CN105624167B

CN105624167B - 一种遗传性中心性晕轮状视网膜病变的致病突变及其检测试剂

Info

Publication number: CN105624167B
Application number: CN201610076303.0A
Authority: CN
Inventors: 赵晨; 陈雪
Original assignee: Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Current assignee: Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Priority date: 2016-02-03
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2036-02-03
Also published as: CN105624167A

Abstract

本发明公开了一种遗传性中心性晕轮状视网膜病变的致病突变及其检测试剂。一种用于检测遗传性中心性晕轮状视网膜病变的GUCA1A基因，突变的GUCA1A基因为杂合突变GUCA1A p.Arg120Leu。一种检测遗传性中心性晕轮状视网膜病变的试剂盒，所述的试剂盒包括：(a)检测GUCA1A基因物理位置为42146547和42146548核苷酸位点的试剂；或检测GCAP 1蛋白第120位氨基酸位点的试剂；(b)说明书。本发明获得遗传性中心性晕轮状视网膜病变的突变GUCA1A基因，通过检测该突变可以进行遗传性中心性晕轮状视网膜病变的诊断。

Description

一种遗传性中心性晕轮状视网膜病变的致病突变及其检测试剂

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种遗传性中心性晕轮状视网膜病变的致病突变及其检测试剂。

背景技术

中心性晕轮状视网膜病变(central areolar choroidal dystrophy；CACD)是一组由遗传缺陷引起的进行性视网膜退行性疾病，这类疾病以视网膜色素上皮细胞(RPE)和脉络膜血管的不可逆性萎缩为主要病理特征。CACD患者主要危害患者的黄斑区，引起中心视力的进行性下降，严重者可致盲。CACD是临床上常见且危害较为严重的一类遗传性致盲疾病，按其临床特征可分为四个期。早期CACD患者由于其表型易与其他眼底病患者相混淆，故很难对其做出准确的临床诊断。因此，寻找潜在的能够辅助CACD临床诊断的其他诊断方式显得尤为重要。

CACD为单基因遗传病，具有显著的遗传异质性。目前已知的遗传模式为常染色体显性遗传，已知的致病基因有两个，为PRPH2和GUCY2D。然而，这两个基因的突变并不能够解释全部CACD患者的遗传病因，仍有大量CACD患者的致病基因尚未找到，提示存在未知的CACD的新致病基因有待挖掘。针对CACD的分子遗传学研究必须建立在一定的分子生物学技术的基础上。研究CACD致病基因的一个重要目的是进行CACD的分子诊断，鉴于其遗传异质性，寻求一种全新的CACD致病基因的研究方法显得尤为迫切。高通量二代测序技术能够高效的针对大量基因的遗传信息进行捕获，具有传统技术所不可及的优势。

Guanylyl cyclase-activating protein 1(GUCA1A；MIM 600364)基因位于6号染色体短臂6p21.1位置，该基因含有6个外显子，其编码的GCAP 1蛋白是一种含有201个氨基酸的视网膜特异性表达蛋白，目前研究有报道GUCA1A基因突变能够引起视锥细胞变性及锥杆细胞营养不良，但其与CACD间的关系国内外均未见任何报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种遗传性中心性晕轮状视网膜病变的致病突变。

本发明的另一目的是提供该致病突变的应用。

本发明的又一目的是提供该致病突变的检测试剂。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种用于检测遗传性中心性晕轮状视网膜病变的GUCA1A基因，突变的GUCA1A基因为杂合突变GUCA1A p.Arg120Leu。

野生型GUCA1A基因在Ensemble数据库中的基因编号为：ENSG00000048545，所述的突变的GUCA1A基因在物理位置为42146547的碱基由G突变为T，在物理位置为42146548的碱基由C突变为T，其他部分与野生型相同。

一种突变的GCAP 1蛋白，野生型GCAP 1蛋白在Ensemble数据库中的基因转录本编号为：ENST00000394237，突变的GCAP 1蛋白在该野生型蛋白的第120位氨基酸由精氨酸变为亮氨酸，其他部分与野生型相同。

