CN110195098A - 用于检测braf相关融合基因的探针组、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测BRAF相关融合基因的探针组，包括用于检测BRAF/KIAA1549、BRAF/SRGAP3、BRAF/FAM131B、BRAF/AKAP9融合基因的探针对，探针对中一个探针靶向BRAF基因，另一个探针靶向KIAA1549、SRGAP3、FAM131B、AKAP9基因中的一个，探针组每一个探针均采用phi29 DNA聚合酶进行探针标记。本发明还公开了一种用于检测BRAF相关融合基因的试剂盒，包括上述探针组和杂交缓冲液，杂交缓冲液中含有二甲基亚砜。本发明通过筛选到最优的BRAF基因和相关伙伴基因融合基因检测探针及其组合，采用FISH方法进行融合基因检测，信号计数行准确、快速，且结果的重复性好；本发明中首次将phi29 DNA聚合酶用于探针标记，建立phi29 DNA随机引物标记方法；结合精细的组分调整，其标记效果优于目前常用的缺口平移法。

Description

用于检测BRAF相关融合基因的探针组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其是一种用于检测BRAF相关融合基因的探针组、试剂盒及其应用。
背景技术
恶性原发性脑肿瘤约占恶性肿瘤的2％，发病高峰年龄为5～10岁及50～55岁。星形细胞瘤具高度侵袭性，据WHO规定，以肿瘤分化程度进行分级。与高度恶性特征的恶性胶质瘤(GBM；WHO IV级)和分化不良具不典型增生的间变性星形细胞瘤(WHO III级)相比，纤维状细胞星形细胞瘤(I级)和毛细胞性星形细胞瘤(WHO I级)侵袭性较低，表现局限性，不易进展至间变期，多见于儿童和青少年。
在低级别神经中枢肿瘤中常存在BRAF异常，异常涉及7q34区BRAF基因的随机重复和融合。研究认为BRAF基因异常激活MAPK通路，可能与低级别星形细胞瘤的发病相关，可能成为潜在的治疗靶点[1]。在低级别少突胶质瘤中也检测到BRAF拷贝数增加和BRAF-KIAA1549融合，回归分析显示BRAF拷贝数增加与1p/19q缺失显著正相关(P＝0.0032)，与TP53突变负相关(P＝0.0042)[2]。低级别星形细胞瘤中，BRAF-KIAA1549融合的患者可能具更好的临床表现。弥散性小脑低级别星形细胞瘤常出现于青年患者，具较好预后，其中主要亚型毛细胞星形细胞瘤中的某些病例不能简单的依靠形态学诊断，需要借助分子检测手段进行分型。KIAA1549-BRAF融合与IDH1/2和BRAF突变分析一样，能够辅助肿瘤准确分型[3]。
已经发现的BRAF融合的伙伴基因包括：KIAA1549、SRGAP3、FAM131B、AKAP9[4、5]，随着检测的深入，逐渐有新的融合伙伴基因或融合形式被报道[6]。
BRAF异常是肿瘤辅助分型、疗效判断、用药研究、发病机制研究中的新的生物靶标，但目前其检测只集中在科研中，缺少商品化的试剂。文献中公开的检测技术通常包括RT-PCR、FISH、CGH等。逆转录PCR方法(RT-PCR)方法需要了解具体的融合类型，针对断裂位点进行引物和/或探针设计，通过定性的方式检测是否发生融合；无法检测新的未知型别，且融合位点较多，用RT-PCR和测序方法检测非常麻烦。此外FFPE样本组织RNA质量不易质控、容易扩增失败。比较基因组杂交(CGH)通过高分辨全基因组杂交判断染色体拷贝数的变异，优点是能够得到全染色体信息，在未知区段基因的变异研究中有益，能够检测出拷贝数变异，但对于融合基因检测存在不足。荧光原位杂交(FISH)将形态学与核酸检测相结合，能够原位观察细胞内染色体或基因的变化，是现代分子病理学研究中重要工具。
用于FISH的荧光探针标记方法很多，缺口平移法、PCR法、随机引物法、氨基化合物标记、铂化合物标记、寡核苷酸直接合成标记、探针印刷标记。目前，使用最多的是缺口平移法，借助DNaseI和PolyDNA聚合酶I的作用，将双链核酸标记上荧光。但该方法不足之处是受酶用量和酶切偏好性的影响，针对不同模板标记效率存在差异，以致标记的探针用于检测基因融合的准确性不足。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能准确、快速地检测BRAF基因融合的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
在第一个方面，本发明提供了一种用于检测BRAF相关融合基因的探针组，所述探针组包括用于检测BRAF/KIAA1549、BRAF/SRGAP3、BRAF/FAM131B、BRAF/AKAP9融合基因的探针对，所述探针对中一个探针靶向BRAF基因，另一个探针靶向KIAA1549、SRGAP3、FAM131B、AKAP9基因中的一个，所述探针组每一个探针均采用phi29 DNA聚合酶进行探针标记。
优选地，所述探针组进行探针标记时，采用随机六聚体引物进行扩增。
优选地，所述探针组进行探针标记时，扩增温度为30℃，扩增时间为12小时。本申请的发明人经多次试验发现，当扩增时采用随机六聚体引物进行扩增，扩增温度为30℃，扩增时间为12小时，相比随机八聚体引物、随机十聚体引物扩增，扩增效果最佳，扩增的产率最高。
优选地，所述phi29 DNA聚合酶在反应体系中的浓度为3U/uL。本申请的发明人经多次试验发现，当探针标记时phi29 DNA聚合酶在反应体系中的浓度为3U/uL时，相比其他浓度的phi29 DNA聚合酶标记的探针用于样本杂交，杂交结果中的信噪比最优。
在第二个方面，本发明提供了用于检测BRAF相关融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述的探针组。
