RWR1基因过量表达的转基因水稻在受到稻瘟菌侵害时,相比野生型水稻,稻瘟菌菌丝的生长受到明显的抑制,使其对稻瘟菌的抗性显著提高。因此,RWR1基因与水稻对稻瘟菌的抗性相关;RWR1蛋白及其编码基因可用于农业和生态环境治理所需的抗病植物品种的培育与鉴定,在植物抗病育种领域中具有重要作用。
附图说明
图1为T2代p1300:RWR1转基因水稻接种稻瘟菌RB22后抗病表型。
图2为T2代p1300:RWR1转基因水稻在接种稻瘟菌RB22后感病级数统计结果。
图3为T2代p1300:RWR1转基因水稻在接种稻瘟菌后水稻叶片中真菌DNA的相对值。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中定量实验,均重复三次,结果取平均值。
下述实施例中水稻采用常规品种TP309(以下也称为野生型水稻)(记载于Wang J,Qu B,Dou S,Li L,Yin D,Pang Z,Zhou Z,Tian M,Liu G,Xie Q,Tang D,Chen X,Zhu L.,The E3ligase OsPUB15interacts with the receptor-like kinase PID2and regulatesplant cell death and innate immunity.BMC Plant Biol.2015,13;15.,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)。
实施例1、RWR1基因的获得
提取水稻(Oryza sativa)Oyzabrachyantha(记载于Chen J,Huang Q,Gao D,WangJ,Lang Y,Liu T,Li B,Bai Z,Luis Goicoechea J,Liang C,Chen C,Zhang W,Sun S,LiaoY,Zhang X,Yang L,Song C,Wang M,Shi J,Liu G,Liu J,Zhou H,Zhou W,Yu Q,An N,ChenY,Cai Q,Wang B,Liu B,Min J,Huang Y,Wu H,Li Z,Zhang Y,Yin Y,Song W,Jiang J,Jackson SA,Wing RA,Wang J,Chen M.Whole-genome sequencing of Oryzabrachyanthareveals mechanisms underlying Oryza genome evolution.Nat Commun.2013;4:1595,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)叶片的DNA,设计引物进行PCR扩增。
RWR1-F:5'ACGGCCAGTGCCAAGCTT GAGAGAGAGGGAGAGATGAA 3'
RWR1-R:5'CGCGCCTCGAGATCCA CCAACGGCGAGTAATAGCAT 3'
扩增得到5273bp PCR产物。
将上述PCR产物送去测序,其核苷酸序列为序列表中序列3,包括约1026bp的启动子序列和4247bp编码区序列,序列表中序列3第1-5273位所示的基因命名为RWR1。序列表中序列1是该基因的CDS序列,共3645个碱基,编码1214个氨基酸,命名为RWR1蛋白(序列2)。
实施例2、RWR1基因的功能验证
1、表达载体的获得
Hind III和XbaI双酶切原始质粒pCAMBIA1300-flag(记载于Wang Z,Li N,JiangS,Gonzalez N,Huang X,Wang Y,InzéD,Li Y.SCFSAP controls organ size bytargeting PPD proteins for degradation in Arabidopsisthaliana.Nat.Commun.2016;7:11192,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得),回收9.6kb大片断,得到pCAMBIA1300-221-flag载体骨架。
将实施例1得到的5273bp PCR产物与载体骨架pCAMBIA1300-flag进行In-fusion反应(TAKARA公司),得到双元表达载体pCAMBIA1300::RWR1。
经过测序,重组表达载体pCAMBIA1300::RWR1为将序列3所示的DNA分子替换pCAMBIA1300-flag质粒的Hind III和Xba I之间的35S启动子得到的载体。序列3所示的DNA分子中第1-1026位为RWR1基因启动子序列,第1027-5273位为RWR1基因编码区序列。
2、RWR1基因表达重组菌获得
将上述1的重组表达载体pCAMBIA1300::RWR1转化农杆菌EHA105,挑取单克隆,于含有卡那霉素与利福平抗生素的LB液体培养基中28℃过夜振荡培养,得到转化子。
将转化子进行菌液PCR鉴定(RWR1-6500F和Flag-R,得到约600bp的为阳性重组菌),将阳性重组菌命名为EHA105/p1300::RWR1,并保存于-70℃备用。
RWR1-6500F:5′GAGACCTGTCACATGCTCATA 3′
Flag-R:5′CTAGTTAATTAAGACGCGTCCT 3′。
3、RWR1基因表达水稻的获得
采用根癌农杆菌介导法转化水稻,具体方法如下:
Ⅰ.转化受体的制备:选取授粉后14天的水稻TP309幼胚作为农杆菌侵染的受体。
Ⅱ.农杆菌工程菌株的培养:从阳性重组菌农杆菌EHA105/p1300::RWR1储液(20%甘油)取少量菌液,于YEB固体培养基(含有卡那霉素50mg/l,利福霉素50mg/l)上划线培养,28℃避光培养至长出直径1mm大小的单菌落。取单菌落接于同样的培养基上,培养至旺盛生长期。挑取少许菌体接于20mlYEB液体培养基中(含有相应抗生素),28℃避光220rpm振荡培养过夜。次日以2%的接种量转接于20ml含有100uM乙酰丁香酮的YEB液体培养基中,培养至对数生长中期,用3倍以上液体基本培养基稀释至肉眼稍见混浊即可(OD600约0.1),以备转化之用。
Ⅲ.根农杆菌侵染及共培养:取菌液于培养瓶中,加入经预培养的愈伤组织,略微摇动后静置10分钟。于无菌滤纸上晾干愈伤组织后置于添加有100uM乙酰丁香酮的培养基上,25℃暗培养3天。
Ⅳ.抗性愈伤的筛选:将共培养后的愈伤组织转至含有25mg/l潮霉素(hygromycinB)及500mg/l头孢霉素的筛选培养基上,筛选1~2次后,可见抗性愈伤组织长出。
