CN110278965A - 一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂，涉及微生物技术领域，微生物菌肥的组成成分及其质量份数为：微生物菌5‑40％、吸附剂30‑80％、润湿剂1‑5％、助悬剂2‑10％；微生物菌剂的微生物菌为枯草芽孢杆菌，微生物菌的有效活菌数≥300亿cfu/g。本发明还提供了一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂的制备方法，微生物菌剂的制备包括枯草芽孢杆菌菌剂的制备与微生物菌剂的制备。本发明提供的防治柑橘溃疡病的微生物菌剂与铜制剂混合使用，能够有效延长持效期，减少铜制剂使用量，更加有效防止柑橘溃疡病的发生，治愈已染病植株，安全系数更高。

Description

一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
随着柑橘种植产业的迅速发展，种植面积快速扩大，造成果园中柑橘溃疡病病原菌基数逐年增多，进而导致柑橘溃疡病发生日趋严重，会造成树梢溃疡病变，叶片大量发病，果实果皮畸形，溃疡，严重影响果实外观及口感。柑橘溃疡病是柑橘属果树的重要病害之一，其致病菌菌系分化复杂、发病率高、传播快、寄主范围广，严重影响柑橘的产量及品质，成为柑橘属产业发展的重大威胁。
目前市场通常使用铜制剂来预防柑橘溃疡病，但长期大量使用铜制剂带来了一系列问题，如：铜元素沉积降低柑橘光合作用、加重红蜘蛛爆发、病原菌耐药性增加以及柑橘重金属超标等。生物防治措施作为一种新兴的防治措施，与其他方法相比，具有安全、有效、持久的特点，特别是能够避免化学防治带来的一系列问题，对病害防治效果好、环境友好、能保持生态平衡、有效成分为天然产物易降解，因此生物防治措施的研究成为一种必然趋势。
2017年王超等人研究表明蜡状芽孢杆菌能够高效防治柑橘溃疡病，防治效果高达65.46％(CN 107586735 A)，然而，由于蜡状芽孢杆菌存在安全性问题，用于食用经济作物上，人食用会引起食物中毒，中毒者症状为腹痛、呕吐、腹泻等。2010年3月20日，我国农业部依据《微生物肥料生物安全通用技术准则》(NY 1109-2006)相关规定停止了该菌种的微生物肥料登记。
发明内容
根据现有技术中存在的技术缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂及其制备方法，减少农药残留对作物生长造成的危害，同时解决使用蜡状芽孢杆菌菌剂所带来的副作用，降低柑橘溃疡病的发病率，提高柑橘的产量及品质。
为了实现本发明的技术目的，本发明一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂及其制备方法的技术方案是：
一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂，所述微生物菌剂的组成成分及其质量份数为：微生物菌5-40％、吸附剂30-80％、润湿剂1-5％、助悬剂2-10％。
作为本发明的进一步改进，所述微生物菌为枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),简称JQ-001菌株已于2015年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为CGMCC No.11632。
作为本发明的进一步改进，所述微生物菌的有效活菌数≥300亿cfu/g。
作为本发明的进一步改进，所述吸附剂为高岭土、硅藻土、膨润土、轻钙的一种或多种。
作为本发明的进一步改进，所述湿润剂为拉开粉、K12、NNO、EFW的一种或多种。
作为本发明的进一步改进，所述助悬剂为木质素磺酸钠、D425、羧甲基纤维素钠的一种或多种。
作为本发明的进一步改进，所述微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂。
作为本发明的进一步改进，所述微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：