优选地，所述试剂盒还包括杂交缓冲液，所述杂交缓冲液中包括作为促进剂的二甲基亚砜。本申请的发明人经多次试验发现，杂交缓冲液中采用二甲基亚砜作为促进剂时，杂交的效果更佳，背景更弱而杂交信号更亮。优选地，杂交的温度为45℃。
优选地，所述杂交缓冲液中含有质量百分含量为15％～50％的甲酰胺、硫酸葡聚糖0.2～0.25g/700uL以及二甲基亚砜20～30uL/700uL。本申请的发明人经多次试验发现，杂交缓冲液中含有质量百分含量为15％～50％的甲酰胺、硫酸葡聚糖0.2～0.25g/700uL以及二甲基亚砜20～30uL/700uL时，缓冲液的杂交效果(从信号、背景、杂交时间综合考虑)相比其它含量的甲酰胺、硫酸葡聚糖和二甲基亚砜更好。
优选地，所述试剂盒还包括用于阻断非特异性杂交的胎盘DNA。
在第三个方面，本发明提供了上述的探针组或试剂盒在制备恶性肿瘤辅助分型或疗效判断的试剂中的应用。
优选地，所述恶性肿瘤为低级别胶质瘤、胶质母细胞瘤、毛细胞星形细胞瘤、毛粘液样型星形细胞瘤、弥漫性胶质瘤、少突胶质细胞瘤或弥漫性星形细胞瘤。
综上所述，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过筛选到最优的BRAF基因和相关伙伴基因融合基因检测探针及其组合，采用FISH(Fluorescence In-Situ Hybridization)方法进行融合基因检测，信号计数行准确、快速，且结果的重复性好；
(2)本发明中首次将phi29 DNA聚合酶用于探针标记，建立phi29 DNA随机引物标记方法；结合精细的组分调整，其标记效果优于目前常用的缺口平移法；
(3)BRAF相关融合基因检测试剂盒填补了临床中没有检测试剂的不足，通过检测BRAF相关异常，助力肿瘤辅助分型、疗效判断、用药研究、发病机制研究；
(4)本发明优选的克隆检测特异性好，灵敏度高，通过对大片段重排的直观检测，不易遗漏复杂变异类型，对未知融合类型也有很好的鉴别性。
附图说明
图1为本发明中BRAF基因位置示意图，其中，竖线示出了BRAF基因的具***置；
图2为本发明中基因KIAA1549的位置示意图，其中，竖线示出了KIAA1549基因的具***置；
图3为本发明中基因FAM131B的位置示意图，其中，竖线示出了FAM131B基因的具***置；
图4为本发明中基因AKAP9的位置示意图，其中，竖线示出了AKAP9基因的具***置；
图5为本发明中基因SRGAP3的位置示意图，其中，矩形框示出了SRGAP3基因的具***置；
图6为GSP BRAF探针的电泳图；
图7为不同方法标记的探针杂交结果在显微镜下的照片；
图8为正常细胞的探针杂交结果在显微镜下的照片；
图9为探针与靶序列的杂交结果在显微镜下的照片；
图10为探针杂交结果的信号解读模式图；
图11为BRAF/KIAA1549融合探针检测为阴性的结果在显微镜下的照片；
图12为BRAF/KIAA1549融合探针检测为阳性的结果在显微镜下的照片，其中箭头指示BRAF/KIAA1549融合基因。
具体实施方式
本发明提供了一种新的探针标记方法，使得探针的标记更简单、稳定；首次将phi29 DNA聚合酶应用于核酸标记，利用该酶的多重置换和连续合成特性，使用短的随机六聚体引物进行恒温扩增标记，制备后的荧光探针用于荧光原位杂交检测，信号亮度和杂交效果均符合预期，而且，通过单因素试验发现，相比随机八聚体引物、随机十聚体引物，随机六聚体引物扩增，探针产率分别提高了至少95％。同时，本申请中还探索了除荧光素dUTP外的修饰dCTP的掺入可能性，并比较了荧光标记效果的差异，结果显示当修饰dCTP与修饰dUTP的比例在1:2～1:3，且总量不超过1.5的情况下，所标记的探针的亮度最优。
在一些实施例中，本发明提供了一种BRAF基因和其伙伴基因的检测探针组及其制备方法，所制备的探针组可用于检测BRAF相关融合基因状态，其伙伴基因包括：KIAA1549、SRGAP3、FAM131B、AKAP9；即探针组用于检测BRAF/KIAA1549、BRAF/SRGAP3、BRAF/FAM131B、BRAF/AKAP9融合基因；在一些实施例中，本发明提供了一种BRAF相关融合基因检测试剂盒，实现在组织样本中直接观察信号，以判断BRAF是否发生异常以及融合类型，具有良好的特异性。
在一些实施例中，本发明的探针组包含4组双色探针，用于检测BRAF/KIAA1549、BRAF/SRGAP3、BRAF/FAM131B、BRAF/AKAP9融合基因，其设计过程包括：BAC克隆选择→购买(商品化)→标记、测试→确认探针克隆组(可用于后续生产)；BRAF基因的BAC克隆为RP11-77C17、CTD-2333C6中至少一种；而关于BRAF伙伴基因：
a)针对KIAA1549基因的BAC克隆为CTD-2506B12、CTD-2335P8、CTD-2249H15、RP11-737E2中至少一种；
b)针对FAM131B基因的BAC克隆为CTD-2315I10、RP11-318O21、CTD-2552L15中至少一种；
c)针对AKAP9基因的BAC克隆为CTD-3127L24、CTD-2260N24、CTD-2203H22中至少一种；
d)针对SRGAP3基因的BAC克隆为CTC-300K6、CTC-334F4、CTD-2210F19、CTD-2593M19中至少一种。
在一些实施例中，本发明提供了制备探针的方法，包括步骤：
探针标记(使用phi29 DNA聚合酶)→定量(#探针的点样量、长度都会影响杂交效果)→包装/待用。具体涉及以下内容：
