CN110257327A - 一种脐带间充质干细胞的分离培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是，包括如下步骤：采集脐带标本；清洗脐带标本；脐带标本切片；脐带组织薄片处理；脐带组织薄片培养；消化处理；离心收集细胞；重悬接种培养；消化传代培养；细胞鉴定。本发明能够高效的分离脐带间充质干细胞，组织长出细胞的概率高，能够满足临床应用和大批量生产干细胞制品的需要；分离培养工作量小、效率高。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞分离培养，尤其涉及一种脐带间充质干细胞分离培养方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是一种成体干细胞，它存在于脐带、骨髓、脂肪和脐带血等一些组织中，具有很强的自我更新及多胚层分化能力。研究表明它在免疫调节和促进组织修复方面疗效显著，已经大量用于类风湿性关节炎、红斑狼疮、移植物抗宿主病、肝纤维化等多种重大疾病的临床研究和治疗上。
脐带间充质干细胞是从足月分娩断脐后的新生儿脐带中提取，具有来源丰富、不伤及身体、增殖能力强、具有多胚层分化能力、免疫原性低等优点，已经得到了越来越多专业人士的认可和应用。
目前国内外常用的分离方法大致有两种：
一是酶解法；酶解法成本高，对细胞有损伤，得到的原代细胞数量少，想要扩增到临床应用的细胞数量，就得在体外进行更多代数的培养，增加了细胞突变的几率，增大了临床应用的风险。
二是组织块贴壁培养法；常规的组织块贴壁培养法是将脐带组织剪碎，然后将细小的组织块一颗一颗的铺到培养皿底部，每个培养皿需要铺几百块组织，虽然可以避免酶解法的一些弊端，但是工作量大，组织长出细胞的概率低。分离少量的细胞用于科研可以，但是要达到临床应用的细胞数或者大批量生产干细胞制品的话，常规的组织块贴壁培养法就不适合了。
CN 103589683A公开了“一种脐带间充质干细胞的分离方法和培养方法”。该分离方法包括：用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎；用MSCs培养基重悬剪碎的华通氏胶，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。上述培养方法包括：对培养皿进行包被处理，弃去明胶，用PBS缓冲液进行洗涤；将分离获得的组织块和细胞重悬液接种于培养皿中；待细胞生长融合至80%-90%时进行消化传代。毫无疑问，这是所属技术领域的一种有益的探索。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞分离培养方法，其能够高效的分离脐带间充质干细胞，组织长出细胞的概率高，能够满足临床应用和大批量生产干细胞制品的需要；分离培养工作量小、效率高。
本发明所述的一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是，包括如下步骤：
步骤一，采集脐带标本；取足月分娩的断脐后的脐带10cm（厘米）放入采集瓶中，加入脐带组织保护液，于4—8℃的条件下送至实验室，采集的脐带标本必须在48小时内进行分离操作；
步骤二，清洗脐带标本；先从采集瓶中取出脐带标本，浸没在75%酒精中消毒，消毒时间为20-40秒；然后，用生理盐水冲洗脐带标本，冲洗2—3次，去除酒精残余；
步骤三，脐带标本切片；先剪去脐带标本两端各1cm，取中间的5cm长度的脐带标本，沿脐带标本的横向剪成1mm（毫米）厚度的脐带组织薄片，再将每片脐带组织薄片（沿脐带标本的纵向）对半剪成两片；
步骤四，脐带组织薄片处理；先将对半剪成两片的脐带组织薄片置于生理盐水中，清洗干净脐带组织薄片上的血渍；
步骤五，脐带组织薄片培养；将清洗干净后的脐带组织薄片均匀地贴在细胞培养皿上，并在脐带组织薄片的上面盖上玻璃片；然后，加入完全培养液，在37℃、5%CO2浓度、饱和湿度的培养箱中培养；隔4天更换一次完全培养液，并观察培养皿底和玻璃片上脐组织带薄片周围的细胞生长的情况；
步骤六，消化处理；当脐带组织薄片周围的培养皿底部和玻璃片上长满大量细胞后，去除脐带组织薄片，用胰蛋白酶溶液对培养皿和玻璃片上的细胞进行消化；消化1—3分钟；
步骤七，离心收集细胞；加入2ml胎牛血清终止消化，收集消化液于50ml离心管中，离心收集细胞；
步骤八，重悬接种培养；将离心收集到的细胞用所述完全培养液重悬接种于培养瓶中培养；培养得到的细胞为P1代细胞；
