CN110194800B - 一种融合蛋白、细胞外泌体和肿瘤疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO.2所示；本发明还公开了一种细胞外泌体及其应用，其含有上述融合蛋白；本发明中的DC外泌体疫苗负载ASTN2‑PAPPA融合蛋白或其中一段多肽，是一种非细胞性肿瘤疫苗，该DEX疫苗结合了DC疫苗的长处和外泌体的独特优势，作为肿瘤疫苗效果非常显著，可用于肿瘤免疫治疗；另外，ASTN2‑PAPPA是一个全新的融合RNA翻译成的编码蛋白质，在食管癌中特异性表达，在食管癌的发生发展中起到关键的作用。

Description

一种融合蛋白、细胞外泌体和肿瘤疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其是一种融合蛋白、细胞外泌体和肿瘤疫苗及其应用。

背景技术

恶性肿瘤发生发展涉及到诸多层面的分子机制。RNA异常剪接是其中的一个关键机制。RNA剪接作为RNA加工过程中高度精准的关键步骤，任何错误都可能导致表达异常乃至疾病发生。随着深度测序、转录组学和生物信息技术的发展，发现了大量由RNA异常剪接产生的产物：融合RNA和融合蛋白。不同于融合基因，融合RNA的产生不涉及染色体和DNA变化(包括DNA***、扩增、缺失、重排、转位)。但是，融合RNA可以翻译成为融合蛋白；这种融合RNA翻译成的融合蛋白和融合基因产物一样，可成为有效的肿瘤标志物和药物靶点。这方面最有说服力的例子是存在于95％慢性粒细胞白血病中的BCR–ABL融合基因，BCR–ABL不仅成为CML的重要诊断标志物，而且其抑制剂格列卫(Gleevec)把致死率曾经极高的CML的治愈率提高了61％。肿瘤疫苗包括多肽疫苗、核酸疫苗、重组病毒疫苗、细菌疫苗、DC疫苗、DC外泌体(DEX)疫苗等，其原理是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性免疫和体液免疫，激活免疫细胞对肿瘤的特异性杀伤作用。

树突状细胞(DC)由于其强大的抗原提呈作用，被用于负载肿瘤抗原，制备细胞性疫苗，也被证实能有效地诱导抗原特异性免疫应答，如Provenge是最早被批准上市的针对***癌的DC疫苗。DEX疫苗作为非细胞疫苗，其组成明确，结构稳定，安全性高，可长期冷冻保存，可按照GMP批量生产，克服了DC细胞疫苗的诸多缺点，在肿瘤免疫治疗方面更有优越性。

针对***癌的DC疫苗Provenge是最先批准上市的肿瘤治疗疫苗。然而DC细胞仍存在着增殖数量有限，质量控制复杂，来源受限，生产和保存活细胞疫苗的技术难度大，成本高等问题，限制了其临床效果和应用。所以需要新的形式的疫苗能够克服突破上述困难，以便更好地发挥肿瘤免疫的作用，并推广到临床。另外，目前食管癌没有相应的肿瘤疫苗。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种针对食管癌的疫苗。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括如下几个方面：

作为本发明的第一个方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或所述融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO.2所示。需要说明的是，该融合蛋白(以下也称作ASTN2-PAPPA)是本申请的发明人新发现的，由RNA异常剪接产生的融合RNA翻译成的融合蛋白产物，在食管鳞癌组织中特异性高表达，发明人以此为抗原制作树突状细胞(DC)外泌体肿瘤疫苗；此处的编码序列指ASTN2-PAPPA融合蛋白的cDNA序列。

作为本发明的另一个方面，本发明提供一种细胞外泌体，所述外泌体中含有上述融合蛋白。应当说明的是，外泌体中可以但不限于含有融合蛋白，还可以含有表达所述融合蛋白的RNA。

作为本发明的另一个方面，本发明提供一种细胞外泌体，所述外泌体中含有上述的融合蛋白中至少一段多肽。应当说明的是，所述外泌体中可以含有所述融合蛋白中一段多肽，也可以是2段多肽或三段多肽，甚至更多段多肽，其中多肽的长度优选8～14个氨基酸；多肽长度最优选9或10个氨基酸。

