JP2020502480A - 2次元ゲル電気泳動における熱安定性変化に基づいた蛍光差を用いた標的タンパク質の識別方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、2次元ゲル電気泳動における熱安定性変化に基づいた蛍光差を用いた標的タンパク質の識別方法に関し、より具体的には、特定の薬物、好ましくは生理活性分子がその標的タンパク質と結合した時に現れるタンパク質の熱安定性変化を2次元ゲル電気泳動の蛍光差を通じて分析することによって、特定の薬物の標的になるタンパク質を識別(identification)する方法に関する。本発明に係るTS−FITGEを用いた標的タンパク質の同定方法を用いる場合、極端な化学構造を有する生理活性天然物、すなわち、合成が難しい複雑な構造の天然物と、化学的修飾のための空間が不足した小さくて単純な天然物にプローブを標識しなくてもその標的タンパク質を容易に探し出すことができ、これは革新的な新薬および治療法の開発に非常に効率的である。また、既存の熱安定性アッセイがFITGE技術と結合されることによって、タンパク質の熱安定性変化による融解温度の変化が微小であるかまたは融解曲線の傾きが激しい場合にも、特定温度における顕著な色変化を通じてタンパク質の熱安定性変化を容易に検出できるという長所がある。【選択図】図1
Description
本発明は、2次元ゲル電気泳動における熱安定性変化に基づいた蛍光差を用いた標的タンパク質の識別方法に関し、より具体的には、特定の薬物、好ましくは生理活性分子がその標的タンパク質と結合した時に現れるタンパク質の熱安定性変化を2次元ゲル電気泳動の蛍光差を通じて分析することによって、特定の薬物の標的になるタンパク質を識別(identification)する方法に関する。
低分子物質がその生理活性を示すためには、それらの生体分子的パートナーと結合しなければならない。このような現象を標的結合(target engagement)と言い、薬物の発見と化学生物学的研究において重要な分野である。形質スクリーニングを介した伝統的な天然物またはヒット化合物(hit compound)の標的タンパク質は大半の場合は知られていなかったため、標的タンパク質は生理活性低分子物質の活性メカニズムを定めるために識別されなければならず、これは新規な治療剤または生物医学科学分野のリサーチツールの発展のために重要である。
標的の識別に最も一般に用いられる接近方式には、親和性クロマトグラフィ−プルダウンアッセイがある(Schenone et al.,Nat.Chem.Biol.2013.,9,pp.232−240)。生理活性化合物がアガロースビーズに固定されることによって、細胞溶解物がビーズと共に培養され、変形されたビーズと結合された標的タンパク質は結合されていない他のタンパク質から分離される。化学的プロテオミクスにおいて最近の二つの接近法は、(i)タンパク質クラスの酵素活性を用いた活性ベースのプロテオームプロファイリングとして、活性部位への共有結合ラベリングを用いたもの(Simon et al.,Nat.Chem.Biol.2013.,9,pp.200−205)、および(ii)非酵素タンパク質の結合相互作用を用いた親和性ベースのプロテオームプロファイリングとして、光親和性ベースの共有結合性架橋(covalent cross−linking)を用いたもの(Pan et al.,Nat.Prod.Rep.2015.8.24.,doi:10.1039/c5np00101c)を含む。このような接近法は、化学的プロテオミクスの範囲を確実に拡張させたものの、酵素反応に必要な求電子剤、クリックケミストリーにおけるアルキン部分(moiety)、標的タンパク質への共有結合性架橋結合のための光親和性官能基などの機能部位(functional handles)を導入するために本来の生理活性化合物に化学的修飾を加えなければならない。そこで、機能変化の最小化、光親和性官能基の最適化、分子構造および大きさを含む立体的な要素(conformational factors)の考慮などを通じて、標的の識別のためのプローブを発展させるための持続的な努力があった。例えば、韓国登録特許第10−1427328号においては、タンパク質と結合が可能な特定の光反応官能基および蛍光物質標識用官能基を含むプローブを、生理活性分子に共有結合により標識することによって標的タンパク質を同定しようとした。
しかし、機能化のための設計および合成は、標的の識別において大きな障害物にならざるを得ない。多くの類似物質を合成しそれらの構造−活性関係を探索することは、相当に多くの努力を必要とする。仮に標的識別プローブが生理活性をそのとおりに維持できるように合成されたとしても、化学的修飾されたプローブが細胞のプロテオームと非特異的相互作用をするのは依然として避けることができない。複雑な天然物の全体的な合成の制限、またはこれらを天然供給源から十分な量で抽出し出すことの制限により化学的修飾を実行し難いだけでなく、若干の修飾だけで本来のヒット化合物が有する生物学的活性を失いうる。例えば、ブリオスタチン1(bryostatin 1)という化合物の場合、58段階の合成段階を経なければならないほど合成するのが難しいだけでなく(Keck et al.,J.Am.Chem.Soc.133,744−747(2011))、その化学構造式が非常に複雑であるため(図7a)、従来の標的識別方法を用いる場合、好適に機能するプローブを製作するのが難しい。また、ホルデニン(hordenine)の場合、その逆に非常に単純な構造になっており(図13a)、プローブを標識するための化学的変化が不可能な代表的な天然生理活性低分子物質である。したがって、どのような構造的な変化も必要としない非標識標的識別方法が必要な実情である。
最近報告されたCETSA(cellular thermal stability assay;CETSA)では、標識がない方式の標的結合(target engagement)が無傷の細胞および組織内で観察された(Martinez Molina,et al.,Science.2013.,341,pp.84−87)。熱変性後のウェスタンブロットにより、溶液部分に存在する標的タンパク質の量が測定された。生理活性リガンドの結合が標的タンパク質を熱変性に対して安定化させ、タンパク質の融解温度Tmを増加させた。このようなCETSAの堅固性と効率性のため、CETSAは多くの研究員に採択されて標的結合の確認のために用いられた。例えば、国際公開公報WO2015/145151号においてもCETSAと定量的質量分析法を用いて薬物抵抗性を有した患者からバイオマーカーを探そうとし、韓国公開特許公報第10−2014−0033366号においてもタンパク質の熱的変化を用いて標的タンパク質に結合するリガンドを探そうとした。しかし、前記二つの特許は、いずれにしてもリガンドと標的タンパク質の結合による融解温度の変化が大きくなく微小な場合には、リガンドと標的タンパク質の結合可否を容易に検出できないという短所がある。それのみならず、CETSAは非偏向的な(unbiased)プロテオーム−ワイド標的の識別に好適ではなく、その理由は該方法が使用可能抗体を用いた仮説に基づいた(hypothesis driven)候補タンパク質にのみ適用可能であるためである。その反面、非偏向的標的の識別は、成功的な形質スクリーニングのための必須条件であり、革新新薬治療法の開発に率いる。
