CN110241202A - 视网膜色素变性突变位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及视网膜色素变性突变位点及其应用。本发明基于临床资源，借助基因捕获芯片及深度测序技术，通过遗传学、结合临床表现及人群验证，成功证实所检测到的35个突变位点为视网膜色素变性新致病位点，为该疾病的诊断提供了新的分子生物学基础，基于所述的35个突变位点可以开发视网膜色素变性的诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于疾病诊断和基因检测领域，具体涉及35个视网膜色素变性突变位点及其应用。
背景技术
视网膜色素变性(retinitis pigmentosa；RP)是一组以视网膜光感受器(视杆细胞和视锥细胞)和色素上皮受损为特征的进行性可致盲遗传性眼底病。全球范围内RP的发病率为1/3000-1/5000，中国人群的发病率可高达1/1000。该病的主要临床特征是：进行性视野缺损、夜盲，视网膜骨细胞状色素沉着和视网膜电图异常等。发病年龄从出生到老年不等。大约20％-30％的RP患者存在包括听力丧失、肥胖、多指畸形和神经***病变等眼外症状。这些眼外异常很容易被忽视或混淆。此外，RP的临床表现与许多其他遗传性视网膜疾病有部分重叠，包括Leber先天性黑蒙(LCA)、锥杆营养不良(CRD)、黄斑营养不良(MD)和先天性静止性夜盲症(CSNB)等。这为临床医生正确诊断和分类RP提供了巨大的挑战。该病的发病、进展和严重程度在大多数情况下由基因和遗传方式决定，同时还受外界环境的影响。RP的遗传方式主要包括常染色体显性、隐性和伴X性染色体遗传。少数与伴Y性染色体遗传、线粒体遗传、双基因遗传和基因印记等有关。目前发现有100个与RP相关的基因，其中比较明确的有87个。此外，专利文献CN106282197A还公开了一种RP致病突变SPP2p.Gly97Arg，专利文献CN108103066A还公开了一种RP致病突变CRB2p.R1249G。然而这些基因仅能解释60％的RP病例，且几乎不存在热点突变，仍有相当部分RP致病突变不能被解释。
基于临床的高通量二代测序(next-generation sequencing；NGS)技术已被证明是诊断遗传类疾病的有力工具，尤其在遗传类视网膜疾病中具有高度的准确性、敏感性和可重复性。基因检测结果不仅为疾病的临床诊断、预后和发病风险的评估提供支持，还为定制各种治疗方法和确定哪些患者将受益于基于基因的新疗法提供指导依据，对患者及其家庭都会产生非常积极的影响。然而，正如所有的医疗干预一样，基因检测也有一些特定的风险。比如目前在检测过程中经常遇到的一个问题就是多个突变位点致病性判断，即便目前有严格的致病性判断标准，如美国医学遗传学会ACMG标准，受限于多种因素(如：家系信息不全，未报道位点，基因异质性等)，在临床工作中仍有大部分位点的致病性无法明确。例如，基因检测的假阳性结果可能影响病人的生育计划、使病人产生焦虑或内疚的情绪、甚至可能扰乱病人与其他家庭成员的关系。基因检测的假阴性结果耽误患者的诊疗，增加患病者的出生率等。因此，扩大对RP突变位点致病性的了解，以最大限度地提高基因检测的效益，减少与之伴随的风险，显得尤为迫切。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供涉及20个基因的35个RP新致病位点。
第一方面，本发明提供了一种特异性检测受试者基因组DNA中是否存在以下任一种、两种或几种突变的试剂：
作为一个优选例，所述试剂选自：引物、引物对、探针、抗体和核酸芯片中的一种或几种。
第二方面，本发明提供了一种诊断视网膜色素变性的试剂盒，所述试剂盒含有如上所述的试剂。
第三方面，本发明提供了如上所述的试剂或如上所述的试剂盒的用途，所述用途选自：
1)在制备诊断或辅助诊断视网膜色素变性产品中的应用；
2)在制备筛查或辅助筛查视网膜色素变性患者产品中的应用；
3)在制备预测视网膜色素变性患病风险产品中的应用；
4)在制备检测与视网膜色素变性相关的基因是否突变产品中的应用；
5)在制备检测与视网膜色素变性相关的蛋白质是否突变产品中的应用。
第四方面，本发明提供了一种用于检测遗传性眼病的突变位点组合，所述突变位点组合至少包含一种如上所述的突变。
作为一个优选例，所述遗传性眼病选为视网膜色素变性。
第五方面，本发明提供了如上所述的突变位点组合在制备遗传性眼病诊断试剂盒中的应用。
