CN110283238A

CN110283238A - 水稻抗病蛋白rwr1及其应用

Info

Publication number: CN110283238A
Application number: CN201810224514.3A
Authority: CN
Inventors: 周俭民; 赵燕; 何朝族; 陈明生
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2018-03-19
Filing date: 2018-03-19
Publication date: 2019-09-27
Anticipated expiration: 2038-03-19
Also published as: CN110283238B

Abstract

本发明公开了水稻抗病蛋白RWR1及其应用。本发明提供了如下1)‑3)中任一种物质在调控植物抗病性中的应用：1)蛋白RWR1；2)编码蛋白RWR1的DNA分子；3)含有编码蛋白RWR1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。本发明的实验证明，RWR1基因过量表达的转基因水稻在受到稻瘟菌侵害时，相比野生型水稻,稻瘟菌菌丝的生长受到明显的抑制，使其对稻瘟菌的抗性显著提高。因此，RWR1基因与水稻对稻瘟菌的抗性相关；RWR1蛋白及其编码基因可用于农业和生态环境治理所需的抗病植物品种的培育与鉴定，在植物抗病育种领域中具有重要作用。

Description

水稻抗病蛋白RWR1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种水稻抗病蛋白RWR1及其应用。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物，由病原微生物引起的水稻病害严重影响水稻产量和品质。随着人们对水稻－病原菌互作机制研究的不断深入，利用抗病基因培育水稻抗病品种已成为水稻育种专家们防治水稻病害最有效、最安全、最经济的方式。

预测水稻抗病相关基因：利用比较生物信息学方法，选取AA基因型野生稻Oryza_glaberrima、FF基因型野生稻Oryza_brachyanth和两个亚洲栽培稻(粳稻日本晴和籼稻9311)这四个全基因组测序水稻作比较基因组分析研究，利用PanOCT软件对四个品种的水稻基因组进行共线性分析，确定共线性区域，鉴定出抗病相关基因，得到目标基因共线性区域和重复基因簇Cluster；结合OrthMCL同源蛋白分析得到同源蛋白；对共线性区域中预测的邻近目标基因划分Cluster基因家族(相邻两个目标基因小于10个基因间隔)；结合***树分析判断同一基因家族中哪些目标基因是同源串联重复，哪些是异源串联重复；最后通过RDP3软件分析基因家族中目标基因同源重组发生的历史事件。

筛选水稻广谱抗病基因：基于比较生物基因信息结果，按照目前已经报道的水稻抗病基因的进化方式及抗病基因的特点，选取了可能具有抗病功能的多个基因进行功能验证(其中包含已经发表的、有功能的抗病基因的同源基因基因8个)。

利用基因芯片分析技术，大规模筛选克隆水稻抗病基因，通过转基因技术转化水稻后，鉴定转基因水稻植株对稻瘟病等病菌的抗性，明确了目标基因在广谱抗病性的作用，为培育具有持久和广谱性的水稻抗病性提供新基因和材料资源。

发明内容

本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。

本发明提供了如下1)-3)中任一种物质在调控植物抗病中的应用：

1)蛋白RWR1；

2)编码蛋白RWR1的DNA分子；

3)含有编码蛋白RWR1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白RWR1为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

上述应用中，所述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

4)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述应用中，所述抗病为抗稻瘟病。

上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。

上述1)-3)中任一种物质在培育抗病植物中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述抗病为抗稻瘟病；

或，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。

本发明第二个目的是提供一种培育抗病转基因植物的方法。

本发明提供的一种培育抗病转基因植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中编码蛋白RWR1的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物；

所述蛋白RWR1为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

上述方法中，所述提高目的植物中编码蛋白RWR1的DNA分子的表达量和/或活性为将所述编码蛋白RWR1的DNA分子导入目的植物。

上述方法中，所述抗病为抗稻瘟病；

上述方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。

上述所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物体现在如下至少一种：

1)所述转基因植物的坏死斑少于所述目的植物；

2)所述转基因植物的感病级数小于所述目的植物；

3)所述转基因植物的MoPot2的DNA相对表达量低于所述目的植物；

所述转基因植物为转基因水稻的纯合植株(+/+)。

本发明的实验证明，RWR1基因过量表达的转基因水稻在受到稻瘟菌侵害时，相比野生型水稻,稻瘟菌菌丝的生长受到明显的抑制，使其对稻瘟菌的抗性显著提高。因此，RWR1基因与水稻对稻瘟菌的抗性相关；RWR1蛋白及其编码基因可用于农业和生态环境治理所需的抗病植物品种的培育与鉴定，在植物抗病育种领域中具有重要作用。

附图说明

图1为T₂代p1300:RWR1转基因水稻接种稻瘟菌RB22后抗病表型。

图2为T₂代p1300:RWR1转基因水稻在接种稻瘟菌RB22后感病级数统计结果。

图3为T₂代p1300:RWR1转基因水稻在接种稻瘟菌后水稻叶片中真菌DNA的相对值。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中定量实验，均重复三次，结果取平均值。

下述实施例中水稻采用常规品种TP309(以下也称为野生型水稻)(记载于Wang J,Qu B,Dou S,Li L,Yin D,Pang Z,Zhou Z,Tian M,Liu G,Xie Q,Tang D,Chen X,Zhu L.，The E3ligase OsPUB15interacts with the receptor-like kinase PID2and regulatesplant cell death and innate immunity.BMC Plant Biol.2015,13；15.，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)。

