CN110256429B - 一种具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物及其制备方法和应用。所述化合物的结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示。本发明所述含有螺环结构的氨基嘧啶类化合物对多种EGFR突变均有良好的抑制作用，尤其是化合物A1、A2、A3和A4，特别是化合物A1和A2，对EGFR T790M的抑制IC50值达到了89nM，对EGF‑R d747‑749/A750P、EGF‑R L858R、EGF‑R L861Q、EGF‑R T790M/L858R的抑制IC50值分别达到了53nM、86nM、76nM和90nM；所述化合物有望在肿瘤耐药方面做出重大贡献。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物化学技术领域，更具体地，涉及一种具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
人类表皮生长因子受体(EGFR)家族是由4个不同的受体酪氨酸激酶(RTKs)组成，分别为EGFR、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)、人类表皮生长因子受体3(human epidermal growth factor receptor 3，HER3)和人类表皮生长因子受体4(human epidermal growth factor receptor 4，HER4)。它们参与激活一系列复杂的细胞信号传导通路，与多种恶性肿瘤的发生、发展及预后等密切相关。EGFR家族RTKs，特别是EGFR和HER2已成为抗肿瘤治疗的新靶点。临床研究表明，EGFR和HER2与许多正常组织细胞的增殖和分化过程密切相关。在许多恶性肿瘤中，均存在EGFR和HER2过度表达或异常激活现象。相比于单靶点激酶抑制剂，双靶点激酶抑制剂可以同时作用于EGFR和HER2两个靶点，抑制或阻断多个细胞信号传导通路，更好地发挥抗肿瘤效果，降低不良反应。目前，EGFR/HER2双靶点激酶抑制剂已成为抗肿瘤药物研究的热点之一。
来那替尼(neratinib，Nerlynx)是一种口服的、有效的不可逆的酪氨酸激酶抑制剂，像拉帕替尼和阿伐他汀一样，用于延长辅助治疗早期HER2过表达/扩增乳腺癌的成年患者，通过阻止通过表皮生长因子受体(EGFR)，HER1，HER2和HER4信号通路转导，达到抗癌的目的。FDA批准该药后，为早期、HER2阳性、标准曲妥珠辅助治疗后、存在高危风险的乳腺癌患者的强化治疗提供了新的选择。近期研究表明neratinib对多种EGFR突变如EGFR T790、MEGF-R L858R、EGF-R L861Q、EGF-R T790M/L858R有较好的抑制作用。
由于对多种EGFR受体同时具有抑制剂的化合物的抗肿瘤效果更佳，因此有必要进一步的研究和开发出多靶点激酶抑制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物。本发明以Neratinib和本课题组发现的新型Met抑制剂螺[吲哚啉-3,4’-哌啶]-2-酮类化合物Met-2为先导化合物，设计合成了本发明所述含有螺环结构的氨基嘧啶类化合物，所述化后物对多种EGFR突变均有良好的抑制作用，尤其是化合物A1、A2、A3和A4，特别是化合物A1和A2，对EGFR T790M的抑制IC50值达到了89nM，对EGF-R d747-749/A750P、EGF-R L858R、EGF-RL861Q、EGF-R T790M/L858R的抑制IC50值分别达到了53nM、86nM、76nM和90nM；所述化合物有望在肿瘤耐药方面做出重大贡献。
本发明的另一目的在于提供所述具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物的应用。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物，所述化合物的结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：
其中R1为氢、C2-4三氟酰基、磺酰基、磺酰基烷基、乙烯基砜、1-(二甲氨基)-2-烯-丁酰氯、-COR5、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烯基、C5-6芳基或杂芳基、C3-6杂脂环基或C6芳环并C3-6杂环基；所述芳杂基的杂原子个数为1-4个，所述杂原子为O、S或N；所述R5为C1-4烷基、C1-4烯基、C1-4烯烷氨基或C1-4烷氨基；
R2为氢、卤素、硝基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基或C2-6烯基；
R3为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6环烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C3-6环氨基、C5-6杂芳氨基或C3-6杂脂环氨基；所述芳杂基的杂原子个数为1-4个，所述杂原子为O、S或N；
R4为五元或六元芳基、五元或六元取代芳基、五元或六元杂芳基、五元或六元取代杂芳基，所述芳杂基的杂原子个数为1-4个，所述杂原子为O、S或N；所述取代芳基中的取代基为卤素、硝基、氨基、苯环、苄氧基、吡啶基或吡啶取代甲氧基。
优选地，所述R1为氢、C2-4三氟酰基、-COR5、C1-4烷基、C1-4烷氧基或C1-4烯基；所述R5为C1-4烷基、C1-4烯基、C1-4烷氨基或C1-4烷氨基；
R2为氢、卤素、硝基、氨基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷氨基或C2-4烯基；
R3为氢、卤素、氰基、C1-4烷基、C1-4环烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷氨基或C3-6环氨基；
R4为
其中所述R6和R7各自独立地为氢、卤素、苯环、苄氧基、吡啶基或吡啶取代甲氧基。
优选地，所述R1为氢、-COR5、C1-4烷基、C1-4烷氧基或C1-4烯基；所述R5为甲基、乙基、丙基、异丙基、乙烯基、丙烯基、甲氧基、乙氧基或N,N-二甲基丙烯基；
R2为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、乙烯基或丙烯基；
R3为氢、氰基、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基；
R4为
中的一种。
优选地，所述化合物选自以下结构中的一种：
上述化合物按照顺序，其化学名称分别为：
2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基]氨基}-4-{[4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}嘧啶-5-甲腈；
4-{[3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}-2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基]氨基}嘧啶-5-甲腈；
4-{[4-(苄氧基)-3-氯苯基]氨基}-2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3，4'-哌啶]-6-基]氨基}嘧啶-5-甲腈；
2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基]氨基}-4-{[1-(吡啶-2-甲基)-1H-吡唑-4-基]氨基}嘧啶-5-甲腈；
(2E)-4-{6'-[(5-氰基-4-{[4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1，3'-吲哚]-1'-基}-1-(二甲氨基)-4-氧代丁-2-烯-2-基；
(2E)-4-{6'-[(4-{[3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}-5-氰基嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-1'-基}-1-(二甲氨基)-4-氧代丁-2-烯-2-基；