第六方面，本发明提供了一种探针组合物，其包含特异性结合至目标基因的探针，所述探针至少能检测一种如上所述的突变。
作为一个优选例，所述探针组合物以混合物形式提供，或者以独立存在的形式提供。
第七方面，本发明提供了一种基因捕获芯片，所述探针至少能检测一种如上所述的突变。
第八方面，本发明提供了一种基因捕获试剂盒，包括如上任一所述的探针组合物。
第九方面，本发明提供了一种基因捕获方法，包括：
构建样本全基因组DNA文库；
与如上任一所述的探针组合物杂交；
洗脱非目标基因的DNA片段，获得目标基因的DNA片段。
第十方面，本发明提供了一种非诊断性检测方法，包括使用如上任一所述的探针组合物或如上所述的基因捕获芯片或如上所述的基因捕获试剂盒的步骤。
本发明优点在于：
虽然已有大量的致病位点被报道，但仍存在大量未知的致病位点。本发明提供了20基因(ABCA4，C5orf42，CDHR1，CNGB1，CRB1，CRX，EYS，GRM6，IFT140，NRL，PDE6A，PRPF6，RHO，RP2，RPE65，RPGR，RPGRIP1，SNRNP200，USH2A，WDR19)的35个新致病位点，为视网膜色素变性的诊断提供了新的分子生物学基础，基于所述的35个突变位点可以开发视网膜色素变性的诊断试剂盒。
附图说明
图1：先证者家系图。
图2：先证者眼底照(A)、视野(B)及双眼光学相干断层成像(C)。
图3：USH2Ac.14223_14224insC(p.Pro4741Profs39)和USH2Ac.7300+1G>T测序图。
图4：患者A家系图。
图5：患者A眼底照(A)、双眼光学相干断层成像(B)及视野(C)。
图6：患者B家系图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：对一个四代的患有视网膜色素变性(retinitis pigmentosa；RP)的家系进行基因突变检测
一、实验方法
1.该家系临床资源的采集及遗传资源库的建立
收集该家系中各成员的临床资料及血液样本，家系图见图1。临床资料主要包括个人病史、家族史、最佳矫正视力(best corrected visual acuities；BCVAs)、裂隙灯检查、眼底照、色觉检查、视野检查(Humphrey视野计)、视觉诱发电位检测(visual evokedpotentials；VEP)、全视野电生理检查(electroretinography；ERG)、眼底荧光血管造影检查(fundus fluorescein angiography；FFA)及光学相干断层成像检查(opticalcoherence tomography；OCT)等。提取患者及家系成员的外周血，并用血液基因组DNA提取试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)提取DNA。
2.借助于高通量二代测序技术检测该家系的致病突变
2.1设计并订制捕获芯片
2.1.1USH2A基因及转录本序列信息
该基因捕获芯片涵盖了762个遗传性眼病相关基因，其中包括我们USH2A基因。此芯片由华大基因设计。所参照的USH2A基因的转录本编号为：NM_206933.2，选择此转录本的原则是：首先考虑拥有CCDS编码蛋白的转录本，若一个基因有多个转录本均编码蛋白，则首选含氨基酸数最多的蛋白相对应的转录本，若多个转录本氨基酸含量相同，则进一步选择含碱基数最多的转录本。
2.1.2杂交探针的设计、目标区域捕获及深度测序
通过查阅OMIM数据库、眼病基因数据库、文献查询、临床眼病发病情况，筛选出762个基因作为眼病检测探针。在参考人类基因组Hg38下，选择上述762个基因的外显子序列，将外显子区向前和后延伸至30bp，降低重组的影响。探针序列的获取：从Hg38中获得762个基因的外显子序列及其侧翼±30bp。每个参考序列从参考序列的一端开始，并选择预定长度的参考序列来获得探针序列，以便最后探针覆盖参考序列至少一次，探针总长度是907nt，总覆盖目标区域为2.3M。此探针总覆盖深度可达到99.5％，探针设计过程中还增加了后续的样品质量控制环节。
①DNA提取：采用琼脂糖凝胶电泳法检测样品的完整性；
②文库准备：参照BGISEQ-500《BGI基因库建设指导手册》；
a)通过超声高性能样品处理***(协变)随机打断合格的DNA样品，选择片段后得到150bp-250bp的片段；
b)修复DNA片段末端，3’末端加“A”；
c)与Illumina PE接头—寡核昔酸混合物相连接，连接产物经PCR富集，获DNA文库。片段扩增后，用于捕获富集、洗涤和脱去不富集的杂交文库和眼科基因；