对BAC克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量；用荧光素标记质粒DNA，针对同一种基因的质粒DNA所标记的荧光素相同，针对BRAF基因和针对伙伴基因(KIAA1549、SRGAP3、FAM131B、AKAP9)的检测探针标记的荧光素的颜色不相同；荧光素优选为FITC和Rhodamine。
在一些实施例中，本发明的基因探针的标记利用phi29 DNA聚合酶进行常温标记，phi29 DNA聚合酶是从噬菌体phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶，具有3'→5'外切酶校读能力，并且具有特殊的多重置换和连续合成特性；因其等温扩增的特点，操作上更加便利，标记中使用短的随机六聚体引物进行扩增，扩增温度30℃，扩增时间为12小时。
在一些实施例中，本发明以两组探针进行探针标记参数的优化，具体包括以下三个方面：
(1)荧光素-dCTP与荧光素-dUTP的混合物(比例1:2～1:3)；
为了提高荧光素掺入效率，除使用常规的修饰dUTP外，探索了其它荧光素-dNTPs不同比例的掺入效果，结果表明，荧光素-dCTP与荧光素-dUTP的混合物(比例1:2～1:3)标记效果最佳，荧光信号明亮，特异性佳。
(2)phi29 DNA聚合酶用量调整；
(3)标记时间(4小时、10小时和12小时)。
在一些实施例中，本发明对探针的标记方法进行了比较，包括常规切口平移方法、商品化标记试剂盒和phi29 DNA聚合酶标记三种方法的差异，同时评估标记效果，包括设备使用、试剂成本、信号差异。在一些实施例中，本发明进行了探针质控及建立了探针检测的阈值，其中采用人外周血培养细胞评估探针的灵敏度和特异性，进而建立探针检测的阈值；采用骨髓样本评估探针的使用效果(基质样本来源于临床)。在一些实施例中，本发明选择20例左右样本进行探针组的临床应用评估，并使用建立的阈值进行结果判读。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法；如无特别说明，本发明中的试剂浓度均为质量浓度。
实施例1探针组设计与制备
(1)探针设计
本实施例的用于检测BRAF相关融合基因的探针组包含4组双色探针，涉及BRAF和伙伴基因KIAA1549、SRGAP3、FAM131B、AKAP9，设计过程包括：BAC克隆选择→购买(商品化)→标记、测试→确认克隆组(可用于后续生产)。
融合基因探针设计过程涉及融合的两个基因，本实施例中主要检测与BRAF基因融合的相关基因，因此，第一基因为BRAF基因，设计包括BRAF基因在内的探针组用于BRAF基因重排/断裂检测；第二基因为BRAF融合的伙伴基因，包括KIAA1549、SRGAP3、FAM131B、AKAP9。第一基因和第二基因标记颜色不同，当融合发生时会检测到红绿相邻或重叠的融合信号。BAC克隆筛选方法参照《医学遗传学数据库资源利用实例教程》赵佳等p26-28。购买于Invitrogen克隆库。
●BAC克隆选择：
挑选包含目的基因BRAF、KIAA1549、SRGAP3、FAM131B、AKAP9和延伸两端序列的克隆。
BRAF基因位置信息为BRAF 7q34chr7:140,715,951-140,924,928，参见图1。BRAF(B-Raf Proto-Oncogene,Serine/Threonine Kinase)基因是人类最重要的原癌基因之一，位于人类7号染色体上，编码RAF家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。包括BRAF激酶区的串联重复被认为是胶质瘤中常见情况，导致一系列融合的发生。
BRAF相关融合基因包括BRAF探针组，由包括BRAF基因在内的延展探针组成，GSPBRAF包括三组探针，具体如下表1所示。
表1 GSP BRAF探针
BAC ***片段起止位置
第一探针 RP11-77C17 chr7:140574064-140719922
第二探针 CTD-2333C6 chr7:140537228-140635629
第三探针 CTD-2516J12 chr7:140726316-140940670(包括BRAF基因)
GSP BRAF标记为红色或绿色，当基因完整(未重排)时，红色/或绿色信号保持完整，在细胞核内表现两红色或两绿色信号；当断裂发生时，表现信号断裂，即表现三红或三绿信号，与伙伴基因融合时，检测到融合(黄色)信号。
基因KIAA1549的位置信息为7q34chr7:138,831,381-138,981,318，参见图2。KIAA1549基因编码蛋白，编码蛋白属于UPF0606家族。在许多纤维性星细胞细胞瘤中发现与BRAF基因融合。融合可能与2Mb的7q34区串联重复相关。其断裂位点具多样性，形成不同的转录产物。基因与MAPK信号通路相关。
伙伴基因KIAA1549探针包括KIAA1549探针组，由包括KIAA1549基因在内的延展探针组成，GSP KIAA1549包括四组探针，具体如下表2所示。
表2 GSP KIAA1549探针
GSP KIAA1549 BAC ***片段起止位置(GRCh38/hg38)
第一探针 CTD-2506B12 chr7:138,710,722-138,889,464
第二探针 CTD-2335P8 chr7:138,909,564-138,995,565(包括KIAA1549基因)
第三探针 CTD-2249H15 chr7:138952430-139050079
第四探针 RP11-737E2 chr7:138,953,649-139,144,187
GSP KIAA1549标记为绿色或红色(与GSP BRAF颜色不同)，当基因完整(未重排)时，绿色或红色信号保持完整，在细胞核内表现两绿色或两红色信号；当断裂发生时，表现信号断裂，即表现三绿或三红信号，与BRAF融合时，检测到融合(黄色)信号。