实施例1、RWR1基因的获得

提取水稻(Oryza sativa)Oyzabrachyantha(记载于Chen J,Huang Q,Gao D,WangJ,Lang Y,Liu T,Li B,Bai Z,Luis Goicoechea J,Liang C,Chen C,Zhang W,Sun S,LiaoY,Zhang X,Yang L,Song C,Wang M,Shi J,Liu G,Liu J,Zhou H,Zhou W,Yu Q,An N,ChenY,Cai Q,Wang B,Liu B,Min J,Huang Y,Wu H,Li Z,Zhang Y,Yin Y,Song W,Jiang J,Jackson SA,Wing RA,Wang J,Chen M.Whole-genome sequencing of Oryzabrachyanthareveals mechanisms underlying Oryza genome evolution.Nat Commun.2013；4:1595，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)叶片的DNA，设计引物进行PCR扩增。

RWR1-F：5'ACGGCCAGTGCCAAGCTT GAGAGAGAGGGAGAGATGAA 3'

RWR1-R：5'CGCGCCTCGAGATCCA CCAACGGCGAGTAATAGCAT 3'

扩增得到5273bp PCR产物。

将上述PCR产物送去测序，其核苷酸序列为序列表中序列3，包括约1026bp的启动子序列和4247bp编码区序列，序列表中序列3第1-5273位所示的基因命名为RWR1。序列表中序列1是该基因的CDS序列，共3645个碱基，编码1214个氨基酸，命名为RWR1蛋白(序列2)。

实施例2、RWR1基因的功能验证

1、表达载体的获得

Hind III和XbaI双酶切原始质粒pCAMBIA1300-flag(记载于Wang Z,Li N,JiangS,Gonzalez N,Huang X,Wang Y,InzéD,Li Y.SCFSAP controls organ size bytargeting PPD proteins for degradation in Arabidopsisthaliana.Nat.Commun.2016；7:11192，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)，回收9.6kb大片断，得到pCAMBIA1300-221-flag载体骨架。

将实施例1得到的5273bp PCR产物与载体骨架pCAMBIA1300-flag进行In-fusion反应(TAKARA公司)，得到双元表达载体pCAMBIA1300::RWR1。

经过测序，重组表达载体pCAMBIA1300::RWR1为将序列3所示的DNA分子替换pCAMBIA1300-flag质粒的Hind III和Xba I之间的35S启动子得到的载体。序列3所示的DNA分子中第1-1026位为RWR1基因启动子序列，第1027-5273位为RWR1基因编码区序列。

2、RWR1基因表达重组菌获得

将上述1的重组表达载体pCAMBIA1300::RWR1转化农杆菌EHA105，挑取单克隆，于含有卡那霉素与利福平抗生素的LB液体培养基中28℃过夜振荡培养，得到转化子。

将转化子进行菌液PCR鉴定(RWR1-6500F和Flag-R，得到约600bp的为阳性重组菌)，将阳性重组菌命名为EHA105/p1300::RWR1，并保存于-70℃备用。

RWR1-6500F：5′GAGACCTGTCACATGCTCATA 3′

Flag-R：5′CTAGTTAATTAAGACGCGTCCT 3′。

3、RWR1基因表达水稻的获得

采用根癌农杆菌介导法转化水稻，具体方法如下：

Ⅰ.转化受体的制备:选取授粉后14天的水稻TP309幼胚作为农杆菌侵染的受体。

Ⅱ.农杆菌工程菌株的培养:从阳性重组菌农杆菌EHA105/p1300::RWR1储液(20％甘油)取少量菌液，于YEB固体培养基(含有卡那霉素50mg/l,利福霉素50mg/l)上划线培养，28℃避光培养至长出直径1mm大小的单菌落。取单菌落接于同样的培养基上，培养至旺盛生长期。挑取少许菌体接于20mlYEB液体培养基中(含有相应抗生素)，28℃避光220rpm振荡培养过夜。次日以2％的接种量转接于20ml含有100uM乙酰丁香酮的YEB液体培养基中，培养至对数生长中期，用3倍以上液体基本培养基稀释至肉眼稍见混浊即可(OD600约0.1)，以备转化之用。

Ⅲ.根农杆菌侵染及共培养:取菌液于培养瓶中，加入经预培养的愈伤组织，略微摇动后静置10分钟。于无菌滤纸上晾干愈伤组织后置于添加有100uM乙酰丁香酮的培养基上，25℃暗培养3天。

Ⅳ.抗性愈伤的筛选:将共培养后的愈伤组织转至含有25mg/l潮霉素(hygromycinB)及500mg/l头孢霉素的筛选培养基上，筛选1～2次后，可见抗性愈伤组织长出。

Ⅴ.抗性植株的再生:将抗性愈伤组织转至含25mg/l潮霉素的培养基上,光照条件同前。待分化出的抗性小芽长至2-3cm时,将其转至含25mg/l潮霉素的再生苗继代培养基上，当长至完整的植株后,将其从固体培养基转至营养液中开放式培养。待生成新根后,将苗转入温室，得到T₀代转RWR1水稻。

