CN110256548A

CN110256548A - 具有调控植物开花期功能的ZmELF3.1蛋白及其功能缺失突变体和应用

Info

Publication number: CN110256548A
Application number: CN201910601083.2A
Authority: CN
Inventors: 王海洋; 赵永平; 王宝宝; 谢钰容; 孔德鑫; 刘扬
Original assignee: South China Agricultural University; Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: South China Agricultural University; Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2019-07-04
Publication date: 2019-09-20

Abstract

本发明公开了具有调控植物开花期功能的ZmELF3.1蛋白及其功能缺失突变体和应用。本发明用拟南芥ELF3的蛋白序列为基础，通过在玉米基因组数据库的同源比对获得2个玉米的ELF3基因，分别命名为ZmELF3.1和ZmELF3.2。本发明进一步利用RISPR/Cas9基因编辑技术，将玉米ZmELF3.1基因突变后，其功能缺失突变体在长日照和短日照条件下，均表现出晚花表型，而且ZmELF3.1基因功能缺失后，还表现出叶片数和株高增加，由此确定玉米ZmELF3.1基因对调控玉米开花时间起着至关重要的作用。本发明不仅对调控玉米开花期具有重要意义，还可将其应用于米自交系改良和杂交育种。

Description

具有调控植物开花期功能的ZmELF3.1蛋白及其功能缺失突变体和应用

技术领域

本发明涉及调控玉米开花期的功能蛋白，尤其涉及调控调控玉米开花期的ZmELF3.1蛋白及其功能缺失突变体，本发明进一步涉及它们在调控植物开花期中的应用，属于ZmELF3.1功能蛋白及其突变体的应用领域。

背景技术

玉米原产于墨西哥南部热带地区，属于短日照作物，热带玉米种植在长日照条件下开花期延迟(Hung and Holland 2012)。而温带玉米则是通过降低对光周期的敏感性优化开花时间来适应长日照环境(Yang et al.2013)。开花期是玉米适应当地种植环境的一个复杂性状(Buckler et al.2009)，它是决定玉米生态分布的一个关键因素。玉米已经延伸贯穿整个世界，它已经可以适应不同的生态环境。尤其是玉米的开花时间可以在温带气候下适应短生长季节，长日照和低温。

开花时间是玉米育种中的重要适应性特征和重要选择标准。开花时间在玉米适应不同环境中有重要的作用，其作用是整合多种控制玉米由营养生长转向生殖生长最佳时间的内部和外部信号。因此，开花时间反映了玉米通过热带种过渡到当地条件对其环境的适应性响应，并且被认为是玉米育种中的重要适应性特征和重要选择标准。

然而，控制玉米品种的开花时间和生态地理适应的分子遗传机制仍然很大程度上不清楚。更好地理解开花时间调节机制对于更好地适应不同生态区的玉米品种的分子育种是至关重要的。

虽然，在水稻、大麦和豌豆等作物中，ELF3基因被报道能够调控植物开花时间，参与植物生物钟过程，是水稻、大麦和豌豆适应不同地理生态环境的关键基因。而在玉米中，ELF3基因到目前为止还未增报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种调控玉米开花期的ZmELF3.1功能蛋白及其编码基因；

本发明的目的之二是提供的ZmELF3.1蛋白的功能缺失突变体；

本发明的目的之三是将ZmELF3.1功能蛋白及其功能缺失突变体应用于调控玉米开花期等方面。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了一种具有调控植物开花期功能的ZmELF3.1蛋白，其氨基酸为(a)或(b)所示:

(a)、SEQ ID No.1所示的氨基酸；或

(b)、将SEQ ID No.1所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和***而衍生得到的仍具有调控植物开花期功能或活性的蛋白变体。

本发明进一步提供了所述ZmELF3.1蛋白的编码基因，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：

(a)、SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；或

(b)、编码SEQ ID No.1所示氨基酸序列的多核苷酸序列；或

(c)、与SEQ ID NO.2的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列所编码蛋白质仍具有调控植物开花期功能；或

(d)、与SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列至少有90％或以上同源性的多核苷酸序列；或

(e)、在SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或***的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有调控植物开花期的功能或活性。

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备ZmELF3.1蛋白的氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

所述“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、***或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQ ID No.1所示氨基酸序列的多核苷酸变体或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。