4-{[4-(苄氧基)-3-氯苯基]氨基}-2-({1'-[(2E)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰基]-5'-甲氧基-1'，2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-6'-基}氨基)嘧啶-5-甲腈；
3-{6'-[(5-氰基-4-{[4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-1'-基}-3-氧代丙-1-烯-2-基；
3-{6'-[(4-{[3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}-5-氰基嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1，3'-吲哚]-1'-基}-3-氧代丙-1-烯-2-基；
(2E)-4-{6'-[(5-氰基-4-{[1-(吡啶-2-甲基)吡唑-4-基]氨基}嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-1'-基}-1-(二甲氨基)-4-氧代丁-2-烯-2-基；
3-{6'-[(5-氰基-4-{[1-(吡啶-2-甲基)吡唑-4-基]氨基}嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1，3'-吲哚]-1'-基}-3-氧代丙-1-烯-2-基。
更优选地，所述化合物选自以下结构中的一种：
所述结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物与酸反应得到的具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物在药学上可接受的盐也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述酸为盐酸、硝酸、硫酸或三氟乙酸、磷酸、醋酸、碳酸。
本发明同时所述具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物的制备方法，式Ⅰ所示化合物的制备方法如下所示：
盐酸苯肼化合物1和4-甲酰哌啶-1-甲酸苄酯进行环合生成化合物2；然后在惰性气体氛围下与三氟乙酸干发生酰化反应得到酰化产物化合物3；化合物3再与硝酸铜和乙酸酐发生硝化反应，得到化合物4；然后将化合物4中的硝基还原为氨基，得到化合物5；化合物5再与碘甲烷发生烷基化反应得到螺环片段化合物6；再与2，4-二氯嘧啶衍生物在75℃反应，得到的中间体化合物7，在弱碱性体条件下反应得到水解产物化合物8，所得化合物8与含R1取代基的化合物发生反应即可得到式Ι所示化合物；
式Ⅱ所示化合物的制备方法如下所示：
2，3-二氢-1H-吲哚-2-酮化合物2-1与二异丙胺和正丁基锂反应得到1'，2'-二氢螺[环丙烷-1，3吲哚]-2'-酮化合物2-2；然后与硝酸发生硝化反应得到硝化产物化合物2-3；然后硝基还原得氨基产物化合物2-4；再被还原生成螺环片段化合物2-5；化合物2-5与卤代嘧啶衍生物在100℃搅拌反应得到中间体化合物2-6；再与锌二腈反应，所得产物最后与含R1取代基的化合物发生反应即可得到式Ⅱ所示化合物。
优选地，式Ι所示化合物制备过程中，所述盐酸苯肼化合物1和4-甲酰哌啶-1-甲酸苄酯反应的当量比为1:2.52,；反应温度为40℃；
所述惰性气体氛围为氮气氛围；
所述化合物3在室温条件下发生硝化反应，化合物5在室温条件下发生烷基化反应；
所述化合物5与碘甲烷反应的当量比为1:1.3；
所述化合物4经10％钯炭催化还原生成化合物5；
所述化合物6与与2，4-二氯嘧啶衍生物的反应温度为75℃；
所述含R1取代基的化合物为酰氯类化合物或砜类化合物。
更优选地，所述含R1取代基的化合物为丙-2-烯酰氯、1-(二甲氨基)-2-烯-丁酰氯、甲磺酰氯、对甲苯磺酰氯或乙烯基砜。
化合物2-2与硝酸发生硝化反应的当量比为1:1.8；反应温度为室温；
优选地，式Ⅱ所示化合物制备过程中，所述化合物2-3在铁粉做还原剂、70℃条件下还原成为化合物2-4；
所述化合物2-4在氢化铝锂做还原剂、70℃条件下还原成为化合物2-5；
所述化合物2-5在100℃条件下反应生成化合物2-6
所述含R1取代基的化合物为酰氯类化合物或砜类化合物。
更优选地，所述含R1取代基的化合物为丙-2-烯酰氯、1-(二甲氨基)-2-烯-丁酰氯、甲磺酰氯、对甲苯磺酰氯或乙烯基砜。
所述具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐在制备酪氨酸激酶和/或其突变体抑制剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述突变体为EGF-R d747-749/A750P、EGF-RL858R、EGF-R L861Q或EGF-RT790M/L858R中的一种或多种。
本发明还保护所述具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗癌药物中的应用。
优选地，所述抗癌药物为由酪氨酸激酶和/或其突变体表达异常引发的黑色素瘤、肝癌、肾癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫瘤、卵巢癌、直肠癌、***区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***、***癌、***癌、食道癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、慢性或急性白血病、膀胱癌、肾或输卵管癌、脊柱轴肿瘤、垂体腺瘤、胃肠间质肿瘤、结肠直肠癌、非小细胞癌、小细胞肺癌、肥大细胞增多症、胶质瘤、肉瘤或淋巴瘤中的一种或多种。
本发明还保护一种药物组合物，包含如式Ⅰ或式Ⅱ所示具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物、其要学上可接受的盐、其水合物、其溶剂合物、其多晶型物、其互变异构体、其立体异构体或其前药中的一种或多种。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料和/或载体。
优选的，所述辅料包括下列物质中的至少一种：溶剂、抛射剂、增溶剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗螯合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、释放剂、絮凝剂及反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
本发明的药物组合物可制成各种剂型：按剂型的分散***分类，具体来说可以制成以下制剂：溶液型、胶体溶液型、乳剂型、混悬型、气体分散型、微粒分散型、固体分散型；按照形态分类，具体来说可以制成以下剂型：液体剂型(如芳香水剂、溶液剂、注射剂、合剂、洗剂、搽剂等)，固体剂型(如散剂、丸剂、片剂、膜剂等)，半固体剂型(如软膏剂、栓剂、糊剂等)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述含有螺环结构的氨基嘧啶类化合物对多种EGFR突变均有良好的抑制作用，尤其是化合物A1、A2、A3和A4，特别是化合物A1和A2，对EGFR T790M的抑制IC50值达到了89nM，对EGF-R d747-749/A750P、EGF-R L858R、EGF-R L861Q、EGF-R T790M/L858R的抑制IC50值分别达到了53nM、86nM、76nM和90nM；所述化合物有望在肿瘤耐药方面做出重大贡献。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1：2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基]氨基}-4-{[4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(A1)
1、苄基5-甲氧基-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-1'-羧酸苄酯的合成(2)