FAM131B的位置信息为：7q34chr7:143,353,400-143,382,304，参见图3。FAM131B(Family With Sequence Similarity 131Member B)是蛋白编码基因，与MAPK信号通路相关。伙伴基因FAM131B探针包括FAM131B探针组，由包括FAM131B基因在内的延展探针组成，GSP FAM131B包括3组探针，具体如下表3所示。
表3 GSP FAM131B探针
GSP FAM131B BAC ***片段起止位置
第一探针 CTD-2315I10 chr7:143,103,903-143,260,760
第二探针 RP11-318O21 chr7:143,292,210-143,468,173(包括FAM131B)
第三探针 CTD-2552L15 chr7:143,464,327-143,881,482
GSP FAM131B标记为绿色或红色(与GSP BRAF颜色不同)，当基因完整(未重排)时，绿色或红色信号保持完整，在细胞核内表现两绿色或两红色信号；当断裂发生时，表现信号断裂，即表现三绿或三红信号，与BRAF融合时，检测到融合(黄色)信号。
基因AKAP9的位置信息为：7q21.2chr7:91,940,867-92,110,673，参见图4。AKAP9(A-Kinase Anchoring Protein 9)编码蛋白是一组在结构上具差异化的蛋白，通常与PKA蛋白激酶A调节亚单位结合，限制细胞内全酶于特定位置。基因编码AKAP家族成员，基因具多种断裂位点，形成至少两种亚型，与许多信号通路蛋白相互作用。GSP AKAP9包括3组探针，具体如下表4所示。
表4 GSP AKAP9探针
GSP AKAP9 BAC ***片段起止位置
第一探针 CTD-3127L24 chr7:91,855,940-92,006,135
第二探针 CTD-2260N24 chr7:91,943,675-92,058,834(包括AKAP9)
第三探针 CTD-2203H22 chr7:92,097,746-92,203,250
GSP AKAP9标记为绿色或红色(与GSP BRAF颜色不同)，当基因完整(未重排)时，绿色或红色信号保持完整，在细胞核内表现两绿色或两红色信号；当断裂发生时，表现信号断裂，即表现三绿或三红信号，与BRAF融合时，检测到融合(黄色)信号。
基因SRGAP3的位置信息为：3p25.3chr3:8,980,591-9,363,053，参见图5。SRGAP3(SLIT-ROBO Rho GTPase Activating Protein 3)是蛋白编码基因，与星形细胞瘤和染色体3pter-p25缺失综合征相关。GSP SRGAP3包括3组探针，具体如下表5所示。
表5 GSP SRGAP3探针
BAC ***片段起止位置
第一探针 CTC-300K6 chr3:8,903,110-8,993,737
第二探针 CTD-2210F19 chr3:9,081,462-9,233,647(包括SRGAP3)
第三探针 CTD-2593M19 chr3:9,227,240-9,386,205
GSP SRGAP3标记为绿色或红色(与GSP BRAF颜色不同)，当基因完整(未重排)时，绿色或红色信号保持完整，在细胞核内表现两绿色或两红色信号；当断裂发生时，表现信号断裂，即表现三绿或三红信号，与BRAF融合时，检测到融合(黄色)信号。需要说明的是，本发明中探针对应的BAC克隆选择包括但不限于列举上述表格中的一种组合方式，根据需要还可以选择其它的克隆组合。
(2)探针标记
使用市售商品化质粒提取试剂盒进行克隆质粒DNA提取，DNA定量后，-20℃密封保存。针对同一种基因的质粒DNA所标记的荧光素相同，针对BRAF基因和针对伙伴基因(KIAA1549、SRGAP3、FAM131B、AKAP9)的检测探针标记的荧光素的颜色不相同。荧光素为FITC和Rhodamine。
探针标记的技术路线为：标记方法/物料(使用phi29 DNA聚合酶标记)→参数优化→标记→定量(#探针的点样量、长度都会影响杂交效果)→包装/待用。
探针标记的具体步骤包括：
以BAC克隆为基础模板，使用phi29 DNA聚合酶，利用随机六聚体引物，常温下扩增。基因探针的标记利用phi29 DNA聚合酶进行常温标记。phi29 DNA聚合酶是从噬菌体phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶。具有3'→5'外切酶校读能力，并且具有特殊的多重置换和连续合成特性；因其等温扩增的特点，操作上更加便利，标记中使用短的随机六聚体引物进行扩增，扩增温度30℃，扩增时间为12小时。
实施例2探针标记体系参数优化
(1)荧光素-dCTP与荧光素-dUTP的混合物比例优化
为了提高荧光素掺入效率，除使用常规的修饰dUTP外，探索了其它荧光素-dNTPs不同比例(参见表6，其中质粒选择BRAF基因探针组)的掺入效果，结果(参见表7)表明，荧光素-dCTP与荧光素-dUTP的混合物(比例1:2～1:3)标记效果最佳，荧光信号明亮，特异性佳。
表6 溶液I
随机六聚体引物含有6个碱基的随机序列，5`末端带有磷酸基，3`末端为羟基，序列为5`-P-d(NNNNNN)-3`，N＝G\A\C\T。随机引物的组合形式多，因此，特异性较低，但对于长的或带有二级结构区域模板扩增效果较好。探针标记时，因选择的克隆模板除载体序列(载体序列为非人基因组)外，余序列为靶区域特异互补区段。标记过程需在扩增中合成带荧光标记序列。为提高扩增效率，分别使用了随机六聚体引物、随机八聚体引物、随机十聚体引物进行测试，结果显示随机六聚体引物的扩增效果最佳，产率最高。