优选地，所述细胞为树突状细胞(DC细胞)。应当说明的是，所述细胞可以是但不限于树突状细胞，还可以是其它能分泌外泌体的真核细胞；DC细胞和其它真核细胞一样可以分泌外泌体，DC分泌的外泌体(DEXs)高表达MHC分子和共刺激分子等，使其具有免疫活性，DEX表面的MHC-抗原肽复合物直接结合T细胞的T细胞受体(TCR)，再协同第二刺激信号，可以活化初始T细胞，促进T细胞增殖，激活细胞毒性T细胞的抗肿瘤免疫应答。DEX疫苗还能通过交叉呈递抗原到其他DC细胞，从而产生免疫放大作用。DEX疫苗作为非细胞疫苗，其组成明确，结构稳定，安全性高，可长期冷冻保存，可按照GMP批量生产，克服了DC细胞疫苗的诸多缺点，在肿瘤治疗方面更有优越性。此外DEX疫苗负载抗原可以进一步提高疫苗引发的抗肿瘤免疫应答的特异性免疫反应。

优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。

更优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.8所示。

作为本发明的另一个方面，本发明提供一种肿瘤疫苗，所述疫苗包含上述的外泌体。

作为本发明的另一个方面，本发明还提供上述的融合蛋白、外泌体或疫苗在制备治疗癌症的药物中的应用。

作为本发明的另一个方面，本发明还提供一种治疗癌症的药物，所述药物含有上述的外泌体或疫苗。

优选地，所述癌症为食管癌。应当说明的是，上述药物可以治疗的癌症包括但不限于食管癌，还可以是其它癌症，只要该癌症的癌细胞中表达上述融合蛋白，尤其是高表达上述融合蛋白的癌症。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明中的DC外泌体疫苗负载ASTN2-PAPPA融合蛋白或其中一段多肽，是一种非细胞性肿瘤疫苗，该DEX疫苗结合了DC疫苗的长处和外泌体的独特优势，作为肿瘤疫苗效果非常显著，可用于肿瘤免疫治疗；

另外，ASTN2-PAPPA是一个全新的融合RNA翻译成的编码蛋白质，在食管癌中特异高表达，在食管癌的发生发展中起到关键的作用，因此，本申请的发明人选择其作为食管癌的特异性抗原，用于制备疫苗。

附图说明

图1为IFNγ检测结果，其中，peptide表示多肽；

图2为流式细胞仪的检测结果，其中，cytotoxicity表示细胞毒性；

图3为外泌体鉴定结果，其中图A为检测外泌体标志物CD9和TSG101的结果，图B为透射电镜观察并拍摄外泌体形态结构的结果；

图4为IFNγ检测结果；

图5为流式细胞仪的检测结果。

具体实施方式

本发明以融合RNA翻译的融和蛋白作为肿瘤疫苗的抗原，以外泌体负载抗原作为非细胞性肿瘤疫苗，提供了一种针对食管鳞癌的特异性外泌体肿瘤疫苗。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 ASTN2-PAPPA融合蛋白的发现

实验方法：收集肿瘤病人的病理组织样本，通过高通量测序技术，发现在恶性肿瘤中，ASTN2基因(ID：23245)和PAPPA基因(ID：5069)发生了融合，形成了新的融合蛋白ASTN2-PAPPA，并确定了发生融合的部位及其序列。

