CN110200290A - 一种山药多肽的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种山药多肽的提取方法，属于生物技术领域，具体为：1)新鲜山药去皮破碎磨浆成浆液加水，加温至45～55℃，超声提取得提取液；2)步骤1)中的提取液变性后加温，加入复合酶A和复合酶B酶解；3)步骤2)的酶解液灭活处理，静置，分离纯化得到上清液；4)步骤3)的上清液经分子量分级后脱苦浓缩干燥获得山药多肽。有益效果为：本发明方法采用双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理的方式促使山药蛋白变性，大大提高了水解效率以及山药多肽的得率，乙酸可消除山药多肽苦味，提高其适口性和可食性，拓展其可应用范围，山药多肽在抑制胰岛瘤细胞、防治糖尿病、缓解糖耐量、降低血糖方面具有较大的应用潜力。

Description

一种山药多肽的提取方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种山药多肽的提取方法。
背景技术
山药又称薯蓣、土薯、山薯蓣、怀山药、淮山、白山药，是《中华本草》收载的草药，药用来源为薯蓣科植物山药干燥根茎。作为药食两用的中药材，山药受区域气候特征、地质特点、生长习性等因素的影响，具有不同的产地特征。山药主产地河南博爱、武陟、温县等地，山西、陕西、山东、河北、浙江、湖南、四川、云南、贵州、广西等地也有栽培。以广西、河北、河南等地为主的几大产地构成了国内主要山药栽培区。
山药也是人类食用最早的植物之一，早在唐朝诗圣杜甫的诗中就有“充肠多薯蓣”的名句。山药块茎肥厚多汁，又甜又绵，且带粘性，生食热食都是美味。根据山东省农科院对山药的化验结果，其块茎中平均含粗蛋白质14.48％，粗纤维3.48％，淀粉43.7％，糖1.14％，钾2.62％，磷0.2％，钙0.2％，镁0.14％，灰分5.51％，铁53.57ppm，锌29.22ppm，铜10.58ppm，锰5.38ppm。人类所需的18种氨基酸中，山药中含有16种。
山药肉质细嫩，含有极丰富的营养保健物质。《神农本草经》谓之“主健中补虚、除寒热邪气、补中益气力、长肌肉、久服耳目聪明”；((日华子本草》说其“助五脏、活筋骨、长志安神、主治泄精健忘”；《本草纲目》认为山药能“益肾气、健脾胃、止泻痢、化瘫涎、润毛皮”。近些年来的研究表明，山药具有诱导产生干扰素，增强人体免疫功能的作用。其所含胆碱和卵磷脂有助于提高人的记忆力，常食之可健身强体、延缓衰老，是人们所喜爱的保健佳品。以山药为主、辅以魔芋做成的仿生食品，具有营养丰富、滋补健身、养颜美容之功效，是不可多得的健康营养美食。山药是山中之药、食中之药。不仅可做成保健食品，而且具有调理疾病的药用价值。《本草纲目》指出：山药治诸虚百损、疗五劳七伤、去头面游风、止腰痛、除烦热、补心气不足、开达心孔、多记事、益肾气、健脾胃、止泻痢、润毛皮，生捣贴肿、硬毒能治；《医学衷中参西录》中的玉液汤和滋培汤，以山药配黄芪，可治消渴、虚劳喘逆，经常结合用枸杞子、桑椹子等这些药食同源的中药材做茶泡饮，可补肾强身，增强抵抗力，可以起到较好的保健养生功效。山药乃山中之药、食中之药，具有药食同源的特点。因此，山药不仅有很高的药用价值，而且安全、无毒。尽管如此，并没有成熟开发的从山药中提取化合物问世，用于预防或治疗糖尿病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种山药多肽的提取方法，本发明方法采用双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理的方式促使山药蛋白变性，大大提高了水解效率以及山药多肽的得率，乙酸可消除山药多肽苦味，提高其适口性和可食性，拓展其可应用范围，山药多肽在抑制胰岛瘤细胞、防治糖尿病、缓解糖耐量、降低血糖方面具有较大的应用潜力。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：
[1]一种山药多肽的提取方法，具体包括：
1)新鲜山药去皮破碎磨浆成浆液，添加5～10重量倍的水，加温至45～55℃，超声提取10～30min得提取液；新鲜山药磨浆成浆液后以超声波提取，可有效分离山药中的粗蛋白质、粗纤维以及淀粉，大大增大上述底物的分散程度，为进一步地酶解做准备；