然后在上述溶液I中依次加入10×Reaction bμffer 2μL、phi29 DNA聚合酶(10U/μL)6.0μL、Tween20 1μL、H2O补足20μL。配完后混匀，30℃标记16小时，65℃10分钟灭活酶。取20μL标记产物加入1.5mL离心管，然后依次加入3mol/L醋酸钠2μl和无水乙醇50μl，混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，去上清；加入500μl的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，去上清，避光干燥。使用100μL纯化水溶解沉淀。将溶解后的产物置于Covaris M220超声波DNA破碎仪，20℃处理40秒。完成DNA片段化后，取出产物，按照1:1.8比例使用Ampure XP纯化磁珠纯化产物，最后溶于20μL纯化水中，即得标记后的探针。取1μl使用2％琼脂糖凝胶电泳，要求在200bp左右存在弥散带(参见图6)。
结果如表7所示，分析发现，当仅含有修饰dCTP时，标记探针信号不佳；修饰dUTP因结构特殊性，作为标记过程掺入物，能较好的体现探针信号；但在标记体系中适当提高修饰dCTP的比例时(初步结论显示修饰dCTP：修饰dUTP比值在1:2～1:3)，信号亮度会获得改观；对于修饰dXTP的掺入量，也进行了初步研究，当修饰dXTP：未修饰dXTP比值保持大于1时，有利于修饰dXTP的掺入，但当修饰dXTP量过大(U 4:1时)，会引起背景较高。
表7 不同修饰dCTP：修饰dUTP比值下的标记效果
分组 信号 背景 修饰dCTP：修饰dUTP 修饰dXTP：未修饰dXTP
A 2+ 1+ -- (U)1.5:1
B 2+/1+ 1+ -- (U)1:1
C 1+ 1+ -- (C)1.5:1
D 1+/0 1+ -- (C)1:1
E 2+/1+ 1+ 1:1 (C和U)1.5:1
F 2+ 2+ 1:2 (C)1:1.5；(U)4:1
G 3+ 1+ 1:2 (C)1:2.3；(U)1.5:1
H 3+ 1+ 1:3 (C)1:4；(U)1.5:1
I 1+ 2+ 1:1 (C和U)1:1
注：0表示无；1+表示微弱；2+表示中等强度；3+表示高强度或高亮度。
由于G和H标记信号亮度和背景都能够满足要求，继续后续的测试。
(2)phi29 DNA聚合酶用量优化
重复配制H配方，形成如表6所示的溶液I，然后依次加入10×Reaction bμffer2μL、phi29 DNA聚合酶(10U/μL)6μL、Tween20 1μL、H2O补足20μL。按照表8所示的反应体系设置。
表8 不同的探针标记反应体系
配完后混匀，30℃标记16小时，65℃10分钟灭活酶。取20μL标记产物加入1.5mL离心管，然后依次加入3mol/L醋酸钠2μl和无水乙醇50μl，混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，去上清；加入500μl的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，去上清，避光干燥。使用100μL纯化水溶解沉淀。将溶解后的产物置于Covaris M220超声波DNA破碎仪，20℃处理40秒。完成DNA片段化后，取出产物，按照1:1.8比例使用Ampure XP纯化磁珠纯化产物，最后溶于20μL纯化水中，即得标记后的探针。取1μl使用2％琼脂糖凝胶电泳，要求在200bp左右存在弥散带。
根据上述实验步骤所得结果分析发现，phi29 DNA聚合酶(10U/μL)4.0～6.0μL时，信噪比最优。
(3)标记时间优化(4小时、10小时、12小时、16小时和24小时)
重复配制H配方，形成溶液I，然后依次加入10×Reaction bμffer 2μL、phi29 DNA聚合酶(10U/μL)6μL、Tween20 1μL、H2O补足20μL。配完后混匀，30℃分别标记4小时、10小时、12小时、16小时和24小时，其他操作同上。
结果分析发现，30℃分别标记10小时以上，能够符合预期。当标记时间达24小时，背景上升快，影响结果判读。
实施例3探针标记方法比较
探针N系列(切口平移法)通过切口平移方法对质粒DNA混合物进行荧光标记，针对GSP KIAA1549基因探针标记橙色，针对GSP BRAF基因探针标记绿色。采用abbott的NickTranslation Kit，按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。
配完后震荡混匀，在16℃标记12小时，再80℃孵育10分钟灭活酶。对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，去上清；加入1ml的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，去上清，避光干燥。使用2ul纯化水溶解，获得探针。
将探针P系列(phi29 DNA随机引物标记)和探针N系列(切口平移法)探针，结合杂交缓冲液配制杂交体系，分别使用人外周血培养细胞进行杂交检测，评估杂交效果，杂交后镜下阅片，阅片结果如图7所示。探针P系列杂交信号更明亮，背景明显低于探针N系列，表明phi29 DNA聚合酶优于切口平移法，具更好的掺入标记效果。
为了比较常规切口平移方法、商品化标记试剂盒和phi29 DNA聚合酶标记效果的差异，以BRAF基因探针组为例进行样本与探针的杂交，试验方法参考上述内容，统计杂交后的结果图片，如表9所示。
表9 三种标记方法的特点