(1)融合蛋白ASTN2-PAPPA的核苷酸序列如下所示：

GATTGATCTACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGGGATCATGGCCGCCGCCGGCGCCCGGCTCAGCCCCGGCCCCGGCTCGGGGCTCCGGGGGCGGCCGAGGCTCTGCTTCCACCCGGGGCCGCCGCCACTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGTTCCTGCTCCTGCTGCCGCCGCCGCCGCTGCTGGCCGGCGCCACCGCCGCTGCCTCGCGGGAGCCCGACAGCCCGTGCCGGCTGAAGACCGTCACGGTGTCCACACTGCCCGCCCTGCGGGAGAGCGACATCGGCTGGAGCGGCGCCCGCGCCGGGGCCGGGGCTGGGACCGGGGCCGGAGCCGCCGCCGCCGCCGCGTCCCCGGGCTCTCCTGGCTCTGCCGGCACCGCCGCCGAGTCGCGCCTCCTGCTCTTTGTGCGTAACGAGCTGCCGGGGCGCATCGCGGTGCAGGACGACCTGGACAACACCGAGCTGCCCTTCTTCACCCTGGAGATGTCTGGCACAGCGGCGGACATCTCGCTGGTGCACTGGAGACAGCAGTGGCTGGAGAATGGCACCTTGTACTTCCACGTCTCCATGAGCAGCTCCGGGCAGCTGGCCCAAGCCACCGCCCCCACTCTCCAGGAGCCCTCGGAGATTGTTGAGGAGCAGATGCACATCCTCCACATTTCTGTGATGGGTGGCCTCATCGCGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGTGTTCACCGTGGCGCTGTACGCCCAGCGACGTTGGCAGAAGCGTCGCCGCATCCCCCAGAAGAGCGCAAGCACAGAAGCCACTCATGAGATCCACTACATCCCATCTGTGCTGCTGGGTCCCCAGGCGCGGGAGAGCTTCCGTTCATCCCGGCTGCAAACCCACAATTCCGTCATTGGCGTGCCCATCCGGGAGACTCCCATCCTGGATGACTATGACTGTGAGGAGGATGAGGAGCCACCTAGGCGGGCCAACCATGTCTCCCGCGAGGACGAGTTTGGCAGCCAGGTGACCCACACTCTGGACAGTCTGGGACATCCAGGGGAAGAGAAGGTGGACTTTGAGAAGAAAGCAGCAGCTGAGGCGACTCAGGAGACAGTGGAGTCCCTGATGCAGAAGTTCAAGGAGAGTTTCCGCGCTAACACGCCCATCGAGATCGGTCAGCTGCAACCACCCCTGCGCAGCACATCGGCAGGGAAGAGGAAGCGGAGGAGCAAGTCTCGAGGAGGAATCAGCTTTGGGAGAGCCAAGGGGACGTCGGGCTCAGAGGCAGACGATGAAACTCAGCTGACATTCTACACGGAGCAGTACCGCAGTCGCCGCCGCAGCAAAGGTTTGCTGAAAAGCCCAGTGAACAAGACAGCCCTGACACTGATTGCTGTGAGTTCCTGCATCCTGGCCATGGTGTGTGGCAGCCAGATGTCTTGTCCACTCACTGTGAAGGTGACTCTGCATGTGCCCGAGCACTTCATAGCAGATGGAAGCAGCTTCGTGGTGAGTGAAGGGAGCTACCTGGACATCTCCGACTGGTTAAACCCAGCCAAGCTTTCCCTGTATTACCAGATCAATGCCACCTCCCCATGGGTGAGGGACCTCTGTGGACAAAGGACGACAGATGCCTGTGAGCAGCTCTGCGACCCAGAAACCGGAGAGTGCAGCTGTCATGAAGGCTATGCCCCTGACCCTGTTCACAGACACCTGTGTGTGCGCAGTGACTGGGGACAGAGTGAAGGACCTTGGCCCTACACGACACTTGAGAGGGGCTATGATCTGGTGACAGGGGAGCAAGCCCCTGAAAAGATTCTCAGGTCTACTTTCAGCTTGGGCCAAGGCCTCTGGCTTCCTGTCAGCAAAAGCTTTGTGGTTCCGCCTGTGGAGCTGTCCATCAACCCCCTGGCCAGCTGCAAGACCGATGTGCTCGTCACGGAAGACCCTGCAGATGTCAGGGAAGAAGCGATGCTGTCCACATACTTTGAAACCATCAATGACCTGCTGTCTTCCTTCGGGCCAGTTCGTGACTGCTCTCGGAACAATGGGGGCTGCACTCGCAACTTCAAGTGTGTGTCTGACCGGCAGGTGGATTCCTCGGGATGTGTGTGCCCTGAGGAGCTGAAACCCATGAAGGATGGCTCTGGCTGCTACGACCACTCCAAAGGCATTGACTGCTCTGATGGCTTTAATGGCGGCTGTGAGCAGCTGTGCCTGCAGCAGACGCTGCCCCTGCCCTACGATGCCACTTCGAGCACCATCTTCATGTTCTGCGGTTGCGTGGAGGAGTACAAACTGGCTCCTGATGGAAAATCCTGCTTAATGCTCTCAGATGTCTGCGAGGGCCCCAAGTGCCTCAAACCTGACTCCAAATTCAATGATACCCTCTTTGGAGAGATGCTACATGGTTACAACAACCGGACCCAGCATGTGAACCAAGGCCAAGTCTTCCAGATGACCTTTAGGGAGAACAACTTCATCAAGGACTTTCCCCAGCTGGCCGATGGGCTGTTGGTGATCCCGCTGCCGGTGGAGGAGCAGTGCCGGGGGGTCCTCTCCGAGCCCCTTCCGGACCTCCAACTGCTCACTGGAGATATCAGGTATGATGAGGCCATGGGTTACCCCATGGTGCAGCAGTGGCGGGTCCGGAGCAACCTCTACCGTGTGAAGCTCAGCACCATCACCCTCGCAGCAGGCTTCACTAATGTTCTCAAGATTCTGACCAAGGAGAGCAGTCGGGAGGAGCTGCTGTCCTTCATCCAGCACTATGGCTCCCACTACATCGCAGAGGCCCTCTATGGCTCAGAGCTCACCTGCATCATCCACTTTCCCAGCAAGAAGGTCCAGCAGCAGCTGTGGCTCCAGTATCAGAAAGAGACCACAGAGCTGGGCAGCAAGAAGGAGCTCAAGTCCATGCCCTTCATCACCTACCTCTCAGGTTTGCTGACAGCCCAGATGCTGTCAGATGACCAGCTCATTTCAGGTGTGGAGATTCGCTGTGAGGAGAAGGGGCGCTGTCCATCTACCTGTCACCTTTGCCGCCGGCCAGGCAAGGAGCAGCTGAGCCCCACACCAGTGCTGCTGGAAATCAACCGTGTGGTGCCACTTTATACCCTCATCCAAGACAATGGCACAAAGGAGGCCTTCAAGAGTGCACTGATGAGTTCCTACTGGTGCTCAGGGAAAGGGGATGTGATCGATGACTGGTGCAGGTGTGACCTCAGCGCCTTTGATGCCAATGGGCTCCCCAACTGCAGCCCCCTTCTGCAGCCGGTGCTGCGGCTGTCCCCAACAGTGGAGCCCTCCAGTACTGTGGTCTCCTTGGAGTGGGTGGATGTTCAGCCAGCTATTGGGACCAAGGTCTCCGACTATATTCTGCAGCATAAGAAAGTGGATGAATACACAGACACTGACCTGTACACAGGAGGATTCCTGAGTTTTGCTGATGACTTACTCTCTGGCCTGGGCACATCTTGTGTAGCAGCTGGTCGAAGCCATGGAGAGGTCCCTGAAGTCAGTATCTACTCAGTCATCTTCAAGTGTCTGGAGCCCGACGGTCTCTACAAGTTCACTCTGTATGCTGTGGATACACGAGGGAGGCACTCAGAGCTAAGCACGGTGACCCTGAGGACGGCCTGTCCACTGGTAGATGACAACAAGGCAGAAGAAATAGCTGACAAGATCTACAATCTGTACAATGGGTACACAAGTGGAAAGGAGCAGCAGATGGCCTACAACACACTGATGGAGGTCTCAGCCTCGATGCTGTTCCGAGTCCAGCACCACTACAACTCTCACTATGAAAAGTTTGGCGACTTCGTCTGGAGAAGTGAGGATGAGCTGGGGCCCAGGAAGGCCCACCTGATTCTACGGCGACTGGAGAGGGTGAGTAGCCACTGCTCCAGCCTCCTGCGGAGTGCCTACATCCAGAGCCGCGTGGAAACAGTGCCCTATCTTTTCTGCCGCAGCGAGGAGGTCCGGCCTGCAGGCATGGTGTGGTATAGCATCCTCAAGGACACCAAAATCACGTGTGAGGAGAAGATGGTGTCAATGGCCCGAAACACGTACGGGGAGTCCAAGGGCCGG*AGCCAGTGTCCTGGGCTAAACACAAGAGTGCTGATTCCCACTGTAAGTTACAGTGAAGAACTTCTGCTATCTGAGGGCATGTGTTTTCATCTTCAAAAAAGGATGGACAGTCCCCATGAACCTTCCCTCTCCAACCACACAGGCCTTGCTTCTGGACATGCAGTGATAACTCTCTGTTTGCTGGATGAAGATCATGTTGGCTCTATGCACATTCAGATAACCTTCTACACCAGACACCCCTGGTGACTAGAGGGCCCTATTCTATAGTTCACCTAAA(SEQ ID NO.2)