将ZmELF3.1蛋白的编码基因在植物中进行过表达，能够使植物的开花期提前；或者通过基因编辑技术或基因敲除技术等将植物体内的ZmELF3.1蛋白进行功能缺陷突变所得到的植物的开花时间晚于野生型植物。因此，本发明在调控植物开花期等方面具有重要的应用价值。

更具体的，所述的调控植物开花期包括使植物的开花期提前或使植物的开花期延迟或推后。

本发明提供了一种使植物开花时间提前的方法，包括：(1)构建含有所述ZmELF3.1蛋白的编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将ZmELF3.1蛋白的编码基因在植物组织或细胞中进行过表达。

本发明还提供了一种开花期提前的植物新品种的培育方法，包括：(1)构建含有所述ZmELF3.1蛋白的编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将ZmELF3.1蛋白的编码基因在植物组织或细胞中进行过表达。

本发明还提供了含有所述ZmELF3.1蛋白的编码基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。

将所述ZmELF3.1蛋白的编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区、SEQID No.2所示的多核苷酸序列和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.2所示的多核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。

此外，也可以通过将植物体内的ZmELF3.1蛋白采用基因编辑技术或基因敲除的方式得到ZmELF3.1蛋白功能缺陷的转基因植物，所得转基因植物的开花时间晚于受体植物(野生型玉米品种)，这对于需要将延迟植物开花期具有重要的应用价值。

由此，本发明提供了一种延迟植物开花期的方法，包括：构建ZmELF3.1基因的基因编辑载体或ZmELF3.1基因的基因敲除载体，将该基因编辑载体或基因敲除载体转入受体植物中，得到ZmELF3.1蛋白功能缺陷的转基因植物；所得转基因植物的开花时间晚于野生型植物；

其中，ZmELF3.1基因的基因编辑载体或ZmELF3.1基因的基因敲除载体可以按照本领域的常规构建方法得到。

作为一种优选的实施方案，本发明提供了一种ZmELF3.1基因的基因编辑载体的构建方法，包括：

(1)制备玉米U6-2启动子片段，其中，采用SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所述的引物进行PCR扩增得到玉米U6-2启动子片段；

(2)sgRNA表达盒的制备

用Overlap PCR的方法将带有接头的ZmELF3.1基因的靶点序列和sgRNA骨架序列融合在一起，获得的PCR产物命名为ZmELF3.1-1片段；其中所述的Overlap PCR的引物序列为SEQ ID No:5、SEQ ID No:6和SEQ ID No:7所示；所述sgRNA骨架序列为SEQ ID No:8所示；

再用Overlap PCR的方法将上一步获得的融合PCR片段和U6-2启动子片段融合为一个片段，获得的PCR产物即为sgRNA表达盒；其中，所用到的PCR引物序列为SEQ ID No:9、SEQ ID No:910和SEQ ID No:11所示；

(3)sgRNA表达盒连接CPB-pUbi-hspcas9载体：将sgRNA表达盒连接到CPB-Ubi-hspcas9载体上获得连接产物，即得。

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑创制了ZmELF3.1蛋白缺陷的突变体zmelf3.1，突变体zmelf3.1在长日照条件下比野生型C01散粉晚11-13天，吐丝晚15-17天，叶片数显著多于野生型C01。突变体zmelf3.1在短日照条件下比野生型C01散粉晚8天左右，吐丝晚8天左右，叶片数显著多于野生型C01。

所述的“转化”指将编码基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。

本发明中所述的转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的基因提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick et al.Plant CellReports.1986.5:81-84)。

本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物，优选是玉米。

本发明用拟南芥ELF3的蛋白序列为基础，通过在玉米基因组数据库的同源比对获得2个玉米的ELF3基因，分别命名为ZmELF3.1和ZmELF3.2。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将玉米ZmELF3.1基因突变后，其功能缺失突变体在长日照和短日照条件下，均表现出晚花表型，而且ZmELF3.1基因功能缺失后，还表现出叶片数和株高增加。表明玉米ZmELF3.1基因对调控玉米开花时间起着至关重要的作用。本发明与玉米开花期相关的功能基因ZmELF3.1对控制玉米开花期有重要作用，不仅对改良玉米开花期具有重要意义，还可将其应用于米自交系改良和杂交育种。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“***”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行***以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