采用同样的方法，将空载体pCAMBIA1300-221-flag转入水稻TP309中，得到T₀代转空载体水稻。

将上述T₀代植物播种，得到T₁代植株。

4、转RWR1水稻的鉴定

将生长约两周T₁代转RWR1水稻剪取约3厘米的叶片，迅速用液氮速冻。提取总DNA，以野生型水稻TP309为对照，进行PCR扩增,以检测目标基因整合进入基因组。

用于PCR检测RWR1表达的引物(扩增得到位于RWR13’末端与标签Flag的连接片段)为：

RWR1-6500F：5′GAGACCTGTCACATGCTCATA 3′

Flag-R：5′CTAGTTAATTAAGACGCGTCCT 3′

回收PCR扩增产物并进行测序，表明RWR1已经整合进入水稻的基因组，将这些整合到水稻基因组的植株记作阳性T₁代转RWR1水稻。

T₁代转空载体水稻和野生型水稻TP309均没有RWR1整合。

5、纯合RWR1基因表达水稻的获得

将上述鉴定为阳性T₁代转RWR1水稻单株收种得到T₂代种子，分别将30-40粒种子用含25mg/L潮霉素水溶液中进行浸泡萌发,通过植物根的生长状态判定阳性植株(转基因阴性植株的幼根生长在潮霉素作用下受到严重抑制，表现为主根较短，侧根基本不发生，伸长到约1厘米开始褐化；而转基因阳性材料由于具有潮霉素抗性，根的生长基本不受抑制，主根和侧根的发生都很正常)，记作T₂代p1300:RWR1转基因水稻，进行移栽实验。

T₁代转空载体水稻收种种植，得到T₂代转空载体水稻。

6、RWR1基因表达水稻对稻瘟菌抗性分析

水稻接种前，T₂代p1300:RWR1转基因水稻、T₂代转空载体水稻以及野生型水稻TP309均在常规条件下培养：光照14小时，黑暗10小时，温度28℃。

待植物长至三叶一心期(大约需20天)时，进行稻瘟菌RB22接菌实验，孢子液浓度为5X10⁵/ml(RB22记载于Kang H,Wang Y,Peng S,Zhang Y,Xiao Y,Wang D,Qu S,Li Z,YanS,Wang Z,Liu W1,Ning Y,Korniliev P,Leung H,Mezey J,McCouch SR,WangGL..Dissection of the genetic architecture of rice resistance to the blastfungus Magnaportheoryzae.Mol Plant Pathol.2016,17(6):959-72.，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)。待叶片完全喷湿后,黑暗处理24小时后,见光培养5天后统计发病情况并进行拍照记录。

结果表明，与野生型水稻TP309相比，纯合的T₂代p1300:RWR1转基因水稻在喷施RB22孢子液后,对稻瘟菌RB22的抗性显著提高，说明RWR1蛋白与水稻对稻瘟菌的抗性相关。

具体表现为：

1)统计分析接种RB22后的植物表型

结果如图1所示，喷菌6天后，T₂代p1300:RWR1转基因水稻的纯合植株(+/+)和杂合植株(+/-)的叶片基本没受到稻瘟菌的浸染；而作为对照的野生型水稻(图1中分离出来的野生型水稻，表示为-/-)的叶片有大量坏死斑。

T₂代转空载体水稻表型与野生型水稻无显著差异。

2)调查分析水稻材料叶片发病级数

按照四川省水稻抗稻瘟病性田间鉴定技术规范(DB51/T714-2007)，对水稻材料进行发病级数的统计，结果如图2，喷菌6天后，T₂代p1300:RWR1转基因水稻的纯合植株(+/+)和杂合植株(+/-)叶片感病级数远远低于对照野生型水稻和转基因分离出来的野生型水稻(-/-)。

3)检测水稻叶片中稻瘟菌DNA与水稻叶片DNA相对值

检测RB22喷菌后6天后，检测T₂代p1300:RWR1转基因水稻及野生型水稻中稻瘟菌marker基因MoPot2的DNA相对表达量。

具体方法如下：

A、水稻叶片DNA提取

总DNA的提取用CATB法提取：

1)取各株系上述水稻叶片约3厘米,在液氮中磨成粉末后，加0.3mL CATB DNA提取液，震荡混匀。

2)研磨液于65℃温箱中放置30分钟后，加入0.3mL氯仿，盖紧离心管，剧烈摇荡离心管20秒，12000g离心5分钟。

3)取上层水相约0.3mL于一新离心管，加0.3mL异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000g离心10分钟。

4)弃去上清液，加入0.7mL的75％乙醇，涡旋混匀，4℃下12000g离心1分钟。

5)小心弃去上清液，然后室温或真空干燥10分钟，溶解于0.3mL双蒸水中，得到DNA。

B、荧光定量PCR分析

1)反应体系

SYBR Premix 10μL

2)反应程序

95℃，30s；30cycles of(95℃，10s；60℃，20s；72℃，20s)

3)数据分析

Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。

ΔCt＝Ct(Gene)-Ct(UBQ)，以2-ΔCt的值衡量基因的表达水平。

涉及到的定量PCR分析表达的基因及所用引物如下所示：

内参基因为ubqutin，用于扩增内参基因的Q-PCR引物为：

UBQ-F:5′-TTCTGGTCCTTCCACTTTCAG-3′

UBQ-R:5′-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3′

检测MoPot2的Q-PCR引物为：

MoPot2-F:5′-ACGACCCGTCTTTACTTATTTGG-3′

MoPot2-R:5′-AAGTAGCGTTGGTTTTGTTGGAT-3′

结果如图3所示，T₂代p1300:RWR1转基因水稻与对照植物野生型水稻TP309相比，MoPot2的DNA相对表达量显著降低；T₂代转空载体水稻与野生型水稻相比，MoPot2的DNA相对表达量没有显著差异。

上述实验均重复3次，结果一致。

上述结果证明RWR1基因与水稻对稻瘟菌的抗性相关，说明RWR1蛋白及其编码基因可用于农业生产中抗病植物品种的培育与鉴定，在植物抗病育种领域中具有重要作用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>水稻抗病蛋白RWR1及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3645