本发明所述的突变的GUCA1A基因或者所述的突变的GCAP 1蛋白在制备遗传性中心性晕轮状视网膜病变检测试剂或检测设备中的应用。

其中所述的检测试剂优选自：引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片中的一种或多种。

所述的检测设备优选包括含有检测突变的GUCA1A基因的基因芯片的检测平台。

一种检测遗传性中心性晕轮状视网膜病变的试剂盒，所述的试剂盒包括：

(a)检测GUCA1A基因物理位置为42146547和42146548核苷酸位点的试剂；或检测GCAP 1蛋白第120位氨基酸位点的试剂；

(b)说明书。

其中，所述的试剂优选选自引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片中的一种或多种。

作为本发明的一种优选，所述的试剂为基于深度测序为平台的基因芯片杂交探针。

检测42146547及42146548核苷酸位点的杂交探针序列优选为chr6|42146509-42146628，序列如SEQ ID NO.14所示。

作为本发明的另一种优选，所述的试剂为检测42146547及42146548核苷酸位点的引物对。

检测42146547及42146548核苷酸位点的正向引物序列为SEQ ID NO.17，反向引物序列为SEQ ID NO.18。

一种以深度测序为平台筛查CACD患者中GUCA1A基因突变的方法，包括以下步骤：

(1)建立CACD患者家系临床与遗传资源库，收集RP家系的临床资料及血液标本，提取基因组DNA；

(2)设计SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.16所示的用于检测GUCA1A基因突变的杂交探针，并将其整合到基因芯片上；

(3)利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序；

(4)对测序结果进行优化的生物信息学分析，筛选到一个新的CACD的致病突变为杂合突变GUCA1A p.Arg120Leu。突变GUCA1A p.Arg120Leu位于6号染色体，物理位置为42146547及42146548(Ensemble数据库)的碱基由GC突变为TT；RNA水平：GUCA1A基因编码RNA第359及360位碱基由GC突变为TT；蛋白水平：SPP2基因编码蛋白第120位氨基酸由精氨酸变为亮氨酸。

步骤(2)所述的基因芯片优选Agilent公司生产的基因芯片。

步骤(3)所述的利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序优选利用美国Illumina公司的Hi-seq2000仪器完成。

步骤(3)所述的利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序优选流程为：将基因组DNA片段化，在DNA末端标记“A”并与Illumina PE接头-寡核苷酸混合物相连接；连接产物经PCR富集，获得DNA文库，并将DNA文库与已知致病基因捕获芯片杂交、洗脱、纯化，获得编码序列；创建配对末端，在Illumina HiSeqTM 2000平台上对目标序列进行测序。

有益效果

1.CACD是常见的、严重的遗传性致盲疾病，在我国发病率较高，严重危害了国民健康。挖掘CACD的新致病突变和新致病基因有利于进一步探索CACD的分子遗传学病因，是充分利用我国的眼科遗传病资源，造福CACD患者的现实需要，是后基因组时代最重要的研究方向之一。本专利旨在探索CACD的遗传学病因，从而帮助了解发病机制、辅助临床诊断、产前诊断和转基因治疗。

2.目前并没有研究指出GUCA1A基因突变与中心性晕轮状视网膜病变间的关系，因此，针对GUCA1A基因与CACD的相关研究显得尤为必要。本专利选择GUCA1A基因作为CACD的候选基因，是由申请人在多年从事临床医疗、遗传学研究的基础上所筛选出的，通过本发明方法进一步明确了GUCA1A基因与CACD的关系。

3.一个基因可以对应多个不同的转录本，且不同转录本所编码的RNA及蛋白有所不同。本专利中申请人根据长期从事遗传学研究的经验，筛选出GUCA1A基因的最优转录本，并根据不同的转录本设计相应的探针，从而使筛查效益达到最高，最终获得遗传性视网膜色素变性疾病的致病突变GUCA1A p.Arg120Leu。

