CN110241053A - 一种混合发酵培养丁酸梭菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种混合发酵培养丁酸梭菌的方法，属于微生物培养技术领域，所述方法包括以下步骤：将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的单菌培养液混合进行混合培养；所述混合培养的温度为29℃，所述混合培养的pH值为6.4～6.8，所述混合培养的时间为16～20h，所述混合培养的转速为150～170rpm；所述丁酸梭菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌混合的数量比例为1:1:3:1。所述方法操作简单，培养获得的丁酸梭菌的生物量显著提高，生物活性也大大提升。

Description

一种混合发酵培养丁酸梭菌的方法
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，尤其涉及一种混合发酵培养丁酸梭菌的方法。
背景技术
科技的飞速发展使得人类的生活水平显著提升，日渐凸显的环保和食品安全问题越来越受到人们的重视。早前受养殖业、饲料业所热捧的抗生素正逐步被更为绿色、安全的微生态制剂所替代。丁酸梭菌作为新型微生态制剂大家族中的一员，无论是对养殖业还是其他相关产业均有非常广阔的市场前景。
丁酸梭菌是一种存在于人类和动物肠道中的非常住、产芽孢益生菌，亦广泛分布在树叶、土壤、奶酪以及天然酸奶中，具有耐热(80℃、30min的热处理下不会失活)、耐酸(在体内可以耐受胃液、胆汁酸和消化液的作用)和耐多种抗生素(仅对万古霉素、四环素等少数抗生素敏感)的生物学特性。丁酸梭菌还能够调节肠道的微生态平衡，早在1999年，赵熙等就发现丁酸梭菌具有增殖肠道内有益菌并抑制有害菌的作用。在对提高养殖业产能和饲料利用率、增强饲养畜禽免疫力以及治疗动物因大肠杆菌等有害菌所引起的腹泻等方面上，丁酸梭菌均有显著的效果。
丁酸梭菌在体外室温下能长期保存，但难以纯培养，从而导致其发酵生物量普遍不高。而混合培养则能产生优于细菌纯培养时的效果，能显著提高菌株的生理代谢功能、对有害菌的拮抗作用以及生物产量。目前对丁酸梭菌混合发酵培养的研究较少，培养所获得的生物产量也无显著提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种混合发酵培养丁酸梭菌的方法，所述方法操作简单，培养获得的丁酸梭菌的生物量显著提高，生物活性也大大提升。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种混合发酵培养丁酸梭菌的方法，包括以下步骤：
将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的单菌培养液混合进行混合培养；所述混合培养的温度为29℃，所述混合培养的pH值为6.4～6.8，所述混合培养的时间为16～20h，所述混合培养的转速为150～170rpm；
所述丁酸梭菌的单菌培养液中丁酸梭菌的活菌浓度为(5～7)×107CFU/mL，所述枯草芽孢杆菌的单菌培养液中枯草芽孢杆菌的活菌浓度为(1.5～2.5)×107CFU/mL，所述酵母菌的单菌培养液中酵母菌的活菌浓度(0.5～1.5)×108CFU/mL，所述乳酸菌的单菌培养液中乳酸菌的活菌浓度为(0.5～1.5)×108CFU/mL；
所述丁酸梭菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌单菌培养液混合的体积比例为1:1:3:1。
优选的，所述混合培养的pH值为6.5。
优选的，所述混合培养的转速为160rpm。
优选的，所述丁酸梭菌的单菌培养液中丁酸梭菌的活菌浓度为(5.9～6.2)×107CFU/mL。
优选的，所述枯草芽孢杆菌的单菌培养液中枯草芽孢杆菌的活菌浓度为(1.9～2.1)×107CFU/mL。