<212> DNA

<213> 水稻 (Oryza sativa)

<400> 1

atggctgagt ttttggttcg gccgctgctg tccacggtgc agaacgcttc cagctatctt 60

gcaggccagt acagggtgat ggaaggcatg gaggagcagc gcaaagctct ggagcgcatg 120

cttccactca tcctcaccgt catccacgac gcacagaaca gaaccaaaca atcccaagta 180

ggcgcttggc tgcaagagct caagaaggtg tcctacgagg cgaccgacgt gttcgacgag 240

ttcagatacg aggcgctccg gcgcgaagcc aggaggaaag ggcacggcgc tgtaagcctc 300

ttctcctctc gtaacccaat cgtgtttcgc tacaggatgg gcaagaagct gcggaagatc 360

gtgcagagaa tcaaggaact tgtcgaggag atgaattcct ttgggctcgt acaccggcag 420

gaaacaccga ggcagtcgag gcaaactgat tcagtgatgc ttgattttga gaaggatatt 480

gttagcagat ccagagatga ggagaagagg aaggttgtca agatattggt ggatgaagct 540

agcgacaggg agctcacagt ccttcctgtt gttggaatgg gtggtcttgg caagactaca 600

tttgcacagc tcatctacaa tgaccctgaa atcctgaagc attttcagct tcgcaggtgg 660

tgttgtgtgt ctgatgaatt tgatgtcgtt agcatcgcaa acaacatatg tgtgagcaca 720

gagagaaatc gtgaaagggc actgcaagat ctgcagaagg aagtaagtgg aaagaagttt 780

ctgatagtgt tggatgatgt gtggaatagg gattctgaca agtggggaaa gttaatgacc 840

tgccttaagc agggctccag gggcagtgtg gtactaacaa caactcggga tgtcaaagtc 900

gctacaatta tggctaccag tgaagttgaa gtgtataatc ttggtaagct aggagaagtg 960

tatttgaagg aaataatcca aagtaaagca attggtttgc caggaagtga tgagcatttg 1020

gaagttctta ataaaattgt tcagagatgt gatggctctc ctttagctgc aaaatccttt 1080

ggctctgtgt tgtctagcag gagtactgta caagaatgga aggatatatt agccaaaagt 1140

aacatttgca atgaggggga ggacacaatt tttcctatac ttcgtctcag ctatgacgac 1200

ttaccatttg acatgaagca atgctttgct ttctgtgcta tattcccaaa agattatgtg 1260

attgatgtgg agactttgat taagctatgg ttggcacatg acttcatacc attacaagag 1320

gatgacaatc tagaatcggc agccgaagat atcttcaagg agctagtttg gaggtcattt 1380

tttcaagatg taaagaaatc ttctatatgg accacatgca agatacatga tcttatgcac 1440

gacattgctc aatctgttat gggaaaagaa tgtgtcagca tagctggaag gtccaatttt 1500

ataagtctgt tatcagaaca tcctaggtat cactttcact catcatacaa agagactgtt 1560

ctcttagatg actttatgag aaaacaatct ccaactctcc ggagtttatt gtttgaacga 1620

tggtttaatt acttcagcac atcacattta tccaagtgca gttctctgcg agcactgaag 1680

ctcctacgat gcagcgaatt cttaccaatc gggcaccttc agcacctaag atatctcaat 1740

atctcatcaa acagttgtat caaaaagctt cctaaagata tatgcatact ctacaatcta 1800

cagactttgg tcctctctta ttgtaaaaat cttgtcgaac ttccaaagga tatgaagtat 1860

atgaaaaatc tgcgacacct ttatacggat ggatgtccaa aattgaagta catgcctccg 1920

gaccttggac agttaacttc cctgcagata ttaacatctt ttgtggtggg agctaggtct 1980

ggttgcagta accttagaga attgcgtacc ttaaaccttt gtggcaggct acagttatgt 2040

ggcctagaaa atgaaaagga agaaaatgcg aaagcagcca atcttcgaaa caaagagaaa 2100

cttacacatt tgtctcttga gtggaatagc aactgccatc ttgaaggaac aaattcccct 2160

tataaggttc ttgatgctct taaacctcat cacaggctgc agatgcttaa ggtaatttcc 2220

tatacaggca gttcttttcc agcatggata acagaccttg gtgtcctgca aaacttgata 2280

gagctccatt tagagggctg tacaatgtgt ggagaatttc ctcagttcat tcgtttcaag 2340

tttcttcagg ttctttatct gagtagactt gataacttgc aaaccctatg tcgcgaggaa 2400

ggaagacaag gaacagaaca agcatttcat cagcttgaga aggttgtcat caacatctgt 2460

ccaaagtttc aaacattgtg ctctggtgtg gcatccactg catttccaga actaaaggaa 2520