Ⅴ.抗性植株的再生:将抗性愈伤组织转至含25mg/l潮霉素的培养基上,光照条件同前。待分化出的抗性小芽长至2-3cm时,将其转至含25mg/l潮霉素的再生苗继代培养基上,当长至完整的植株后,将其从固体培养基转至营养液中开放式培养。待生成新根后,将苗转入温室,得到T0代转RWR1水稻。
采用同样的方法,将空载体pCAMBIA1300-221-flag转入水稻TP309中,得到T0代转空载体水稻。
将上述T0代植物播种,得到T1代植株。
4、转RWR1水稻的鉴定
将生长约两周T1代转RWR1水稻剪取约3厘米的叶片,迅速用液氮速冻。提取总DNA,以野生型水稻TP309为对照,进行PCR扩增,以检测目标基因整合进入基因组。
用于PCR检测RWR1表达的引物(扩增得到位于RWR13’末端与标签Flag的连接片段)为:
RWR1-6500F:5′GAGACCTGTCACATGCTCATA 3′
Flag-R:5′CTAGTTAATTAAGACGCGTCCT 3′
回收PCR扩增产物并进行测序,表明RWR1已经整合进入水稻的基因组,将这些整合到水稻基因组的植株记作阳性T1代转RWR1水稻。
T1代转空载体水稻和野生型水稻TP309均没有RWR1整合。
5、纯合RWR1基因表达水稻的获得
将上述鉴定为阳性T1代转RWR1水稻单株收种得到T2代种子,分别将30-40粒种子用含25mg/L潮霉素水溶液中进行浸泡萌发,通过植物根的生长状态判定阳性植株(转基因阴性植株的幼根生长在潮霉素作用下受到严重抑制,表现为主根较短,侧根基本不发生,伸长到约1厘米开始褐化;而转基因阳性材料由于具有潮霉素抗性,根的生长基本不受抑制,主根和侧根的发生都很正常),记作T2代p1300:RWR1转基因水稻,进行移栽实验。
T1代转空载体水稻收种种植,得到T2代转空载体水稻。
6、RWR1基因表达水稻对稻瘟菌抗性分析
水稻接种前,T2代p1300:RWR1转基因水稻、T2代转空载体水稻以及野生型水稻TP309均在常规条件下培养:光照14小时,黑暗10小时,温度28℃。
待植物长至三叶一心期(大约需20天)时,进行稻瘟菌RB22接菌实验,孢子液浓度为5X105/ml(RB22记载于Kang H,Wang Y,Peng S,Zhang Y,Xiao Y,Wang D,Qu S,Li Z,YanS,Wang Z,Liu W1,Ning Y,Korniliev P,Leung H,Mezey J,McCouch SR,WangGL..Dissection of the genetic architecture of rice resistance to the blastfungus Magnaportheoryzae.Mol Plant Pathol.2016,17(6):959-72.,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)。待叶片完全喷湿后,黑暗处理24小时后,见光培养5天后统计发病情况并进行拍照记录。
结果表明,与野生型水稻TP309相比,纯合的T2代p1300:RWR1转基因水稻在喷施RB22孢子液后,对稻瘟菌RB22的抗性显著提高,说明RWR1蛋白与水稻对稻瘟菌的抗性相关。
具体表现为:
1)统计分析接种RB22后的植物表型
结果如图1所示,喷菌6天后,T2代p1300:RWR1转基因水稻的纯合植株(+/+)和杂合植株(+/-)的叶片基本没受到稻瘟菌的浸染;而作为对照的野生型水稻(图1中分离出来的野生型水稻,表示为-/-)的叶片有大量坏死斑。
T2代转空载体水稻表型与野生型水稻无显著差异。
2)调查分析水稻材料叶片发病级数
按照四川省水稻抗稻瘟病性田间鉴定技术规范(DB51/T714-2007),对水稻材料进行发病级数的统计,结果如图2,喷菌6天后,T2代p1300:RWR1转基因水稻的纯合植株(+/+)和杂合植株(+/-)叶片感病级数远远低于对照野生型水稻和转基因分离出来的野生型水稻(-/-)。
3)检测水稻叶片中稻瘟菌DNA与水稻叶片DNA相对值
检测RB22喷菌后6天后,检测T2代p1300:RWR1转基因水稻及野生型水稻中稻瘟菌marker基因MoPot2的DNA相对表达量。
具体方法如下:
A、水稻叶片DNA提取
总DNA的提取用CATB法提取:
1)取各株系上述水稻叶片约3厘米,在液氮中磨成粉末后,加0.3mL CATB DNA提取液,震荡混匀。
2)研磨液于65℃温箱中放置30分钟后,加入0.3mL氯仿,盖紧离心管,剧烈摇荡离心管20秒,12000g离心5分钟。
3)取上层水相约0.3mL于一新离心管,加0.3mL异丙醇,室温放置10分钟,4℃,12000g离心10分钟。
4)弃去上清液,加入0.7mL的75%乙醇,涡旋混匀,4℃下12000g离心1分钟。
5)小心弃去上清液,然后室温或真空干燥10分钟,溶解于0.3mL双蒸水中,得到DNA。
B、荧光定量PCR分析
1)反应体系
SYBR Premix 10μL
2)反应程序
95℃,30s;30cycles of(95℃,10s;60℃,20s;72℃,20s)
3)数据分析
Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
ΔCt=Ct(Gene)-Ct(UBQ),以2-ΔCt的值衡量基因的表达水平。
涉及到的定量PCR分析表达的基因及所用引物如下所示:
内参基因为ubqutin,用于扩增内参基因的Q-PCR引物为:
UBQ-F:5′-TTCTGGTCCTTCCACTTTCAG-3′
UBQ-R:5′-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3′
检测MoPot2的Q-PCR引物为:
MoPot2-F:5′-ACGACCCGTCTTTACTTATTTGG-3′
MoPot2-R:5′-AAGTAGCGTTGGTTTTGTTGGAT-3′
结果如图3所示,T2代p1300:RWR1转基因水稻与对照植物野生型水稻TP309相比,MoPot2的DNA相对表达量显著降低;T2代转空载体水稻与野生型水稻相比,MoPot2的DNA相对表达量没有显著差异。
上述实验均重复3次,结果一致。
上述结果证明RWR1基因与水稻对稻瘟菌的抗性相关,说明RWR1蛋白及其编码基因可用于农业生产中抗病植物品种的培育与鉴定,在植物抗病育种领域中具有重要作用。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>水稻抗病蛋白RWR1及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3645