LC−MSテクニックの速い発展により、最近ゲル−フリー(gel−free)プロテオミクスが好まれているにもかかわらず、2次元ゲル電気泳動(2−DE)は費用、堅固性、および解像度の側面で依然として効果的なプロテオミクス接近法として残っている。本発明者らは、熱安定性アッセイを2次元ゲル電気泳動に基づくFITGE(fluorescence difference in two−dimensional gel electrophoresis)技術と結合すれば、単にCy3シグナルとCy5シグナル間の蛍光差による赤色スポットまたは緑色スポットを他の黄色スポットと区別することによって、熱安定性変化が発生したタンパク質スポットを効果的に探せるということに着目した。
そこで、本発明者らは、2次元ゲル電気泳動における熱安定性変化に基づいた蛍光差(thermal stability shift−based fluorescence difference in two−dimensional gel electrophoresis;TS−FITGE)を用いた、プロテオーム−ワイド標的の識別のための非標識方法を用いて、極端な化学構造を有する生理活性天然物、すなわち、合成が難しい複雑な構造の天然物と、化学的修飾のための空間が不足した小さくて単純な天然物の標的を識別し、それを通じてTS−FITGE方法の堅固性と実用性を立証しようとした。二つの蛍光シグナルは熱的に安定化または不安定化されたタンパク質スポットを可視化するのに用いられ、各々の様々な温度におけるゲルの定量イメージ分析を通じて各タンパク質スポットに対する融解曲線をプロッティング(plotting)した。
その結果、TS−FITGE方法は、成功的にメトトレキサート(methotrexate)およびブリオスタチン1の知られた標的タンパク質を明らかにし、特に膜固定タンパク質の識別に該方法が適用できることを確認した。さらには、ホルデニンの知られていない標的タンパク質として、インビトロ(in−vitro)タンパク質調節因子である単純天然物を識別し、その機能を検証した。
本発明の目的は、薬物分子、好ましくは生理活性分子の標的タンパク質を同定する方法であって、2次元ゲル電気泳動における熱安定性変化に基づいた蛍光差(thermal stability shift−based fluorescence difference in two−dimensional gel electrophoresis;TS−FITGE)を用いた同定方法を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、次のステップを含む、薬物分子、好ましくは生理活性分子の標的タンパク質を同定する方法を提供する:
(a)細胞溶解物またはヒト由来細胞が含まれた混合物Aを製造するステップ、
(b)細胞溶解物またはヒト由来細胞と、薬物分子とが混合されて含まれた混合物Bを製造するステップ、
(c)前記混合物Aと前記混合物Bを同一な特定温度に変化させるステップ、
(d)前記(c)ステップで得られた特定温度の混合物Aおよび混合物Bに互いに異なる波長の蛍光物質を各々混合して、混合物Aおよび混合物Bの溶液部分に存在するタンパク質に前記互いに異なる波長の蛍光物質を各々標識するステップ、
(e)前記(d)ステップで得られた混合物Aおよび混合物Bを混合して混合物Cを製造するステップ、
(f)前記混合物Cを電気泳動するステップ、および
(g)前記(f)ステップの電気泳動によりゲルに現れるタンパク質スポットに対する蛍光波長を分析して、前記(c)ステップにより熱安定性変化(thermal stability shift)が現れたタンパク質を確認するステップ。
(a)細胞溶解物またはヒト由来細胞が含まれた混合物Aを製造するステップ、
(b)細胞溶解物またはヒト由来細胞と、薬物分子とが混合されて含まれた混合物Bを製造するステップ、
(c)前記混合物Aと前記混合物Bを同一な特定温度に変化させるステップ、
(d)前記(c)ステップで得られた特定温度の混合物Aおよび混合物Bに互いに異なる波長の蛍光物質を各々混合して、混合物Aおよび混合物Bの溶液部分に存在するタンパク質に前記互いに異なる波長の蛍光物質を各々標識するステップ、
(e)前記(d)ステップで得られた混合物Aおよび混合物Bを混合して混合物Cを製造するステップ、
(f)前記混合物Cを電気泳動するステップ、および
(g)前記(f)ステップの電気泳動によりゲルに現れるタンパク質スポットに対する蛍光波長を分析して、前記(c)ステップにより熱安定性変化(thermal stability shift)が現れたタンパク質を確認するステップ。
本発明に係るTS−FITGEを用いた標的タンパク質の同定方法を用いる場合、極端な化学構造を有する生理活性天然物、すなわち、合成が難しい複雑な構造の天然物と、化学的修飾のための空間が不足した小さくて単純な天然物にプローブを標識しなくてもその標的タンパク質を容易に探し出すことができ、これは革新的な新薬および治療法の開発に非常に効率的である。また、既存の熱安定性アッセイがFITGE技術と結合されることによって、タンパク質の熱安定性変化による融解温度の変化が微小であるかまたは融解曲線の傾きが激しい場合にも、特定温度における顕著な色変化を通じてタンパク質の熱安定性変化を容易に検出できるという長所がある(図16参照)。
本明細書において、「熱安定性変化(thermal stability shift)」という概念は、薬物分子とその標的タンパク質の結合により、標的タンパク質が(i)熱的安定化(thermally stabilized)されて標的タンパク質本来の融解温度Tmより高い融解温度値を有するようになるか、(ii)熱的不安定化(thermally destabilized)されて標的タンパク質本来の融解温度より低い融解温度値を有するようになることを意味する。
本発明は、一つの観点において、(a)細胞溶解物またはヒト由来細胞が含まれた混合物Aを製造するステップ、(b)細胞溶解物またはヒト由来細胞と、薬物分子とが混合されて含まれた混合物Bを製造するステップ、(c)前記混合物Aと前記混合物Bを同一な特定温度に変化させるステップ、(d)前記(c)ステップで得られた特定温度の混合物Aおよび混合物Bに互いに異なる波長の蛍光物質を各々混合して、混合物Aおよび混合物Bの溶液部分に存在するタンパク質に前記互いに異なる波長の蛍光物質を各々標識するステップ、(e)前記(d)ステップで得られた混合物Aおよび混合物Bを混合して混合物Cを製造するステップ、(f)前記混合物Cを電気泳動するステップ、および(g)前記(f)ステップの電気泳動によりゲルに現れるタンパク質スポットに対する蛍光波長を分析して、前記(c)ステップにより熱安定性変化(thermal stability shift)が現れたタンパク質を確認するステップを含む、薬物分子の標的タンパク質を同定する方法に関するものである。
前記「ヒト由来細胞」は、尿、糞、胎盤、毛髪、爪など人間から排出されたもの、または血液、皮膚、腫瘍、組織など人間から採取されたものから由来する細胞を意味する。
本発明において、前記(c)ステップの特定温度は37〜70℃の範囲にあることを特徴とし、前記方法は前記(g)ステップの各タンパク質スポットに対する融解曲線グラフをプロッティング(plotting)するステップをさらに含むことを特徴とする。