优选的，所述酵母菌的单菌培养液中酵母菌的活菌浓度(0.9～1.1)×108CFU/mL。
优选的，所述乳酸菌的单菌培养液中乳酸菌的活菌浓度为(0.8～1.2)×108CFU/mL。
优选的，分别将所述丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌进行单独培养获得丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的单菌培养液；所述单独培养的温度为28℃，所述单独培养的时间为20～28h，所述单独培养的转速为150～170rpm。
优选的，所述混合培养的培养基以1L计，包括以下组分：葡萄糖20g、蛋白胨30g、酵母粉20g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、轻质CaCO31g、MnSO4·H2O 0.02g和余量的水。
优选的，所述培养基的pH值为7.0～7.4。
本发明的有益效果：本发明提供的混合发酵培养丁酸梭菌的方法，通过将所述丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌混合培养，控制丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的菌浓度和混合比例、混合培养的温度、pH值等参数，使得所述丁酸梭菌的生物量有显著的提高。本发明提供的方法操作简单、节约资源、无危害，培养获得的丁酸梭菌的生物活性也有较大提高，本发明所述方法能够创造较大的经济价值。
具体实施方式
本发明提供了一种混合发酵培养丁酸梭菌的方法，包括以下步骤：将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的单菌培养液混合进行混合培养；所述混合培养的温度为29℃，所述混合培养的pH值为6.4～6.8，所述混合培养的时间为16～20h，所述混合培养的转速为150～170rpm；所述丁酸梭菌的单菌培养液中丁酸梭菌的活菌浓度为(5～7)×107CFU/mL，所述枯草芽孢杆菌的单菌培养液中枯草芽孢杆菌的活菌浓度为(1.5～2.5)×107CFU/mL，所述酵母菌的单菌培养液中酵母菌的活菌浓度(0.5～1.5)×108CFU/mL，所述乳酸菌的单菌培养液中乳酸菌的活菌浓度为(0.5～1.5)×108CFU/mL；所述丁酸梭菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌单菌培养液混合的体积比例为1:1:3:1。
本发明首先分别对丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌进行单独培养。本发明对所述单菌培养的方法和步骤没有特殊要求，采用本领域常规的方法和步骤即可。在本发明中，所述单独培养的温度优选为28℃，所述单独培养的时间优选为20～28h，更优选为24h，所述单独培养的转速优选为150～170rpm，更优选为160rpm。在本发明具体实施过程中，分别将所述丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌接种于灭菌后的液体培养基中进行培养获得单菌培养液。在本发明中，所述丁酸梭菌的单菌培养液中丁酸梭菌的活菌浓度优选为(5.9～6.2)×107CFU/mL，更优选为6.1×107CFU/mL；所述枯草芽孢杆菌的单菌培养液中枯草芽孢杆菌的活菌浓度优选为(1.9～2.1)×107CFU/mL，更优选为2.0×107CFU/mL；所述酵母菌的单菌培养液中酵母菌的活菌浓度优选为(0.9～1.1)×108CFU/mL，更优选为1.0×108CFU/mL；所述乳酸菌的单菌培养液中乳酸菌的活菌浓度优选为(0.8～1.2)×108CFU/mL，更优选为1.0×108CFU/mL.