<212> DNA
<213> 水稻 (Oryza sativa)
<400> 1
atggctgagt ttttggttcg gccgctgctg tccacggtgc agaacgcttc cagctatctt 60
gcaggccagt acagggtgat ggaaggcatg gaggagcagc gcaaagctct ggagcgcatg 120
cttccactca tcctcaccgt catccacgac gcacagaaca gaaccaaaca atcccaagta 180
ggcgcttggc tgcaagagct caagaaggtg tcctacgagg cgaccgacgt gttcgacgag 240
ttcagatacg aggcgctccg gcgcgaagcc aggaggaaag ggcacggcgc tgtaagcctc 300
ttctcctctc gtaacccaat cgtgtttcgc tacaggatgg gcaagaagct gcggaagatc 360
gtgcagagaa tcaaggaact tgtcgaggag atgaattcct ttgggctcgt acaccggcag 420
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agcgacaggg agctcacagt ccttcctgtt gttggaatgg gtggtcttgg caagactaca 600
tttgcacagc tcatctacaa tgaccctgaa atcctgaagc attttcagct tcgcaggtgg 660
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aacatttgca atgaggggga ggacacaatt tttcctatac ttcgtctcag ctatgacgac 1200
ttaccatttg acatgaagca atgctttgct ttctgtgcta tattcccaaa agattatgtg 1260
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cagactttgg tcctctctta ttgtaaaaat cttgtcgaac ttccaaagga tatgaagtat 1860
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ggttgcagta accttagaga attgcgtacc ttaaaccttt gtggcaggct acagttatgt 2040
ggcctagaaa atgaaaagga agaaaatgcg aaagcagcca atcttcgaaa caaagagaaa 2100
cttacacatt tgtctcttga gtggaatagc aactgccatc ttgaaggaac aaattcccct 2160
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tatacaggca gttcttttcc agcatggata acagaccttg gtgtcctgca aaacttgata 2280
gagctccatt tagagggctg tacaatgtgt ggagaatttc ctcagttcat tcgtttcaag 2340
tttcttcagg ttctttatct gagtagactt gataacttgc aaaccctatg tcgcgaggaa 2400
ggaagacaag gaacagaaca agcatttcat cagcttgaga aggttgtcat caacatctgt 2460
ccaaagtttc aaacattgtg ctctggtgtg gcatccactg catttccaga actaaaggaa 2520
gtcaagttaa tggatttgga gagctttgag acatgggtgg caatggaagg gaggcaaggt 2580
tacatgccaa catttcctct gcttgaggag gttgaaatca acaagtgccc aaaattgaca 2640
actctacctg aagcaccaaa gctcaagatt ttaaatctaa atgaaaacaa agcgcagctg 2700
tccttgtcat tgcttcaatc cagctatata tcctcattgt ccaagctaag attggaaata 2760
gatgacaaag aaacaaccct gcagctgctt gatcagatcc acgaatcatc tctctcagaa 2820
atggagttaa cacattgcaa cattctcttc cccttgagcc catcacagtc aaaaatgagg 2880
atctgggaat ggcttggaca acttgttgag ctgaaaatcg actcctgcga ttcgctcatc 2940
tactggccag aagaagagtt cctatgcttg gtatccctga agaaattgac catcaaggag 3000
tgctataacc taattggccg tcctacccag gtgacaggaa atccaactct cctgccacat 3060
ctcacatcgc tttatgtttc taagtgtgtc aggttgagag agctctttgt tcttccacca 3120
tctatcaaat atattacaat taatgactcc atttgtcttg agagcttctc attcccctcc 3180
tatcatctgc catgcctaga acgtctaagt ttctggaatt gtcgttcagt ggtaacactt 3240
cagaacctac caccatgcct tatgctgtcc attgatgcat gttgggagct tcaatcgctg 3300
tcagggcagc tggatgaact caagcatttg ggcattgtac gctgcaataa actggagtca 3360