盐酸对甲氧苯肼和4-甲酰哌啶-1-甲酸苄酯溶于甲苯和乙腈的混合溶液中，向其中加入三氟乙酸，搅拌12小时，冷却，加入甲醇后，再加入硼氢化钠，于0-5℃搅拌3小时，加适量的水，乙酸乙酯萃取，分离有机层，无水硫酸钠干燥，抽滤，真空浓缩，石油醚重结晶得化合物2，4.5g,产率45％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.39-7.35(m,5H),6.67(d,J＝2.5Hz,1H),6.57-6.49(m,1H),6.42(d,J＝8.4Hz,1H),5.11(m,3H),4.13-3.86(m,2H),3.67(s,3H),3.34(s,2H),3.01-2.95(m,2H),1.71-1.51(m,4H)ppm；ESI-MS m/z:353[M+1]+。
2、苄基5-甲氧基-1-(三氟乙酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-1'-羧酸苄酯的合成(3)
在0℃搅拌下，向化合物2和三乙胺的二氯甲烷溶液中缓慢加入三氟乙酸酐，氮气保护下搅拌12小时，加水稀释，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，抽滤，真空浓缩，过梯度快速色谱柱(乙酸乙酯/石油醚10-35％)得黄色固体化合物3，3.8g,产率66％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝8.9Hz,1H),7.44-7.27(m,5H),7.05(d,J＝2.6Hz,1H),6.86(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),5.11(s,2H),4.20(s,2H),4.06-3.99(m,2H),3.76(s,3H),3.01(s,2H),1.85(td,J＝13.2,4.7Hz,2H),1.65(d,J＝13.0Hz,2H)ppm；ESI-MS m/z:449[M+1]+。
3、苄基-5-甲氧基-6-硝基-1-(三氟乙酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-1'-羧酸苄酯的合成(4)
在0℃搅拌下，向化合物3的乙酸酐溶液中加入硝酸铜三水合物，混合物在室温搅拌3小时，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，抽滤，真空浓缩，过梯度快速色谱柱(乙酸乙酯/石油醚0-80％)得黄色固体化合物4，3.9g,产率86％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.47(s,1H),7.57(s,1H),7.52-7.23(m,5H),5.12(s,2H),4.29(s,2H),4.16-4.03(m,2H),4.00(s,3H),3.05-2.96(m,2H),1.99-1.91(m,2H),1.73(d,J＝13.2Hz,2H)ppm；ESI-MSm/z:494[M+1]+。
4、1-{6-氨基-5-甲氧基-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-1-基}-2,2,2-三氟乙酰基-1-酮的合成(5)
向化合物4的甲醇溶液中加入钯碳，该混合物在氢气氛围中搅拌5h。抽滤，滤液真空浓缩得到化合物5。2.4g,产率92％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.47(s,1H),6.79(s,1H),4.88(s,2H),4.04(s,2H),3.79(s,3H),2.99-2.85(m,2H),2.63-2.43(m,3H),1.75(td,J＝12.8,4.3Hz,2H),1.52-1.42(m,2H)ppm；ESI-MS m/z:330[M+1]+。
5、1-{6-氨基-5-甲氧基-1'-甲基-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-1-基}-2,2,2-三氟乙酰基-1-酮的合成(6)
向化合物5(2.4g，7.29mmol)和三乙胺(2.2g，21.74mmol)的四氢呋喃溶液中加入碘甲烷(1.35g，9.5mmol)。搅拌6小时后，将混合物真空浓缩，过梯度快速色谱柱(二氯甲烷/甲醇0-10％)，得到浅黄色固体化合物6,1.4g,产率58％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.46(s,1H),6.81(s,1H),4.89(s,2H),4.01(s,2H),2.77(d,J＝8.0Hz,2H),2.21(s,3H),1.96-1.79(m,4H),1.53(d,J＝10.5Hz,2H)ppm；ESI-MS m/z:344[M+1]+。
6、2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(三氟乙酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基]氨基}-4-{[4-(吡啶)-2-甲氧基)苯基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(7a)
向2-氯-4-[[4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基]氨基]嘧啶-5-甲腈(300mg，0.89mmol)和化合物6(200mg，0.58mmol)的2-丙醇溶液中加入对甲苯磺酸(153mg，0.89mmol)。在75℃下搅拌反应结束后，将反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)稀释，并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，抽滤，真空浓缩，得到黄色粗固体得到化合物7a，370mg,产率71％。ESI-MS m/z:645[M+1]+。
7、2-({5-甲氧基-1'-甲基-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基}氨基)-4-{[4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(8a)
向7a(370mg，0.40mmol，)的甲醇溶液中加入碳酸钾(280mg，2.03mmol)。搅拌2小时后，将混合物用水稀释，并用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过制备液相纯化粗产物[柱：XBridge Shield RP18OBD柱，5um，19×150mm；流动相A：含10mmol/L碳酸氢铵的水，流动相B：乙腈；流速：30mL/min；梯度：13分钟内10％B至60％B；得到黄色固体8a，64mg，收率26％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.25(s,1H),8.58(ddd,J＝4.9,1.8,1.0Hz,1H),8.45(s,1H),8.39(s,1H),7.84(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.50-7.37(m,3H),7.35(ddd,J＝7.6,4.8,1.3Hz,1H),7.00-6.91(m,2H),6.83(s,1H),6.79(s,1H),5.15(s,2H),4.91(s,1H),3.68(s,3H),3.24(s,2H),2.78-2.60(m,2H),2.20(s,3H),1.98(t,J＝11.7Hz,2H),1.90-1.73(m,2H),1.61-1.44(m,2H)ppm；ESI-MS m/z:549[M+1]+。
8、2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基]氨基}-4-{[4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(A1)