本发明在获得所述单菌培养液后，单菌培养液混合进行混合培养。在本发明中，所述丁酸梭菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌混合的数量比例为1:1:3:1，所述混合培养的温度为29℃，所述混合培养的pH值为6.4～6.8，优选为6.5；所述混合培养的时间优选为16～20h，更优选为18h，所述混合培养的转速为150～170rpm，优选为160rpm；所述混合培养的培养基以1L计，优选的包括以下组分：葡萄糖20g、蛋白胨30g、酵母粉20g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、轻质CaCO31g、MnSO4·H2O 0.02g和余量的水，所述混合培养的培养基的pH值优选为7.0～7.4，更优选为7.2。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
混合培养的培养基以1L计，包括以下组分：葡萄糖20g、蛋白胨30g、酵母粉20g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、轻质CaCO31g、MnSO4·H2O0.02g和余量的蒸馏水，所述混合培养的培养基的pH值为7.2。
丁酸梭菌单独培养采用的培养基为混合培养的培养基，组成如上。
枯草芽孢杆菌单独培养采用的培养基以1L计：包括葡萄糖20g、蛋白胨15g、氯化钠5g、牛肉膏0.5g、琼脂20g和余量的蒸馏水；PH值6.8～7.2
酵母菌单独培养采用的培养基以1L计：包括蔗糖30g、NaNO33g、K2HPO41g、KCL0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、琼脂15～20g和余量的蒸馏水，pH值6.8～7.2。
乳酸菌单独培养采用的培养基以1L计，包括蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0g、葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g、磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g、硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g、琼脂18.0g和余量的蒸馏水，pH值6.2～6.6。
(1)分别配制丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的液体培养基，经高压灭菌后进行接种，用胶塞塞住，边缘用封口膜封住，在28℃，160rpm培养24h，获得单菌培养液。
采用平板计数法，分析4种单菌培养液中菌种的浓度，丁酸梭菌6.1×107CFU/mL，枯草芽孢杆菌2.0×107CFU/mL，酵母菌1.0×108CFU/mL，乳酸菌1.0×108CFU/mL。
(2)根据单种菌培养结果，选定pH 6.5、29℃和160rpm进行混合培养。移取1.0mL丁酸梭菌液加入混合培养的培养基，加入另外3种菌，分别调至丁酸梭菌:酵母菌:枯草芽孢杆菌:乳酸菌为1:1:1:1、1:1:2:1、1:1:3:1、1:3:1:1和1:2:1:1。培养18h后，在波长600nm处测量混合菌液的OD值。
(3)丁酸梭菌:酵母菌:枯草芽孢杆菌:乳酸菌为1:1:1:1、1:1:2:1、1:1:3:1、1:3:1:1和1:2:1:1，混合培养后菌液的OD值分别为2.52、2.48、2.64、2.53、2.51。
(4)混合菌液在10-8的稀释浓度下，通过镜检计数。最终结果，丁酸梭菌的浓度为1×109CFU/mL，枯草芽孢杆菌的浓度为2.3×109CFU/mL，酵母菌的浓度为3.0×109CFU/mL，乳酸菌的浓度为1.0×109CFU/mL。
由此可见，采用本发明提供的混合发酵培养丁酸梭菌的方法能够显著提高培养液中丁酸梭菌的活菌浓度，显著提高生物量和生物活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种混合发酵培养丁酸梭菌的方法，包括以下步骤：
将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的单菌培养液混合进行混合培养；所述混合培养的温度为29℃，所述混合培养的pH值为6.4～6.8，所述混合培养的时间为16～20h，所述混合培养的转速为150～170rpm；
所述丁酸梭菌的单菌培养液中丁酸梭菌的活菌浓度为(5～7)×107CFU/mL，所述枯草芽孢杆菌的单菌培养液中枯草芽孢杆菌的活菌浓度为(1.5～2.5)×107CFU/mL，所述酵母菌的单菌培养液中酵母菌的活菌浓度(0.5～1.5)×108CFU/mL，所述乳酸菌的单菌培养液中乳酸菌的活菌浓度为(0.5～1.5)×108CFU/mL；
所述丁酸梭菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌单菌培养液混合的体积比例为1:1:3:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合培养的pH值为6.5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述混合培养的转速为160rpm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述丁酸梭菌的单菌培养液中丁酸梭菌的活菌浓度为(5.9～6.2)×107CFU/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的单菌培养液中枯草芽孢杆菌的活菌浓度为(1.9～2.1)×107CFU/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母菌的单菌培养液中酵母菌的活菌浓度(0.9～1.1)×108CFU/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌的单菌培养液中乳酸菌的活菌浓度为(0.8～1.2)×108CFU/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分别将所述丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌进行单独培养获得丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的单菌培养液；所述单独培养的温度为28℃，所述单独培养的时间为20～28h，所述单独培养的转速为150～170rpm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合培养的培养基以1L计，包括以下组分：葡萄糖20g、蛋白胨30g、酵母粉20g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、轻质CaCO31g、MnSO4·H2O0.02g和余量的水。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养基的pH值为7.0～7.4。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication
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