4.CACD具有一定的遗传异质性，目前已知的致病基因包括PRPH2和GUCY2D，但仍存在未知的致病基因。本发明提供了新的致病基因的致病位点，为该疾病的诊断提供了新的分子生物学基础。

附图说明

图1：家系图

图2：CACD1期患者眼底照、眼底自发荧光、眼底荧光血管造影(患者IV：10)

图3：CACD2期患者眼底照、眼底自发荧光、眼底荧光血管造影(患者III：16)

图4：CACD3期患者眼底照、眼底自发荧光、眼底荧光血管造影(患者III：14)

图5：CACD4期患者眼底照、眼底自发荧光、眼底荧光血管造影(患者III：18)

图6：GUCA1A突变及野生型序列测序图

图7：保守性分析

图8：野生型及携带有突变的GUCA1A蛋白晶体结构

图9：斑马鱼整体形态结构

图10：斑马鱼眼部形态结构

图11：斑马鱼眼球切片免疫荧光染色

图12：斑马鱼脉络膜血管形态结构

具体实施方式

实施例1

对一个五代中心性晕轮状视网膜病变(central areolar choroidal dystrophy；CACD)的家系的GUCA1A基因突变进行检测。

实验方法：

1.该家系临床资源的采集及遗传资源库的建立：

收集该家系中各成员的临床资料及血液样本，家系图见图1。临床资料主要包括个人病史、家族史、最佳矫正视力(best corrected visual acuities；BCVAs)、裂隙灯检查、眼底照、色觉检查、视野检查(Humphrey视野计)、视觉诱发电位检测(visual-evokedpotentials；VEP)、全视野电生理检查(electroretinography；ERG)、眼底荧光血管造影检查(fundus fluoresceinangiography；FFA)及光学相干断层成像检查(optical coherencetomography；OCT)等。并用血液基因组DNA提取试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)对家系各成员的血液基因组DNA进行提取。

2.借助于高通量二代测序挖掘该家系的致病突变：

2.1设计并订制捕获芯片：

2.1.1SPP2基因及转录本序列信息：

该基因捕获芯片为全外显子组捕获芯片，可对目前所有已知基因进行检测，其中包括全部目前已知的CACD相关的致病基因。我们所参照的GUCA1A基因在Ensemble数据库中的基因编号为：ENSG00000048545(注：该编号来自Ensemble数据库，www.ensembl.org，可输入基因编码检索基因详细信息及基因序列)。

2.1.2转录本的选择：

针对不同基因选择特定的转录本，每个基因均含有多个转录本，在选择转录本时，我们的原则是：首先考虑拥有CCDS编码蛋白的转录本，若一个基因有多个转录本均编码蛋白，则首选含氨基酸数最多的蛋白相对应的转录本，若多个转录本氨基酸含量相同，则进一步选择含碱基数最多的转录本。据以上原则，我们所筛选出的GUCA1A基因转录本编号为：ENST00000394237(注：该编号来自Ensemble数据库，www.ensembl.org，可输入转录本编码检索转录本详细信息及转录本序列)。

2.1.2杂交探针的设计：

杂交探针的设计标准为：(1)探针覆盖所有候选基因的目标区域，即外显子区域以及外显子和内含子拼接处(外显子上下游各100个bp)；(2)去除重复序列：对于在基因组出现的高度重复序列以及在人类基因组中出现2-5倍的较低频率的重复片段，我们予以去除，避免捕获其他同源基因，增加假阳性，从而降低检测效率。申请人将所有候选基因的目标区域与人类基因组DNA序列进行比对，共移除了2.5％的重复序列；(3)在探针设计过程中，我们对临近的外显子进行了特定的整合，其相邻探针整合标准为：当相邻外显子的综合目标区域(即前个外显子的上游100bp起至后一个外显子的下游100bp止)总和小于600bp，即将其整合为一个探针，以求通过一对探针完成多对外显子区域的捕获；(4)当所设计探针序列小于250bp时，在其两端各包含上下游100bp的内含子的基础上，各继续增加相同bp数的内含子，使探针大小达到250bp。根据以上设计原则，我们针对GUCA1A基因所设计的探针序列如下：