gtcaagttaa tggatttgga gagctttgag acatgggtgg caatggaagg gaggcaaggt 2580

tacatgccaa catttcctct gcttgaggag gttgaaatca acaagtgccc aaaattgaca 2640

actctacctg aagcaccaaa gctcaagatt ttaaatctaa atgaaaacaa agcgcagctg 2700

tccttgtcat tgcttcaatc cagctatata tcctcattgt ccaagctaag attggaaata 2760

gatgacaaag aaacaaccct gcagctgctt gatcagatcc acgaatcatc tctctcagaa 2820

atggagttaa cacattgcaa cattctcttc cccttgagcc catcacagtc aaaaatgagg 2880

atctgggaat ggcttggaca acttgttgag ctgaaaatcg actcctgcga ttcgctcatc 2940

tactggccag aagaagagtt cctatgcttg gtatccctga agaaattgac catcaaggag 3000

tgctataacc taattggccg tcctacccag gtgacaggaa atccaactct cctgccacat 3060

ctcacatcgc tttatgtttc taagtgtgtc aggttgagag agctctttgt tcttccacca 3120

tctatcaaat atattacaat taatgactcc atttgtcttg agagcttctc attcccctcc 3180

tatcatctgc catgcctaga acgtctaagt ttctggaatt gtcgttcagt ggtaacactt 3240

cagaacctac caccatgcct tatgctgtcc attgatgcat gttgggagct tcaatcgctg 3300

tcagggcagc tggatgaact caagcatttg ggcattgtac gctgcaataa actggagtca 3360

ctgaattgct tgggagaatt gccatcactg gaacatcttg accttaagat gtgcaaacgt 3420

ctagcatcgg cgccatgtgg cccaaggagt tactcatctc ttttgagtat tacaatccaa 3480

gactgcccaa gaatgaatat gaagaaggta tatgagtggc tccggccacg gctggatagc 3540

cttgaggaaa gagacctgtc acatgctcat acaagagtaa tttatgaaga gtctaaatgc 3600

ccgacactaa aatcatggaa atatgctatt actcgccgtt ggtga 3645

<210> 2

<211> 1214

<212> PRT

<213>水稻 (Oryza sativa)

<400> 2

Met Ala Glu Phe Leu Val Arg Pro Leu Leu Ser Thr Val Gln Asn Ala

1 5 10 15

Ser Ser Tyr Leu Ala Gly Gln Tyr Arg Val Met Glu Gly Met Glu Glu

20 25 30

Gln Arg Lys Ala Leu Glu Arg Met Leu Pro Leu Ile Leu Thr Val Ile

35 40 45

His Asp Ala Gln Asn Arg Thr Lys Gln Ser Gln Val Gly Ala Trp Leu

50 55 60

Gln Glu Leu Lys Lys Val Ser Tyr Glu Ala Thr Asp Val Phe Asp Glu

65 70 75 80

Phe Arg Tyr Glu Ala Leu Arg Arg Glu Ala Arg Arg Lys Gly His Gly

85 90 95

Ala Val Ser Leu Phe Ser Ser Arg Asn Pro Ile Val Phe Arg Tyr Arg

100 105 110

Met Gly Lys Lys Leu Arg Lys Ile Val Gln Arg Ile Lys Glu Leu Val

115 120 125

Glu Glu Met Asn Ser Phe Gly Leu Val His Arg Gln Glu Thr Pro Arg

130 135 140

Gln Ser Arg Gln Thr Asp Ser Val Met Leu Asp Phe Glu Lys Asp Ile

145 150 155 160

Val Ser Arg Ser Arg Asp Glu Glu Lys Arg Lys Val Val Lys Ile Leu

165 170 175

Val Asp Glu Ala Ser Asp Arg Glu Leu Thr Val Leu Pro Val Val Gly

180 185 190

Met Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Phe Ala Gln Leu Ile Tyr Asn Asp

195 200 205

Pro Glu Ile Leu Lys His Phe Gln Leu Arg Arg Trp Cys Cys Val Ser

210 215 220

Asp Glu Phe Asp Val Val Ser Ile Ala Asn Asn Ile Cys Val Ser Thr

225 230 235 240

Glu Arg Asn Arg Glu Arg Ala Leu Gln Asp Leu Gln Lys Glu Val Ser

245 250 255

Gly Lys Lys Phe Leu Ile Val Leu Asp Asp Val Trp Asn Arg Asp Ser

260 265 270

Asp Lys Trp Gly Lys Leu Met Thr Cys Leu Lys Gln Gly Ser Arg Gly

275 280 285

Ser Val Val Leu Thr Thr Thr Arg Asp Val Lys Val Ala Thr Ile Met

290 295 300

Ala Thr Ser Glu Val Glu Val Tyr Asn Leu Gly Lys Leu Gly Glu Val

305 310 315 320

Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Gln Ser Lys Ala Ile Gly Leu Pro Gly Ser