附图说明

图1为通过CRISPR/Cas9基因编辑方法获得突变体zmelf3.1；测序结果，从图中可以看出：突变体zmelf3.1在编辑的ZmELF3.1基因第二个外显子上产生136bp长度的碱基大片段删除或1bp的***，导致蛋白质移码突变。

图2为对T2代植株进行鉴定，挑选纯合体植株(图2-A)，对纯合体突变植株进行基因ZmELF3.1的qPCR检测，发现zmelf3.1中基因ZmELF3.1几乎不转录。

图3为纯合突变体zmelf3.1的开花期形态形表型；A：突变体zmelf3.1在长日照条件下比野生型C01散粉晚11-13天，吐丝晚15-17天，叶片数显著多于野生型C01；B：突变体zmelf3.1在短日照条件下比野生型C01散粉晚8天左右，吐丝晚8天左右，叶片数显著多于野生型C01。

图4为纯合突变体zmelf3.1的开花期表型的统计学数据；A为长日照条件下数据，B为短日照条件下数据。

图5为纯合突变体zmelf3.1的顶端分生组织的发育进程图片，从图中可看出，纯合突变体zmelf3.1比野生型C01发育明显迟缓。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的野生型C01为中国种子集团(武汉)的玉米自交系转化材料。

实施例1 ZmELF3.1基因的获得及突变体zmelf3.1的创制

1、ZmELF3.1基因的获得

本试验用拟南芥ELF3的蛋白序列为基础，通过在玉米基因组数据库的同源比对获得2个玉米的ELF3基因，分别命名为ZmELF3.1和ZmELF3.2。

2、突变体Zmelf3.1的创制

首先从玉米Gramene数据库中获取ZmELF3.1(Zm00001d044232)的基因组序列，并在基因组序列中把CDS序列标注出来，然后在CDS序列中用Snap Gene Viewer软件设计2个靶位点，靶位点找到后要到Gramene玉米数据库中进行BLAST比对，确保这两个靶位点的特异性。靶点序列分别是：

ZmELF3.1-Guide 1：GTCCTCACAGACCAAGAACAAGG

ZmELF3.1-Guide 2：GTAGACTGTCGATAAAATCTAGG

然后利用CTAB法提取玉米野生型自交系C01的基因组DNA。用引物：

ZmELF3.1-F2:5'TGGCTGTAATGATATGCTTGGG 3'

ZmELF3.1-R2:5'TTCTCTTAGCACCAACTTCCCG 3'

对所提的基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物测序。测序结果与B73参考序列进行比对分析，发现C01的ZmELF3.1靶位点序列与B73参考序列相同。

然后根据测序结果合成引物用于ZmELF3.1的CRISPR-Cas9载体构建，引物如下：

ZmELF3.1-1F:

5'GAGCCGCAAGCACCGAATTGTCCTCACAGACCAAGAACAGTTTTAG AGCTAGAAATAGCAAGTT3'

ZmELF3.1-2F:

5'GAGCCGCAAGCACCGAATTGTAGACTGTCGATAAAATCTGTTTTAG AGCTAGAAATAGCAAGTT3'

然后构建ZmELF3.1的CRISPR-Cas9载体，具体步骤如下：

(1)将CPB-pUbi-hspcas9载体用HindIII酶切，回收

(2)玉米U6-2启动子片段的制备：

引物序列：

MU62-1F：5'TGCACTGCACAAGCTGCTGTTTTTGTTAGCCCCATCG 3'MU62-1R:5'AATTCGGTGCTTGCGGCTC 3'

PCR扩增体系见表1。

表1 PCR扩增体系

成分	体积
		2×PCR Buffer for KOD Fx	25μL
2mM dNTPs	10μL
		MU62-1F	1.5μL
MU62-1R	1.5μL
		KOD Fx	1μL
B73DNA	1μL
		Add ddH<sub>2</sub>O	Up to 50μL

PCR反应程序如下：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收，即获得玉米U6-2启动子片段。

(3)sgRNA表达盒的制备

首先用Overlap PCR的方法将带有接头的靶点序列和sgRNA骨架序列融合在一起，获得的PCR产物分别命名为ZmELF3.1-1片段，ZmELF3.1-2片段。

引物序列：

ZmELF3.1-1F:

5'GAGCCGCAAGCACCGAATTGTCCTCACAGACCAAGAACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT 3'

ZmELF3.1-2F:

5'GAGCCGCAAGCACCGAATTGTAGACTGTCGATAAAATCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT 3'

MUsgR-2R:5'GGCCAGTGCCAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCG3'

PCR扩增体系见表2。

表2 PCR扩增体系

成分	体积
		2×PCR Buffer for KOD Fx	25μL
2mM dNTPs	10μL
		ZmELF3.1-1F/ZmELF3.1-2F	1.5μL
MUsgR-2R	1.5μL
		KOD Fx	1μL
合成的sgRNA骨架序列	1μL
		Add ddH<sub>2</sub>O	Up to 50μL

人工合成sgRNA骨架片段序列如下：

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT

PCR反应程序如下：

然后用Overlap PCR的方法将上一步获得的融合PCR片段和U6-2启动子片段融合为一个片段，获得的PCR产物即为sgRNA表达盒，分别命名为U62-ZmELF3.1-1片段，U62-ZmELF3.1-2片段。引物序列为：

MU62-1F：5'TGCACTGCACAAGCTGCTGTTTTTGTTAGCCCCATCG3'(U62-ZmELF3.1-1)

MU62-2F:5'TGCTTTTTTTAAGCTGCTGTTTTTGTTAGCCCCATCG3'(U62-ZmELF3.1-2)

MUsgR-2R:5'GGCCAGTGCCAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCG3'

PCR扩增体系见表3。

表3 PCR扩增体系

成分	体积
		2×PCR Buffer for KOD Fx	25μL
2mM dNTPs	10μL
		MU62-1F/MU62-2F	1.5μL
MUsgR-2R	1.5μL
		KOD Fx	1μL
U6-2启动子片段	1μL
		ZmELF3.1-1片段/ZmELF3.1-2片段	1μL
Add ddH<sub>2</sub>O	Up to 50μL

PCR反应程序如下：

(4)sgRNA表达盒连接CPB-pUbi-hspcas9载体

按以下反应体系和过程，将2个sgRNA表达盒依次连接到CPB-Ubi-hspcas9载体上，获得连接产物。

反应体系及过程见表4。

表4反应体系及过程

成分	体积
		sgRNA表达盒	1μL
CPB-pubi-hspcas9载体片段	1μL
		重组酶	0.5μL

重组酶为Clontech公司的In-Fusion酶，反应条件为50℃,30min。

注：连接U62-ZmELF3.1-1片段用CPB-pubi-hspcas9载体片段，连接U62-ZmELF3.1-2片段用CPB-pubi-hspcas9-U62-ZmELF3.1-1载体片段(均为HindIII酶切)。

(5)转化大肠杆菌DH5α及验证

将连接产物用热激法42℃转化大肠杆菌DH5α，菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素的平板上,37℃培养约12-16h。挑取平板上长出的单菌落,摇菌扩繁。以菌液为模板进行PCR验证。

PCR扩增体系见表5。

表5 PCR扩增体系

成分	体积
		ddH<sub>2</sub>O	5.75μL
2XTsinGKE master mix	7.5μL
		Ubi-4F	0.375μL
PstI-R	0.375μL
		菌液	1μL
Total	15μL

其中根据载体设计的上游引物为Ubi-4F:5’CTTAGACATGCAATGCTCATTATCTC3’，下游引物为PstI-R:5’CTGGCGAAAGGGGGATGT3’，用于检测阳性克隆。

PCR反应程序如下：

将PCR条带大小正确的菌液送公司测序。测序结果正确的质粒经HindIII单酶切后获得第一次的连接产物载体片段，然后再重复步骤(4)和(5)，将U62-ZmELF3.1-2片段连接到CPB-pubi-hspcas9载体上。

(6)将构建好的CPB-pubi-hspcas9-ZmELF3.1基因编辑载体用电击法导入农杆菌EHA105中。

(7)利用农杆菌介导玉米未成熟胚遗传转化方法将CPB-pubi-hspcas9-ZmELF3.1T-DNA导入玉米自交系C01受体(委托中国种子集团有限公司生命科学技术中心完成，地址：湖北省武汉市高新技术开发区高新大道888号生物园路3号)。获得转基因T0代种子。