标记方法 信号 背景 探针区段 成本差异
phi29 DNA聚合酶 3+ 1+ 200bp左右弥散带 ★★★
切口平移方法 2+/3+ 2+ 500bp以下弥散带 ★★★
商品化标记试剂盒 3+ 1+～2+ 100bp～800bp ★★★★★
实施例4探针质控及阈值建立
为了评估实施例1制备的探针组的灵敏度和特异性，采用人外周血培养细胞作为测试样本，进而建立了探针组的检测阈值。为了评估探针组的使用效果，采用了骨髓样本(基质样本来源于临床)。具体的处理步骤如下：
4.1制片
●取骨髓2～3ml(肝素钠抗凝)2000rpm离心5分钟，去大部分上清；
●取1ml细胞加入10ml的0.075M KCl,吹打混匀，静置2分钟；
●37±1℃恒温水浴锅低渗20分钟；
●加卡诺氏固定液1ml，吹打混匀，室温预固定10分钟；
●吹打混匀，2000rpm离心5分钟；
●去上清，沉淀加固定液10ml，吹打混匀，-20℃静置30分钟；
●2000rpm离心5分钟，去上清；
●加入适量固定液重悬细胞，取3μl悬液滴加到干净的载玻片上；
4.2预处理/变性杂交
●将滴好的玻片置于室温2×SSC溶液中浸泡2分钟；
●依次在室温70％、90％、100％的乙醇中浸泡2分钟脱水；然后取出玻片，室温晾干；
●处理好的样本片待用。
●取出包含探针的杂交液，平衡至室温；
●杂交液滴至盖玻片，然后将样本片反转，对齐后轻合。轻压使探针均匀分布，避免产生气泡；
●湿润原位杂交仪湿度条，将玻片置于原位杂交仪上，关闭原位杂交仪盖，设置“Denat&Hyb”程序，变性78±1℃2分钟，杂交37±1℃1～16小时(若无杂交仪，可使用替代仪器，如恒温热台进行变性，电热烘箱/或水浴锅进行杂交，需注意温度准确及保持杂交湿度)。
4.3洗涤复染
●关闭杂交仪电源，取出玻片，去除盖玻片；
●样本片放入72±1℃0.3％NP-40/SSC中2分钟；
●取出，将其放入室温0.1％NP-40/2×SSC中30秒；
●取出，再将其放入室温70％、90％、100％乙醇中各2分钟脱水；
●取出，暗处自然干燥玻片；
●室温，滴加10μlDAPI复染剂，暗处存放，待观察。
检测结果如表10所示，实施例1的探针组特异性100％，灵敏度100％。能够满足检测预期。在骨髓样本的检测中，实施例1的探针组的检测信号明亮。
表10 探针检测结果
中期染色体 骨髓样本
BRAF/KIAA1549 2R2G 2R2G
BRAF/SRGAP3 2R2G 2R2G
BRAF/FAM131B 2R2G 2R2G
BRAF/AKAP9 2R2G 2R2G
其中，R示红色信号；G示绿色信号；2代表单个细胞核内的信号点个数。
计数100个骨髓细胞，分别计算典型异常和正常细胞(正常细胞的探针杂交图参见图8)比例，计算异常细胞平均值，计算标准差，以平均值±3SD作为阈值范围，计算结果如下表11所示。
表11 探针检测阈值
平均值 标准差SD 3±SD
BRAF/KIAA1549 0.95 0.76 3
BRAF/SRGAP3 0.85 0.75 3
BRAF/FAM131B 0.90 0.72 3
BRAF/AKAP9 1.00 0.86 4
实施例5用于检测BRAF相关融合基因的试剂盒
本发明的用于检测BRAF相关融合基因的试剂盒的一种实施例，包括有实施例1制备的BRAF基因和KIAA1549、SRGAP3、FAM131B、AKAP9基因检测探针，用于BRAF/KIAA1549、BRAF/SRGAP3、BRAF/FAM131B、BRAF/AKAP融合基因的检测。
使用GSP KIAA1549、GSP SRGAP3、GSP FAM131B、GSP AKAP9探针(标记为红色)分别结合GSP BRAF(标记为绿色)制备杂交液：BRAF/KIAA1549杂交液、BRAF/SRGAP3杂交液、BRAF/FAM131B杂交液、BRAF/AKAP9杂交液，检测试剂盒包括4管杂交液。组装成品试剂，设定产品操作说明。
试剂盒杂交液的具体配方如下表12所示。
表12 试剂盒杂交液组成
其中，COT Human DNA是胎盘DNA，长度主要为50至300bp，并且富含重复的DNA序列，比如Alu和Kpn家族成员，通常用于阻断非特异性杂交，抑制重复DNA序列；杂交缓冲液(700uL)含有质量百分含量为15％～50％的甲酰胺、硫酸葡聚糖0.2～0.25g/700uL、二甲基亚砜20～30uL/700uL以及2×SSC(柠檬酸钠缓冲液)70uL/700uL。试剂盒成品组装的一种实施例，如下表13所示。
表13 试剂盒成品组装
组分名称 规格/5test 数量
BRAF/KIAA1549杂交液 50μl/管 1管
BRAF/SRGAP3杂交液 50μl/管 1管
BRAF/FAM131B杂交液 50μl/管 1管
BRAF/AKAP9杂交液 50μl/管 1管
说明书 —— 1份
使用人外周血培养细胞验证杂交体系的灵敏度和特异性，分析50个中期染色体，观察探针与靶序列的杂交情况，结果参见图9，可见对应的染色***点应分别被标记为绿色和红色荧光，无染色***点之间的交叉杂交现象，表明本实施例的杂交效率为100％(50/50)。
实施例6实施例1的探针组的临床应用评价
选择20例临床样本进行实施例5的试剂盒的应用评估，使用实施例4建立的阈值进行结果判读。
1、预处理
1.1 室温二甲苯10分钟；
1.2 室温无水乙醇10分钟；
1.3 室温100％乙醇、90％乙醇、70％乙醇各3分钟；
1.4 室温纯化水中3分钟，甩去多余水分；
1.5 纯化水煮片25分钟；
1.6 室温晾干；
1.7 200μl的胃蛋白酶消化5～20分钟；
1.8 室温2×SSC 3分钟；
1.9 室温70％，90％，100％梯度乙醇脱水各2分钟；
1.10 室温晾干。