325 330 335

Asp Glu His Leu Glu Val Leu Asn Lys Ile Val Gln Arg Cys Asp Gly

340 345 350

Ser Pro Leu Ala Ala Lys Ser Phe Gly Ser Val Leu Ser Ser Arg Ser

355 360 365

Thr Val Gln Glu Trp Lys Asp Ile Leu Ala Lys Ser Asn Ile Cys Asn

370 375 380

Glu Gly Glu Asp Thr Ile Phe Pro Ile Leu Arg Leu Ser Tyr Asp Asp

385 390 395 400

Leu Pro Phe Asp Met Lys Gln Cys Phe Ala Phe Cys Ala Ile Phe Pro

405 410 415

Lys Asp Tyr Val Ile Asp Val Glu Thr Leu Ile Lys Leu Trp Leu Ala

420 425 430

His Asp Phe Ile Pro Leu Gln Glu Asp Asp Asn Leu Glu Ser Ala Ala

435 440 445

Glu Asp Ile Phe Lys Glu Leu Val Trp Arg Ser Phe Phe Gln Asp Val

450 455 460

Lys Lys Ser Ser Ile Trp Thr Thr Cys Lys Ile His Asp Leu Met His

465 470 475 480

Asp Ile Ala Gln Ser Val Met Gly Lys Glu Cys Val Ser Ile Ala Gly

485 490 495

Arg Ser Asn Phe Ile Ser Leu Leu Ser Glu His Pro Arg Tyr His Phe

500 505 510

His Ser Ser Tyr Lys Glu Thr Val Leu Leu Asp Asp Phe Met Arg Lys

515 520 525

Gln Ser Pro Thr Leu Arg Ser Leu Leu Phe Glu Arg Trp Phe Asn Tyr

530 535 540

Phe Ser Thr Ser His Leu Ser Lys Cys Ser Ser Leu Arg Ala Leu Lys

545 550 555 560

Leu Leu Arg Cys Ser Glu Phe Leu Pro Ile Gly His Leu Gln His Leu

565 570 575

Arg Tyr Leu Asn Ile Ser Ser Asn Ser Cys Ile Lys Lys Leu Pro Lys

580 585 590

Asp Ile Cys Ile Leu Tyr Asn Leu Gln Thr Leu Val Leu Ser Tyr Cys

595 600 605

Lys Asn Leu Val Glu Leu Pro Lys Asp Met Lys Tyr Met Lys Asn Leu

610 615 620

Arg His Leu Tyr Thr Asp Gly Cys Pro Lys Leu Lys Tyr Met Pro Pro

625 630 635 640

Asp Leu Gly Gln Leu Thr Ser Leu Gln Ile Leu Thr Ser Phe Val Val

645 650 655

Gly Ala Arg Ser Gly Cys Ser Asn Leu Arg Glu Leu Arg Thr Leu Asn

660 665 670

Leu Cys Gly Arg Leu Gln Leu Cys Gly Leu Glu Asn Glu Lys Glu Glu

675 680 685

Asn Ala Lys Ala Ala Asn Leu Arg Asn Lys Glu Lys Leu Thr His Leu

690 695 700

Ser Leu Glu Trp Asn Ser Asn Cys His Leu Glu Gly Thr Asn Ser Pro

705 710 715 720

Tyr Lys Val Leu Asp Ala Leu Lys Pro His His Arg Leu Gln Met Leu

725 730 735

Lys Val Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Ser Phe Pro Ala Trp Ile Thr Asp

740 745 750

Leu Gly Val Leu Gln Asn Leu Ile Glu Leu His Leu Glu Gly Cys Thr

755 760 765

Met Cys Gly Glu Phe Pro Gln Phe Ile Arg Phe Lys Phe Leu Gln Val

770 775 780

Leu Tyr Leu Ser Arg Leu Asp Asn Leu Gln Thr Leu Cys Arg Glu Glu

785 790 795 800

Gly Arg Gln Gly Thr Glu Gln Ala Phe His Gln Leu Glu Lys Val Val

805 810 815

Ile Asn Ile Cys Pro Lys Phe Gln Thr Leu Cys Ser Gly Val Ala Ser

820 825 830

Thr Ala Phe Pro Glu Leu Lys Glu Val Lys Leu Met Asp Leu Glu Ser

835 840 845

Phe Glu Thr Trp Val Ala Met Glu Gly Arg Gln Gly Tyr Met Pro Thr

850 855 860

Phe Pro Leu Leu Glu Glu Val Glu Ile Asn Lys Cys Pro Lys Leu Thr

865 870 875 880

Thr Leu Pro Glu Ala Pro Lys Leu Lys Ile Leu Asn Leu Asn Glu Asn

885 890 895

Lys Ala Gln Leu Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ser Ser Tyr Ile Ser Ser

900 905 910

Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Ile Asp Asp Lys Glu Thr Thr Leu Gln

915 920 925

Leu Leu Asp Gln Ile His Glu Ser Ser Leu Ser Glu Met Glu Leu Thr

930 935 940

His Cys Asn Ile Leu Phe Pro Leu Ser Pro Ser Gln Ser Lys Met Arg

945 950 955 960

Ile Trp Glu Trp Leu Gly Gln Leu Val Glu Leu Lys Ile Asp Ser Cys

965 970 975

Asp Ser Leu Ile Tyr Trp Pro Glu Glu Glu Phe Leu Cys Leu Val Ser

980 985 990

Leu Lys Lys Leu Thr Ile Lys Glu Cys Tyr Asn Leu Ile Gly Arg Pro

995 1000 1005

Thr Gln Val Thr Gly Asn Pro Thr Leu Leu Pro His Leu Thr Ser

1010 1015 1020

Leu Tyr Val Ser Lys Cys Val Arg Leu Arg Glu Leu Phe Val Leu

1025 1030 1035

Pro Pro Ser Ile Lys Tyr Ile Thr Ile Asn Asp Ser Ile Cys Leu

1040 1045 1050

Glu Ser Phe Ser Phe Pro Ser Tyr His Leu Pro Cys Leu Glu Arg

1055 1060 1065

Leu Ser Phe Trp Asn Cys Arg Ser Val Val Thr Leu Gln Asn Leu

1070 1075 1080

Pro Pro Cys Leu Met Leu Ser Ile Asp Ala Cys Trp Glu Leu Gln

1085 1090 1095

Ser Leu Ser Gly Gln Leu Asp Glu Leu Lys His Leu Gly Ile Val

1100 1105 1110

Arg Cys Asn Lys Leu Glu Ser Leu Asn Cys Leu Gly Glu Leu Pro

1115 1120 1125

Ser Leu Glu His Leu Asp Leu Lys Met Cys Lys Arg Leu Ala Ser

1130 1135 1140

Ala Pro Cys Gly Pro Arg Ser Tyr Ser Ser Leu Leu Ser Ile Thr

1145 1150 1155

Ile Gln Asp Cys Pro Arg Met Asn Met Lys Lys Val Tyr Glu Trp

1160 1165 1170

Leu Arg Pro Arg Leu Asp Ser Leu Glu Glu Arg Asp Leu Ser His

1175 1180 1185

Ala His Thr Arg Val Ile Tyr Glu Glu Ser Lys Cys Pro Thr Leu

1190 1195 1200

Lys Ser Trp Lys Tyr Ala Ile Thr Arg Arg Trp

1205 1210

<210> 3

<211> 5273

<212> DNA

<213>水稻 (Oryza sativa)