(8)将T0代种子播于大田中，在玉米长至4个展开叶时，用Basta试剂(200克/升草胺磷，购自淘宝的圣春秋农资店铺)稀释1000倍涂抹叶尖，筛选没有***T-DNA的(Basta涂抹部位枯死)T1代植株。然后取样提取T1代植株的基因组DNA，PCR扩增并测序鉴定靶位点是否发生突变。

PCR扩增体系见表6。

表6 PCR扩增体系

成分	体积
		ddH<sub>2</sub>O	5.75μL
2XTsinGKE master mix	7.5μL
		ZmELF3.1-F3	0.375μL
ZmELF3.1-R3	0.375μL
		基因组DNA	1μL
Total	15μL

ZmELF3.1-F3:5'GACAGAGTTTCTTCATCCAGGTTT 3'

ZmELF3.1-R3:5'CCACAGCTTTTGATCCTTGC 3'

PCR反应程序如下：

由于ZmELF3.1基因设计了两个靶点，理论上如果Cas9同时在两个靶点切割，则zmelf3.1纯合突变体经PCR扩增后应该获得单一的小带片段。野生型植株则PCR扩增后应该获得没有切割的单一的大带片段，而杂合植株应该扩增出2条带(大片段和小片段)(见图2-A)，如下表7所示：

表7扩增条带

大带bp	小带bp
		516	382

经初步PCR筛选鉴定后，选取单一的小带片段送公司测序。测序结果见(图1-C)，鉴定出了3个独立事件来源的zmelf3.1纯合突变体，2个删除了136bp，一个***了一个碱基T，它们都发生了移码突变，从而使ZmELF3.1蛋白丧失功能。

实施例2 Zmelf3.1突变体的表型分析

(1)将野生型与取实施例1中鉴定到的阴性的纯合zmelf3.1突变体(KO#1，KO#2，KO#3)种植于河北省廊坊市广阳区万庄镇伊指挥营村国际高新技术产业园基地和海南省三亚市乐东黎族自治县尖峰镇翁毛村万钟公司产学研示范园基地，野生型与每个突变体种植3行，每行15株。对大田中野生型和突变体植株的开花期调查发现,在长日照和短日照条件下，zmelf3.1突变体的散粉期和吐丝期显著晚于野生型(P<10^-10)(图3和图4)，这一结果表明，玉米ZmELF3.1基因促进玉米开花。

(2)将野生型与取实施例1中鉴定到的阴性纯合zmelf3.1突变体(KO#1，KO#2，KO#3)种植于河北省廊坊市广阳区万庄镇伊指挥营村国际高新技术产业园基地，在V5和V8期取样剥生长锥，观察野生型和突变体生长锥的发育情况，从图5可看出，在V5和V8期，zmelf3.1突变体生长锥发育明显滞后于野生型，这与其晚花表型吻合。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院生物技术研究所；华南农业大学

<120> 具有调控植物开花期功能的ZmELF3.1蛋白及其功能缺失突变体和应用

<130> BJ-2002-190321A

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 756

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 1

Met Thr Arg Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Lys Glu Glu Pro Gly Lys

1 5 10 15

Val Met Gly Pro Leu Phe Pro Arg Leu His Val Ser Asp Ala Gly Lys

20 25 30

Gly Gly Gly Pro Arg Ala Pro Pro Arg Asn Lys Met Ala Leu Tyr Glu

35 40 45

Gln Phe Thr Val Pro Ser Asn Arg Phe Ser Ser Pro Ala Ala Ser Ala

50 55 60

Arg Ala Ala Gly Ala Ser Leu Val Pro Ser Thr Ala Ala Ala Gln Val

65 70 75 80

Tyr Gly Tyr Asp Arg Thr Leu Phe Gln Pro Phe Asp Val Pro Ser Asn

85 90 95

Glu Pro Pro Arg Ser Ser Glu Lys Phe Lys Gly Asn Thr Ile Asn Gly

100 105 110

Gln Ser Asn Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Arg Met Ser Ser Gln Thr