前記融解曲線はS字状曲線(sigmoidal curve)であり、薬物分子とその標的タンパク質が結合してタンパク質が熱的に安定化された場合にはS字状曲線がグラフ上で右側に移動し、熱的に不安定化された場合にはS字状曲線がグラフ上で左側に移動する。本発明の一実施例において、生理活性分子であるホルデニンが標的タンパク質であるヌクレオホスミンと結合してタンパク質の融解温度が増加、すなわち、熱的に安定化されることを確認することができ、他の実施例において、他の生理活性分子であるブリオスタチン1が標的タンパク質であるPKCαと結合してタンパク質の融解温度が減少、すなわち、熱的に不安定化されることを確認することができた。
したがって、本発明において、前記(g)ステップの熱安定性変化は、前記混合物Bに存在するタンパク質が前記薬物分子と結合することによって熱安定化されることを特徴とする。例えば、生理活性分子であるホルデニン(hordenine)が標的タンパク質であるヌクレオホスミン(nucleophosmin、NPM)と結合する場合、ヌクレオホスミンは熱安定化される。また、前記(g)ステップの熱安定性変化は、前記混合物Bに存在するタンパク質が前記薬物分子と結合することによって熱不安定化されることを特徴とする。例えば、生理活性分子であるブリオスタチン1(bryostatin 1)が標的タンパク質であるPKCα(protein kinase Cα)と結合する場合、PKCαは熱不安定化される。
また、前記(b)ステップの薬物分子は好ましくは生理活性分子であり、前記(g)ステップで得られた標的タンパク質の種類は特に限定されるものではないが、膜固定(membrane−anchored)タンパク質であってもよい。
なお、本発明において、前記(d)ステップの蛍光物質は特に制限されるものではないが、Cy2、Cy3、Cy5、fluorescein、Alexafluor488、R6G、HEX、AlexaFluor32、TAMRA、AlexaFluor546、EtBr、SYPRO RubyおよびBlue FAMからなる群より選択されるいずれか一つ以上であってもよく、好ましくは、前記(d)ステップの混合物Aに混合される蛍光物質はCy3、混合物Bに混合される蛍光物質はCy5であることを特徴とする。また、好ましくは、前記Cy3およびCy5に各々下記のアミン−反応性官能基がさらに結合されてもよい。好ましくは、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(N−hydroxysuccinimide(NHS)ester)がさらに結合されてもよい。
<アミン−反応性官能基>
<アミン−反応性官能基>
また、本発明において、前記(g)ステップの蛍光波長(シグナル)分析は、前記混合物Aの溶液部分に存在するタンパク質に標識される蛍光物質から発生する蛍光波長と、前記混合物Bの溶液部分に存在するタンパク質に標識される蛍光物質から発生する蛍光波長の比率を分析することによって行われる。前記比率は、本発明が属した技術分野で一般的に用いられる2Dゲル蛍光測定装置、好ましくは、DeCyder 2Dソフトウェアを用いて計算することができる。
なお、本発明において、前記(f)ステップの電気泳動は、2次元(2D)ゲル電気泳動であることを特徴とする。既存の1次元(1D)電気泳動の場合、1方向に電気泳動して分子量別にタンパク質が分けられる。この場合、標的タンパク質と同一または類似した分子量のタンパク質が生理活性分子と結合するのを区分し難い場合が多い。したがって、2方向に分子量および電荷量に応じてタンパク質が分離されるため、前記のような問題を解決し標的タンパク質を同定することができる。
以下では実施例を通じて本発明をより詳しく説明することにする。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは当業界で通常の知識を有する者にとって明らかなことである。よって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。
熱安定性変化を用いたプロテオーム−ワイド標的の識別
CETSAは指定された抗体を用いて知られた候補タンパク質に適用させることができ、それにより、熱安定性変化を本発明者らが開発したFITGE技術に適用させてプロテオーム−ワイド標的の識別をしようとした。図1に示すように、細胞は、薬物の存在または不存在下で、3分間熱変性が誘導される温度範囲内で加熱された。その次に、細胞をPBS(phosphate−buffered saline)溶液において凍結−融解サイクルを通じて洗浄および溶解させ、遠心分離を通じて変成されたタンパク質を沈殿させた。大部分のタンパク質は薬物の存在または不存在下で同一な変性パターンを示した反面、熱安定性に変化があった標的タンパク質は薬物との結合により溶液部分に存在する量の差を示した。溶液部分の全てのタンパク質はN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを含む二つの互いに異なる染料、すなわち、陰性対照群としてキャリアのみ処理されたグループにはCy3−NHSが、薬物処理されたグループにはCy5−NHSがコンジュゲーションされた。染料がコンジュゲーションされた二つのグループのプロテオームは混合された後に2次元ゲル電気泳動(2−DE)により分離され、各タンパク質スポットのCy3蛍光シグナルに対するCy5蛍光シグナルの比率が自動イメージ分析によって定量された。
CETSAは指定された抗体を用いて知られた候補タンパク質に適用させることができ、それにより、熱安定性変化を本発明者らが開発したFITGE技術に適用させてプロテオーム−ワイド標的の識別をしようとした。図1に示すように、細胞は、薬物の存在または不存在下で、3分間熱変性が誘導される温度範囲内で加熱された。その次に、細胞をPBS(phosphate−buffered saline)溶液において凍結−融解サイクルを通じて洗浄および溶解させ、遠心分離を通じて変成されたタンパク質を沈殿させた。大部分のタンパク質は薬物の存在または不存在下で同一な変性パターンを示した反面、熱安定性に変化があった標的タンパク質は薬物との結合により溶液部分に存在する量の差を示した。溶液部分の全てのタンパク質はN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを含む二つの互いに異なる染料、すなわち、陰性対照群としてキャリアのみ処理されたグループにはCy3−NHSが、薬物処理されたグループにはCy5−NHSがコンジュゲーションされた。染料がコンジュゲーションされた二つのグループのプロテオームは混合された後に2次元ゲル電気泳動(2−DE)により分離され、各タンパク質スポットのCy3蛍光シグナルに対するCy5蛍光シグナルの比率が自動イメージ分析によって定量された。
薬物による熱安定性変化が起こっていないタンパク質は黄色スポットを示した反面(Cy3とCy5の合成シグナル)、薬物結合によって熱的に安定化または不安定化されたタンパク質は各々赤色スポットと緑色スポットを示した。また、加熱されていないプロテオームはCy2−NHSとコンジュゲーションされ、同量のCy2−コンジュゲーションされたプロテオームが各々のゲルサンプルに添加されてインター−ゲル定量の内部標準(internal standard)になるようにした。それにより、各タンパク質スポットの融解曲線が得られた(図1)。
TS−FITGEにおいて熱的変化したスポットは潜在的な標的タンパク質とみなされ、質量分析法による識別のために切除(excision)された。
実施例1:同一な電気泳動的流動性(mobility)のための三つの蛍光染料の準備