步骤九，消化传代培养；待P1细胞长至80%—95%融合后以，用胰蛋白酶进行消化收集并传代培养，消化传代培养得到的细胞为P2代细胞；其传代培养的方式是以一瓶传5瓶的比例进行传代；
步骤十，细胞鉴定；待P2代细胞长至80%—95%融合后，消化收集细胞进行鉴定。
进一步，步骤一中所述的脐带组织保护液的成分为DMEM/F12培养基、D-Hanks液、链霉素、青霉素，DMEM/F12培养基和D-Hanks液的体积比为1：1，青霉素浓度为100U/ml，链霉素浓度为100g/ml。
进一步，步骤四中所述的生理盐水是质量浓度为0.9%的注射用生理盐水。
进一步，步骤五中所述的完全培养液为含有5%—15%体积浓度胎牛血清的DMEM/F12培养基。
进一步，步骤六中所述的胰蛋白酶溶液的质量浓度为0.125%—0.5%。
进一步，步骤七中所述的离心收集细胞，其离心力为300-700G。
本发明的有益效果
（1）由于采用了让每片脐带薄片组织的上下两个横截面都能接触到适合细胞生长的介质——下横截面贴着培养皿底部，上横截面贴着玻璃片，能让一片组织同时在两个介质上长出细胞。所有组织片长出细胞的概率能达到99%以上，从而大大提高了脐带组织的利用率和分离效率。
（2）大大减少了分离操作的工作量，每份脐带的分离用时为5—10分钟，提高了工作效率；
综上所述，本发明比现有其他脐带间充质干细胞的分离方法操作更简单，大大减少了操作的工作量，能够高效的处理大量的脐带样本；脐带组织能长出细胞的概率得到了极大的提高，99%的组织片都能长出细胞，能得到大量的脐带间充质干细胞，更适合带间充质干细胞的产业化和临床应用。
附图说明
图1是沿脐带标本横向剪成1mm（毫米）厚度的脐带组织薄片示意图；
图2是将脐带组织薄片剪成两半的示意图；
图3是将脐带组织薄片均匀的贴在细胞培养皿上并在脐带组织薄片上盖上玻璃片的示意图；
图4是在脐带组织薄片周围长出大量细胞的状态图（照片）；
图5是P1代细胞长满培养皿的状态图（放大倍数：40X）；
图6是取P2代细胞做的细胞生长曲线图；
图7是脐带间充质干细胞的流式检测结果（低表达CD34、CD45、HLA-DR，表达率低于2%的标准）曲线图；
图 8是脐带间充质干细胞的流式检测结果（高表达CD90、CD73、CD105，表达率高于95%的标准）曲线图；
图9是脐带间充质干细胞裸鼠皮下成软骨诱导分化组织切片图（阿辛蓝染色，箭头所指为软骨组织）；
图10是脐带间充质干细胞体外成脂诱导分化图（油红染色，箭头所指为脂滴）。
具体实施方式：
下面结合图片对本发明做进一步说明。
本发明所述的一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是，包括如下步骤：
步骤一，采集脐带标本；取足月分娩的断脐后的脐带10cm（厘米）放入采集瓶中，加入脐带组织保护液，于4—8℃的条件下送至实验室，采集的脐带标本必须在48小时内进行分离操作；
所述的脐带组织保护液的成分为DMEM/F12培养基、D-Hanks液、链霉素、青霉素，DMEM/F12培养基和D-Hanks液的体积比为1：1，青霉素浓度为100U/ml，链霉素浓度为100g/ml。
步骤二，清洗脐带标本；先从采集瓶中取出脐带标本，浸没在75%酒精中消毒，消毒时间为20-40秒；然后，用生理盐水冲洗脐带标本，冲洗2—3次，去除酒精残余；
步骤三，脐带标本切片；先剪去脐带标本两端各1cm，取中间的5cm长度的脐带标本，沿脐带标本的横向剪成1mm（毫米）厚度的脐带组织薄片（参见图1），再将每片脐带组织薄片（沿脐带标本的纵向）对半剪成两片（参见图2）；
步骤四，脐带组织薄片处理；先将对半剪成两片的脐带组织薄片置于生理盐水中，清洗干净脐带组织薄片上的血渍；
所述的生理盐水是质量浓度为0.9%的注射用生理盐水。
步骤五，脐带组织薄片培养；将清洗干净后的脐带组织薄片均匀地贴在细胞培养皿上，并在脐带组织薄片的上面盖上玻璃片（参见图3）；然后，加入完全培养液，在37℃、5%CO2浓度、饱和湿度的培养箱中培养；隔4天更换一次完全培养液，并观察培养皿底和玻璃片上脐组织带薄片周围的细胞生长的情况；这样能够让一块脐带组织片在上下两种适合细胞生长的介质中同时长出细胞，效率得到了极大的提高。
所述的完全培养液为含有5%—15%体积浓度胎牛血清的DMEM/F12培养基。
步骤六，消化处理；当脐带组织薄片周围的培养皿底部和玻璃片上长满大量细胞后（参见图4），去除脐带组织薄片，用胰蛋白酶溶液对培养皿和玻璃片上的细胞进行消化；消化1—3分钟（具体消化时间在此范围内根据显微镜下观察情况而定）；所述的胰蛋白酶溶液的质量浓度为0.125%—0.5%；