(1)菌种活化：将低温保存的所述枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，36-38℃恒温条件下培养24-36h；
(2)一级种子液的制备：配制牛肉膏蛋白胨摇瓶培养基，利用500mL三角瓶分装，装液量200mL，高压灭菌后接入活化后的所述枯草芽孢杆菌，温度36-38℃，转速200-260rpm/min条件下培养22-26h；
(3)二级种子液的制备：配制种子罐培养基，将步骤(2)得到的所述一级种子液，按3-5％的接种量分别接入种子罐，所述种子罐装液量60％，温度36-38℃，转速180-220rpm/min，通气比1:1条件下培养20-26h；所述种子罐培养基的配方如下：蛋白胨0.8-1.2％，酵母提取物0.4-0.6％，氯化钠0.8-1.2％；
(4)大规模工业发酵培养：配制发酵罐培养基，将步骤(3)得到的所述二级种子液，按大规模工业发酵罐所用培养基体积比的5-10％接种量分别接入大规模工业发酵罐，所述发酵罐装液量60％，温度36-38℃，转速180-260rpm/min，通气量比1:1条件下培养至产生芽胞，完成发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵液；所述发酵罐培养基配方如下：豆粕粉3.5-4.5％，葡萄糖4.5-5.5％，磷酸二氢钾0.2-0.25％；
(5)枯草芽孢杆菌菌剂的制备：向步骤(4)得到的所述枯草芽孢杆菌发酵液中，按发酵液干物质重量比为1:1添加吸附剂进行吸附，然后直接进行喷雾干燥；
(6)所述枯草芽孢杆菌菌剂含菌量的检测：采用稀释平板法检测喷雾干燥后菌剂的含菌量；
(7)所述微生物菌剂的制备：将步骤(5)得到的所述芽孢杆菌菌剂按重量比加入60％吸附剂，2％润湿剂，8％助悬剂混合均匀，将混合好的物料加入气流粉碎机，细度控制325-400目，粉碎后检测可湿性粉剂含菌量、悬浮性、润湿性等技术指标，达标后得到所述微生物菌剂。
作为本发明的进一步改进，所述微生物菌剂与铜制剂配合施用，用于防治柑橘属植物溃疡病，具体施用时期及用量如下：
(1)春梢展叶1周左右，用所述微生物菌剂稀释1000倍+所述铜制剂1000倍进行处理，灌根1次，叶面喷施2次(间隔15—20天)；
(2)夏梢长至2-3厘米时，用所述微生物菌剂稀释1000倍+所述铜制剂1000倍进行处理，灌根1次，叶面喷施2次(间隔15—20天)；
(3)秋梢长至2-3厘米时，用所述微生物菌剂稀释1000倍+所述铜制剂1000倍进行处理，灌根1次，叶面喷施2次(间隔15—20天)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的防治柑橘溃疡病的微生物菌剂具有生产周期短、活性高、成本低的优点，有利于工业化生产，应用的枯草芽孢杆菌是一种耐盐、耐热、好氧且具有广泛生存适应能力的细菌，拮抗多种病原微生物，预防病害的进一步扩散，在防病、提高柑橘抗逆性、促生、调理土壤等方面起到了至关重要的作用，且枯草芽孢杆菌在使用过程中无存在安全隐患问题。该微生物菌剂与铜制剂混合使用，能够有效延长持效期，减少铜制剂使用量，更加有效防止柑橘溃疡病的发生，治愈已染病植株，安全系数更高。
具体实施方式
本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),简称JQ-001菌株已于2015年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为CGMCC No.11632。
为对本发明有益效果作进一步阐述，进行了以下具体实施例，特别说明的是，以下具体实施例旨在更好的理解本发明，绝不仅限于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用实验材料，如无特殊说明，均为商店购买的常规生化制剂。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
实施例1、微生物菌剂的制备
1、一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂，微生物菌剂的组成成分及其质量份数为：微生物菌30％、吸附剂60％、润湿剂2％、助悬剂8％。