ctgaattgct tgggagaatt gccatcactg gaacatcttg accttaagat gtgcaaacgt 3420
ctagcatcgg cgccatgtgg cccaaggagt tactcatctc ttttgagtat tacaatccaa 3480
gactgcccaa gaatgaatat gaagaaggta tatgagtggc tccggccacg gctggatagc 3540
cttgaggaaa gagacctgtc acatgctcat acaagagtaa tttatgaaga gtctaaatgc 3600
ccgacactaa aatcatggaa atatgctatt actcgccgtt ggtga 3645
<210> 2
<211> 1214
<212> PRT
<213>水稻 (Oryza sativa)
<400> 2
Met Ala Glu Phe Leu Val Arg Pro Leu Leu Ser Thr Val Gln Asn Ala
1 5 10 15
Ser Ser Tyr Leu Ala Gly Gln Tyr Arg Val Met Glu Gly Met Glu Glu
20 25 30
Gln Arg Lys Ala Leu Glu Arg Met Leu Pro Leu Ile Leu Thr Val Ile
35 40 45
His Asp Ala Gln Asn Arg Thr Lys Gln Ser Gln Val Gly Ala Trp Leu
50 55 60
Gln Glu Leu Lys Lys Val Ser Tyr Glu Ala Thr Asp Val Phe Asp Glu
65 70 75 80
Phe Arg Tyr Glu Ala Leu Arg Arg Glu Ala Arg Arg Lys Gly His Gly
85 90 95
Ala Val Ser Leu Phe Ser Ser Arg Asn Pro Ile Val Phe Arg Tyr Arg
100 105 110
Met Gly Lys Lys Leu Arg Lys Ile Val Gln Arg Ile Lys Glu Leu Val
115 120 125
Glu Glu Met Asn Ser Phe Gly Leu Val His Arg Gln Glu Thr Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Arg Gln Thr Asp Ser Val Met Leu Asp Phe Glu Lys Asp Ile
145 150 155 160
Val Ser Arg Ser Arg Asp Glu Glu Lys Arg Lys Val Val Lys Ile Leu
165 170 175
Val Asp Glu Ala Ser Asp Arg Glu Leu Thr Val Leu Pro Val Val Gly
180 185 190
Met Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Phe Ala Gln Leu Ile Tyr Asn Asp
195 200 205
Pro Glu Ile Leu Lys His Phe Gln Leu Arg Arg Trp Cys Cys Val Ser
210 215 220
Asp Glu Phe Asp Val Val Ser Ile Ala Asn Asn Ile Cys Val Ser Thr
225 230 235 240
Glu Arg Asn Arg Glu Arg Ala Leu Gln Asp Leu Gln Lys Glu Val Ser
245 250 255
Gly Lys Lys Phe Leu Ile Val Leu Asp Asp Val Trp Asn Arg Asp Ser
260 265 270
Asp Lys Trp Gly Lys Leu Met Thr Cys Leu Lys Gln Gly Ser Arg Gly
275 280 285
Ser Val Val Leu Thr Thr Thr Arg Asp Val Lys Val Ala Thr Ile Met
290 295 300
Ala Thr Ser Glu Val Glu Val Tyr Asn Leu Gly Lys Leu Gly Glu Val
305 310 315 320
Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Gln Ser Lys Ala Ile Gly Leu Pro Gly Ser
325 330 335
Asp Glu His Leu Glu Val Leu Asn Lys Ile Val Gln Arg Cys Asp Gly
340 345 350
Ser Pro Leu Ala Ala Lys Ser Phe Gly Ser Val Leu Ser Ser Arg Ser
355 360 365
Thr Val Gln Glu Trp Lys Asp Ile Leu Ala Lys Ser Asn Ile Cys Asn
370 375 380
Glu Gly Glu Asp Thr Ile Phe Pro Ile Leu Arg Leu Ser Tyr Asp Asp
385 390 395 400
Leu Pro Phe Asp Met Lys Gln Cys Phe Ala Phe Cys Ala Ile Phe Pro
405 410 415
Lys Asp Tyr Val Ile Asp Val Glu Thr Leu Ile Lys Leu Trp Leu Ala
420 425 430
His Asp Phe Ile Pro Leu Gln Glu Asp Asp Asn Leu Glu Ser Ala Ala
435 440 445
Glu Asp Ile Phe Lys Glu Leu Val Trp Arg Ser Phe Phe Gln Asp Val
450 455 460
Lys Lys Ser Ser Ile Trp Thr Thr Cys Lys Ile His Asp Leu Met His
465 470 475 480