<400> 3

gagagagagg gagagatgaa tgcataaaaa gagaaaagtt ttagtgggac tcacattaag 60

aatggtgcac tatggagctt gtatcctatg tgtggctttg tcctacgtga catctctttt 120

tttatgagag agtggcctgc atagtgtatg tccgtggtac ttttttagtt atggaggcct 180

ctctatgtca ccatccttga gcaggtacca ctgttttcta tgtaaaattt ggtacctctt 240

gttaccttag gtactagaag gtaccaaatt ttaagtttta ctctcatccc tcctttttta 300

tcttaaggta ccggtatctc gcggtaccaa atcatttatg atcgttggat caaacagtgc 360

acatcctatt tagctagatc caatggtgag aaacgatttg gtatctcgag gtactggtac 420

ctcgaggtat aaaaggaagg ataagagtaa aactcaccaa attttacata taaaacagtg 480

gtacctcttg taccttctta aggatggaaa aaaaactctt ttaacaacat atattgtcta 540

aaaaatacca gcaggatgct tgcatcggat cgttggtaac gaaaaattac ggggcattta 600

actttttgtc actcttaaaa ttggttaata ataaatttat cactcattat atatgatata 660

tacgctctga tatgttaggt ccaatgataa atatgttaat tattgccggt tatgtacgcc 720

gtgtgtccag agcatctcat taaagtagga atcactctat cttctctccc acatcgatcg 780

accacctctc tctcttccat ctccatccac agcatcccct cggagattag ggcctccgtt 840

ctctgatcga tctagatcga tcccccacaa catctagatc gggtctcgac gaaggttagt 900

gccgctagct agctgcctgc gatatcatat catttcagtt ctgcaatgtg gagtaattaa 960

ccgtgttccc tctcccatcc atgatgcaga gaagagaacg aagcatcatc ttcagaggga 1020

gcaacgatgg ctgagttttt ggttcggccg ctgctgtcca cggtgcagaa cgcttccagc 1080

tatcttgcag gccagtacag ggtgatggaa ggcatggagg agcagcgcaa agctctggag 1140

cgcatgcttc cactcatcct caccgtcatc cacgacgcac agaacagaac caaacaatcc 1200

caagtaggcg cttggctgca agagctcaag aaggtgtcct acgaggcgac cgacgtgttc 1260

gacgagttca gatacgaggc gctccggcgc gaagccagga ggaaagggca cggcgctgta 1320

agcctcttct cctctcgtaa cccaatcgtg tttcgctaca ggatgggcaa gaagctgcgg 1380

aagatcgtgc agagaatcaa ggaacttgtc gaggagatga attcctttgg gctcgtacac 1440

cggcaggaaa caccgaggca gtcgaggcaa actgattcag tgatgcttga ttttgagaag 1500

gatattgtta gcagatccag agatgaggag aagaggaagg ttgtcaagat attggtggat 1560

gaagctagcg acagggagct cacagtcctt cctgttgttg gaatgggtgg tcttggcaag 1620

actacatttg cacagctcat ctacaatgac cctgaaatcc tgaagcattt tcagcttcgc 1680

aggtggtgtt gtgtgtctga tgaatttgat gtcgttagca tcgcaaacaa catatgtgtg 1740

agcacagaga gaaatcgtga aagggcactg caagatctgc agaaggaagt aagtggaaag 1800

aagtttctga tagtgttgga tgatgtgtgg aatagggatt ctgacaagtg gggaaagtta 1860

atgacctgcc ttaagcaggg ctccaggggc agtgtggtac taacaacaac tcgggatgtc 1920

aaagtcgcta caattatggc taccagtgaa gttgaagtgt ataatcttgg taagctagga 1980

gaagtgtatt tgaaggaaat aatccaaagt aaagcaattg gtttgccagg aagtgatgag 2040

catttggaag ttcttaataa aattgttcag agatgtgatg gctctccttt agctgcaaaa 2100

tcctttggct ctgtgttgtc tagcaggagt actgtacaag aatggaagga tatattagcc 2160

aaaagtaaca tttgcaatga gggggaggac acaatttttc ctatacttcg tctcagctat 2220

gacgacttac catttgacat gaagcaatgc tttgctttct gtgctatatt cccaaaagat 2280

tatgtgattg atgtggagac tttgattaag ctatggttgg cacatgactt cataccatta 2340

caagaggatg acaatctaga atcggcagcc gaagatatct tcaaggagct agtttggagg 2400

tcattttttc aagatgtaaa gaaatcttct atatggacca catgcaagat acatgatctt 2460

atgcacgaca ttgctcaatc tgttatggga aaagaatgtg tcagcatagc tggaaggtcc 2520

aattttataa gtctgttatc agaacatcct aggtatcact ttcactcatc atacaaagag 2580

actgttctct tagatgactt tatgagaaaa caatctccaa ctctccggag tttattgttt 2640

gaacgatggt ttaattactt cagcacatca catttatcca agtgcagttc tctgcgagca 2700

ctgaagctcc tacgatgcag cgaattctta ccaatcgggc accttcagca cctaagatat 2760

ctcaatatct catcaaacag ttgtatcaaa aagcttccta aagatatatg catactctac 2820

aatctacaga ctttggtcct ctcttattgt aaaaatcttg tcgaacttcc aaaggatatg 2880

aagtatatga aaaatctgcg acacctttat acggatggat gtccaaaatt gaagtacatg 2940