用于筛选CACD致病基因GUCA1A的杂交探针序列共16条，序列如SEQ ID NO.1～SEQID NO.16所示；

2.2目标区域捕获及深度测序：

首先将基因组DNA片段化，并在DNA末端标记“A”，与Illumina PE接头-寡核苷酸混合物相连接，连接产物经PCR富集，获得DNA文库。然后将DNA文库与已知致病基因捕获芯片杂交、洗脱、纯化，获得编码序列。最后创建配对末端，在HiSeqTM 2000(Illumina,Inc.,SanDiego,CA,USA)平台上对目标序列进行测序。

2.3对测序数据进行生物信息学分析，筛选出候选致病基因：

2.3.1采用Mosaik软件(http://bioinformatics.bc.edu/marthlab/Mosaik)处理Illumina原始测序数据(配对末端数据)，产生.bam类型文件。将.bam文件输入GATK，利用GATK检测单核苷酸变异体(single nucleotide variant)和小的***或缺失(insertion/deletions)，同时进行质量评估，便于下游的生物信息学分析，最后产生.vcf类型文件。

2.3.2将患者的测序结果在包括dbSNP144

(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp144.txt.gz.)，HapMap计划

(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)，1000Genome Project

(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)，炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)以及Exome

Variant Server(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)在内的五个单核苷酸多态性(SNP)数据库中筛查，滤过所有已知的SNP位点；

2.3.3将患者的测序结果所对应的基因序列进行比较和分析，优先分析***/缺失突变、无义突变和错义突变，结果可分为三类，包括已知突变、已知基因的新突变和新基因的突变。

2.4经Sanger测序验证，鉴定致病基因：

PCR法分别针对筛选出的突变位点及邻近DNA序列在相应家系中进行扩增，所用引物序列采用Primer 3(http://frodo.wi.mit.edu/)引物设计软件设计。所用PCR的反应体系(20μL体系)为：5*buffer 4μL，25mM MgCl₂2μL，DNA 1μL，正向引物F 1μL，反向引物R 1μL，10mM dNTP0.4μL，Taq酶0.1μL，ddH₂O 10.5μL。PCR反应程序：98℃5min，35个循环(98℃10s，60℃15s，72℃1min)，72℃7min，4℃5min。1％琼脂糖凝胶电泳检测，与紫外线切胶仪下切取PCR产物凝胶并纯化。对所有的PCR产物分别以正、反向引物测序，并对测序结果进行进一步分析，使用NCBI在线对比工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，排除假阳性结果，并筛选出在家族中共分离的突变位点。其中检测42146547及42146548核苷酸位点的正向引物序列为SEQ ID NO.17，反向引物序列为SEQ ID NO.18。

实验结果：

1.家系临床资料：

眼科临床专家对该家系中的参与研究的全部患者(II：6、II：11、II：13、III：7、III：12、III：14、III：16、III：18、III：20、III：31、III：33、IV：3、IV：5、IV：10、IV：13和IV：19)进行了详细全面的临床检查后，对该家系内患者作出了“CACD”的临床诊断。家系内患者CACD各临床分期的眼底照、自发荧光及荧光造影的检查结果如图2-图5：图2为患者IV：10的眼部检查结果，符合CACD临床分期1期表现；图3为患者III：16的眼部检查结果，符合CACD临床分期2期表现；图4为患者III：14的眼部检查结果，符合CACD临床分期3期表现；图5为患者III：18的眼部检查结果，符合CACD临床分期4期表现。家系内全部患者的详细临床资料如下：