2次元ゲルにおいてCy2−、Cy3−、Cy5−コンジュゲーションされたタンパク質の移動性の偏差を最小化するために、電荷と(charge−matched)質量が(mass−matched)一致する染料を準備した。各染料の合成過程は以下のとおりである。
Cy2の合成
2次元ゲルにおいてCy2−、Cy3−、Cy5−コンジュゲーションされたタンパク質の移動性の偏差を最小化するために、電荷と(charge−matched)質量が(mass−matched)一致する染料を準備した。各染料の合成過程は以下のとおりである。
Cy2の合成
試薬および条件:(a)1,2−ジクロロベンゼン(10mL)内でn−プロピルブロミド(0.1mmol、1equiv.)および2−メチルベンゾオキサゾール(0.1mmol、1equiv.)の溶液が24時間110℃で攪拌された。反応混合物はエーテルと共に粉末化され、前記沈殿物は得ようとする生成物3を白色の結晶として得るためにエーテルで洗浄された。(b)酢酸無水物(10mL)内で3の溶液(0.1mmol、1equiv.)およびN,N’−ジフェニルホルムアミジン(0.1mmol、1.2equiv.)の溶液が30分間120℃で攪拌された。溶媒は減少した圧力下で除去され、残余物は得ようとする生成物4を黄色の結晶として得るためにフラッシュカラムクロマトグラフィによりジクロロメタン/メタノールで精製された。(c)1,2−ジクロロベンゼン(10mL)内で4−(ブロモメチル)フェニル酢酸(0.1mmol、1equiv.)溶液および2−メチルベンゾオキサゾール(0.1mmol、1equiv.)の溶液が24時間110℃で攪拌された。反応混合物はエーテルと共に粉末化され、前記沈殿物は得ようとする生成物5を黄色の結晶として得るためにエーテルで洗浄された。(d)エタノール(10mL)内で4(0.1mmol、1equiv.)および5(0.1mmol、1equiv)の溶液にトリエチルアミンを添加し、30分間80℃で攪拌された。溶媒は減少した圧力下で除去され、残余物は得ようとする生成物Cy2を濃い黄色の結晶として得るためにフラッシュカラムクロマトグラフィによりジクロロメタン/メタノールで精製された。
Cy3の合成
Cy3の合成
試薬および条件:(a)ニトロメタン(10mL)内でn−プロピルブロミド(0.1mmol、1equiv.)および2,3,3−トリメチルインドレニン(0.1mmol、1equiv.)の溶液が6時間80℃で攪拌された。反応混合物はエーテルと共に粉末化され、前記沈殿物は得ようとする生成物6をピンク色の結晶として得るためにエーテルで洗浄された。(b)ニトロメタン(10mL)内で5−ブロモ吉草酸(0.1mmol、1equiv.)および2,3,3−トリメチルインドレニン(0.1mmol、1equiv.)の溶液が6時間80℃で攪拌された。反応混合物はエーテルと共に粉末化され、前記沈殿物は得ようとする生成物7を紫色の結晶として得るためにエーテルで洗浄された。(c)酢酸無水物(10mL)内で7(0.1mmol、1equiv.)およびN,N’−ジフェニルホルムアミジン(0.12mmol、1.2equiv.)の溶液が30分間120℃で攪拌された。反応混合物は室温で冷却された。その後、ピリジン(10mL)内に6の溶液が添加された。混合物は12時間室温で攪拌された。溶液はクロロホルム内に濃縮および溶解され、水および1N HCl水溶液で洗浄された。有機層はその後MgSO4と共に乾燥され、Cy3を濃いピンク色の結晶として得るためにフラッシュカラムクロマトグラフィによりジクロロメタン/メタノールで濾過、蒸発、および精製された。
Cy5の合成
Cy5の合成
試薬および条件:(a)ヨードメタン、ニトロメタン、r.t.,12h。(b)前記Cy3の合成過程中の(b)と同一。(c)酢酸無水物(10mL)内で7(0.1mmol、1equiv.)およびマロンジアルデヒドビス(フェニルイミン)モノヒドロクロリド(0.12mmol、1.2equiv.)の溶液が30分間120℃で攪拌された。反応混合物は室温で冷却された。その後、ピリジン(10mL)内に8の溶液が添加された。混合物は12時間室温で攪拌された。溶液はクロロホルム内に濃縮および溶解され、水および1N HCl水溶液で洗浄された。有機層はその後MgSO4と共に乾燥され、Cy5を濃い青色の結晶として得るためにフラッシュカラムクロマトグラフィによりジクロロメタン/メタノールで濾過、蒸発、および精製された。
Cy2、Cy3、Cy5−NHSエステルの合成
Cy2、Cy3、Cy5−NHSエステルの合成
試薬および条件:(a)DMF(5mL)内でCy2、Cy3、またはCy5(0.1mmol、1.0equiv.)の溶液にピリジン(0.2mL)および炭酸N,N−ジスクシンイミジル(DSC、0.15mmol、1.5equiv.)が添加された。混合物は2時間60℃で攪拌された。前記溶媒は減少した圧力下で除去され、残余物は各々得ようとする生成物Cy2−NHSエステル、Cy3−NHSエステルまたはCy5−NHSエステルを得るためにフラッシュカラムクロマトグラフィによりジクロロメタン/メタノールで精製された。
前記全ての染料は+1の電荷を帯び、互いに2Daだけの差のみ示した(図2)。Cy2、Cy3、Cy5とコンジュゲーションされたタンパク質が同じ移動性を有することによって、37℃ゲル内の大部分のタンパク質スポットが融合(merging)後に白色を示した(図3)。さらに高い温度において、熱的に不安定なタンパク質(Cy3−およびCy5−コンジュゲーションされたタンパク質)は変成するかまたは無くなった。したがって、このスポットは、加熱されていないCy2染料と結合した内部標準(internal standard)により青色を示した(図3b)。
実施例2:メトトレキサート(Methotrexate)に対する概念実証(proof−of−concept)標的識別研究
メトトレキサートは、主標的タンパク質であるジヒドロ葉酸還元酵素(dihydrofolate reductase、DHFR)が16℃の顕著に大きいTm移動があると知られているため(Martinez Molina,D.et al.,Science.341,84−87(2013))、概念実証研究のために選択された。様々な変性温度の2次元ゲルシリーズ中、37℃ゲルのほぼ全てのタンパク質スポットが黄色を示したが、53℃ゲルにおいては明らかな赤色スポットが発見された(図4aと図5)。定量分析のために、53℃ゲルにあった全てのタンパク質スポットにおいてCy3に対するCy5シグナルの比率を計算してボックスプロット(box plot)に示した(図4b)。
メトトレキサートは、主標的タンパク質であるジヒドロ葉酸還元酵素(dihydrofolate reductase、DHFR)が16℃の顕著に大きいTm移動があると知られているため(Martinez Molina,D.et al.,Science.341,84−87(2013))、概念実証研究のために選択された。様々な変性温度の2次元ゲルシリーズ中、37℃ゲルのほぼ全てのタンパク質スポットが黄色を示したが、53℃ゲルにおいては明らかな赤色スポットが発見された(図4aと図5)。定量分析のために、53℃ゲルにあった全てのタンパク質スポットにおいてCy3に対するCy5シグナルの比率を計算してボックスプロット(box plot)に示した(図4b)。
予想したとおりに、図4aに示された赤色スポットは最も高い比率を示し(図4bに矢印で表示)、このスポットには顕著に異なるCy5およびCy3蛍光シグナルがあることを提示した。このスポットの融解曲線はCy2シグナルを内部標準として用いて一定温度の範囲内で描かれ、S字状曲線の移動を示し、メトトレキサートの潜在的な標的タンパク質のTm増加を示した(図4c)。