d)扩增产物用于单链分离和循环处理，循环文库生成。采用Qbit检测进行质量控制。
③测序：质控合格后采用BGISEQ-500PE100+10进行测序。
表1.目标区域的覆盖范围
2.2对测序数据进行生物信息学分析，筛选出候选致病基因
2.2.1生物信息学分析
1)从测序仪获得原始数据(FASTQ数据)；
2)过滤：原始FASTQ数据质量控制，除去低质量数据；
3)Mapping：使用Soap和BWA软件。以Hg38作为参考序列；
4)去除重复序列：基于Picard去重复算法，去除重复序列；
5)变异检测：数据的变异检测基于GATK；
6)变异注释：dbSNP、1K基因组数据库、ESP6500数据库、EXAC数据库、华大基因内部频率注释数据库。HGVS用于变量的标准命名。OIMIM、HGMD等疾病数据库用于突变的病因注释。
2.2.2将患者的测序结果所对应的基因序列进行比较和分析，优先分析***/缺失突变、无义突变和错义突变，结果可分为三类，包括已知突变、已知基因的新突变和新基因的突变。
2.3经Sanger测序验证，鉴定致病突变
PCR法分别针对筛选出的突变位点及邻近DNA序列在相应家系中进行扩增，所用引物序列采用Primer 3(http://frodo.wi.mit.edu/)引物设计软件设计。所用PCR的反应体系(20μL体系)为：5*buffer 4μL，25mM MgCl2 2μL，DNA1μL，正向引物F 1μL，反向引物R 1μL，10mM dNTPs 0.4μL，Taq酶0.1μL，ddH2O 10.5μL。PCR反应程序：98℃5min，35个循环(98℃10s，60℃15s，72℃1min)，72℃7min，4℃5min。3％琼脂糖凝胶电泳检测，于紫外线切胶仪下切取PCR产物凝胶并纯化。对所有的PCR产物分别以正、反向引物测序，并对测序结果进行进一步分析，使用NCBI在线对比工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，排除假阳性结果，并筛选出在家族中共分离的突变位点。
二、实验结果
1.家系临床资料
眼科临床专家对该家系中的6名患者进行详细全面的临床检查后，作出“视网膜色素变性”的临床诊断，下面以先证者为例，对其详细临床资料进行说明：
1)BCVAs：右眼0.02，左眼0.05；
2)裂隙灯检查：双眼晶状体轻混，余未见明显异常；
3)眼底照：双眼骨细胞样色素沉积，视盘蜡黄，视网膜血管变细以及周边部视网膜变性(图2中A)；
4)视野检查：右眼管状视野，左眼视野消失(图2中B)；
5)ERG：双眼视锥、视杆细胞反应均消失，呈熄灭波；
6)OCT：双眼黄斑周边部光感受器内、外均消失，视网膜色素上皮层萎缩(图2中C)。
2.该家系遗传检测结果
通过对家族中的两名患者3、4及两名正常人7、9进行了二代测序及生物信息学分析后，发现两位患者均携带有可疑的复合杂合突变USH2Ac.14792_14793insT(p.Leu4931Phefs2)和c.503C>T(p.Thr168Ile)，未发现其他可疑的致病基因突变位点。经Sanger测序验证证实该突变位点在该家族中表现为共分离，测序结果见图3。突变USH2Ac.14792_14793insT(p.Leu4931Phefs2)位于1号染色体，物理位置为chr1:215640733的碱基由C突变为CA；RNA水平：USH2A基因编码RNA第14792位***碱基A；蛋白水平：USH2A基因编码蛋白从4931位氨基酸发生移码，该基因相关的突变从未在RP患者中发现。突变USH2Ac.503C>T(p.Thr168Ile)位于1号染色体，物理位置为chr1:216418662的碱基由G突变为A；RNA水平：USH2A基因编码RNA第503位碱基由C变为T；蛋白水平：USH2A基因编码蛋白168位氨基酸由Thr变为Ile，该基因相关的突变从未在RP患者中发现。
根据我们所设计的筛选流程，借助我们所设计的基因芯片及深度测序技术，我们成功证实所检测到的该USH2A基因的两个突变位点c.14792_14793insT(p.Leu4931Phefs2)和c.503C>T(p.Thr168Ile)为RP疑似致病位点。
实施例2：针对实施例1中所检测出的两个致病位点在RP人群中验证
一、实验方法
1.RP患者收集
对疑似RP患者进行全面的眼科检查，按照实施病例1中的方法对患者进行临床资源的采集及遗传资源库的建立。