115 120 125

Lys Asn Lys Asp Val Cys Ala Ser Lys Ser Ile Ala Lys Cys Thr Ser

130 135 140

Gln His Arg Val Gly Asn Thr Ile Met Ser Ser Gly Lys Lys Val Val

145 150 155 160

Ser Asp Asp Glu Phe Met Val Pro Ser Ile Cys Tyr Pro Arg Phe Tyr

165 170 175

Arg Gln Ser Thr Gln Asp His Ala Asp Lys Ser Lys Pro Gln Ser Thr

180 185 190

Thr Asn Pro His Lys Ser Pro Ala Met Ser Lys Ser Ser Val Glu Cys

195 200 205

Tyr Ser Thr Val Asn Lys His Leu Asp Lys Ile Asn Glu Ala Asp Arg

210 215 220

Arg Leu Met Asn Ser Pro Lys Val Lys Glu Lys Glu Ala Val Gln Gly

225 230 235 240

Ser Lys Ala Val Glu Val Lys Glu Lys Ser Ser Ser Phe Gln Ala Ser

245 250 255

Glu Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Ala Lys Leu Cys Gln Met Arg Asn Lys

260 265 270

Ala Ser Asn Ile Asn His Cys Asp Asn Asn Gly Cys Gln Pro Ala Ser

275 280 285

Val Asn Gly Asn Phe Thr Glu Ala Lys Asn Pro Thr Ala Ala Arg Asn

290 295 300

Thr Ser Ser Cys Lys Pro Cys Thr Asp Val Asp Ser Ser Asn Arg Lys

305 310 315 320

Ser Asn Leu Leu Glu Arg Ser Pro Arg Glu Val Gly Ala Lys Arg Lys

325 330 335

Arg Gly His His Asn Gly Glu Gln Asn Asp Asp Leu Ser Asp Ser Ser

340 345 350

Val Glu Cys Ile Pro Gly Gly Glu Ile Ser Pro Asp Glu Ile Val Ala

355 360 365

Ala Ile Gly Pro Lys His Phe Trp Lys Ala Arg Arg Ala Ile Gln Asn

370 375 380

Gln Gln Arg Val Phe Ala Val Gln Val Phe Glu Leu His Lys Leu Ile

385 390 395 400

Lys Val Gln Lys Leu Ile Ala Ala Ser Pro His Leu Leu Ile Glu Gly

405 410 415

Asp Pro Val Leu Gly Asn Ala Leu Thr Gly Lys Arg Asn Lys Leu Pro

420 425 430

Lys Gly Asn Ser Lys Val Gln Thr Leu Ser Ile Thr Asn Lys Asp Asp

435 440 445

Ile Gln Pro Thr Leu Glu Gln Pro Glu Leu Ser Lys Gln Asp Thr Glu

450 455 460

Gly Asn Leu Leu Ala His Ser His Asp Asp Gly Leu Gly Asp Asn His

465 470 475 480

His Asn Gln Ala Ala Thr Asn Glu Thr Phe Thr Ser Asn Pro Pro Ala

485 490 495

Met His Val Ala Pro Asp Asn Lys Gln Asn Asn Trp Cys Met Asn Pro

500 505 510

Pro Gln Asn Gln Trp Leu Val Pro Val Met Ser Pro Ser Glu Gly Leu

515 520 525

Val Tyr Lys Pro Phe Ala Gly Pro Cys Pro Pro Val Gly Asn Leu Leu

530 535 540

Thr Pro Phe Tyr Ala Asn Cys Ala Pro Ser Arg Leu Pro Ser Thr Pro

545 550 555 560

Tyr Gly Val Pro Ile Pro His Gln Pro Gln His Met Val Pro Pro Gly

565 570 575

Ala Pro Ala Met His Met Asn Tyr Phe Pro Pro Phe Ser Met Pro Val

580 585 590

Met Asn Pro Gly Thr Pro Ala Ser Ala Val Glu Gln Gly Ser His Ala

595 600 605

Ala Ala Pro Gln Pro His Gly His Met Asp Gln Gln Ser Leu Ile Ser

610 615 620

Cys Asn Met Ser His Pro Ser Gly Val Trp Arg Phe Leu Ala Ser Arg

625 630 635 640

Asp Ser Glu Pro Gln Ala Ser Ser Ala Thr Ser Pro Phe Asp Arg Leu

645 650 655

Gln Val Gln Gly Asp Gly Ser Ala Pro Leu Ser Phe Phe Pro Thr Ala

660 665 670

Ser Ala Pro Asn Val Gln Pro Pro Pro Ser Ser Gly Gly Arg Asp Arg

675 680 685

Asp Gln Gln Asn His Val Ile Arg Val Val Pro Arg Asn Ala Gln Thr

690 695 700