2)步骤1)中的提取液变性后加温至60～75℃，加入复合酶A和复合酶B酶解；以多种复合酶酶解山药浆液，可以较大程度地发挥多种酶的协调增益作用，其酶解活性、效率与速度远超单一活性酶，显著地缩短了酶解时间，加速酶解，降低能耗；
3)步骤2)的酶解液在85～100℃进行灭活处理10～15min，静置，分离纯化得到上清液；酶解液灭活后分离纯化可将小分子多肽与蛋白质、纤维素、淀粉等副产物分离开来，所得上清液中山药多肽的含量提高，利于对其进行进一步地分级与脱苦等操作；
4)浓缩干燥：步骤3)的上清液经分子量分级后脱苦浓缩干燥获得山药多肽；分子量分级后所得到的目标分子量范围的山药多肽具有较高的降糖功效，脱苦有利于增加山药多肽的适口性和可食性，为山药多肽的多元化利用提供了可能，经浓缩干燥后获取的山药多肽纯品中活性山药多肽的纯度可达98％，具有较为高效的抑制胰岛瘤细胞(INS-1细胞)作用，可应用于预防和治疗Ⅱ型糖尿病，可以缓解糖尿病模型小鼠的糖耐量，降糖功效具有较为理想的应用潜力。
根据本发明的实施方式，所述步骤2)的变性按照包括如下步骤的方法进行：将提取液置于双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理，处理步骤为：
A)开启双频率超声波30～45s，关闭超声波；
B)开启微波辐射15～30s，关闭微波辐射；
C)依次重复步骤A)、B)15～30min；其中，
所述双频率复合超声的超声波1的频率为35～40KHz，能量密度是0.3～0.4W/cm2；超声波2的频率为65～80KHz，能量密度是0.6～0.8W/cm2；
所述微波的频率为3000-4500MHz，功率为2000～4000W/L提取液；
所述提取液变性的起始温度为25℃。
与其他方法相比，本发明方法中的变性采用了双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理的方式，使山药组织中的山药蛋白明显变性，破坏了山药组织的三级结构，促使卷曲、纠结的蛋白质伸展成链式，增加了蛋白质底物与酶的接触几率，提高了山药蛋白质的水解程度；此外，双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理的方式还可以作用于纤维素&蛋白质和/或淀粉&蛋白质和/或纤维素&蛋白质&淀粉等复合结构，有效打散上述复合结构的结合模式，促进其中的蛋白质更快、更多的解离，并进一步被酶解，极大地提高了山药蛋白的水解程度，增加了山药多肽的得率，提高了制备效率。
根据本发明的实施方式，其中复合酶A由木聚糖酶和纤维素酶构成，复合酶B由碱性蛋白酶和植物蛋白酶构成。
根据本发明的实施方式，所述木聚糖酶可选自β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-***糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶的至少一种。
根据本发明的实施方式，所述纤维素酶可选自外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的至少一种。
根据本发明的实施方式，所述碱性蛋白酶可选自Novo蛋白酶与Carsberg蛋白酶的一种或两种。
根据本发明的实施方式，所述复合植物蛋白酶可选自木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶的至少一种。
根据本发明的实施方式，所述复合酶A和复合酶B的酶活力比可为120～400万U:300～1000万U。
本发明中，酶活力单位U指的是在特定条件下(25℃，pH7.0)，每1min转化1微摩尔的底物所需的酶量或转化1微摩尔的有关基团所需的酶量。
根据本发明的实施方式，复合酶A中木聚糖酶的质量可以为所述提取液质量的0.2～0.25％，纤维素酶的质量可以为所述提取液质量的0.1～0.15％；复合酶B中碱性蛋白酶的质量可以为所述提取液质量的0.3～0.5％，植物蛋白酶的质量可以为所述提取液质量的0.4～0.6％。