cctccggacc ttggacagtt aacttccctg cagatattaa catcttttgt ggtgggagct 3000

aggtctggtt gcagtaacct tagagaattg cgtaccttaa acctttgtgg caggctacag 3060

ttatgtggcc tagaaaatga aaaggaagaa aatgcgaaag cagccaatct tcgaaacaaa 3120

gagaaactta cacatttgtc tcttgagtgg aatagcaact gccatcttga aggaacaaat 3180

tccccttata aggttcttga tgctcttaaa cctcatcaca ggctgcagat gcttaaggta 3240

atttcctata caggcagttc ttttccagca tggataacag accttggtgt cctgcaaaac 3300

ttgatagagc tccatttaga gggctgtaca atgtgtggag aatttcctca gttcattcgt 3360

ttcaagtttc ttcaggttct ttatctgagt agacttgata acttgcaaac cctatgtcgc 3420

gaggaaggaa gacaaggaac agaacaagca tttcatcagc ttgagaaggt tgtcatcaac 3480

atctgtccaa agtttcaaac attgtgctct ggtgtggcat ccactgcatt tccagaacta 3540

aaggaagtca agttaatgga tttggagagc tttgagacat gggtggcaat ggaagggagg 3600

caaggttaca tgccaacatt tcctctgctt gaggaggttg aaatcaacaa gtgcccaaaa 3660

ttgacaactc tacctgaagc accaaagctc aagattttaa atctaaatga aaacaaagcg 3720

cagctgtcct tgtcattgct tcaatccagc tatatatcct cattgtccaa gctaagattg 3780

gaaatagatg acaaagaaac aaccctgcag ctgcttgatc agatccacga atcatctctc 3840

tcagaaatgg agttaacaca ttgcaacatt ctcttcccct tgagcccatc acagtcaaaa 3900

atgaggatct gggaatggct tggacaactt gttgagctga aaatcgactc ctgcgattcg 3960

ctcatctact ggccagaaga agagttccta tgcttggtat ccctgaagaa attgaccatc 4020

aaggagtgct ataacctaat tggccgtcct acccaggtga caggaaatcc aactctcctg 4080

ccacatctca catcgcttta tgtttctaag tgtgtcaggt tgagagagct ctttgttctt 4140

ccaccatcta tcaaatatat tacaattaat gactccattt gtcttgagag cttctcattc 4200

ccctcctatc atctgccatg cctagaacgt ctaagtttct ggaattgtcg ttcagtggta 4260

acacttcaga acctaccacc atgccttatg ctgtccattg atgcatgttg ggagcttcaa 4320

tcgctgtcag ggcagctgga tgaactcaag catttgggca ttgtacgctg caataaactg 4380

gagtcactga attgcttggg agaattgcca tcactggaac atcttgacct taagatgtgc 4440

aaacgtctag catcggcgcc atgtggccca aggagttact catctctttt gagtattaca 4500

atccaagact gcccaagaat gaatatgaag aaggtatatg agtggctccg gccacggctg 4560

gatagccttg aggaaagaga cctgtcacat gctcatacaa gagtaattta tgaaggtaca 4620

ctccattgct agcattttcc ttctttttcc gtttttcgtt tcttttacat agatgaatag 4680

attttatgtt cctgtgccag tgtatatctg cactcaaagt tccaatcatc aggccctgtg 4740

ttttataact gaataagata gaaattgtgt ttcttggtta aagagattct agtctaacct 4800

tgatcgaaca aaggttcgtt ccaccaaaac cataggagct ccatcactgt ttattgacaa 4860

gtttgtgtct acctgtgagg tgtgctatgt gactgcattt gtagcttcct ataatattca 4920

acataattta gtcggtgtcg ataccatgca tgaaatgagc atttttttta tcctcgagaa 4980

actattataa ggaagcactg ttttttatat aaaatttggt actttctagt atctaatata 5040

ctaacagtgg tacctcttag taccttctca aggatcgtaa tatcgctcgc atggaatagt 5100

tcctttccct ctgtactcca ttttattttt tctctttttc tgcagtttat ttcgattgtg 5160

agatattatc taaaaaaaat tcggttgtga gactgacatt tatttttcat gctacagagt 5220

ctaaatgccc gacactaaaa tcatggaaat atgctattac tcgccgttgg tga 5273

Claims

1.如下1)-3)中任一种物质在调控植物抗病性中的应用：

1)蛋白RWR1；

2)编码蛋白RWR1的DNA分子；

所述蛋白RWR1为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述抗病为抗稻瘟病。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：

所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。

5.权利要求1-4任一项中的如下1)-3)中任一种物质在培育抗病植物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抗病为抗稻瘟病；

或，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。

7.一种培育抗病转基因植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中编码蛋白RWR1的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物；

所述蛋白RWR1为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述提高目的植物中编码蛋白RWR1的DNA分子的表达量和/或活性为将所述编码蛋白RWR1的DNA分子导入目的植物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述抗病为抗稻瘟病。

10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。