将8a(42mg，0.08mmol)和三乙胺(80mg，0.79mmol)溶解在二氯甲烷，在氮气保护再加入丙-2-烯酰氯(5.6mg，0.06mmol)的二氯甲烷溶液。搅拌反应1小时后，混合物真空浓缩。通过制备型高效液相[柱：XBridge Shield RP18OBD柱，5um，19×150mm；：用10mmol/L碳酸氢铵水溶液，流动相B：乙腈)纯化粗产物。梯度：25.0％B，最高48.0％B，10分钟；检测器：UV220nm]，得到白色固体化合物A1,14.4mg,产率31％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.17(s,1H),9.19(s,1H),9.00(s,1H),8.60(d,J＝4.2Hz,1H),8.40(s,1H),8.24(s,1H),7.84(td,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.50-7.34(m,4H),6.81-6.71(m,3H),6.30(d,J＝18.0Hz,1H),5.84(d,J＝11.1Hz,1H),5.09(s,2H),4.23(s,2H),3.74(s,3H),3.47-3.43(s,2H),3.20-3.13(m,2H),2.80(s,3H),2.24(t,J＝12.0Hz,2H),1.89-1.85(m,2H)ppm；ESI-MS m/z:603[M+1]+。
实施例2 4-{[3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}-2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(A2)
1、4-{[3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}-2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(三氟乙酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3，4'-哌啶]-6-基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(7b)
以实施例1制备的化合物6为原料进行反应，参照化合物7a的方法，制备化合物7b，290mg,产率63％。ESI-MS m/z:679[M+1]+。
2、4-{[3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}-2-({5-甲氧基-1'-甲基-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基}氨基)嘧啶-5-甲腈的合成(8b)
参照实施案例1合成化合物7b后，化合物8b的合成参照化合物8a的合成方法，46mg,产率29％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.31(s,1H),8.69-8.54(m,2H),8.41(s,1H),7.87(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.64(s,1H),7.58-7.54(m,2H),7.42-7.30(m,1H),7.14(d,J＝9.0Hz,1H),6.81(s,1H),6.74(s,1H),5.25(s,2H),4.94(s,1H),3.68(s,3H),3.24(s,2H),2.67(d,J＝10.5Hz,2H),2.17(s,3H),2.00-1.71(m,4H),1.52(d,J＝11.8Hz,2H)ppm；ESI-MSm/z:583[M+1]+。
3、4-{[3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}-2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(A2)
参照实施案例1合成化合物8b后，化合物A2的合成参照化合物A1的合成方法，4.2mg,产率12％。1H NMR(300MHz,Methanol-d4)δ8.64(s,1H),8.57(dt,J＝4.8,1.4Hz,1H),8.35(s,1H),7.91(dd,J＝8.5,6.7Hz,1H),7.73-7.64(m,2H),7.46-7.29(m,2H),6.97-6.94(m,2H),6.77(dd,J＝16.7,10.3Hz,1H),6.30(d,J＝16.8Hz,1H),5.77(d,J＝10.6Hz,1H),5.16(s,2H),4.12(s,2H),3.90(s,3H),2.93(d,J＝12.0Hz,2H),2.39(s,3H),2.23(t,J＝12.3Hz,2H),2.04(dt,J＝14.3,7.2Hz,2H),1.72(d,J＝13.4Hz,2H)ppm；ESI-MS m/z:637[M+1]+。
实施例3 4-{[4-(苄氧基)-3-氯苯基]氨基}-2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3，4'-哌啶]-6-基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(A3)
1、4-{[4-(苄氧基)-3-氯苯基]氨基}-2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(三氟乙酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]]-6-基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(7c)
参照实施案例1合成化合物6后，化合物7c的合成参照化合物7a的合成方法，210mg,产率53％。ESI-MS m/z:678[M+1]+。
2、4-{[4-(苄氧基)-3-氯苯基]氨基}-2-({5-甲氧基-1'-甲基-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基}氨基)嘧啶-5-甲腈的合成(8c)
参照实施案例1合成化合物7c后，化合物8c的合成参照化合物8a的合成方法，70mg,产率60％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.30(s,1H),8.60(s,1H),8.41(s,1H),7.63(s,1H),7.59-7.51(m,1H),7.50-7.30(m,5H),7.15(d,J＝9.0Hz,1H),6.81(s,1H),6.75(s,1H),5.17(s,2H),4.94(s,1H),3.68(s,3H),3.28-3.19(m,2H),2.68(d,J＝10.7Hz,2H),2.17(s,3H),2.02-1.75(m,4H),1.53(d,J＝12.0Hz,2H)ppm；ESI-MS m/z:582[M+1]+。
3、4-{[4-(苄氧基)-3-氯苯基]氨基}-2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3，4'-哌啶]-6-基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(A3)
参照实施案例1合成化合物8c后，化合物A3的合成参照化合物A1的合成方法，23.1mg,产率38％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.41(s,1H),8.25(s,1H),7.70(d,J＝2.6Hz,1H),7.54-7.24(m,6H),6.98(d,J＝9.3Hz,1H),6.92(s,1H),6.72(dd,J＝16.6,10.3Hz,1H),6.25(d,J＝16.6Hz,1H),5.81(d,J＝10.4Hz,1H),5.13(s,2H),4.17(s,2H),3.76(s,3H),3.43(d,J＝12.7Hz,2H),3.22-3.03(m,2H),2.81(s,3H),2.19-1.97(m,2H),1.85(d,J＝13.9Hz,2H)ppm；ESI-MS m/z:636[M+1]+。
实施例4 2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基]氨基}-4-{[1-(吡啶-2-甲基)-1H-吡唑-4-基]氨基}嘧啶-5-甲腈化合物的合成(A4)
1、2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(三氟乙酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基]氨基}-4-{[1-(吡啶)-2-基甲基)-1H-吡唑-4-基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(7d)
