CN110200959A - 一种黄酮类化合物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黄酮类化合物的应用，所述黄酮类化合物3,3',4',5,7‑五羟基黄酮二水合物，通过ELISA和蛋白质荧光淬灭实验证明该化合物能有效抑制PD‑1/PD‑L1蛋白相互作用，并且对PD‑L1蛋白有较强的亲和作用。细胞克隆数形成和ELISA检测IL‑2分泌实验证明该化合物能有效增强T淋巴Jurkat细胞对MDA‑MB‑231和NCI‑H460肿瘤细胞的肿瘤杀伤活性，以及IL‑2的表达水平，进而逆转T细胞免疫抑制。本发明的研究成果为靶向于PD‑1/PD‑L1免疫检验点的肿瘤免疫治疗提供了一种药物。

Description

一种黄酮类化合物的应用

技术领域

本发明涉及一种小分子化合物的应用，尤其是一种黄酮类化合物的应用。

背景技术

T细胞是重要的免疫细胞，在抗肿瘤免疫治疗过程中发挥着重要功能。T细胞的活化是一个高度调节的过程，除了需要T细胞受体(TCR)传导的第一信号(TCR与MHC-抗原肽结合)外，还需要协同共信号分子(共刺激信号和共抑制信号)提供的第二信号来促进或者抑制T细胞反应，其中第二信号是引起T细胞抗原特异性应答的关键。共信号分子受体蛋白包括CD28、PD-1、CTLA-4、ICOS、BTLA、LAG3、TIM3和OX40等分子，其中CD28、OX40和ICOS是用来递呈共刺激信号以激活T细胞免疫反应，而PD-1、CTLA-4、BTLA、LAG3和TIM3受体蛋白是用来递呈共抑制信号进而抑制T细胞免疫反应。

PD-1蛋白是一种独特的抑制性受体，在初始抗原介导T细胞活化期间通过TCR表达于T细胞表面，其调节信号在肿瘤免疫逃逸、炎症、自身免疫性疾病等中具有重要作用。PD-1(CD279)有两个配体：PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，当PD-1与配体结合时能够抑制T淋巴细胞的增殖和减少相关细胞因子的分泌，如IL-2和γ-IFN，使机体免疫应答受到抑制，从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。

PD-1/PD-L1免疫检验点抑制剂可以阻断PD-1/PD-L1信号通路介导的免疫抑制信号。目前靶向于PD-1/PD-L1免疫检验点的抑制剂主要是抗PD-1和抗PD-L1单克隆抗体，已经上市的抗体类药物有6种，分别是默沙东的Keytruda、百时美施贵宝的Opdivo(Nivolumab)、罗氏的Tecentrip(Atezolizumab)、辉瑞和德国默克的Bacencio(Acelumab)、英国和瑞士阿斯利康的Imfinzi(Durvalumab)、赛诺菲和再生元的Libtayo(Cemiplimab-rwlc)。然而，这些药物具有缺乏口服利用度、有限的组织和肿瘤渗透性、价格昂贵等因素限制。小分子化合物具有高稳定性、易穿透性、易保存性、低成本性和方便口服的特性，具有广阔的发展应用空间。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种黄酮类化合物的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种从植物中获取的具有抗氧化活性的黄酮类化合物，3,3',4',5,7-五羟基黄酮二水合物(别名：二水槲皮素或二水栎精)，具有式(I)所示结构：

上述化合物是从selleck公司购买，其纯度为99.06％。

上述黄酮类化合物作为PD-1/PD-L1蛋白相互作用的抑制剂方面的应用。

所述黄酮类化合物对PD-L1蛋白有较强的亲和作用。

上述黄酮类化合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。

优选的，上述黄酮类化合物的应用，所述抗肿瘤药物为以PD-1/PD-L1为靶点的肿瘤免疫治疗药物。

所述黄酮类化合物可明显增加Jurkat细胞对MDA-MB-231和NCI-H460细胞的肿瘤杀伤活性。

所述黄酮类化合物增加Jurkat细胞IL-2的表达水平。

所述黄酮类化合物在作为抑制PD-1/PD-L1蛋白相互作用、PD-1/PD-L1免疫抑制信号并逆转T细胞免疫抑制的应用。

本发明的有益效果是：

上述黄酮类化合物，能够有效抑制PD-1/PD-L1蛋白间的相互作用。蛋白质荧光淬灭实验证明该小分子化合物与PD-L1蛋白有较强的亲和活性，单克隆形成共培养实验和ELISA检测IL-2分泌实验证明该化合物能够增强Jurkat细胞对MDA-MB-231和NCI-H460细胞的肿瘤杀伤活性，并上调Jurkat细胞IL-2的表达。这些结果表明，该小分子化合物可以抑制PD-1/PD-L1蛋白相互作用和PD-1/PD-L1信号传递，逆转T细胞免疫抑制，可以作为靶向于PD-1/PD-L1免疫检验点的肿瘤免疫治疗的药物。