根据本发明的实施方式，可先加入复合酶A酶解15～30min，再加入复合酶B酶解15～30min。
根据本发明的实施方式，可向提取液中加入复合酶A与复合酶B的混合物，酶解30～60min。
根据本发明的实施方式，所述分子量分级按照包括如下步骤的方法进行：将所述上清液依次通过0.5μm微滤膜、5kD超滤膜和2kD超滤膜，收集透过所述2kD超滤膜的山药多肽；所述超滤膜具体可为再生纤维素膜。
根据本发明的实施方式，所述脱苦按照包括如下步骤的方法进行：55℃～60℃条件下，按照料液比1:50～60的比例，将所述透过2kD超滤膜的山药多肽完全溶解于含有0.1～2wt％乙酸的水溶液中，搅拌下混合30～60min，蒸发浓缩后以蒸馏水漂洗至洗液呈中性；以含有适量乙酸的水溶液溶解山药多肽后，乙酸可彻底地消除山药多肽的苦味，大大提高山药多肽的适口性和可食性，拓展了山药多肽的可应用范围，而且以乙酸脱苦操作简单、价格低廉，乙酸可以回收重复利用，对环境友好。
根据本发明的实施方式，所述分离纯化的方法为过滤器、离心机或膜过滤中的一种或几种，优选地，所述分离纯化的方法为用双联滤器进行粗滤后经陶瓷超滤膜过滤。
根据本发明的实施方式，所述浓缩干燥为喷雾干燥、真空带式干燥、真空微波干燥、冷冻干燥中的一种或几种。
根据本发明的实施方式，本发明使用的山药可以是但不限于佛手山药、紫山药、铁棍山药、鸡皮糙山药、西施山药、灵芝山药、小白嘴山药、长山药、细毛山药、水山药。
[2]一种抑制胰岛瘤细胞的药物，所述药物的活性成分是山药多肽。
[3]一种预防和治疗Ⅱ型糖尿病的药物，所述药物的活性成分是山药多肽。
[4]如项[1]、[2]、[3]所述山药多肽的应用，包括：
所述山药多肽可包被于食用胶囊中，制成保健胶囊；和/或
所述山药多肽可与赋型剂复合，制备成口服含片；和/或
所述山药多肽可加入饮料或饮用水中，制成保健饮料；和/或
所述山药多肽可加入方便食品中，制成食品保健品。
本发明的有益效果为：
1)与其他方法相比，本发明方法中的变性采用了双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理的方式，使山药组织中的山药蛋白明显变性，破坏了山药组织的三级结构，促使卷曲、纠结的蛋白质伸展成链式，增加了蛋白质底物与酶的接触几率，提高了山药蛋白质的水解程度；
2)双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理的方式还可以作用于纤维素&蛋白质和/或淀粉&蛋白质和/或纤维素&蛋白质&淀粉等复合结构，有效打散上述复合结构的结合模式，促进其中的蛋白质更快、更多的解离，并进一步被酶解，极大地提高了山药蛋白的水解程度，增加了山药多肽的得率，提高了制备效率；
3)以含有适量乙酸的水溶液溶解山药多肽后，乙酸可彻底地消除山药多肽的苦味，大大提高山药多肽的适口性和可食性，拓展了山药多肽的可应用范围，而且以乙酸脱苦操作简单、价格低廉，乙酸可以回收重复利用，对环境友好；
4)经浓缩干燥后获取的山药多肽纯品中活性山药多肽的纯度可达98％，具有较为高效的抑制胰岛瘤细胞(INS-1细胞)作用，可应用于预防和治疗Ⅱ型糖尿病，可以缓解糖尿病模型小鼠的糖耐量，降糖功效具有较为理想的应用潜力。
本发明采用了上述技术方案提供一种山药多肽的提取方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种山药多肽的提取方法，具体包括：
1)新鲜山药去皮破碎磨浆成浆液，添加5重量倍的水，加温至45℃，超声提取15min得提取液；新鲜山药磨浆成浆液后以超声波提取，可有效分离山药中的粗蛋白质、粗纤维以及淀粉，大大增大上述底物的分散程度，为进一步地酶解做准备；
2)步骤1)中的提取液变性后加温至65℃，加入复合酶A和复合酶B酶解；以多种复合酶酶解山药浆液，可以较大程度地发挥多种酶的协调增益作用，其酶解活性、效率与速度远超单一活性酶，显著地缩短了酶解时间，加速酶解，降低能耗；
3)步骤2)的酶解液在95℃进行灭活处理15min，静置，分离纯化得到上清液；酶解液灭活后分离纯化可将小分子多肽与蛋白质、纤维素、淀粉等副产物分离开来，所得上清液中山药多肽的含量提高，利于对其进行进一步地分级与脱苦等操作；