表1.家系内患者的临床检查结果

2.该家系遗传检测结果：

通过对家族中的两名患者IV：3及IV：13进行了全外显子组测序及生物信息学分析后，我们发现了两位患者均携带有可疑的杂合突变GUCA1A p.Arg120Leu，其对应核苷酸改变为GUCA1A c.359_369delGCinsTT，未发现其他可疑的致病基因突变位点。经Sanger测序验证证实该突变位点在该家族中表现为共分离，测序结果见图6。突变GUCA1A p.Arg120Leu位于6号染色体，物理位置为42146547及42146548(Ensemble数据库)的碱基由GC突变为TT；RNA水平：GUCA1A基因编码RNA第359及360位碱基由GC突变为TT；蛋白水平：SPP2基因编码蛋白第120位氨基酸由精氨酸变为亮氨酸，该基因相关的突变从未在RP患者中发现。

根据我们所设计的筛选流程，借助我们所设计的基因芯片及深度测序技术，我们成功证实所检测到的该GUCA1A基因杂合突变为CACD新致病基因，p.Arg120Leu为该疾病的新致病位点。

实施例2：

针对实施例1中所检测出的致病突变GUCA1A p.Arg120Leu进行功能学研究。

实验方法：

1.保守性分析：

采用NCBI HomoloGene数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene)对所筛选得到突变在多个物种中进行保守性评估及预测。

2.蛋白晶体结构改变研究：

采用SWISS MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)预测软件对GUCA1A野生型蛋白及携带有p.Arg120Leu突变的突变蛋白结构分别进行预测，评估突变所引起的蛋白结构改变。

3.斑马鱼实验：

分别合成野生型和突变型人源GUCA1A基因全长cDNA并将其克隆至pxT7载体，构建pxT7标签的GUCA1A^WT和GUCA1A^MU质粒，利用这些质粒合成相应的GUCA1A mRNA，包括GUCA1A^WT和GUCA1A^MU mRNA。将上述合成的mRNA分别进行显微注射到斑马鱼胚胎中，观察：

1)光镜观察斑马鱼整体形态结构的改变；

2)透射电镜观察斑马鱼眼部形态结构的改变；

3)斑马鱼视网膜特异性基因表达的改变：收集注射后4天的斑马鱼，分别检测其视网膜特异性的转录本在mRNA及蛋白水平的变化。Trizol法提取斑马鱼的mRNA，并利用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，利用QPCR检测视网膜特异性转录本的表达情况，比较GUCA1A^WT和GUCA1A^MU mRNA注射组。对4天的斑马鱼进行固定、脱水和OCT包埋，对其眼球组织进行冰冻切片，对冰冻切片进行免疫荧光染色，一抗为PNA/RHO/ZPR-2抗体，漂洗后再加入荧光二抗和DAPI，封片后用Olympus激光共聚焦显微镜对其进行观察，比较GUCA1A^WT和GUCA1A^MU mRNA注射组。

4)斑马鱼脉络膜血管形态结构的变化：收集注射后10天的Tg(flk1：EGFP)转基因斑马鱼，利用Leica激光共聚焦显微镜观察其脉络膜血管，比较GUCA1A^WT和GUCA1A^MU mRNA注射组。

实验结果：

1.保守性分析：

GUCA1A p.Arg120Leu位点在人、猩猩、狼、牛、鼠、鸡及斑马鱼等多个物种中高度保守，即该位点在进化过程中高度保守，侧面印证该位点的突变可能会引起较为严重的病理现象(图7)。

2.蛋白晶体结构改变研究：

蛋白晶体结构预测结果显示，GUCA1A p.Arg120Leu突变可引起野生型Arg120位点与Ser51号氨基酸间的氢键结构消失，引起蛋白质结构的改变(图8)，从而进一步影响蛋白功能。