2、样品和探针同时变性
2.1 加10μl的杂交液到杂交区域，盖上盖玻片，轻压；橡皮胶封片；
2.2 变性82℃5分钟，杂交37℃、2小时。
3、杂交后洗涤及复染
3.1 72±1℃洗液I(1×SSC/0.3％NP-40)10分钟；
3.2 室温洗液II(0.1％NP-40/2×SSC)5分钟；
3.3 室温70％，90％，100％乙醇各2分钟；
3.4 暗处自然干燥玻片；
3.5 滴加DAPI复染剂，待观察。
4、结果分析
选择合适的滤块观察。其中，GSP BRAF探针显示绿色信号；GSP KIAA1549、GSPSRGAP3、GSP FAM131B、GSP AKAP9探针显示红色信号。信号解读模式参考图10所示。
使用实施例1制备的BRAF相关融合基因检测探针，对20份临床样本分别进行检测，具体检测结果见下表14。图11和图12为BRAF/KIAA1549融合探针的检测结果。如图11中所示，检测信号类型为2R2G，表现为正常信号类型，因此，结果判断为BRAF/KIAA1549融合基因检测阴性。图12中，检测信号类型为1R1G2F，相对于正常信号类型2R2G，表现R和G信号融合，因此，结果判断为BRAF/KIAA1549融合基因检测阳性。本次样本验证中未检测到其他融合阳性。
表14 临床样本检测结果
参考文献：
1、Pfister S,Janzarik W G,Remke M,et al.BRAF gene dμplication constitμtes a mechanism of MAPK pathway activation in low-grade astrocytomas[J].TheJoμrnal of clinical investigation,2008,118(5):1739-1749.Rodrigμez F J,Schniederjan M J,Nicolaides T,et al.High rate of concμrrent BRAF-KIAA1549genefμsion and 1p deletion in disseminated oligodendroglioma-like leptomeningealneoplasms(DOLN)[J].Acta neμropathologica,2015,129(4):609；
2、Kim Y H,Nonogμchi N,Paμlμs W,et al.Freqμent BRAF gain in low-gradediffμse gliomas with 1p/19q loss[J].Brain Pathology,2012,22(6):834-840；、
3、Ida C M,Lambert S R,Rodrigμez F J,et al.BRAF alterations are freqμent in cerebellar low-grade astrocytomas with diffμse growth pattern[J].Joμrnal of neμropathology and experimental neμrology,2012,71(7):631-639；
4、H.Cin,C.Meyer,R.Herr,W.G.,et al.PfisterOncogenic FAM131B-BRAF fμsion resμlting from 7q34deletion comprises an alternative mechanism of MAPKpathway activation in pilocytic astrocytoma Acta Neμropathol,121(2011),pp.763-774；
5、Ciampi R,Knaμf J A,Kerler R,et al.Oncogenic AKAP9-BRAF fμsion is anovel mechanism of MAPK pathway activation in thyroid cancer[J].The Joμrnalof clinical investigation,2005,115(1):94-101；
6、Hawkins C E,Walker E,Mohamed N,et al.BRAF-KIAA1549fμsion predictsbetter clinical oμtcome in pediatric low grade astrocytoma[J].Clinical CancerResearch,2011:clincanres.0034.2011。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.用于检测BRAF相关融合基因的探针组，其特征在于，所述探针组包括用于检测BRAF/KIAA1549、BRAF/SRGAP3、BRAF/FAM131B、BRAF/AKAP9融合基因的探针对，所述探针对中一个探针靶向BRAF基因，另一个探针靶向KIAA1549、SRGAP3、FAM131B、AKAP9基因中的一个，所述探针组每一个探针均采用phi29 DNA聚合酶进行探针标记。
2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针组进行探针标记时，采用随机六聚体引物进行扩增。
3.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针组进行探针标记时，扩增温度为30℃，扩增时间为12小时。
4.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述phi29 DNA聚合酶在反应体系中的浓度为3U/uL。