步骤七，离心收集细胞；加入2ml胎牛血清终止消化，收集消化液于50ml离心管中，离心收集细胞；所述的离心收集细胞，其离心力为300-700G；
步骤八，重悬接种培养；将离心收集到的细胞用所述完全培养液重悬接种于培养瓶中培养；培养得到的细胞为P1代细胞；
步骤九，消化传代培养；待P1细胞长至80%—95%融合后以（参见图5），用胰蛋白酶进行消化收集并传代培养，消化传代培养得到的细胞为P2代细胞；其传代培养的方式是以一瓶传五瓶的比例进行传代；
步骤十，细胞鉴定；待P2代细胞长至80%—95%融合后，消化收集细胞进行鉴定。
取一部分细胞进行培养并制作细胞生长曲线，结果参见图6；
取一部分细胞进行流式细胞术鉴定脐带间充质干细胞表面标记物表达特征，共检测了了六个细胞表面标记物，分别是CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD105、CD90，检测结果是低表达CD34、CD45、HLA-DR，表达值在2%以下，参见图7；高表达CD73、CD105、CD90，表达值在95%以上，参见图8；符合间充质干细胞的标准；
取一部分细胞做体外成脂诱导分化实验（结果参见图10）和裸鼠体内成骨诱导分化实验（结果参见图9）。
Claims (6)
1.一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是，包括如下步骤：
步骤一，采集脐带标本；取足月分娩的断脐后的脐带10cm（厘米）放入采集瓶中，加入脐带组织保护液，于4—8℃的条件下送至实验室，采集的脐带标本必须在48小时内进行分离操作；
步骤二，清洗脐带标本；先从采集瓶中取出脐带标本，浸没在75%酒精中消毒，消毒时间为20-40秒；然后，用生理盐水冲洗脐带标本，冲洗2—3次，去除酒精残余；
步骤三，脐带标本切片；先剪去脐带标本两端各1cm，取中间的5cm长度的脐带标本，沿脐带标本的横向剪成1mm（毫米）厚度的脐带组织薄片，再将每片脐带组织薄片对半剪成两片；
步骤四，脐带组织薄片处理；先将对半剪成两片的脐带组织薄片置于生理盐水中，清洗干净脐带组织薄片上的血渍；
步骤五，脐带组织薄片培养；将清洗干净后的脐带组织薄片均匀地贴在细胞培养皿上，并在脐带组织薄片的上面盖上玻璃片；然后，加入完全培养液，在37℃、5%CO2浓度、饱和湿度的培养箱中培养；隔4天更换一次完全培养液，并观察培养皿底和玻璃片上脐组织带薄片周围的细胞生长的情况；
步骤六，消化处理；当脐带组织薄片周围的培养皿底部和玻璃片上长满大量细胞后，去除脐带组织薄片，用胰蛋白酶溶液对培养皿和玻璃片上的细胞进行消化；消化1—3分钟；
步骤七，离心收集细胞；加入2ml胎牛血清终止消化，收集消化液于50ml离心管中，离心收集细胞；
步骤八，重悬接种培养；将离心收集到的细胞用所述完全培养液重悬接种于培养瓶中培养；培养得到的细胞为P1代细胞；
步骤九，消化传代培养；待P1细胞长至80%—95%融合后以，用胰蛋白酶进行消化收集并传代培养，消化传代培养得到的细胞为P2代细胞；其传代培养的方式是以一瓶传5瓶的比例进行传代；
步骤十，细胞鉴定；待P2代细胞长至80%—95%融合后，消化收集细胞进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：步骤一中所述的脐带组织保护液的成分为DMEM/F12培养基、D-Hanks液、链霉素、青霉素，DMEM/F12培养基和D-Hanks液的体积比为1：1，青霉素浓度为100U/ml，链霉素浓度为100g/ml。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：步骤四中所述的生理盐水是质量浓度为0.9%的注射用生理盐水。
4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：步骤五中所述的完全培养液为含有5%—15%体积浓度胎牛血清的DMEM/F12培养基。
5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：步骤六中所述的胰蛋白酶溶液的质量浓度为0.125%—0.5%。
6.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：步骤七中所述的离心收集细胞，其离心力为300-700G。
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