2、微生物菌为枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),简称JQ-001菌株已于2015年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为CGMCC No.11632。
枯草芽孢杆菌JQ-001菌株的鉴定相关内容如下：
枯草芽孢杆菌JQ-001菌株的鉴定(CGMCC No.11632)
(1)微生物学特性：菌株在NA培养基，37℃环境下，培养12-18h后，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，扁平干燥无光泽，边缘不整齐，不产生色素。菌株杆状、具周生鞭毛，革兰氏染色呈阳性，好氧。
(2)分子生物学特性：将JQ-001菌株的16SrDNA扩增序列在NCBI数据库中比对，与Bacillus subtilis同源性为99.38％，结合JQ-001菌株的形态特征、生理生化特征，确定JQ-001菌株属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
3、微生物菌的有效活菌数≥300亿cfu/g。
4、吸附剂为高岭土、硅藻土、膨润土、轻钙的一种或多种。
5、湿润剂为拉开粉、K12、NNO、EFW的一种或多种。
6、助悬剂为木质素磺酸钠、D425、羧甲基纤维素钠的一种或多种。
7、微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂。
8、微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：
(1)菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，36-38℃恒温条件下培养24-36h；
(2)一级种子液的制备：配制牛肉膏蛋白胨摇瓶培养基，利用500mL三角瓶分装，装液量200mL，高压灭菌后接入活化后的枯草芽孢杆菌，温度36-38℃，转速200-260rpm/min条件下培养22-26h；
(3)二级种子液的制备：配制种子罐培养基，将步骤(2)得到的一级种子液，按3-5％的接种量分别接入种子罐，种子罐装液量60％，温度36-38℃，转速180-220rpm/min，通气比1:1条件下培养20-26h；种子罐培养基的配方如下：蛋白胨0.8-1.2％，酵母提取物0.4-0.6％，氯化钠0.8-1.2％；
(4)大规模工业发酵培养：配制发酵罐培养基，将步骤(3)得到的二级种子液，按大规模工业发酵罐所用培养基体积比的5-10％接种量分别接入大规模工业发酵罐，发酵罐装液量60％，温度36-38℃，转速180-260rpm/min，通气量比1:1条件下培养至产生芽胞，完成发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵液；发酵罐培养基配方如下：豆粕粉3.5-4.5％，葡萄糖4.5-5.5％，磷酸二氢钾0.2-0.25％；
(5)枯草芽孢杆菌菌剂的制备：向步骤(4)得到的枯草芽孢杆菌发酵液中，按发酵液干物质重量比为1:1添加吸附剂进行吸附，然后直接进行喷雾干燥；
(6)枯草芽孢杆菌菌剂含菌量的检测：采用稀释平板法检测喷雾干燥后菌剂的含菌量；
(7)微生物菌剂的制备：将步骤(5)得到的芽孢杆菌菌剂按重量比加入60％吸附剂，2％润湿剂，8％助悬剂混合均匀，将混合好的物料加入气流粉碎机，细度控制325-400目，粉碎后检测可湿性粉剂含菌量、悬浮性、润湿性等技术指标，达标后得到微生物菌剂。
9、微生物菌剂与铜制剂配合施用，用于防治柑橘属植物溃疡病，具体施用时期及用量如下：
(1)春梢展叶1周左右，用微生物菌剂稀释1000倍+铜制剂1000倍进行处理，灌根1次，叶面喷施2次(间隔15—20天)；
(2)夏梢长至2-3厘米时，用微生物菌剂稀释1000倍+铜制剂1000倍进行处理，灌根1次，叶面喷施2次(间隔15—20天)；