5.用于检测BRAF相关融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～4任一项所述的探针组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括杂交缓冲液，所述杂交缓冲液中包括作为促进剂的二甲基亚砜。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交缓冲液中含有质量百分含量为15％～50％的甲酰胺、硫酸葡聚糖0.2～0.25g/700uL以及二甲基亚砜20～30uL/700uL。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于阻断非特异性杂交的胎盘DNA。
9.权利要求1～4任一项所述的探针组或权利要求5～8任一项所述的试剂盒在制备恶性肿瘤辅助分型或疗效判断的试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤为低级别胶质瘤、胶质母细胞瘤、毛细胞星形细胞瘤、毛粘液样型星形细胞瘤、弥漫性胶质瘤、少突胶质细胞瘤或弥漫性星形细胞瘤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112029832A (zh) * 2020-06-05 2020-12-04 杭州布平生物医药科技有限公司 一种快检测braf-kiaa1549融合突变的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012096325A1 (ja) * 2011-01-12 2012-07-19 アステラス製薬株式会社 新規ｂｒａｆ融合体の検出法
US20160009785A1 (en) * 2012-11-05 2016-01-14 Foundation Medicine, Inc. Novel fusion molecules and uses thereof
CN108138230A (zh) * 2015-07-21 2018-06-08 夸登特健康公司 用于捕获融合基因的锁核酸
CN109234400A (zh) * 2018-11-13 2019-01-18 武汉康录生物技术股份有限公司 一种用于检测kiaa1549-braf融合基因的荧光原位杂交探针及其制备方法和应用
US20190033293A1 (en) * 2016-01-15 2019-01-31 Japanese Foundation For Cancer Research Novel fusions and method for detecting same
CN109439751A (zh) * 2018-11-13 2019-03-08 武汉康录生物技术股份有限公司 一种用于检测kiaa1549-braf融合基因的荧光原位杂交探针试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012096325A1 (ja) * 2011-01-12 2012-07-19 アステラス製薬株式会社 新規ｂｒａｆ融合体の検出法
US20160009785A1 (en) * 2012-11-05 2016-01-14 Foundation Medicine, Inc. Novel fusion molecules and uses thereof
CN108138230A (zh) * 2015-07-21 2018-06-08 夸登特健康公司 用于捕获融合基因的锁核酸
US20190033293A1 (en) * 2016-01-15 2019-01-31 Japanese Foundation For Cancer Research Novel fusions and method for detecting same
CN109234400A (zh) * 2018-11-13 2019-01-18 武汉康录生物技术股份有限公司 一种用于检测kiaa1549-braf融合基因的荧光原位杂交探针及其制备方法和应用
CN109439751A (zh) * 2018-11-13 2019-03-08 武汉康录生物技术股份有限公司 一种用于检测kiaa1549-braf融合基因的荧光原位杂交探针试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMPIREGENOMICS: "KIAA1549/BRAF Break Apart Extended FISH Probe", 《百度》 *
HURIYE CIN等: "Oncogenic FAM131B–BRAF fusion resulting from 7q34 deletion comprises an alternative mechanism of MAPK pathway activation in pilocytic astrocytoma", 《ACTA NEUROPATHOL》 *
J ROOHI等: "An improved method for generating BAC DNA suitable for FISH", 《CYTOGENET GENOME RES.》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112029832A (zh) * 2020-06-05 2020-12-04 杭州布平生物医药科技有限公司 一种快检测braf-kiaa1549融合突变的方法

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