Asp Ile Ala Gln Ser Val Met Gly Lys Glu Cys Val Ser Ile Ala Gly
485 490 495
Arg Ser Asn Phe Ile Ser Leu Leu Ser Glu His Pro Arg Tyr His Phe
500 505 510
His Ser Ser Tyr Lys Glu Thr Val Leu Leu Asp Asp Phe Met Arg Lys
515 520 525
Gln Ser Pro Thr Leu Arg Ser Leu Leu Phe Glu Arg Trp Phe Asn Tyr
530 535 540
Phe Ser Thr Ser His Leu Ser Lys Cys Ser Ser Leu Arg Ala Leu Lys
545 550 555 560
Leu Leu Arg Cys Ser Glu Phe Leu Pro Ile Gly His Leu Gln His Leu
565 570 575
Arg Tyr Leu Asn Ile Ser Ser Asn Ser Cys Ile Lys Lys Leu Pro Lys
580 585 590
Asp Ile Cys Ile Leu Tyr Asn Leu Gln Thr Leu Val Leu Ser Tyr Cys
595 600 605
Lys Asn Leu Val Glu Leu Pro Lys Asp Met Lys Tyr Met Lys Asn Leu
610 615 620
Arg His Leu Tyr Thr Asp Gly Cys Pro Lys Leu Lys Tyr Met Pro Pro
625 630 635 640
Asp Leu Gly Gln Leu Thr Ser Leu Gln Ile Leu Thr Ser Phe Val Val
645 650 655
Gly Ala Arg Ser Gly Cys Ser Asn Leu Arg Glu Leu Arg Thr Leu Asn
660 665 670
Leu Cys Gly Arg Leu Gln Leu Cys Gly Leu Glu Asn Glu Lys Glu Glu
675 680 685
Asn Ala Lys Ala Ala Asn Leu Arg Asn Lys Glu Lys Leu Thr His Leu
690 695 700
Ser Leu Glu Trp Asn Ser Asn Cys His Leu Glu Gly Thr Asn Ser Pro
705 710 715 720
Tyr Lys Val Leu Asp Ala Leu Lys Pro His His Arg Leu Gln Met Leu
725 730 735
Lys Val Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Ser Phe Pro Ala Trp Ile Thr Asp
740 745 750
Leu Gly Val Leu Gln Asn Leu Ile Glu Leu His Leu Glu Gly Cys Thr
755 760 765
Met Cys Gly Glu Phe Pro Gln Phe Ile Arg Phe Lys Phe Leu Gln Val
770 775 780
Leu Tyr Leu Ser Arg Leu Asp Asn Leu Gln Thr Leu Cys Arg Glu Glu
785 790 795 800
Gly Arg Gln Gly Thr Glu Gln Ala Phe His Gln Leu Glu Lys Val Val
805 810 815
Ile Asn Ile Cys Pro Lys Phe Gln Thr Leu Cys Ser Gly Val Ala Ser
820 825 830
Thr Ala Phe Pro Glu Leu Lys Glu Val Lys Leu Met Asp Leu Glu Ser
835 840 845
Phe Glu Thr Trp Val Ala Met Glu Gly Arg Gln Gly Tyr Met Pro Thr
850 855 860
Phe Pro Leu Leu Glu Glu Val Glu Ile Asn Lys Cys Pro Lys Leu Thr
865 870 875 880
Thr Leu Pro Glu Ala Pro Lys Leu Lys Ile Leu Asn Leu Asn Glu Asn
885 890 895
Lys Ala Gln Leu Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ser Ser Tyr Ile Ser Ser
900 905 910
Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Ile Asp Asp Lys Glu Thr Thr Leu Gln
915 920 925
Leu Leu Asp Gln Ile His Glu Ser Ser Leu Ser Glu Met Glu Leu Thr
930 935 940
His Cys Asn Ile Leu Phe Pro Leu Ser Pro Ser Gln Ser Lys Met Arg
945 950 955 960
Ile Trp Glu Trp Leu Gly Gln Leu Val Glu Leu Lys Ile Asp Ser Cys
965 970 975
Asp Ser Leu Ile Tyr Trp Pro Glu Glu Glu Phe Leu Cys Leu Val Ser
980 985 990
Leu Lys Lys Leu Thr Ile Lys Glu Cys Tyr Asn Leu Ile Gly Arg Pro
995 1000 1005
Thr Gln Val Thr Gly Asn Pro Thr Leu Leu Pro His Leu Thr Ser
1010 1015 1020
Leu Tyr Val Ser Lys Cys Val Arg Leu Arg Glu Leu Phe Val Leu
1025 1030 1035