其中，*标记为发生融合的位点。

(2)融合蛋白ASTN2-PAPPA的氨基酸序列

MAAAGARLSPGPGSGLRGRPRLCFHPGPPPLLPLLLLFLLLLPPPPLLAGATAAASREPDSPCRLKTVTVSTLPALRESDIGWSGARAGAGAGTGAGAAAAAASPGSPGSAGTAAESRLLLFVRNELPGRIAVQDDLDNTELPFFTLEMSGTAADISLVHWRQQWLENGTLYFHVSMSSSGQLAQATAPTLQEPSEIVEEQMHILHISVMGGLIALLLLLLVFTVALYAQRRWQKRRRIPQKSASTEATHEIHYIPSVLLGPQARESFRSSRLQTHNSVIGVPIRETPILDDYDCEEDEEPPRRANHVSREDEFGSQVTHTLDSLGHPGEEKVDFEKKAAAEATQETVESLMQKFKESFRANTPIEIGQLQPPLRSTSAGKRKRRSKSRGGISFGRAKGTSGSEADDETQLTFYTEQYRSRRRSKGLLKSPVNKTALTLIAVSSCILAMVCGSQMSCPLTVKVTLHVPEHFIADGSSFVVSEGSYLDISDWLNPAKLSLYYQINATSPWVRDLCGQRTTDACEQLCDPETGECSCHEGYAPDPVHRHLCVRSDWGQSEGPWPYTTLERGYDLVTGEQAPEKILRSTFSLGQGLWLPVSKSFVVPPVELSINPLASCKTDVLVTEDPADVREEAMLSTYFETINDLLSSFGPVRDCSRNNGGCTRNFKCVSDRQVDSSGCVCPEELKPMKDGSGCYDHSKGIDCSDGFNGGCEQLCLQQTLPLPYDATSSTIFMFCGCVEEYKLAPDGKSCLMLSDVCEGPKCLKPDSKFNDTLFGEMLHGYNNRTQHVNQGQVFQMTFRENNFIKDFPQLADGLLVIPLPVEEQCRGVLSEPLPDLQLLTGDIRYDEAMGYPMVQQWRVRSNLYRVKLSTITLAAGFTNVLKILTKESSREELLSFIQHYGSHYIAEALYGSELTCIIHFPSKKVQQQLWLQYQKETTELGSKKELKSMPFITYLSGLLTAQMLSDDQLISGVEIRCEEKGRCPSTCHLCRRPGKEQLSPTPVLLEINRVVPLYTLIQDNGTKEAFKSALMSSYWCSGKGDVIDDWCRCDLSAFDANGLPNCSPLLQPVLRLSPTVEPSSTVVSLEWVDVQPAIGTKVSDYILQHKKVDEYTDTDLYTGGFLSFADDLLSGLGTSCVAAGRSHGEVPEVSIYSVIFKCLEPDGLYKFTLYAVDTRGRHSELSTVTLRTACPLVDDNKAEEIADKIYNLYNGYTSGKEQQMAYNTLMEVSASMLFRVQHHYNSHYEKFGDFVWRSEDELGPRKAHLILRRLERVSSHCSSLLRSAYIQSRVETVPYLFCRSEEVRPAGMVWYSILKDTKITCEEKMVSMARNTYGESKGR*SQCPGLNTRVLIPTVSYSEELLLSEGMCFHLQKRMDSPHEPSLSNHTGLASGHAVITLCLLDEDHVGSMHIQITFYTRHPW(SEQ ID NO.1)