(3)秋梢长至2-3厘米时，用微生物菌剂稀释1000倍+铜制剂1000倍进行处理，灌根1次，叶面喷施2次(间隔15—20天)。
实施例2、微生物菌剂对沃柑柑橘溃疡病的影响
1、供试药剂
本发明制备的防治柑橘溃疡病的微生物菌剂。
2、供试作物与防治对象
供试作物：沃柑，树龄5年；
防治对象：柑橘溃疡病。
3、试验地点
试验地点：云南省西双版纳傣族自治州勐满县。
4、大田试验
①试验设计
试验设置3个处理，每个处理选取果树6株，处理Ⅰ为空白对照；处理Ⅱ用500倍液铜制剂进行处理；处理Ⅲ用1000倍液本发明微生物菌剂+1000倍液铜制剂进行处理。
柑橘集中3次施用，时间节点分别为：2018年2月中下旬，2018年6月中旬，2018年9月中下旬。
每次均进行灌根1次，叶面喷施2次，时间间隔15—20天。
②试验结果
本发明制备的防治柑橘溃疡病的微生物菌剂对沃柑柑橘溃疡病的影响结果如表1所示。
表1微生物菌剂对沃柑柑橘溃疡病的影响
处理 病指防效％ 平均产量kg/株
处理Ⅰ(空白对照) 0 29.7
处理Ⅱ 47.0 30.2
处理Ⅲ 84.7 46.7
从表1可以看出，本发明防治柑橘溃疡病的微生物菌剂对沃柑柑橘溃疡病有较好的病指防效。
实施例3、微生物菌剂对砂糖橘柑橘溃疡病的影响
1、供试药剂
本发明制备的防治柑橘溃疡病的微生物菌剂。
2、供试作物与防治对象
供试作物：砂糖橘，树龄5年；
防治对象：柑橘溃疡病。
3、试验地点
试验地点：广西壮族自治区百色市西林县。
4、大田试验
①试验设计
试验设置3个处理，每个处理选取果树6株，处理Ⅰ为空白对照；处理Ⅱ用500倍液铜制剂进行处理；处理Ⅲ用1000倍液本发明微生物菌剂+1000倍液铜制剂进行处理。
柑橘集中3次施用，时间节点分别为：2018年2月中下旬，2018年6月中旬，2018年9月中下旬。
每次均进行灌根1次，叶面喷施2次，时间间隔15—20天。
②试验结果
本发明制备的防治柑橘溃疡病的微生物菌剂对砂糖橘柑橘溃疡病的影响结果如表2所示。
表2微生物菌剂对砂糖橘柑橘溃疡病的影响
处理 病指防效％ 平均产量kg/株
处理Ⅰ(空白对照) 0 57.8
处理Ⅱ 42.1 59.0
处理Ⅲ 79.9 86.3
从表2可以看出，本发明防治柑橘溃疡病的微生物菌剂对砂糖橘柑橘溃疡病有较好的病指防效。
实施例4、微生物菌剂对冰糖橙柑橘溃疡病的影响
1、供试药剂
本发明制备的防治柑橘溃疡病的微生物菌剂。
2、供试作物与防治对象
供试作物：冰糖橙，树龄3年；
防治对象：柑橘溃疡病。
3、试验地点
试验地点：湖南省郴州市永兴县。
4、大田试验
①试验设计
试验设置3个处理，每个处理选取果树6株，处理Ⅰ为空白对照；处理Ⅱ用500倍液铜制剂进行处理；处理Ⅲ用1000倍液本发明微生物菌剂+1000倍液铜制剂进行处理。
柑橘集中3次施用，时间节点分别为：2018年2月中下旬，2018年6月中旬，2018年9月中下旬。
每次均进行灌根1次，叶面喷施2次，时间间隔15—20天。
②试验结果
本发明制备的防治柑橘溃疡病的微生物菌剂对冰糖橙柑橘溃疡病的影响结果如表3所示。
表3微生物菌剂对冰糖橙柑橘溃疡病的影响
处理 病指防效％ 平均产量kg/株
处理Ⅰ(空白对照) 0 27.3
处理Ⅱ 44.7 29.4
处理Ⅲ 82.0 41.8
从表3可以看出，本发明防治柑橘溃疡病的微生物菌剂对冰糖橙柑橘溃疡病有较好的病指防效。
本发明制备的微生物菌剂与铜制剂配合施用能够有效降低柑橘溃疡病病原菌的侵染及传播，从而减少叶片及果实病斑数，减少叶片脱落，且抗病持效期更长；同时，本发明微生物菌剂能够显著增加柑橘的座果率，从而提高柑橘的产量及品质。
以上所述，仅是本发明的较好实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实例所作的任何简单修改、变换材料等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂的组成成分及其质量份数为：微生物菌5-40％、吸附剂30-80％、润湿剂1-5％、助悬剂2-10％。