最後に、このスポットを切除してLC−MS/MSを通じて分析した結果、DHFRが標的タンパク質であることを知ることができた(表1)。単クローンDHFR抗体を用いたウェスタンブロット分析を通じてTS−FITGEによって出たパターンと類似した熱的変化パターンであることを知ることができた。
また、チミジル酸合成酵素(メトトレキサートの他の標的タンパク質)も48℃ゲルにおいて明らかな赤色を示す熱−安定スポットに確認され、このスポットにおいてチミジル酸合成酵素の量的蛍光差がDHFRスポットに先立ち最も大きく現れた(図6および表1)。
それにより、熱安定性変化に基づいたTS−FITGEが実現可能であり、生きている細胞内で非偏向(unbiased)標的の識別のための効率的な方法であることを確認した。
質量分析法による2次元電気泳動スポットのタンパク質の識別。100より大きいMascotスコアを有したタンパク質は再現可能な結果を示したのでリストされた。
実施例3:ブリオスタチン1の膜固定(membrane−anchored)標的タンパク質の識別
TS−FITGEの有用性を確認するために、複雑な天然物であるブリオスタチン1の標的タンパク質を識別した。ブリオスタチンは、海洋生物であるフサコケムシ(Bugula neritina)から初めて抽出され、強い坑癌活性、相乗的な化学療法(synergistic chemotherapeutic)活性、記憶力の向上活性を示した(Ruanet al.,Curr.Med.Chem.19,2652−2664(2012))。1982年、ブリオスタチン1の構造が正確に明らかになった後、2011年58段階の総合成が記録された(Keck et al.,J.Am.Chem.Soc.133,744−747(2011))。したがって、ブリオスタチン1は、他の標的識別方法のために好適に機能するプローブを作り難い複雑な天然物の例である(図7a)。また、ブリオスタチンは、プロテインキナーゼC(Protein kinase Cs、PKCs)を調節して原形質膜に移動させて固定させることが知られており、細胞シグナル過程に重要な役割をする基質タンパク質(substrate protein)をリン酸化する(Sun et al.,CNS Drug Rev.12,1−8(2006))。
実施例3:ブリオスタチン1の膜固定(membrane−anchored)標的タンパク質の識別
TS−FITGEの有用性を確認するために、複雑な天然物であるブリオスタチン1の標的タンパク質を識別した。ブリオスタチンは、海洋生物であるフサコケムシ(Bugula neritina)から初めて抽出され、強い坑癌活性、相乗的な化学療法(synergistic chemotherapeutic)活性、記憶力の向上活性を示した(Ruanet al.,Curr.Med.Chem.19,2652−2664(2012))。1982年、ブリオスタチン1の構造が正確に明らかになった後、2011年58段階の総合成が記録された(Keck et al.,J.Am.Chem.Soc.133,744−747(2011))。したがって、ブリオスタチン1は、他の標的識別方法のために好適に機能するプローブを作り難い複雑な天然物の例である(図7a)。また、ブリオスタチンは、プロテインキナーゼC(Protein kinase Cs、PKCs)を調節して原形質膜に移動させて固定させることが知られており、細胞シグナル過程に重要な役割をする基質タンパク質(substrate protein)をリン酸化する(Sun et al.,CNS Drug Rev.12,1−8(2006))。
細胞膜に固定されたタンパク質が本発明のTS−FITGE方法に好適であるかを研究するために、先ず、ウェスタンブロットを通じてPKCを可溶化することにおける界面活性剤の効果を確認し、種々の界面活性剤のうち(図8a)非イオン性、非変性界面活性剤である0.4%(v/v)のIGEPAL CA−630を含むリン酸緩衝生理食塩水における溶解(lysis)条件を最適化した。図7bに示すように、PKCαはブリオスタチン処理前に主に溶液部分に存在したが、弱い界面活性剤が含まれていない溶解バッファにおいてはブリオスタチン処理後に不溶性部分に移動した。しかし、0.4%のIGEPAL CA−630が存在する場合、ブリオスタチン処理後にもPKCαは溶液部分に存在した。PKCδの位置はブリオスタチンに影響を受けなかったが、両方とも可溶化のために非イオン性界面活性剤が必ず必要であった(図7b)。他のPKCアイソザイムの可溶化は、ブリオスタチンと界面活性剤の影響を受けなかった(図8b)。したがって、0.4%のIGEPAL CA−630は、PKCを全体的に可溶化し、溶液部分の熱安定性変化を検知するために必要であることが分かる。
その次に、最適化された溶解条件をもって細胞プロテオームの熱変性パターンを観察するために、ブリオスタチンに対するTS−FITGE実験を行った。興味深くに、幾つかのスポットが、加熱されたサンプルだけでなく加熱されていないサンプル(37℃)においても赤色または緑色を示し、このスポットの色差は熱的変化によるものではないことを示す(図7c、タンパク質aおよびb;図9、タンパク質c、d、e、f、g、h、Iおよびj)。また、大部分の赤色と緑色スポットが水平に相互の横に対の配列に現れた。この現象は、2次元電気泳動から観察される典型的な翻訳後修飾(post−translational modification、PTM)パターンである。したがって、これらのスポットは、熱的変化した標的タンパク質でない、37℃において薬物の結合後に翻訳後修飾になったダウンストリーム基質にみなした。PTMによって発生した赤色と緑色タンパク質スポットは、PTMが起こる時間が充分でないように薬物処理の時間を減らすことによって減少させることができる。予想したとおりに、処理時間が減ることにつれてeを含む赤色スポットは無くなったが、緑色スポットcとdは37℃において黄色系列になった(図10aおよび10b)。タンパク質スポットc、d、eがPKCαにより識別された後(表1)、PKCα抗体を用いてウェスタンブロットを行った。37℃におけるPKCαの総量は1次元ゲルと同一であったが、増加したブリオスタチン1の処理時間を適用した2次元ゲルにおいてはPKCαが水平の赤色と緑色スポットに分離された(図10cおよび10d)。この結果は、全て37℃において赤色と緑色スポットがPTMによって発生するという解釈と一貫した。