3.斑马鱼实验结果：

我们从以下几个方面比较GUCA1A^WT和GUCA1A^MU mRNA注射组斑马鱼的异同：

1)斑马鱼整体形态结构：GUCA1A^WT和GUCA1A^MU mRNA注射组斑马鱼在整体形态结构上并未出现显著差异(图9)；

2)斑马鱼眼部形态结构的改变：我们借助于透射电镜对GUCA1A^WT和GUCA1A^MU mRNA注射组斑马鱼的眼部形态结构进行了比较，发现GUCA1A^MU mRNA注射组斑马鱼的RPE明显变薄，光感受器细胞外节盘层形态结构异常(图10)；

3)斑马鱼视网膜特异性基因表达的改变：我们比较了GUCA1A^WT和GUCA1A^MU mRNA注射组斑马鱼视网膜特异性基因转录本及蛋白的表达差异，发现GUCA1A^MU mRNA注射组斑马鱼视网膜特异性转录本表达较GUCA1A^WT mRNA注射组显著降低。与此同时，我们还对注射后的斑马鱼进行了眼组织切片免疫荧光染色，用RHO标记了斑马鱼的视杆细胞，用PNA标记斑马鱼的视锥细胞，用ZPR-2标记了斑马鱼的视网膜色素上皮层，结果显示，注射GUCA1A^MU mRNA的斑马鱼的视杆细胞层(RHO标记)、视锥细胞层(PNA标记)及视网膜色素上皮层(ZPR-2标记)均缺失，而注射野生型mRNA的斑马鱼各细胞层均较完整(图11)。综上，斑马鱼实验结果表明，GUCA1A^MU mRNA会引起斑马鱼光感受器及RPE细胞的特异性损害，这一结果与病人中得到的结果类似。

4)斑马鱼脉络膜血管形态结构的变化：我们比较了GUCA1A^WT和GUCA1A^MU mRNA注射组斑马鱼脉络膜血管的形态结构，发现GUCA1A^MU mRNA注射组斑马鱼脉络膜血管形态结构异常，其血管的荧光强度较GUCA1A^WT mRNA注射组斑马鱼显著降低(图12)。

综上，我们通过遗传学及动物实验学的实验结论从多方面证实了GUCA1Ap.Arg120Leu突变的视网膜及脉络膜特异性损害，阐明了其与CACD疾病间的关联。本发明所述的突变的GUCA1A基因或者所述的突变的GCAP 1蛋白可在制备遗传性中心性晕轮状视网膜病变检测试剂或检测设备中应用。

Claims

1.一种和遗传性中心性晕轮状视网膜病变相关的突变的GUCA1A基因，其特征在于野生型GUCA1A基因在Ensemble数据库中的基因编号为：ENSG00000048545，所述的突变的GUCA1A基因在物理位置为42146547的碱基由G突变为T，在物理位置为42146548的碱基由C突变为T，其他部分与野生型相同。

2.一种和遗传性中心性晕轮状视网膜病变相关的突变的GCAP 1蛋白，野生型GCAP 1蛋白在Ensemble数据库中的基因转录本编号为：ENST00000394237，突变的GCAP 1蛋白在该野生型蛋白的第120位氨基酸由精氨酸变为亮氨酸，其他部分与野生型相同。

3.检测权利要求1所述的突变的GUCA1A基因或者权利要求2所述的突变的GCAP 1蛋白的试剂在制备遗传性中心性晕轮状视网膜病变检测试剂或检测设备中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的检测试剂选自：引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的检测设备包括含有检测突变的GUCA1A基因的基因芯片的检测平台。

6.一种检测遗传性中心性晕轮状视网膜病变的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括：

(a)检测GUCA1A基因物理位置为42146547和42146548核苷酸位点的试剂；或检测GCAP1蛋白第120位氨基酸位点的试剂；

(b)产品使用说明书。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂选自引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂为基于深度测序为平台的基因芯片杂交探针。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于检测42146547及42146548核苷酸位点的杂交探针序列为chr6|42146509-42146628，序列如SEQ ID NO.14所示。

10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂为检测42146547及42146548核苷酸位点的引物对。

11.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于检测42146547及42146548核苷酸位点的正向引物序列为SEQ ID NO.17，反向引物序列为SEQ ID NO.18。