参照实施案例1合成化合物6后，化合物7d的合成参照化合物7a的合成方法，360mg,产率93％。ESI-MSm/z:619[M+1]+。
2、2-({5-甲氧基-1'-甲基-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶基]-6-基}-氨基)-4-{[1-(吡啶-2-甲基)-]-1H-吡唑-4-基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(8d)
参照实施案例1合成化合物7d后，化合物8d的合成参照化合物8a的合成方法，67mg,产率34％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.64(s,1H),8.81(s,1H),8.51(dd,J＝5.0,1.6Hz,1H),8.36(s,1H),7.80-7.55(m,2H),7.34-7.22(m,1H),6.86(s,1H),6.79(s,1H),6.74(s,1H),5.31(s,2H),5.15(s,1H),3.65(s,3H),3.20(s,2H),2.63(d,J＝10.9Hz,2H),2.17(s,3H),1.90(t,J＝11.6Hz,2H),1.75(t,J＝12.5Hz,2H),1.43(d,J＝12.4Hz,2H)ppm；ESI-MS m/z:523[M+1]+。
3、2-{[5-甲氧基-1'-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-1,2-二氢螺[吲哚-3,4'-哌啶]-6-基]氨基}-4-{[1-(吡啶-2-甲基)-1H-吡唑-4-基]氨基}嘧啶-5-甲腈化合物的合成(A4)
参照实施案例1合成化合物8d后，化合物A4的合成参照化合物A1的合成方法，14mg,产率32％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.65(s,1H),9.12(s,1H),8.56-8.44(m,1H),8.36(s,1H),8.22(s,1H),7.71-7.67(m,2H),7.27(dd,J＝7.4,4.9Hz,1H),7.04(s,1H),6.77(dd,J＝16.5,10.2Hz,1H),6.22(dd,J＝16.5,2.3Hz,1H),5.75(dd,J＝10.2,2.3Hz,1H),5.16(s,2H),3.98(s,2H),3.73(s,3H),2.81-2.57(m,2H),2.20(s,3H),2.07-1.76(m,4H),1.48(d,J＝11.7Hz,2H)ppm；ESI-MS m/z:577[M+1]+。
实施案例5(2E)-4-{6'-(5-氰基-4-{[4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1，3'-吲哚]-1'-基}-1-(二甲氨基)-4-氧代丁-2-烯-2-基的合成(B1)
1、5'-甲氧基-1'，2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-2'-酮的合成(10)
向5-甲氧基-2,3-二氢-1H-吲哚-2-酮(5g，30.64mmol)和二异丙胺(6.14g，60.79mmol)的无水四氢呋喃(50mL)溶液中缓慢加入正丁基锂(49mL，122.68mmol，2.5M正己烷溶液)。将混合物搅拌1小时缓慢加入1,2-二溴乙烷(6.89g，36.68mmol)。将混合溶液转移至室温反应。然后通过加入100mL水淬灭反应，并用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，抽滤，真空浓缩。过梯度快速色谱柱(乙酸乙酯/石油醚
)得到灰白色固体化合物10，2.5g,产率43％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.89(s,1H),6.89(d,J＝9.6Hz,1H),6.86(dd,J1＝8.7Hz,J2＝2.7Hz,1H),6.47(d,J＝2.4Hz,1H),3.77(s,3H),1.78-1.74(m,2H),1.53-1.49(m,2H)ppm；ESI-MS m/z:190[M+1]+。
2、5'-甲氧基-6'-硝基-1',2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-二氢吲哚]-2'-酮的合成(11)
向10(2.5g，13.21mmol)的乙酸乙酯(2.0g，19.59mmol)和二氯甲烷混合溶液中加入硝酸(1.5g，23.80mmol)。将混合溶液在室温下搅拌2小时后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，抽滤，减压干燥得到黄色固体化合物11，1.7g,产率55％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.68(s,1H),7.37(s,1H),7.13(s,1H),3.87(s,3H),1.79-1.71(m,2H),1.61-1.58(m,2H)ppm；ESI-MS m/z:235[M+1]+。
3、6'-氨基-5'-甲氧基-1'，2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-二氢吲哚]-2'-酮的合成(12)
5mmol)溶解在甲醇和水(10mL)中进行脱气，溶液搅拌反应6小时。将反应混合物用水(20mL)稀释，并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，抽滤真空浓缩，得到黄色固体化合物12，1.1g，产率74％。H1NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.07(s,1H),6.50(s,1H),6.34(s,1H),4.68(s,2H),3.69(s,3H),1.38-1.35(m,2H),1.32-1.30(m,2H)ppm；ESI-MS m/z:205[M+1]+。
4、5'-甲氧基-1'，2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-二氢吲哚]-6'-胺的合成(13)
在室温下向化合物12(500mg，2.45mmol)的无水四氢呋喃(10mL)溶液中加入氢化铝锂(375mg，9.87mmol)。将所得溶液在70℃下搅拌4小时。然后加水(20mL)淬灭反应，再用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，抽滤，真空浓缩。过梯度快速色谱柱(乙酸乙酯/石油醚
)得到棕色固体化合物13，260mg，产率56％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ6.14(s,1H),5.94(s,1H),4.92(s,1H),4.04(s,2H),3.61(s,3H),3.31(s,2H),0.80-0.72(m,4H)ppm；ESI-MSm/z:191[M+1]+。
5、5-溴-2-N-{5'-甲氧基-1'，2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-6'-基}-4-N-[4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]嘧啶-2,4-二胺的合成(14a)
向化合物13(450mg，2.37mmol)和5-溴-2-氯-N-[4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]嘧啶-2，4-二胺(647mg，1.65mmol)的二氧六环溶液(向10mL)中加入4-甲基苯-1-磺酸一水合物(408mg，2.37mmol)。将混合溶液在100℃下搅拌反应完全。然后反应混合物用水(20mL)稀释，再用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。将合并的有机层用硫酸钠干燥，抽滤，真空浓缩。过梯度快速色谱柱法(乙酸乙酯/石油醚