4)浓缩干燥：步骤3)的上清液经分子量分级后脱苦浓缩干燥获得山药多肽；分子量分级后所得到的目标分子量范围的山药多肽具有较高的降糖功效，脱苦有利于增加山药多肽的适口性和可食性，为山药多肽的多元化利用提供了可能，经浓缩干燥后获取的山药多肽纯品中活性山药多肽的纯度可达98％，具有较为高效的抑制胰岛瘤细胞(INS-1细胞)作用，可应用于预防和治疗Ⅱ型糖尿病，可以缓解糖尿病模型小鼠的糖耐量，降糖功效具有较为理想的应用潜力。
所述变性按照包括如下步骤的方法进行：将提取液置于双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理，处理步骤为：
A)开启双频率超声波30s，关闭超声波；
B)开启微波辐射30s，关闭微波辐射；
C)依次重复步骤A)、B)15min；其中，
所述双频率复合超声的超声波1的频率为35KHz，能量密度是0.3W/cm2；超声波2的频率为65KHz，能量密度是0.6W/cm2；
所述微波的频率为3000MHz，功率为2500W/L提取液；
所述提取液变性的起始温度为25℃。
与其他方法相比，本发明方法中的变性采用了双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理的方式，使山药组织中的山药蛋白明显变性，破坏了山药组织的三级结构，促使卷曲、纠结的蛋白质伸展成链式，增加了蛋白质底物与酶的接触几率，提高了山药蛋白质的水解程度；此外，双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理的方式还可以作用于纤维素&蛋白质和/或淀粉&蛋白质和/或纤维素&蛋白质&淀粉等复合结构，有效打散上述复合结构的结合模式，促进其中的蛋白质更快、更多的解离，并进一步被酶解，极大地提高了山药蛋白的水解程度，增加了山药多肽的得率，提高了制备效率。
所述复合酶A由木聚糖酶和纤维素酶构成；复合酶B由碱性蛋白酶和植物蛋白酶构成。
所述木聚糖酶是β-1,4-内切木聚糖酶、α-L-***糖苷酶的混合酶，重量比为1:1。
所述纤维素酶是外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶的混合酶，重量比为1:1。
所述碱性蛋白酶是Novo蛋白酶与Carsberg蛋白酶的混合酶，重量比为1:1。
所述复合植物蛋白酶是木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶的混合酶，重量比为1:1:1。
所述复合酶A和复合酶B的酶活力比可为150万U:400万U。
本发明中，酶活力单位U指的是在特定条件下(25℃，pH7.0)，每1min转化1微摩尔的底物所需的酶量或转化1微摩尔的有关基团所需的酶量。
复合酶A中木聚糖酶的质量为所述提取液质量的0.2％，纤维素酶的质量可以为所述提取液质量的0.1％；
复合酶B中碱性蛋白酶的质量可以为所述提取液质量的0.3％，植物蛋白酶的质量可以为所述提取液质量的0.4％。
本实施例中，先加入复合酶A酶解15min，再加入复合酶B酶解15min。
所述分子量分级按照包括如下步骤的方法进行：将所述上清液依次通过0.5μm微滤膜、5kD超滤膜和2kD超滤膜，收集透过所述2kD超滤膜的山药多肽；所述超滤膜具体为再生纤维素膜。
所述脱苦按照包括如下步骤的方法进行：55℃条件下，按照料液比1:50的比例，将所述透过2kD超滤膜的山药多肽完全溶解于含有0.5wt％乙酸的水溶液中，搅拌下混合60min，蒸发浓缩后以蒸馏水漂洗至洗液呈中性；以含有适量乙酸的水溶液溶解山药多肽后，乙酸可彻底地消除山药多肽的苦味，大大提高山药多肽的适口性和可食性，拓展了山药多肽的可应用范围，而且以乙酸脱苦操作简单、价格低廉，乙酸可以回收重复利用，对环境友好。
所述分离纯化的方法为用双联滤器进行粗滤后经陶瓷超滤膜过滤。
所述浓缩干燥为喷雾干燥。
实施例2：
本实施例提供项[1]：一种山药多肽的提取方法，具体包括：
1)新鲜山药去皮破碎磨浆成浆液，添加10重量倍的水，加温至52℃，超声提取25min得提取液；新鲜山药磨浆成浆液后以超声波提取，可有效分离山药中的粗蛋白质、粗纤维以及淀粉，大大增大上述底物的分散程度，为进一步地酶解做准备；