2.根据权利要求1所述的一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌为枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),简称JQ-001菌株已于2015年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为CGMCC No.11632。
3.根据权利要求2所述的一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌的有效活菌数≥300亿cfu/g。
4.根据权利要求3所述的一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂，其特征在于：所述吸附剂为高岭土、硅藻土、膨润土、轻钙的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂，其特征在于：所述湿润剂为拉开粉、K12、NNO、EFW的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂，其特征在于：所述助悬剂为木质素磺酸钠、D425、羧甲基纤维素钠的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂。
8.根据权利要求1所述的一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：
(1)菌种活化：将低温保存的所述枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，36-38℃恒温条件下培养24-36h；
(2)一级种子液的制备：配制牛肉膏蛋白胨摇瓶培养基，利用500mL三角瓶分装，装液量200mL，高压灭菌后接入活化后的所述枯草芽孢杆菌，温度36-38℃，转速200-260rpm/min条件下培养22-26h；
(3)二级种子液的制备：配制种子罐培养基，将步骤(2)得到的所述一级种子液，按3-5％的接种量分别接入种子罐，所述种子罐装液量60％，温度36-38℃，转速180-220rpm/min，通气比1:1条件下培养20-26h；所述种子罐培养基的配方如下：蛋白胨0.8-1.2％，酵母提取物0.4-0.6％，氯化钠0.8-1.2％；
(4)大规模工业发酵培养：配制发酵罐培养基，将步骤(3)得到的所述二级种子液，按大规模工业发酵罐所用培养基体积比的5-10％接种量分别接入大规模工业发酵罐，所述发酵罐装液量60％，温度36-38℃，转速180-260rpm/min，通气量比1:1条件下培养至产生芽胞，完成发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵液；所述发酵罐培养基配方如下：豆粕粉3.5-4.5％，葡萄糖4.5-5.5％，磷酸二氢钾0.2-0.25％；
(5)枯草芽孢杆菌菌剂的制备：向步骤(4)得到的所述枯草芽孢杆菌发酵液中，按发酵液干物质重量比为1:1添加吸附剂进行吸附，然后直接进行喷雾干燥；
(6)所述枯草芽孢杆菌菌剂含菌量的检测：采用稀释平板法检测喷雾干燥后菌剂的含菌量；
(7)所述微生物菌剂的制备：将步骤(5)得到的所述芽孢杆菌菌剂按重量比加入60％吸附剂，2％润湿剂，8％助悬剂混合均匀，将混合好的物料加入气流粉碎机，细度控制325-400目，粉碎后检测可湿性粉剂含菌量、悬浮性、润湿性等技术指标，达标后得到所述微生物菌剂。
9.根据权利要求1所述的一种防治柑橘溃疡病的微生物菌剂的应用，其特征在于：所述微生物菌剂与铜制剂配合施用，用于防治柑橘属植物溃疡病，具体施用时期及用量如下：
(1)春梢展叶1周左右，用所述微生物菌剂稀释1000倍+所述铜制剂1000倍进行处理，灌根1次，叶面喷施2次(间隔15—20天)；
(2)夏梢长至2-3厘米时，用所述微生物菌剂稀释1000倍+所述铜制剂1000倍进行处理，灌根1次，叶面喷施2次(间隔15—20天)；
(3)秋梢长至2-3厘米时，用所述微生物菌剂稀释1000倍+所述铜制剂1000倍进行处理，灌根1次，叶面喷施2次(间隔15—20天)。
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