20分間のブリオスタチン1の処理後、加熱されたサンプルにおいては明らかな緑色スポットが観察されたが、加熱されていないサンプルにおいては観察されておらず、これは標的結合に応じた熱不安定化を示す(図7c、タンパク質cおよびd;図11)。このスポットは47℃ゲルにおいて最も低いCy3に対するCy5シグナルの比率を示し、これは顕著な熱不安定化が発生したことを示す(図7d)。加熱されていないゲルにおいてもスポットが赤色を示し、よって、シグナル差が熱安定性変化によって発生したものではなくPTMによって発生したものであるため、最も高いCy5/Cy3シグナル比率を示したスポットは除外された。スポットcとdの両方とも温度依存的な熱不安定化パターンを示し、タンパク質dの融解曲線は図7eに示す。質量分析を通じて、スポットcとdのタンパク質は全てブリオスタチン1の標的であるPKCαであることが示された(表1)。一般に、標的タンパク質は、薬物結合によって熱安定化になると知られている(Niesen et al.,Nat.Protoc.2,2212−2221(2007))。ブリオスタチン1によるPKCαの熱不安定化を確認するためにCETSAを実行し、これはPKCαの熱不安定化を確実に示す(図7f)。また、48℃における等温容量−反応(isothermal dose−response)曲線はPKCαの容量依存的な熱不安定化を示し(図7g)、前述した内容を裏づけした。ブリオスタチン1は他のアイソザイムとも結合することが知られているため(Kazanietz et al.,Mol.Pharmacol.46,374−379(1994))、他のアイソザイムにもCETSAを実行した。PKCβI、PKCδとPKCεは特別な熱安定性変化を示さなかったが、PKCβIIとPKCθは熱不安定化を示し、予想されたPKCγ、PKCμ、PKCζバンドは発見できなかった(図8bおよび図12)。
実施例4:TS−FITGEを用いたホルデニンの新規な標的タンパク質の識別
最後に、単純な構造になっていて化学的変化が不可能な天然生理活性低分子物質にTS−FITGE方法を適用した。ホルデニン(N,N−dimethyltyramine、図13a)は幾つかの植物、特に芽が出ている麦から発見できるアルカロイドである(Smith et al.,Phytochemistry.16,9−18(1977))。ホルデニンは、ネズミにおけるガストリン分泌の刺激、精管からノルエピネフリンの吸収阻害や、馬の血管に注射された時の呼吸率と心拍率の増加など幾つかの生理活性を有している(Frank et al.,Equine Vet.J.22,437−441(1991))。
最後に、単純な構造になっていて化学的変化が不可能な天然生理活性低分子物質にTS−FITGE方法を適用した。ホルデニン(N,N−dimethyltyramine、図13a)は幾つかの植物、特に芽が出ている麦から発見できるアルカロイドである(Smith et al.,Phytochemistry.16,9−18(1977))。ホルデニンは、ネズミにおけるガストリン分泌の刺激、精管からノルエピネフリンの吸収阻害や、馬の血管に注射された時の呼吸率と心拍率の増加など幾つかの生理活性を有している(Frank et al.,Equine Vet.J.22,437−441(1991))。
インビトロタンパク質翻訳に影響を与える化合物を確認するために、小型分子ライブラリーをスクリーニングした結果、ホルデニンがルシフェラーゼレポーター遺伝子の翻訳を増進させることが明らかになった(図13b)。しかし、ホルデニンの生物学的活性とそのタンパク質翻訳に連関した結合パートナーを分析した以前の研究結果は探すことができなかった。
ホルデニンの標的識別のために、HEK293T細胞を用いてTS−FITGEを実行し、54℃ゲルにおいて最も高いCy5/Cy3比率を示した(図13d)赤い系列のスポット(図13cおよび図14)を検出した。このスポットはS字状融解曲線を描くために一定の温度範囲で定量され(図13e)、そのスポットは標的候補リストを得るためのLC−MS/MS分析のために切除された(表1)。結合パートナーを決定するために、タンパク質翻訳と連関しているヌクレオホスミン(NPM)、伸長因子1−delta(EEF1D)、タンパク質SET(SET)、40Sリボソームタンパク質SA(RPSA)に対してCETSAを実行した(図13fおよび図15a)。
NPMは他の候補タンパク質とは異なり、β−チューブリンとGAPDHに比べて顕著な熱安定化を示した。ホルデニンによるNPMの容量依存的な熱安定化は53℃、7.6mMのEC50値において等温容量反応グラフによって確認された(図15b)。ホルデニンのNPMとの直接的な結合を確認するために表面プラズモン共鳴分析を実行し、これは13.6mMのKD値を有する一般的な1対1結合パターンの濃度依存的な反応を明らかに示した(図13g)。
インビトロタンパク質翻訳の上方調節(upregulation)がホルデニンによるNPMの機能的調節(modulation)によって発生したことであるか調べるために、NPMをインビトロ翻訳システムから枯渇させることによって機能喪失研究(loss−of−function study)を通じて機能的検証(functional validation)を行った。要約すれば、アガロースビーズにあるタンパク質Gに結合されたNPM抗体は、NPMを除去するためにインビトロ翻訳システムと共に培養された。ウェスタンブロットの結果から観察されたことのように、アガロースビーズを除去した後には、溶液に残っていたNPMが減少した(図13h)。NPM減少後、ルシフェラーゼ遺伝子翻訳に対するホルデニン本来の上方調節効果は72.7%が減少し(図13i)、これはホルデニンが直接にNPMを調節し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のインビトロタンパク質翻訳を上方調節したことを検証した。
実施例で用いられた方法
化学物質および試薬:メトトレキサート(methotrexate)、ブリオスタチン1(bryostatin 1)、ホルデニン(hordenine)、および分枝のオクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール(IGEPAL CA−630)を含む全ての化学物質をSigma−Aldrichから購入した。培地、牛胎児血清(FBS)、および抗生剤−抗真菌剤溶液を含む細胞培養試薬はGibco[Life technologies]から購入した。DPBS(Dulbecco’s phosphate−buffered saline)はWelgeneから購入し、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(EDTA−free)はRocheから購入した。
化学物質および試薬:メトトレキサート(methotrexate)、ブリオスタチン1(bryostatin 1)、ホルデニン(hordenine)、および分枝のオクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール(IGEPAL CA−630)を含む全ての化学物質をSigma−Aldrichから購入した。培地、牛胎児血清(FBS)、および抗生剤−抗真菌剤溶液を含む細胞培養試薬はGibco[Life technologies]から購入した。DPBS(Dulbecco’s phosphate−buffered saline)はWelgeneから購入し、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(EDTA−free)はRocheから購入した。
細胞培養:HEK293TおよびJurkatクローンE6−1細胞を韓国細胞株銀行から購入した。HEK293T細胞は、10%(v/v)FBSおよび1%(v/v)抗生剤−抗真菌剤溶液が補充されたDMEMで培養された。Jurkat細胞は、10%(v/v)FBSおよび1%(v/v)抗生剤−抗真菌剤溶液が補充されたRPMI 1640培地で培養された。細胞は、湿度がある5% CO2インキュベータで37℃に維持された。