)得到灰白色固体14a，260mg,产率20％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.59(d,J＝4.5Hz,1H),8.51(s,1H),8.17(s,1H),7.87(dd,J1＝7.5Hz,1.8Hz,1H),7.56-7.47(m,3H),7.37-7.33(m,2H),7.07(d,J＝8.7Hz,1H),6.26(s,1H),5.18(s,2H),4.18-4.01(br,1H),3.93(s,2H),3.67(s,3H),0.94(d,J＝3.0Hz,4H)ppm；ESI-MSm/z:545[M+1]+。
6、2-({5'-甲氧基-1',2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-6'-基}氨基)-4-{[4(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(15a)
将化合物14a(200mg，0.37mmol)，锌二腈(214mg，1.82mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(39mg，0.04mmol)和1,1'-双(二-苯基膦基)二茂铁(41mg，0.07mmol))溶解在N，N-二甲基甲酰胺和水中进行脱气，在微波反应器中搅拌反应3小时。将反应混合物用水(25mL)稀释，再用乙酸乙酯(3×15mL)萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，抽滤，真空浓缩。过梯度快速柱色谱柱法(乙酸乙酯/石油醚
)得到棕色固体化合物15a，110mg,产率50％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.35(br,1H),8.59(d,J＝4.5Hz,1H),8.46(s,1H),7.87(dd,J1＝7.8,1.5Hz,1H),7.55(br,2H),7.37-7.33(m,2H),7.16-7.01(m,3H),6.29(s,1H),5.18(s,2H),4.65(s,1H),4.04-3.97(m,2H),3.75(br,1H),3.69(s,3H),1.00-0.95(m,4H)ppm；ESI-MSm/z:492[M+1]+。
7、(2E)-4-{6'-(5-氰基-4-{[4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1，3'-吲哚]-1'-基}-1-(二甲氨基)-4-氧代丁-2-烯-2-基的合成(B1)
向化合物15a(40mg，0.08mmol)和N，N-二异丙基乙胺(31.53mg，0.24mmol)的无水四氢呋喃溶液中加入(2E)-4-溴丁-2-烯酰氯溶液的无水四氢呋喃(0.5mL)溶液。c搅拌反应1小时后加入二甲胺的四氢呋喃溶液(2mL，2M)。再在室温搅拌反应18小时，将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液(30mL)稀释，乙酸乙酯(50mL×3)萃取。合并的有机相用饱和氯化钠溶液(50mL×3)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩。过制备液相纯化[柱：XbridgeRP18,5μm，19×150mm；流动相：水(0.05％碳酸氢铵)和乙腈(35％乙腈，12分钟内达65％)；检测器，UV220和254nm]，得到灰白色固体化合物B1，1.3mg，产率3％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.97(s,1H),8.81(s,1H),8.56(d,J＝4.2Hz,1H),8.48-8.44(m,2H),7.81(dd,J1＝7.8Hz,J2＝1.8Hz),7.53-7.42(m,3H),7.33-7.31(m,1H),6.98(d,J＝8.7Hz,2H),6.70-6.65(m,1H),6.51(s,1H),6.32(dd,J1＝17.1Hz,J＝2.1Hz,1H),5.14(s,2H),4.09(s,2H),3.75(s,3H),2.16(s,6H),1.09(s,4H)ppm；ESI-MS m/z:603[M+1]+。
实施案例6(2E)-4-{6'-[(4-{[3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}-5-氰基嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-1'-基}-1-(二甲氨基)-4-氧代丁-2-烯-2-基的合成(B2)
1、5-溴-4-N-[3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]-2-N-{5'-甲氧基-1'，2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-6'-基}嘧啶-2,4-二胺的合成(14b)
参照实施案例5合成化合物13后，化合物14b的合成参照化合物14a的合成方法，11.5mg,产率8％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.65-8.60(m,2H),8.23(s,1H),7.91-7.87(m,2H),7.61-7.54(m,2H),7.39-7.36(m,1H),7.26-7.24(m,1H),6.30(s,1H),5.28(s,2H),4.20(br,1H),3.99(s,2H),3.69(s,3H),0.95(d,J＝3.0Hz,4H)ppm；ESI-MSm/z:579[M+1]+。
2、4-[[3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基]-2-([5'-甲氧基-1',2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-6'-基]氨基)嘧啶-5-甲腈的合成(15b)
参照实施案例5合成化合物14b后，化合物15b的合成参照化合物15a的合成方法，5.3mg,产率12％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.60-8.50(m,2H),7.96-7.36(m,6H),7.24-7.10(m,1H),6.33(s,1H),5.27(s,2H),4.17-4.07(m,2H),3.71(br,3H),3.69(s,3H),1.04-0.98(m,4H)ppm；ESI-MS m/z:526[M+1]+。
3、(2E)-4-{6'-[(4-{[3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}-5-氰基嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-1'-基}-1-(二甲氨基)-4-氧代丁-2-烯-2-基的合成(B2)
参照实施案例5合成化合物15b后，化合物B2的合成参照化合物B1的合成方法，1.2mg,产率2％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.81(s,1H),8.58-8.56(m,2H),8.51(s,1H),7.87-7.52(m,5H),7.35-7.31(m,1H),7.16-7.13(m,1H),6.73-6.62(m,1H),6.51(s,1H),6.41-6.31(m,1H),5.22(s,2H),4.12(s,2H),3.76(s,3H),2.16(s,6H),1.08(s,4H)ppm；ESI-MS m/z:637[M+1]+。
实施案例7 4-{[4-(苄氧基)-3-氯苯基]氨基}-2-({1'-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]-5'-甲氧基-1'，2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-6'-基}氨基)嘧啶-5-甲腈的合成(B3)
1、4-N-[4-(苄氧基)-3-氯苯基]-5-溴-2-N-{5'-甲氧基-1'，2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-6'基}嘧啶-2,4-二胺的合成(14c)