Pro Pro Ser Ile Lys Tyr Ile Thr Ile Asn Asp Ser Ile Cys Leu
1040 1045 1050
Glu Ser Phe Ser Phe Pro Ser Tyr His Leu Pro Cys Leu Glu Arg
1055 1060 1065
Leu Ser Phe Trp Asn Cys Arg Ser Val Val Thr Leu Gln Asn Leu
1070 1075 1080
Pro Pro Cys Leu Met Leu Ser Ile Asp Ala Cys Trp Glu Leu Gln
1085 1090 1095
Ser Leu Ser Gly Gln Leu Asp Glu Leu Lys His Leu Gly Ile Val
1100 1105 1110
Arg Cys Asn Lys Leu Glu Ser Leu Asn Cys Leu Gly Glu Leu Pro
1115 1120 1125
Ser Leu Glu His Leu Asp Leu Lys Met Cys Lys Arg Leu Ala Ser
1130 1135 1140
Ala Pro Cys Gly Pro Arg Ser Tyr Ser Ser Leu Leu Ser Ile Thr
1145 1150 1155
Ile Gln Asp Cys Pro Arg Met Asn Met Lys Lys Val Tyr Glu Trp
1160 1165 1170
Leu Arg Pro Arg Leu Asp Ser Leu Glu Glu Arg Asp Leu Ser His
1175 1180 1185
Ala His Thr Arg Val Ile Tyr Glu Glu Ser Lys Cys Pro Thr Leu
1190 1195 1200
Lys Ser Trp Lys Tyr Ala Ile Thr Arg Arg Trp
1205 1210
<210> 3
<211> 5273
<212> DNA
<213>水稻 (Oryza sativa)
<400> 3
gagagagagg gagagatgaa tgcataaaaa gagaaaagtt ttagtgggac tcacattaag 60
aatggtgcac tatggagctt gtatcctatg tgtggctttg tcctacgtga catctctttt 120
tttatgagag agtggcctgc atagtgtatg tccgtggtac ttttttagtt atggaggcct 180
ctctatgtca ccatccttga gcaggtacca ctgttttcta tgtaaaattt ggtacctctt 240
gttaccttag gtactagaag gtaccaaatt ttaagtttta ctctcatccc tcctttttta 300
tcttaaggta ccggtatctc gcggtaccaa atcatttatg atcgttggat caaacagtgc 360
acatcctatt tagctagatc caatggtgag aaacgatttg gtatctcgag gtactggtac 420
ctcgaggtat aaaaggaagg ataagagtaa aactcaccaa attttacata taaaacagtg 480
gtacctcttg taccttctta aggatggaaa aaaaactctt ttaacaacat atattgtcta 540
aaaaatacca gcaggatgct tgcatcggat cgttggtaac gaaaaattac ggggcattta 600
actttttgtc actcttaaaa ttggttaata ataaatttat cactcattat atatgatata 660
tacgctctga tatgttaggt ccaatgataa atatgttaat tattgccggt tatgtacgcc 720
gtgtgtccag agcatctcat taaagtagga atcactctat cttctctccc acatcgatcg 780
accacctctc tctcttccat ctccatccac agcatcccct cggagattag ggcctccgtt 840
ctctgatcga tctagatcga tcccccacaa catctagatc gggtctcgac gaaggttagt 900
gccgctagct agctgcctgc gatatcatat catttcagtt ctgcaatgtg gagtaattaa 960
ccgtgttccc tctcccatcc atgatgcaga gaagagaacg aagcatcatc ttcagaggga 1020
gcaacgatgg ctgagttttt ggttcggccg ctgctgtcca cggtgcagaa cgcttccagc 1080
tatcttgcag gccagtacag ggtgatggaa ggcatggagg agcagcgcaa agctctggag 1140
cgcatgcttc cactcatcct caccgtcatc cacgacgcac agaacagaac caaacaatcc 1200
caagtaggcg cttggctgca agagctcaag aaggtgtcct acgaggcgac cgacgtgttc 1260
gacgagttca gatacgaggc gctccggcgc gaagccagga ggaaagggca cggcgctgta 1320
agcctcttct cctctcgtaa cccaatcgtg tttcgctaca ggatgggcaa gaagctgcgg 1380
aagatcgtgc agagaatcaa ggaacttgtc gaggagatga attcctttgg gctcgtacac 1440
cggcaggaaa caccgaggca gtcgaggcaa actgattcag tgatgcttga ttttgagaag 1500
gatattgtta gcagatccag agatgaggag aagaggaagg ttgtcaagat attggtggat 1560