附图说明

图1为本发明利用ELISA方法从天然化合物库筛选抑制PD-1/PD-L1蛋白相互作用的小分子化合物的结果，化合物I(编号12)即为本发明所述小分子化合物。图1a是小分子化合物浓度为5μM时对His-Trx-PD-1和GST-PD-L1相互作用的抑制结果汇总，图1b是有抑制活性的14种小分子化合物对His-Trx-PD-1和GST-PD-L1相互作用的抑制效果。

图2为化合物I不同浓度时对His-Trx-PD-1和GST-PD-L1相互作用的抑制效果。

图3为本发明利用ELISA方法验证化合物I对HEK293细胞表达的PD-1-Fc-His和PD-L1-His-Biotin蛋白相互作用的抑制效果。图3a是化合物I浓度为5μM时对PD-1-Fc-His和PD-L1-His-Biotin相互作用的抑制效果，图3b是化合物I不同浓度时对PD-1-Fc-His和PD-L1-His-Biotin相互作用的抑制效果。

图4为本发明利用蛋白质荧光淬灭方法检测化合物I对His-HA-PD-L1蛋白的亲和活性。图4a是缓冲液(DMSO含量为0.5％)对His-HA-PD-L1蛋白质荧光淬灭影响，图4b是化合物I对His-HA-PD-L1蛋白质荧光淬灭影响。

图5为本发明利用蛋白质荧光淬灭方法检测化合物I对His-HA-PD-1蛋白的亲和活性。图5a是缓冲液(DMSO含量为0.5％)对His-HA-PD-1蛋白质荧光淬灭影响，图5b是化合物I对His-HA-PD-1蛋白质荧光淬灭影响。

图6为本发明利用细胞单克隆形成实验检测Jurkat细胞和MDA-MB-231细胞共培养体系中化合物I对Jurkat细胞杀伤活性的影响。

图7为本发明利用细胞单克隆形成实验检测Jurkat细胞和NCI-H460细胞共培养体系中化合物I对Jurkat细胞杀伤活性的影响。

图8为本发明利用ELISA方法检测共培养体系中化合物I对Jurkat细胞IL-2的表达情况。图8a是Jurkat细胞与MDA-MB-231细胞共培养IL-2表达，图8b是Jurkat细胞与NCI-H460细胞共培养IL-2表达。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明，但实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1

(1)PD-1/PD-L1蛋白相互作用的抑制剂筛选

①用碳酸盐包被缓冲液稀释大肠杆菌表达的His-Trx-PD-1融合蛋白至1μg/mL，100μL每孔加入96孔酶标板中，置于4℃过夜。用1×PBST洗涤3次，5％脱脂奶粉封闭，每孔300μL，37℃封闭2hrs。

②用1×PBST洗涤3次。同时1×PBS分别稀释GST和GST-PD-L1蛋白至2μg/mL，同时加入0.2μL的DMSO或小分子化合物(终浓度5μM)，混匀，100μL每孔加入96孔板中，37℃结合2hrs。1×PBST洗涤3次，每孔加入100μL 1×PBS稀释的GST抗体(兔多克隆抗体)，37℃结合2hrs。1×PBST洗涤3次，每孔加入100μL 1×PBS稀释的HRP标记的山羊抗兔抗体，37℃结合0.5hrs。

③用1×PBST洗涤5次，每孔加入100μL TMB底物显色液，常温反应5-10min，等体积的2M浓硫酸终止反应，Tecan多功能酶标仪450nm波长下读数。按照所有数值参比于GST-PD-L1(DMSO)组进行计算并作图。图1结果显示，化合物I抑制His-Trx-PD-1与GST-PD-L1蛋白间的相互作用。

④将化合物I进行浓度倍比稀释(19.5nM、39nM、78nM、156nM、312.5nM、625nM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)。按照(1)中方法检测化合物I抑制His-Trx-PD-1与GST-PD-L1蛋白间的相互作用并绘制化合物I抑制曲线。结果如图2所示，化合物能有效抑制大肠杆菌表达的PD-1/PD-L1蛋白间的相互作用。

(2)化合物I抑制HEK293细胞表达的PD-1/PD-L1蛋白相互作用

①碳酸盐包被缓冲液稀释HEK293细胞表达的PD-L1-Fc-His蛋白质1μg/mL，100μL每孔加入96孔酶标板中，置于4℃过夜。用1×PBST洗涤3次，5％脱脂奶粉封闭，每孔300μL，37℃封闭2hrs。