参照实施案例5合成化合物13后，化合物14c的合成参照化合物14a的合成方法，14.6mg,产率10％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.63(s,1H),8.22(s,1H),7.85(s,1H),7.54(d,J＝8.3Hz,1H),7.49(d,J＝7.5Hz,2H),7.42(t,J＝7.5Hz,2H),7.35(t,J＝7.2Hz,1H),7.25(d,J＝8.9Hz,1H),6.29(s,1H),5.20(s,2H),4.32(s,3H),3.97(s,2H),3.68(s,3H),0.95(d,J＝9.8Hz,4H)ppm；ESI-MS m/z:578，580[M+1]+。
2、4-{[4-(苄氧基)-3-氯苯基]氨基}-2-({5'-甲氧基-1',2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-6'-基}氨基)嘧啶-5-甲腈的合成(15c)
参照实施案例5合成化合物14c后，化合物15c的合成参照化合物15a的合成方法，4.2mg,产率9％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.15(s,1H),8.46(s,1H),7.75(s,1H),7.49-7.22(s,8H),6.30(s,1H),5.20(s,2H),4.17-4.07(m,2H),4.04(s,2H),3.71(s,3H),0.97(s,4H)ppm；ESI-MS m/z:525[M+1]+。
3、4-{[4-(苄氧基)-3-氯苯基]氨基}-2-({1'-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]-5'-甲氧基-1'，2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-6'-基}氨基)嘧啶-5-甲腈的合成(B3)
参照实施案例5合成化合物15c后，化合物B3的合成参照化合物B1的合成方法，3.8mg,产率6％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.80(s,1H),8.60(s,1H),8.51(s,1H),7.80(s,1H),7.53-7.37(m,7H),7.14-7.12(m,1H),6.71-6.61(m,1H),6.52(s,1H),6.35-6.27(m,1H),5.16(s,2H),4.11(s,2H),3.76(s,3H),2.15(s,6H),1.12-1.08(m,4H)ppm；ESI-MSm/z:636[M+1]+。
实施案例8 3-{6'-[(5-氰基-4-{[4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-1'-基}-3-氧代丙-1-烯-2-基的合成(B4)
1、5-溴-2-N-{5'-甲氧基-1',2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-6'-基}-4-N-[1-(吡啶-2-甲基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2,4-二胺的合成(14d)
参照实施案例5合成化合物13后，化合物14c的合成参照化合物14a的合成方法，260mg,产率32％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.80(s,1H),8.54(d,J＝4.8Hz,1H),8.14(s,1H),8.09(s,1H),7.79-7.73(m,2H),7.62(s,1H),7.34-7.29(m,1H),7.07(d,J＝7.8Hz,1H),6.28(s,1H),5.41(s,2H),4.46(br,2H),4.00(s,2H),3.68(s,3H),0.94-0.93(m,4H)ppm；ESI-MS m/z:519[M+1]+。
2、2-({5'-甲氧基-1',2'-二氢螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-6'-基}氨基)-4-{[1-(吡啶-2-甲基)-1H-吡唑-4-基]氨基}嘧啶-5-甲腈的合成(15d)
参照实施案例5合成化合物14d后，化合物15d的合成参照化合物15a的合成方法，110mg,产率68％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.67(s,1H),8.54(d,J＝3.6Hz,1H),8.46(s,1H),8.09(s,1H),7.79-7.74(m,3H),7.34-7.30(m,1H),7.07-7.05(m,1H),6.32(s,1H),5.42(s,2H),4.66(br,2H),4.08(s,2H),3.71(s,3H),0.97(s,4H)ppm；ESI-MS m/z:466[M+1]+。
3、3-{6'-[(5-氰基-4-{[4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-1'-基}-3-氧代丙-1-烯-2-基的合成(B4)
参照实施案例5合成化合物15a后，化合物B4的合成参照化合物B1的合成方法，21.9mg,产率35％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.84(s,1H),8.78(s,1H),8.56(d,J＝4.2Hz,1H),8.48-8.44(m,2H),7.83(dd,J1＝7.8Hz,J2＝1.8Hz),7.77-7.46(m,3H),7.32-7.28(m,1H),6.98(d,J＝8.7Hz,1H),6.54-6.45(m,2H),6.19(dd,J1＝17.1Hz,J＝2.1Hz,1H),5.62(dd,J1＝10.5Hz,J＝2.1Hz,1H),5.14(s,2H),4.10(s,2H),3.75(s,3H),1.09(s,4H)ppm；ESI-MS m/z:546[M+1]+。
实施案例9 3-{6'-[(4-{[3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯基]氨基}-5-氰基嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1，3'-吲哚]-1'-基}-3-氧代丙-1-烯-2-基的合成(B5)
参照实施案例5合成化合物15e后，化合物B5的合成参照化合物B1的合成方法，1.6mg,产率为1％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.91(s,1H),8.56(d,J＝4.2Hz,2H),8.51(s,1H),7.85-7.82(m,2H),7.56-7.51(m,2H),7.34-7.28(m,1H),7.16-7.12(m,1H),6.56-6.51(m,2H),6.19(d,J＝10.5Hz,1H),5.62(d,J＝10.5Hz,1H),5.22(s,2H),4.12(s,2H),3.77(s,3H),1.10(d,J＝6.0Hz,4H)ppm；ESI-MS m/z:580[M+1]+。
实施案例10(2E)-4-{6'-[(5-氰基-4-{[1-(吡啶-2-甲基)吡唑-4-基]氨基}嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1,3'-吲哚]-1'-基}-1-(二甲氨基)-4-氧代丁-2-烯-2-基三氟乙酸盐的合成(B6)
参照实施案例5合成化合物15f后，化合物B6的合成参照化合物B1的合成方法，3.8mg,产率6％。
化合物B6与三氟乙酸额成盐，成盐后的结构如下所示：
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.35(s,1H),9.14(s,1H),8.70(s,1H),8.52(d,J＝8.4Hz,1H),8.44(s,1H),8.03(s,1H),7.78-7.72(m,2H),7.32-7.28(m,1H),7.12-7.09(m,1H),6.76-6.55(m,3H),5.37(s,2H),4.16(s,2H),3.90(d,J＝2.8Hz,2H),3.78(s,3H),2.82(s,6H),1.13(t,J＝6.7Hz,4H)ppm；ESI-MS m/z:577[M+1]+。
实施案例11 3-{6'-[(5-氰基-4-{[1-(吡啶-2-甲基)吡唑-4-基]氨基}嘧啶-2-基)氨基]-5'-甲氧基螺[环丙烷-1，3'-吲哚]-1'-基}-3-氧代丙-1-烯-2-基的合成(B7)