2)步骤1)中的提取液变性后加温至70℃，加入复合酶A和复合酶B酶解；以多种复合酶酶解山药浆液，可以较大程度地发挥多种酶的协调增益作用，其酶解活性、效率与速度远超单一活性酶，显著地缩短了酶解时间，加速酶解，降低能耗；
3)步骤2)的酶解液在100℃进行灭活处理10min，静置，分离纯化得到上清液；酶解液灭活后分离纯化可将小分子多肽与蛋白质、纤维素、淀粉等副产物分离开来，所得上清液中山药多肽的含量提高，利于对其进行进一步地分级与脱苦等操作；
4)浓缩干燥：步骤3)的上清液经分子量分级后脱苦浓缩干燥获得山药多肽；分子量分级后所得到的目标分子量范围的山药多肽具有较高的降糖功效，脱苦有利于增加山药多肽的适口性和可食性，为山药多肽的多元化利用提供了可能，经浓缩干燥后获取的山药多肽纯品中活性山药多肽的纯度可达98％，具有较为高效的抑制胰岛瘤细胞(INS-1细胞)作用，可应用于预防和治疗Ⅱ型糖尿病，可以缓解糖尿病模型小鼠的糖耐量，降糖功效具有较为理想的应用潜力。
所述变性按照包括如下步骤的方法进行：将提取液置于双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理，处理步骤为：
A)开启双频率超声波45s，关闭超声波；
B)开启微波辐射15s，关闭微波辐射；
C)依次重复步骤A)、B)30min；其中，
所述双频率复合超声的超声波1的频率为40KHz，能量密度是0.35W/cm2；超声波2的频率为75KHz，能量密度是0.7W/cm2；
所述微波的频率为4000MHz，功率为2500W/L提取液；
所述提取液变性的起始温度为25℃。
与其他方法相比，本发明方法中的变性采用了双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理的方式，使山药组织中的山药蛋白明显变性，破坏了山药组织的三级结构，促使卷曲、纠结的蛋白质伸展成链式，增加了蛋白质底物与酶的接触几率，提高了山药蛋白质的水解程度；此外，双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理的方式还可以作用于纤维素&蛋白质和/或淀粉&蛋白质和/或纤维素&蛋白质&淀粉等复合结构，有效打散上述复合结构的结合模式，促进其中的蛋白质更快、更多的解离，并进一步被酶解，极大地提高了山药蛋白的水解程度，增加了山药多肽的得率，提高了制备效率。
所述复合酶A由木聚糖酶和纤维素酶构成，重量比为1:1，复合酶B由碱性蛋白酶和植物蛋白酶构成，重量比为1:1。
所述木聚糖酶是β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-***糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶的混合酶，重量比为1:1:1:1:1:1。
所述纤维素酶是外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的混合酶，重量比为1:1。
所述碱性蛋白酶是Novo蛋白酶与Carsberg蛋白酶的混合酶，重量比为1:1。
所述复合植物蛋白酶是木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶的混合酶，重量比为1:1:1。
所述复合酶A和复合酶B的酶活力比是400万U:1000万U。
本发明中，酶活力单位U指的是在特定条件下(25℃，pH7.0)，每1min转化1微摩尔的底物所需的酶量或转化1微摩尔的有关基团所需的酶量。
所述复合酶A中木聚糖酶的质量是所述提取液质量的0.25％，纤维素酶的质量是所述提取液质量的0.15％；
复合酶B中碱性蛋白酶的质量是所述提取液质量的0.4％，植物蛋白酶的质量是所述提取液质量的0.6％。
本实施例中，向提取液中加入复合酶A与复合酶B的混合物，酶解60min。
所述分子量分级按照包括如下步骤的方法进行：将所述上清液依次通过0.5μm微滤膜、5kD超滤膜和2kD超滤膜，收集透过所述2kD超滤膜的山药多肽；所述超滤膜具体可为再生纤维素膜。