Ala Ser Val Pro Lys Ala Gln Pro Gln Pro Ser Ser Gly Gly Arg Asp

705 710 715 720

Gln Lys Asn His Val Ile Arg Val Val Pro His Asn Ala Gln Thr Ala

725 730 735

Ser Glu Ser Ala Ala Trp Ile Phe Arg Ser Ile Gln Met Glu Arg Asn

740 745 750

Gln Asn Asp Ser

755

<210> 2

<211> 2271

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 2

atgacgaggg gaggcggtgg acaaggaggc aaggaggagc cggggaaggt gatgggtccg 60

ctgttcccgc ggctccacgt cagcgacgca ggcaagggcg gcggcccgcg ggctccgcca 120

aggaacaaga tggcgctcta cgagcagttc accgtgccgt ccaaccgctt cagctccccc 180

gcggcctccg cccgcgccgc gggggccagc ctcgtgccct ccacggcggc tgcccaggtt 240

tatggttatg acaggacgct gttccagccc ttcgacgtgc cttcaaatga gcctcctcgt 300

tcatctgaaa agttcaaagg aaacactatc aacgggcagt ctaatagtac aagaagagaa 360

cctttgagga tgtcctcaca gaccaagaac aaggacgtct gtgcttcaaa atcaattgcc 420

aagtgcacct cacagcatag agtgggcaac accatcatgt cttctggaaa gaaagtggtc 480

agtgatgatg aatttatggt tccttccatc tgttatccta gattttatcg acagtctact 540

caagatcatg cagataaatc aaaaccccaa tctactacaa acccacacaa aagtcctgca 600

atgtccaaat catctgtaga gtgctatagt actgtgaaca agcacttgga caaaatcaat 660

gaagctgata ggaggttaat gaactctcca aaggttaagg agaaagaagc agtgcaagga 720

tcaaaagctg tggaagttaa agaaaagagt tcatcatttc aggcatcaga aaagttcaaa 780

gacaaatatg ctaagctatg tcaaatgagg aataaggcaa gtaatataaa tcattgtgac 840

aacaacggtt gccaacctgc aagcgtgaat ggaaatttca cagaagcaaa gaaccctaca 900

gcagctagaa atacatcttc ctgtaaacca tgtactgatg tagatagctc taacaggaag 960

tctaatttac tggaaagaag cccacgggaa gttggtgcta agagaaaaag aggacatcac 1020

aatggagagc aaaatgatga tttatctgac tcctcagtgg aatgcatacc tgggggggag 1080

atctctccag atgaaattgt tgctgctatt ggtccaaagc atttctggaa agcaagaaga 1140

gctattcaga atcagcagag ggtttttgct gtccaagtgt tcgagctgca taagctgata 1200

aaagtgcaga aattaatcgc ggcatctcca catctgctta ttgaaggtga tcctgtcctt 1260

ggcaatgcat taacaggaaa aaggaacaaa cttcctaaag gaaattcgaa agttcagacc 1320

ctgtcaatca caaacaaaga tgatatccag ccaaccctag agcaaccaga gttatcaaaa 1380

caagacacag aaggaaactt attggcccat tctcatgatg atggacttgg tgacaaccat 1440

cataatcaag ctgcaacaaa tgaaaccttt acaagcaacc ctccagctat gcatgttgct 1500

cctgacaaca aacagaataa ctggtgcatg aatccaccgc agaatcaatg gcttgtccca 1560

gttatgtcgc cttctgaagg tcttgtctat aagccttttg ccggcccttg tcccccagtt 1620

ggaaatctgc tgacaccatt ttacgccaac tgtgctccgt caaggctgcc ttctacacca 1680

tatggcgttc ctattcctca ccagccacag cacatggtcc ctcctggtgc ccctgccatg 1740

catatgaact acttcccgcc tttcagtatg ccagtgatga atccaggaac accagcatct 1800

gcagtggagc aagggagcca tgctgctgcg ccacagcctc atgggcacat ggaccagcag 1860

tcgctgatct catgtaacat gtcacacccg agtggcgttt ggaggtttct tgcatcaagg 1920

gacagcgagc cacaggccag cagcgccacc agccctttcg acaggctcca agtccaaggt 1980

gatggaagtg ctccgttgtc attctttccc acggcttcag ctccgaatgt ccagcctccg 2040

ccctcatctg gaggccggga ccgggaccag cagaaccatg taatcagggt tgttccgcgt 2100

aacgcacaga ctgcttcagt cccgaaagcc caacctcagc cgtcatccgg aggccgggac 2160