gaagctagcg acagggagct cacagtcctt cctgttgttg gaatgggtgg tcttggcaag 1620
actacatttg cacagctcat ctacaatgac cctgaaatcc tgaagcattt tcagcttcgc 1680
aggtggtgtt gtgtgtctga tgaatttgat gtcgttagca tcgcaaacaa catatgtgtg 1740
agcacagaga gaaatcgtga aagggcactg caagatctgc agaaggaagt aagtggaaag 1800
aagtttctga tagtgttgga tgatgtgtgg aatagggatt ctgacaagtg gggaaagtta 1860
atgacctgcc ttaagcaggg ctccaggggc agtgtggtac taacaacaac tcgggatgtc 1920
aaagtcgcta caattatggc taccagtgaa gttgaagtgt ataatcttgg taagctagga 1980
gaagtgtatt tgaaggaaat aatccaaagt aaagcaattg gtttgccagg aagtgatgag 2040
catttggaag ttcttaataa aattgttcag agatgtgatg gctctccttt agctgcaaaa 2100
tcctttggct ctgtgttgtc tagcaggagt actgtacaag aatggaagga tatattagcc 2160
aaaagtaaca tttgcaatga gggggaggac acaatttttc ctatacttcg tctcagctat 2220
gacgacttac catttgacat gaagcaatgc tttgctttct gtgctatatt cccaaaagat 2280
tatgtgattg atgtggagac tttgattaag ctatggttgg cacatgactt cataccatta 2340
caagaggatg acaatctaga atcggcagcc gaagatatct tcaaggagct agtttggagg 2400
tcattttttc aagatgtaaa gaaatcttct atatggacca catgcaagat acatgatctt 2460
atgcacgaca ttgctcaatc tgttatggga aaagaatgtg tcagcatagc tggaaggtcc 2520
aattttataa gtctgttatc agaacatcct aggtatcact ttcactcatc atacaaagag 2580
actgttctct tagatgactt tatgagaaaa caatctccaa ctctccggag tttattgttt 2640
gaacgatggt ttaattactt cagcacatca catttatcca agtgcagttc tctgcgagca 2700
ctgaagctcc tacgatgcag cgaattctta ccaatcgggc accttcagca cctaagatat 2760
ctcaatatct catcaaacag ttgtatcaaa aagcttccta aagatatatg catactctac 2820
aatctacaga ctttggtcct ctcttattgt aaaaatcttg tcgaacttcc aaaggatatg 2880
aagtatatga aaaatctgcg acacctttat acggatggat gtccaaaatt gaagtacatg 2940
cctccggacc ttggacagtt aacttccctg cagatattaa catcttttgt ggtgggagct 3000
aggtctggtt gcagtaacct tagagaattg cgtaccttaa acctttgtgg caggctacag 3060
ttatgtggcc tagaaaatga aaaggaagaa aatgcgaaag cagccaatct tcgaaacaaa 3120
gagaaactta cacatttgtc tcttgagtgg aatagcaact gccatcttga aggaacaaat 3180
tccccttata aggttcttga tgctcttaaa cctcatcaca ggctgcagat gcttaaggta 3240
atttcctata caggcagttc ttttccagca tggataacag accttggtgt cctgcaaaac 3300
ttgatagagc tccatttaga gggctgtaca atgtgtggag aatttcctca gttcattcgt 3360
ttcaagtttc ttcaggttct ttatctgagt agacttgata acttgcaaac cctatgtcgc 3420
gaggaaggaa gacaaggaac agaacaagca tttcatcagc ttgagaaggt tgtcatcaac 3480
atctgtccaa agtttcaaac attgtgctct ggtgtggcat ccactgcatt tccagaacta 3540
aaggaagtca agttaatgga tttggagagc tttgagacat gggtggcaat ggaagggagg 3600
caaggttaca tgccaacatt tcctctgctt gaggaggttg aaatcaacaa gtgcccaaaa 3660
ttgacaactc tacctgaagc accaaagctc aagattttaa atctaaatga aaacaaagcg 3720
cagctgtcct tgtcattgct tcaatccagc tatatatcct cattgtccaa gctaagattg 3780
gaaatagatg acaaagaaac aaccctgcag ctgcttgatc agatccacga atcatctctc 3840
tcagaaatgg agttaacaca ttgcaacatt ctcttcccct tgagcccatc acagtcaaaa 3900
atgaggatct gggaatggct tggacaactt gttgagctga aaatcgactc ctgcgattcg 3960