細胞抽出液の準備:Jurkat細胞はブリオスタチン1のために用いられ、HEK293T細胞はメトトレキサートおよびホルデニンをために用いられた。HEK293T細胞は、トリプシン/EDTA溶液により得られた後に化合物の処理前に円すい管内に再分散(resuspended)された。メトトレキサートは10μMの濃度で3時間HEK293T細胞と共に培養され、ホルデニンは20μMの濃度で3時間HEK293T細胞と共に培養された。前記化合物の処理後に、細胞は部分標本化(aliquoted)され、3分間特定温度の範囲内の各温度に加熱され、再び3分間25℃で冷却された。加熱された細胞を得た後、PBSで洗浄し、溶解バッファ(プロテアーゼ阻害剤カクテルが補充されたPBS)に再分散された。細胞分散液は、細胞溶解のために液体窒素と共に3回凍結−融解させた。溶液部分は20,000gとして20分間4℃で遠心分離させることで細胞溶解物から分離された。等温容量−反応(isothermal dose−response、ITDR)分析のための手続きは、細胞が様々な濃度の化合物で処理され固定された温度で加熱されることを除いては、前述した手続きと同様に実行された。
ウェスタンブロット:溶液部分は、5×Laemmliバッファと混合された後、95℃で5分間加熱された。タンパク質は、SDS−PAGEによって分離され、PVDFメンブレインに移された。メンブレインは、2% BSAが含まれたTBST(tris−buffered saline with Tween−20)において1時間4℃の温度で、1次抗体(抗−DHFR[ab133546、abcam]、anti−TYMS[3766、Cell signaling]、抗−PKCα[2056、Cell signaling]、抗−PKCβI[ab195039、abcam]、抗−PKCβII[ab32026、abcam]、抗−PKCγ[402 ab131222、abcam]、抗−PKCδ[9616、Cell signaling]、抗−PKCε[ab124806、abcam]、抗−PKCμ[2052、Cell signaling]、抗−PKCθ[ab110728、abcam]、抗−PKCζ[9368、Cell signaling]、抗−NPM[ab52644、abcam]、抗−RPSA[ab133645、abcam]、抗−SET[ab176567、abcam]、抗−EEF1D[ab88868、abcam]、抗−GAPDH[2118、Cell signaling]、and抗−β−tubulin[2146、Cell signaling])と共に一晩中培養された。その次に、メンブレインは、TBSTで洗浄され、2次抗体(抗−ウサギIgG、HRP−linked[7074、Cell signaling])と共に常温で一時間培養された。前記メンブレインは、アマシャム(Amersham)ECLプライムウェスタンブロッティング検出試薬[GE Healthcare]により強化(developed)され、ChemiDoc[Bio−Rad]により検出された。CETSA曲線の場合、薬物処理されたグループおよび対照群グループにおいて、各々37℃における相対的なバンド強度が計算された。ITDR曲線の場合、DMSOグループとの相対的なバンド強度が計算された。データ分析およびS字状曲線フィッティング(sigmoidal curve fitting)がGraphPad Prism 5により実行された。
2Dゲル電気泳動:細胞抽出液の溶液部分のタンパク質濃度がBio−Radタンパク質アッセイによって定量された。アセトンが50μgのタンパク質に添加され、−20℃で1時間培養された。前記混合物を20,000gをもって20分間4℃で遠心分離させた。上層液は捨て、ペレット(pellet)は冷たいアセトンで2回洗浄した。残余ペレットは、10μlのコンジュゲーションバッファ(30mM Tris−HCl(pH8.6)、2Mチオ尿素、7M尿素、4% CHAPS(w/v))に再分散させるために超音波による分解(sonication)をした。1μlの0.4mM Cy3−NHSまたはCy5−NHSは、再分散されたタンパク質と混合され、4℃で50分間培養された。内部標準のための320μgの加熱されていないサンプルを沈殿させ、64μlのコンジュゲーションバッファに再分散させ、6.4μlのCy2−NHSと混合した。コンジュゲーション後、冷たいアセトンを添加し、−20℃で1時間培養した。前記混合物を20,000gをもって20分間4℃で遠心分離させた。上層液は捨て、ペレットは冷たいアセトンで2回洗浄した。加熱されたサンプルは、50μlの再水和バッファ(7M尿素、2Mチオ尿素、2% CHAPS(w/v)、40mM DTT、および1% IPGバッファ)および標準サンプル320μlに再分散させるために超音波による分解をした。50μlの化合物処理されたグループ(Cy5とコンジュゲーションされる)およびDMSO処理されたグループ(Cy3とコンジュゲーションされる)を混合した。その次に、50μlの加熱されていないサンプル(Cy2とコンジュゲーションされる)を内部標準として添加した。総150μg(Cy2、Cy3、およびCy5各々50μgずつ)のタンパク質が10時間再水和された24−cm Immmobiline Drystrip gel[GE Healthcare]にロードされ、Ettan IPGphor 3[GE Healthcare]によって等電点電気泳動が実行された。ストリップゲル内のタンパク質はEttan DALTsix電気泳動システム[GE Healthcare]によって分離され、ゲルはTyphoon Trio[GE Healthcare]によってスキャンされた。
ゲルイメージ分析:Cy2、Cy3およびCy5からの蛍光シグナルはDeCyder 2Dソフトウェアバージョン7.2[GE Healthcare]によって定量された。Cy3に対するCy5のシグナル比率値は正規化され、前記比率のログ値のmodal peakが0になるように設定された。データは箱ひげ図(box−and−whisker diagram)に示し、異常点(outliers)は熱的に移動したスポットにみなされた。インター−ゲル分析の内部標準として用いられたCy2シグナルは全てのゲルをひっくるめてスポットの位置が一致し、Cy2に対するCy3およびCy5シグナルの相対的な量は融解曲線をプロッティングするために計算された。データ分析およびS字状曲線フィッティングが、GraphPad Prism 5によって実行された。
質量分析法:銀−染色されたゲルから得られたタンパク質スポットは切除されて脱色された後、イン−ゲルトリプシン消化(digestion)された。抽出物は、SpeedVacにより蒸発された後、0.1%ギ酸を含有する10%アセトニトリルに溶解された。その結果物として得られたタンパク質は、トラップカラム(内部直径180μm×20mm、Symmetry C18)カートリッジによって脱塩され、nanoAcquity UPLC−ESI−QTOF/MS[SYNAPT G2−Si HDMS、Waters]を用いる統合エレクトロスプレーイオン化(integrated electrospray ionization)PicoTip(±10μm内部直径、New Objective)と共に、C18逆相75μm内部直径×200mm分析カラム(1.7μm粒子大きさ、BEH130 C18、Waters)において分離された。得られたデータは、Protein Lynx Global Serverを介して.pklファイルに変換され、MASCOT検索を利用してSwissProtデータベースをクエリー(query)するのに用いられた。