②用1×PBST洗涤3次。同时1×PBS稀释PD-L1-His-biotin蛋白至1μg/mL，同时加入0.2μL的DMSO或小分子化合物(终浓度5μM)，混匀，100μL每孔加入96孔板中，37℃结合2hrs。1×PBST洗涤3次，每孔加入100μL 1×PBS稀释的HRP标记的链霉亲和素，37℃结合0.5hrs。1×PBST洗涤5次，每孔加入100μL TMB底物显色液，常温反应5-10min，等体积的2M浓硫酸终止反应，Tecan多功能酶标仪450nm波长下读数。图3a结果显示，化合物I抑制HEK-293细胞表达的PD-1/PD-L1蛋白间的相互作用。

③将化合物I进行浓度倍比稀释(19.5nM、39nM、78nM、156nM、312.5nM、625nM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)。按照(2)中方法检测化合物I抑制PD-1-Fc-His与PD-L1-His-biotin蛋白间的相互作用并绘制化合物I抑制曲线。结果如图3b所示，化合物I有效抑制HEK293细胞表达的PD-1/PD-L1蛋白间的相互作用。

(3)蛋白质荧光淬灭检测化合物I与PD-1或PD-L1亲和活性

His-HA-PD-L1或His-HA-PD-1蛋白用缓冲液(50mM Na-P、150mMNaCl pH7.4)稀释至0.05mg/mL，体积2mL，将溶液进行蛋白荧光光谱测定。固定荧光光谱仪的激发波长为280nm，发射范围为300-500nm，激发和发射的狭缝宽度分别设为5nm和2.5nm，在室温条件下扫描不同的样品。荧光滴定实验是固定蛋白质的浓度，不停的改变小分子化合物的浓度，测定蛋白质的荧光光谱的变化。具体操作为：配制浓度为0.25mM的化合物I母液(取2μL溶于DMSO的50mM小分子化合物，用400μL缓冲液稀释)，每次滴加10μL母液于上述溶液中，混匀，测定蛋白质的荧光光谱变化，共滴加10次。

结果如图4和5所示，缓冲液对His-HA-PD-L1和His-HA-PD-1蛋白荧光淬灭影响很小，而化合物对His-HA-PD-L1和His-HA-PD-1蛋白荧光淬灭有明显影响，其中His-HA-PD-L1蛋白荧光淬灭影响最大。结果表明，化合物I与His-HA-PD-L1蛋白有较强的亲和活性。

(4)单克隆形成实验检测Jurkat细胞对肿瘤细胞的杀伤活性

10％FBS DMEM或1640培养基重悬MDA-MB-231或NCI-H460细胞并计数，以1×10⁴个/孔接种于12孔板中，置于37℃培养箱中培养24hrs。用10％FBS 1640培养基重悬活化的Jurkat细胞(2μg/ml PHA刺激48hrs)并计数，同时用10％FBS 1640培养基稀释化合物I至合适浓度，吸尽12孔板中培养上清，按照效靶比(E:T)分别为4:1和8:1的比例将活化的Jurkat细胞与稀释好的化合物I共同加入12孔板中，使小分子药物终浓度为0μM、10μM、20μM和40μM，继续共培养48hrs，对照组不接种Jurkat细胞。用1×PBS洗涤除去悬浮的Jurkat细胞，残留的肿瘤细胞用结晶紫染液染色，观察孔板内单克隆形成数量。

结果如图6和7所示，随着化合物I浓度的增加，孔板内细胞数量逐渐减少；在同一药物浓度条件下，随着效靶比的增加，孔板内细胞数量相比于无Jurkat细胞组逐渐减少。以上结果表明，化合物I增加Jurkat细胞对MDA-MB-31和NCI-H460细胞的杀伤活性。

(5)ELISA检测Jurkat细胞分泌IL-2水平

10％FBS DMEM或1640培养基重悬MDA-MB-231或NCI-H460细胞并计数，以5000个/孔接种于96孔板中，置于37℃培养箱中培养24hrs。用10％FBS 1640培养基重悬活化的Jurkat细胞(2μg/ml PHA刺激48hrs)并计数，同时用10％FBS 1640培养基稀释化合物I至合适浓度，吸尽96孔板中培养上清，将稀释好的化合物I与40000个活化的Jurkat细胞共同加入96孔板中，使小分子药物终浓度为0μM、10μM、20μM和40μM，共培养24hrs。收获上清，利用人IL-2ELISA检测试剂盒测定上清中IL-2的表达情况。

结果如图8所示，本发明的化合物I能够激活Jurkat细胞释放IL-2，逆转T细胞的免疫抑制。

上述实施例对该一种黄酮类化合物的应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种黄酮类化合物作为PD-1/PD-L1蛋白相互作用的抑制剂方面的应用，所述黄酮类化合物为3,3',4',5,7-五羟基黄酮二水合物，具有式(I)所示结构：

2.权利要求1所述黄酮类化合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述抗肿瘤药物为以PD-1/PD-L1为靶点的肿瘤免疫治疗药物。