caaaagaacc atgtaatcag ggttgttccg cataacgcgc agactgcttc ggagtcagca 2220

gcgtggatct tccggtcaat acaaatggag aggaaccaaa atgattcgta g 2271

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

tgcactgcac aagctgctgt ttttgttagc cccatcg 37

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

aattcggtgc ttgcggctc 19

<210> 5

<211> 64

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

gagccgcaag caccgaattg tcctcacaga ccaagaacag ttttagagct agaaatagca 60

agtt 64

<210> 6

<211> 64

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

gagccgcaag caccgaattg tagactgtcg ataaaatctg ttttagagct agaaatagca 60

agtt 64

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 7

ggccagtgcc aagcttaaaa aaagcaccga ctcg 34

<210> 8

<211> 83

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 8

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 9

tgcactgcac aagctgctgt ttttgttagc cccatcg 37

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 10

tgcttttttt aagctgctgt ttttgttagc cccatcg 37

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 11

ggccagtgcc aagcttaaaa aaagcaccga ctcg 34

Claims

1.一种具有调控植物开花期功能的ZmELF3.1蛋白，其特征在于，其氨基酸为(a)或(b)所示:

(a)SEQ ID No.1所示的氨基酸；或

(b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和***而衍生得到的仍具有调控植物开花期功能或活性的蛋白变体。

2.权利要求1所述的ZmELF3.1蛋白的编码基因，其特征在于，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：

(a)SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；或

(b)编码SEQ ID No.1所示氨基酸序列的多核苷酸序列；或

(c)与SEQ ID NO.2的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列所编码蛋白质仍具有调控植物开花期功能；或

(d)与SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列至少有90％或以上同源性的多核苷酸序列；或

(e)在SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或***的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有调控植物开花期的功能或活性。

3.权利要求1所述的ZmELF3.1蛋白或权利要求2所述的ZmELF3.1蛋白的编码基因在调控植物开花期的应用。

4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的调控植物开花期包括使植物的开花期提前或延迟。

5.一种使植物开花时间提前的方法，包括：(1)构建含有权利要求2所述ZmELF3.1蛋白的编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将ZmELF3.1蛋白的编码基因在植物组织或细胞中进行过表达。

6.一种开花期提前的植物新品种的培育方法，包括：(1)构建含有权利要求2所述ZmELF3.1蛋白的编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将ZmELF3.1蛋白的编码基因在植物组织或细胞中进行过表达。

7.一种延迟植物开花期的方法，在特征在于，包括：敲除植物体内的ZmELF3.1基因或使ZmELF3.1蛋白的功能出现缺陷。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，包括：构建ZmELF3.1基因的基因编辑载体或ZmELF3.1基因的基因敲除载体，将该基因编辑载体或基因敲除载体转入受体植物中得到ZmELF3.1蛋白功能缺陷的转基因植物。

9.一种ZmELF3.1基因的基因编辑载体的构建方法，包括：

(1)制备玉米U6-2启动子片段；

(2)sgRNA表达盒的制备：

首先用Overlap PCR的方法将带有接头的ZmELF3.1基因的靶点序列和sgRNA骨架序列融合在一起，获得的PCR产物命名为ZmELF3.1-1片段；其中，所用到的Overlap PCR的引物序列为SEQ ID No:5、SEQ ID No:6和SEQ ID No:7所示；所述sgRNA骨架序列为SEQ ID No:8所示；

再用Overlap PCR的方法将上一步获得的融合PCR片段和U6-2启动子片段融合为一个片段，获得的PCR产物即为sgRNA表达盒；其中，所用到的PCR引物序列为SEQ ID No:9、SEQID No:910和SEQ ID No:11所示；

(3)将sgRNA表达盒连接到CPB-Ubi-hspcas9载体上获得连接产物，即得。

10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中采用SEQ ID No:3和SEQ IDNo:4所述的引物进行PCR扩增得到玉米U6-2启动子片段。