所述脱苦按照包括如下步骤的方法进行：60℃条件下，按照料液比1:55的比例，将所述透过2kD超滤膜的山药多肽完全溶解于含有1.5wt％乙酸的水溶液中，搅拌下混合45min，蒸发浓缩后以蒸馏水漂洗至洗液呈中性；以含有适量乙酸的水溶液溶解山药多肽后，乙酸可彻底地消除山药多肽的苦味，大大提高山药多肽的适口性和可食性，拓展了山药多肽的可应用范围，而且以乙酸脱苦操作简单、价格低廉，乙酸可以回收重复利用，对环境友好。
所述分离纯化的方法是膜过滤。
所述浓缩干燥为冷冻干燥。
所述山药可以是但不限于佛手山药、紫山药、铁棍山药、鸡皮糙山药、西施山药、灵芝山药、小白嘴山药、长山药、细毛山药、水山药。
本实施例提供项[2]：一种抑制胰岛瘤细胞的药物，所述药物的活性成分是如项[1]所述的山药多肽。
本实施例提供项[3]：一种预防和治疗Ⅱ型糖尿病的药物，所述药物的活性成分是如项[1]所述的山药多肽。
本实施例提供项[4]：如项[1]、[2]、[3]所述山药多肽的应用，包括：
所述山药多肽可包被于食用胶囊中，制成保健胶囊；和
所述山药多肽可与赋型剂复合，制备成口服含片；和
所述山药多肽可加入饮料或饮用水中，制成保健饮料；和
所述山药多肽可加入方便食品中，制成食品保健品。
实施例3：
实施例3与实施例2基本相同，不同之处在于实施例3中未进行变性操作。
实施例4：
实施例4与实施例2基本相同，不同之处在于实施例4中，变性时仅仅以A)开启双频率超声波45s，关闭超声波15s；重复步骤A)30min达到变性的目的。
实施例5：
实施例5与实施例2基本相同，不同之处在于实施例5中，变性时仅仅以B)开启微波辐射15s，关闭微波辐射45s；重复步骤B)30min达到变性的目的。
实施例6：
实施例6与实施例2基本相同，不同之处在于实施例6中，步骤3)的上清液未经分子量分级后即行脱苦操作。
实施例7：
实施例7与实施例2基本相同，不同之处在于实施例7中，脱苦时仅仅以蒸馏水进行脱苦。
测试例：
实施例1和实施例2获得的山药多肽粉经高效液相色谱法检测其肽分子量在300—1500Da之间，经氨基酸自动分析仪检测其氨基酸组成如表1所示，其中，精氨酸与组氨酸的摩尔百分比均超过了15％。
表1山药多肽的氨基酸组成
实验例：
A)山药多肽的体外细胞活性测定
采用MTT比色法：将对数生长的胰岛瘤细胞(INS-1细胞)，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h，实验孔分别加入不同浓度的实施例1中的山药多肽；空白组加入相同体积的溶剂(蒸馏水)。每孔设3个复孔，培养48h，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪570nm处测定吸光度A值，按公式：细胞生长增殖率＝(实验组吸光值/对照组吸光值-1)×100％，计算出实施例1中的山药多肽的药物EC50为78.55nmol/L。则说明本发明中的山药多肽对体外对数生长的胰岛瘤细胞(INS-1细胞)具有较强的抑制效果，可将其应用于预防和/或治疗胰岛瘤细胞(INS-1细胞)的靶向药物。
B)山药多肽对Ⅱ型糖尿病模型大鼠进行动物实验：
将大鼠用基础饲料喂养1周后，随机分为普通饲料组(空白对照组，10只)和高脂饲料组(140只)，持续喂养8周后，高脂饲料组大鼠尾静脉一次性注射STZ(链脲佐菌素)25mg/kg，正常对照组大鼠注射等量的枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液。2d后以15mmol/L≤血糖＜30mmol/L者视为Ⅱ型糖尿病模型大鼠造模成功。将造模成功的80只大鼠随机分成八组(每组10只)：模型对照组(水灌胃)、实施例1-7制备的山药多肽按照100mg/kg灌胃，连续灌胃8d，观察动物的症状及检测各项指标，实验结束后测定大鼠的空腹血糖指标。
采用SPSS统计软件进行数据处理，实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用t检验，检验水准α＝0.05。结果见表2。
表2山药多肽对Ⅱ型糖尿病大鼠血糖的影响(χ±SD)
分组 n 实验前(mmol/L) 实验后(mmol/L) 均值下降比(％)
空白对照组 10 5.52±0.32 5.58±0.35 —
模型对照组 10 16.95±0.95 17.02±0.85 —
实施例1 10 17.21±0.78 8.05±0.74★ 53.2