2.按照实施例1中的方法对患者进行高通量二代测序，检测RP患者致病突变。
3.从1242例确诊的RP患者中检测出另外3个由c.14792_14793insT(p.Leu4931Phefs2)及2个由c.503C>T(p.Thr168Ile)致病的患者，未发现其他可疑的致病基因突变位点。以下分别选一例进行说明。
4.患者A中检测出c.14792_14793insT(p.Leu4931Phefs2)及一个已报道致病突变USH2A c.2802T>G p.Cys934Trp，家系图见图4。
1)临床资料
眼科临床专家对该患者进行详细全面的临床检查后，作出“视网膜色素变性”的临床诊断，下面对其详细临床资料进行说明：
①BCVAs：右眼0.2，左眼0.3；
②裂隙灯检查：双眼晶状体轻混，余未见明显异常；
③眼底照：双眼骨细胞样色素沉积，视盘蜡黄，视网膜血管变细以及周边部视网膜变性(图5中A)；
④视野检查：管状视野(图5中B)；
⑤ERG：双眼视锥、视杆细胞反应均消失，呈熄灭波；
⑥OCT：双眼黄斑周边部光感受器内、外节均消失，视网膜色素上皮层萎缩(图5中C)。
2)该家系遗传检测结果
经Sanger测序验证证实该突变位点在该家族中表现为共分离。
5.患者B中检测出c.503C>T(p.Thr168Ile)及一个已报道致病突变USH2Ac.8559-2A>G，家系图见图6。
1)临床资料
眼科临床专家对该患者进行详细全面的临床检查后，作出“视网膜色素变性”的临床诊断，下面对其详细临床资料进行说明：
①BCVAs：双眼0.1；
②裂隙灯检查：双眼晶状体轻混，玻璃体轻混，余未见明显异常；
③眼底照：双眼骨细胞样色素沉积，视盘蜡黄，视网膜血管变细以及周边部视网膜变性；
④视野检查：管状视野；
⑤ERG：双眼视锥、视杆细胞反应均消失，呈熄灭波；
⑥OCT：双眼光感受器细胞层、视网膜色素细胞层萎缩，仅黄斑中心凹残留小段IS/OS层。
2)该家系遗传检测结果
经Sanger测序验证证实该突变位点在该家族中表现为共分离。
6.综上，根据我们所设计的筛选流程，借助我们所设计的基因芯片及深度测序技术，通过遗传学、结合临床表现及人群验证，我们成功证实所检测到的该突变位点c.14792_14793insT(p.Leu4931Phefs2)和c.503C>T(p.Thr168Ile)为RP新致病位点。
本发明的其余RP新突变位点也已通过遗传学、结合临床表现及人群验证，成功证实确为RP新致病位点。因本发明相关内容的论文随时可能公开，为最大限度地保护本发明创造，特及时申请专利，计划于本专利申请日起十二个月内，就相同主题的发明创造再次提出专利申请并要求优先权。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种特异性检测受试者基因组DNA中是否存在以下任一种、两种或几种突变的试剂：
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂选自：引物、引物对、探针、抗体和核酸芯片中的一种或几种。
3.一种诊断视网膜色素变性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述试剂。
4.权利要求1所述的试剂或权利要求3所述的试剂盒的用途，其特征在于，所述用途选自：
1)在制备诊断或辅助诊断视网膜色素变性产品中的应用；
2)在制备筛查或辅助筛查视网膜色素变性患者产品中的应用；
3)在制备预测视网膜色素变性患病风险产品中的应用；
4)在制备检测与视网膜色素变性相关的基因是否突变产品中的应用；
5)在制备检测与视网膜色素变性相关的蛋白质是否突变产品中的应用。
5.一种用于检测遗传性眼病的突变位点组合，其特征在于，所述突变位点组合至少包含一种权利要求1中所述突变。
6.根据权利要求5所述的突变位点组合，其特征在于，所述遗传性眼病为视网膜色素变性。
7.权利要求5所述的突变位点组合在制备遗传性眼病诊断试剂盒中的应用。
8.一种探针组合物，其包含特异性结合至目标基因的探针，其特征在于，所述探针至少能检测一种权利要求1中所述突变。
9.根据权利要求8所述的探针组合物，其特征在于，所述探针组合物以混合物形式提供，或者以独立存在的形式提供。
10.一种基因捕获芯片，其包括固相载体和固定在固相载体上的探针的点阵，其特征在于，所述探针至少能检测一种权利要求1中所述突变。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190917 |