参照实施案例5合成化合物15g后，化合物B7的合成参照化合物B1的合成方法，12mg,产率27％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.74(s,1H),9.32(s,1H),8.80(s,1H),8.55(d,J＝8.4Hz,2H),8.11(s,1H),7.80-7.77(m,2H),7.34-7.30(m,1H),7.06(d,J＝8.4Hz,1H),6.63-6.58(m,2H),6.24(d,J＝17.7Hz,1H),5.72(d,J＝8.4Hz,1H),5.42(s,2H),4.17(s,2H),3.78(s,3H),1.13(t,J＝8.7Hz,4H)；ESI-MSm/z:520[M+1]+。
实施案例12：化合物对EGFR-wt和HER2激酶活性测定
1)配制0.5μM待测化合物溶液；
2)按20μL试验缓冲液、5μL ATP溶液、5μL测试化合物(含10％DMSO)，20μL酶/底物混合物顺序加入到96-well FlashPlatesTM进行测定，两种蛋白激酶反应混合物均含有70mM HEPES-NaOH pH 7.5，3mM MnCl2，3μM原钒酸钠，1.2mM DTT，ATP。ERBB2测定另外含有50μg/mL PEG20000；
3)在室温下孵育60分钟，再用50μL 2％(v/v)H3PO4终止反应，再用200μL 0.9％(w/v)NaCl重复洗板两次；
4)用微板闪烁计数器测定33Pi的含量(“cpm”计数)。(具有完全反应混合物无蛋白激酶的cpm中值定义为低对照；具有完全反应混合物和激酶但不存在抑制剂的cpm中值定义为高对照；高对照和低对照的差异定义为该酶的100％活性；每个激酶的高对照值减去低控制值，相应的“化合物值”中减去低对照值作为数据评估部分。)
残留活性(％)＝100×[(化合物的cpm－低对照)/(高对照－低对照)]
其中以Neratinib为阳性对照药物，测得结果如表1所示。
表1 0.5μM药物浓度下化合物对EGFR-wt和HER2的残留活性
从表1中可知，实施例提供的化合物对EGFR-wt和HER2均表现一定程度的抑制作用，其中化合物A1至A4的抑制作用更加明显。
实施案例13化合物对7种突变蛋白激酶活性测定
1)配制1×10-5-3×10-10待测化合物溶液；
2)按10μL非放射性ATP溶液、25μL试验缓冲液/[γ-33P]-ATP混合物，5μL测试化合物(含10％DMSO)，10μL酶/底物混合物顺序加入到96-well FlashPlatesTM进行测定，两种蛋白激酶反应混合物均含有70mM HEPES-NaOH pH 7.5，3mM MnCl2，3μM原钒酸钠，1.2mMDTT，[γ-33P]-ATP，蛋白激酶和底物；
3)在室温下孵育60分钟，再用50μL 2％(v/v)H3PO4终止反应，再用200μL 0.9％(w/v)NaCl重复洗板两次；
4)用微板闪烁计数器测定33Pi的含量(“cpm”计数)。(具有完全反应混合物无蛋白激酶的cpm中值定义为低对照；具有完全反应混合物和激酶但不存在抑制剂的cpm中值定义为高对照；高对照和低对照的差异定义为该酶的100％活性；每个激酶的高对照值减去低控制值，相应的“化合物值”值减去低对照值作为数据评估部分。)
残留活性(％)＝100×[(化合物的cpm－低对照)/(高对照－低对照)]
以化合物A1和A2为代表进行测试，测得结果如表2所示。
表2化合物对EGFR wt、HER2和7个EGFR突变体蛋白激酶的生化IC50值
激酶测定试验表明，本发明设计合成的大多数化合物相比Neratinib对EGFR-wt和ERBB2表现出更强的抑制作用，尤其是化合物A1和A2，对EGFR wt、HER2和7种EGFR突变蛋白激酶抑制作用优于Neratinib，可用于预防和治疗与EGFR wt、HER2和7种EGFR突变蛋白激酶有关的临床疾病，这些疾病可以是黑色素瘤、肝癌、肾癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫瘤、卵巢癌、直肠癌、***区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***、***癌、***癌、食道癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、慢性或急性白血病、膀胱癌、肾或输卵管癌、脊柱轴肿瘤、垂体腺瘤、胃肠间质肿瘤、结肠直肠癌、非小细胞癌、小细胞肺癌等。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：
其中R1为-COR5；所述R5为C1-4烯基或C2-4烯烷氨基；
R2为C1-6烷氧基；
R3为氰基；
R4为
中的一种。
2.一种具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物在药学上可接受的盐，其特征在于，由权利要求1所述结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物与酸反应得到的盐。
3.权利要求1所述具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物的制备方法，其特征在于，式Ⅰ所示化合物的制备方法如下所示：
盐酸苯肼化合物1和4-甲酰哌啶-1-甲酸苄酯进行环合生成化合物2；然后在惰性气体氛围下与三氟乙酸酐发生酰化反应得到酰化产物化合物3；化合物3再与硝酸铜和乙酸酐发生硝化反应，得到化合物4；然后将化合物4中的硝基还原为氨基，得到化合物5；化合物5再与碘甲烷发生烷基化反应得到螺环片段化合物6；再与2，4-二氯嘧啶衍生物在75℃反应，得到的中间体化合物7，在弱碱性体条件下反应得到水解产物化合物8，所得化合物8与含R1取代基的化合物发生反应即可得到式Ι所示化合物；
式Ⅱ所示化合物的制备方法如下所示：
2，3-二氢-1H-吲哚-2-酮化合物2-1与二异丙胺和正丁基锂反应得到1'，2'-二氢螺[环丙烷-1，3吲哚]-2'-酮化合物2-2；然后与硝酸发生硝化反应得到硝化产物化合物2-3；然后硝基还原得氨基产物化合物2-4；再被还原生成螺环片段化合物2-5；化合物2-5与卤代嘧啶衍生物在100℃搅拌反应得到中间体化合物2-6；再与锌二腈反应，所得产物最后与含R1取代基的化合物发生反应即可得到式Ⅱ所示化合物。
4.权利要求1或2所述具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐在制备酪氨酸激酶和/或其突变体抑制剂中的应用，其特征在于，所述酪氨酸激酶为EGFR激酶。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述突变体为EGF-R d747-749/A750P、EGF-RL858R、EGF-R L861Q或EGF-R T790M/L858R中的一种或多种。
6.权利要求1或2所述具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗癌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述抗癌药物为由酪氨酸激酶和/或其突变体表达异常引发的黑色素瘤、肝癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫瘤、卵巢癌、直肠癌、***区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***、***癌、***癌、食道癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、慢性或急性白血病、膀胱癌、肾或输卵管癌、脊柱轴肿瘤、垂体腺瘤、胃肠间质肿瘤、非小细胞癌、小细胞肺癌、肥大细胞增多症、胶质瘤、肉瘤或淋巴瘤中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述抗癌药物为由酪氨酸激酶和/或其突变体表达异常引发的黑色素瘤为皮肤或眼内黑色素瘤。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述具有螺环结构的氨基嘧啶类化合物、其药学上可接受的盐中的一种或两种。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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