インビトロ(in vitro)タンパク質翻訳:TNTクイック結合型転写/翻訳システム[Promega]が、インビトロ翻訳のために用いられた。TNT Quick Master MixとT7ルシフェラーゼコントロールDNAが製造者のプロトコルに従って混合され、化合物と共に30℃で1時間培養された。ルシフェラーゼアッセイ試薬[Promega]の添加後に、タンパク質翻訳に対する化合物の効果を測定するためにSynergy HT[BioTek]を用いて対照ルシフェラーゼ商品の発光(luminescence)を分析した。
機能的検証(functional validation)のためのヌクレオホスミンの枯渇(depletion):プロテインGセファロースビーズ[Sigma]をPBSで洗浄し、抗−NPM抗体と共に4℃で2時間培養された。結合されていない抗体は洗い出され、抗−NPM抗体と結合されたプロテインGビーズはTNT Quick Master Mixと混合された後に4℃で2時間培養された。遠心分離によって前記ビーズは除去され、上層液はT7ルシフェラーゼコントロールDNAおよび10μMのホルデニンと共に30℃で1時間培養された。ルシフェラーゼアッセイ試薬を添加した後に発光を分析した。
表面プラズモン共鳴分析(Surface plasmon resonance assay):結合力学がBIAcore T100装置[GE Healthcare]によってモニターされた。ヒトヌクレオホスミン全長タンパク質[ab126664、abcam]のバッファコンディションが10K Amiconウルトラ遠心濾過器[Millipore]によってPBSに交換された。CM5チップ表面のカルボキシル基は、NHSとEDCの混合物がフローセル(flow cells)1および2の全てに注入されることによって活性化された。アセテートバッファ(pH4.0)に含まれたヌクレオホスミンタンパク質(36μg/mL)は、フローセル2に550秒間5μl/minの流量で注入された。エタノールアミン−HClは、フローセル1および2の全てに消光(quenching)のために注入された。最終固定レベルは二つの独立した実験において各々9,400 RUおよび12,800 RUに達した。結合研究のために、様々な濃度(1.56μM〜37.5μM)のホルデニンが60秒間30μl/minの流量で注入され、ランニングバッファ(0.005% P20および2% DMSOが補充されたPBS)の400秒間の注入によって(結合が)分離された。データはBIAcore T100 Evaluation software[GE Healthcare]によって分析され、センサグラムは1:1結合モデルに合わせた。
以上、本発明に係る内容の特定部分について詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有した者であれば、このような具体的な記述は単に好ましい実施態様に過ぎず、それによって本発明の範囲が制限されるものではないことは明らかなことである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。
Claims (14)
- 次のステップを含む、薬物分子の標的タンパク質を同定する方法:
(a)細胞溶解物またはヒト由来細胞が含まれた混合物Aを製造するステップ、
(b)細胞溶解物またはヒト由来細胞と、薬物分子とが混合されて含まれた混合物Bを製造するステップ、
(c)前記混合物Aと前記混合物Bを同一な特定温度に変化させるステップ、
(d)前記(c)ステップで得られた特定温度の混合物Aおよび混合物Bに互いに異なる波長の蛍光物質を各々混合して、混合物Aおよび混合物Bの溶液部分に存在するタンパク質に前記互いに異なる波長の蛍光物質を各々標識するステップ、
(e)前記(d)ステップで得られた混合物Aおよび混合物Bを混合して混合物Cを製造するステップ、
(f)前記混合物Cを電気泳動するステップ、および
(g)前記(f)ステップの電気泳動によりゲルに現れるタンパク質スポットに対する蛍光波長を分析して、前記(c)ステップにより熱安定性変化(thermal stability shift)が現れたタンパク質を確認するステップ。 - 前記(c)ステップの特定温度は37〜70℃の範囲にあることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(g)ステップの各タンパク質スポットに対する融解曲線グラフをプロッティング(plotting)するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(b)ステップの薬物分子は生理活性分子であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(g)ステップで得られたタンパク質は膜固定(membrane−anchored)タンパク質であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(g)ステップの熱安定性変化は、前記混合物Bに存在するタンパク質が前記薬物分子と結合することによって熱安定化されることであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質はヌクレオホスミン(nucleophosmin、NPM)であり、前記薬物分子は生理活性分子であるホルデニン(hordenine)であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 前記(g)ステップの熱安定性変化は、前記混合物Bに存在するタンパク質が前記薬物分子と結合することによって熱不安定化されることであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質はPKCα(protein kinase Cα)であり、前記薬物分子は生理活性分子であるブリオスタチン1(bryostatin 1)であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記(d)ステップの蛍光物質は、Cy2、Cy3、Cy5、fluorescein、Alexafluor488、R6G、HEX、AlexaFluor32、TAMRA、AlexaFluor546、EtBr、SYPRO RubyおよびBlue FAMからなる群より選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(d)ステップの混合物Aに混合される蛍光物質はCy3であり、混合物Bに混合される蛍光物質はCy5であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記Cy3およびCy5はアミン−反応性官能基がさらに結合されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 前記(g)ステップの蛍光波長分析は、前記混合物Aの溶液部分に存在するタンパク質に標識される蛍光物質から発生する蛍光波長と、前記混合物Bの溶液部分に存在するタンパク質に標識される蛍光物質から発生する蛍光波長の比率を分析することによって行われることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(f)ステップの電気泳動は2次元ゲル電気泳動であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
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