实施例2 10 16.85±0.70 7.92±0.82★ 53.0
实施例3 10 17.65±0.80 15.82±0.94 10.4
实施例4 10 16.95±0.85 14.29±1.02 15.7
实施例5 10 17.20±0.68 15.98±0.95 7.1
实施例6 10 17.05±0.70 15.86±0.70 7.0
实施例7 10 17.56±0.74 17.02±0.86 3.1
表2中，★表示P<0.05，即与模型对照组相比，差异有显著性，本实验结果表明：山药多肽有明显的降糖作用，具有一定的医用、药用价值。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.一种山药多肽的提取方法，其特征在于包括：
1)新鲜山药去皮破碎磨浆成浆液加水，加温至45～55℃，超声提取得提取液；
2)步骤1)中的提取液变性后加温，加入复合酶A和复合酶B酶解；
3)步骤2)的酶解液灭活处理，静置，分离纯化得到上清液；
4)步骤3)的上清液经分子量分级后脱苦浓缩干燥获得山药多肽；
其中，所述变性是将提取液置于双频率复合超声与微波辐射交错间隔处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述变性的具体步骤为：
A)开启双频率超声波30～45s，关闭超声波；
B)开启微波辐射15～30s，关闭微波辐射；
C)依次重复步骤A)、B)15～30min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述双频率复合超声的
超声波1的频率为35～40KHz，能量密度是0.3～0.4W/cm2；
超声波2的频率为65～80KHz，能量密度是0.6～0.8W/cm2；
微波的频率为3000～4500MHz，功率为2000～4000W/L提取液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述复合酶A由木聚糖酶和纤维素酶构成，
所述复合酶B由碱性蛋白酶和植物蛋白酶构成。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述木聚糖酶可选自β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-***糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶的至少一种；
所述纤维素酶可选自外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的至少一种；
所述碱性蛋白酶可选自Novo蛋白酶与Carsberg蛋白酶的一种或两种；
所述复合植物蛋白酶可选自木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶的至少一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分子量分级按照包括如下步骤的方法进行：
将所述上清液依次通过0.5μm微滤膜、5kD超滤膜和2kD超滤膜，收集透过所述2kD超滤膜的山药多肽；
所述超滤膜具体可为再生纤维素膜。
7.根据权利要求1、2或6任一项所述的方法，其特征在于：所述脱苦按照包括如下步骤的方法进行：
55℃～60℃条件下，按照料液比1:50～60的比例，将所述透过2kD超滤膜的山药多肽完全溶解于含有0.1～2wt％乙酸的水溶液中，搅拌下混合30～60min，蒸发浓缩后以蒸馏水漂洗至洗液呈中性。
8.一种抑制胰岛瘤细胞的药物，所述药物的活性成分是权利要求1～7任一项所述的山药多肽。
9.一种预防和治疗Ⅱ型糖尿病的药物，所述药物的活性成分是权利要求1～7任一项所述的山药多肽。
10.如权利要求1～9任一项所述山药多肽的应用，包括：
所述山药多肽可包被于食用胶囊中，制成保健胶囊；和/或
所述山药多肽可与赋型剂复合，制备成口服含片；和/或
所述山药多肽可加入饮料或饮用水中，制成保健饮料；和/或
所述山药多肽可加入方便食品中，制成食品保健品。
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