ctcatctact ggccagaaga agagttccta tgcttggtat ccctgaagaa attgaccatc 4020
aaggagtgct ataacctaat tggccgtcct acccaggtga caggaaatcc aactctcctg 4080
ccacatctca catcgcttta tgtttctaag tgtgtcaggt tgagagagct ctttgttctt 4140
ccaccatcta tcaaatatat tacaattaat gactccattt gtcttgagag cttctcattc 4200
ccctcctatc atctgccatg cctagaacgt ctaagtttct ggaattgtcg ttcagtggta 4260
acacttcaga acctaccacc atgccttatg ctgtccattg atgcatgttg ggagcttcaa 4320
tcgctgtcag ggcagctgga tgaactcaag catttgggca ttgtacgctg caataaactg 4380
gagtcactga attgcttggg agaattgcca tcactggaac atcttgacct taagatgtgc 4440
aaacgtctag catcggcgcc atgtggccca aggagttact catctctttt gagtattaca 4500
atccaagact gcccaagaat gaatatgaag aaggtatatg agtggctccg gccacggctg 4560
gatagccttg aggaaagaga cctgtcacat gctcatacaa gagtaattta tgaaggtaca 4620
ctccattgct agcattttcc ttctttttcc gtttttcgtt tcttttacat agatgaatag 4680
attttatgtt cctgtgccag tgtatatctg cactcaaagt tccaatcatc aggccctgtg 4740
ttttataact gaataagata gaaattgtgt ttcttggtta aagagattct agtctaacct 4800
tgatcgaaca aaggttcgtt ccaccaaaac cataggagct ccatcactgt ttattgacaa 4860
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acataattta gtcggtgtcg ataccatgca tgaaatgagc atttttttta tcctcgagaa 4980
actattataa ggaagcactg ttttttatat aaaatttggt actttctagt atctaatata 5040
ctaacagtgg tacctcttag taccttctca aggatcgtaa tatcgctcgc atggaatagt 5100
tcctttccct ctgtactcca ttttattttt tctctttttc tgcagtttat ttcgattgtg 5160
agatattatc taaaaaaaat tcggttgtga gactgacatt tatttttcat gctacagagt 5220
ctaaatgccc gacactaaaa tcatggaaat atgctattac tcgccgttgg tga 5273
Claims (10)
1.如下1)-3)中任一种物质在调控植物抗病性中的应用:
1)蛋白RWR1;
2)编码蛋白RWR1的DNA分子;
3)含有编码蛋白RWR1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌;
所述蛋白RWR1为如下(1)或(2):
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:
所述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子:
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子;
2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子;
3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子;
4)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述抗病为抗稻瘟病。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用,其特征在于:
所述植物为双子叶植物或单子叶植物;
或所述植物为单子叶植物,所述单子叶植物具体为水稻。
5.权利要求1-4任一项中的如下1)-3)中任一种物质在培育抗病植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述抗病为抗稻瘟病;
或,所述植物为双子叶植物或单子叶植物;
或所述植物为单子叶植物,所述单子叶植物具体为水稻。
7.一种培育抗病转基因植物的方法,包括如下步骤:提高目的植物中编码蛋白RWR1的DNA分子的表达量和/或活性,得到转基因植物,所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物;
所述蛋白RWR1为如下(1)或(2):
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:
所述提高目的植物中编码蛋白RWR1的DNA分子的表达量和/或活性为将所述编码蛋白RWR1的DNA分子导入目的植物。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于:所述抗病为抗稻瘟病。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法,其特征在于:所述植物为双子叶植物或单子叶植物;
或所述植物为单子叶植物,所述单子叶植物具体为水稻。
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