其中，*标记为发生融合的位点。

实施例2抗原肽序列的确定

通过生物信息学预测分析得出实施例1的ASTN2-PAPPA蛋白上7个可能介导T细胞特异性免疫应答的多肽，如下表1所示。

表1.NetMHCpan 4.0服务器预测的HLA结合的多肽

*使用NetMHCpan 4.0服务器估算结合分数(http：//www.cbs.dtu.dk/services/ NetMHCpan/)。

其中，HLA(human leukocyte antigen)代表人类白细胞抗原。

实施例3 ASTN2-PAPPA是开发特异性食管鳞癌疫苗的有效新抗原

1、制备ASTN2-PAPPA多肽并免疫小鼠：取实施例2的7条抗原多肽(武汉爱博泰公司合成)100ug，以vesiculo-stomatitis virusnucleoprotein，VSV-NP52-59为阴性对照，tyrosinaserelatedprotein 2，Trp2180-188为阳性对照(VSV-NP52-59和Trp2180-188均从市场上购买)，与50ug poly(I：C)(InvivoGen，USA)溶于PBS，使总体积为200ul，注射于C57BL/6(H-2b)小鼠(6-8周雌性)背部皮下，7天后以同样方法再次免疫，12天后断颈处死小鼠并进行分离脾脏T细胞等后续处理。

2、提取小鼠脾脏淋巴细胞：眼球取血后断颈处死小鼠，无菌条件下取出小鼠脾脏，浸泡在无血清的RPMI 1640培养基中，在200目筛网上轻柔并充分研磨脾脏，将脾细胞悬液转至15ml离心管，1000rpm离心10min，弃上清，加入3ml红细胞裂解液(北京索莱宝公司)混匀并裂解5min，1000rpm离心10min，弃上清并用10ml培养基重悬(重复3次)，最后用5ml培养基重悬淋巴细胞。

3、检测小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFNγ：取经免疫小鼠脾脏分离的淋巴细胞，分别用相应用多肽(实施例2的7条多肽)刺激72h，收集上清液，根据试剂盒说明书进行IFNγ(R&Dsystems,USA)检测，结果如图1所示。

4、检测小鼠脾脏淋巴细胞肿瘤杀伤能力：取稳定表达ASTN2-PAPPA的小鼠食管鳞癌细胞为靶细胞(target cells，T)，CFSE染色标记，经免疫小鼠脾脏分离的淋巴细胞为效应细胞(effector cells,E)，以E：T＝10：1共培养5h，收集细胞，用PI(Propidium Iodide,Sigma,USA)孵育5min，流式细胞仪检测，CFSE和PI双阳性细胞即为效应细胞杀伤的肿瘤细胞，结果如图2所示。

以上结果显示3号多肽和6号多肽有效激活了T细胞，并增强了其对肿瘤细胞的杀伤力。

实施例4 ASTN2-PAPPA用于开发食管鳞癌DC外泌体疫苗

1、收集、提取DC外泌体并鉴定和定量：小鼠来源DC细胞系(DC2.4,H-2b,购自上海赛齐生物)与多肽(20ug/ml)(以vesiculo-stomatitis virus nucleoprotein,VSV-NP52-59为阴性对照；tyrosinaserelatedprotein 2,Trp2180-188为阳性对照)共培养，收集并提取外泌体(Dex)，以40ugDex溶于PBS，使总体积为200ul，注射于C57BL/6(H-2b)小鼠(6-8周雌性)背部皮下，7天后以同样方法再次免疫，14天后以同样方法再次免疫，24天后断颈处死小鼠并进行分离脾脏T细胞等后续处理。

收集DC细胞培养基上清，用0.22um滤膜(Millex,Germany)过滤除菌，再用100nm的超滤离心管(millipore,USA)3000g/min离心30min。将离心所得血清或细胞上清移至1.5mL的EP管中，约450-500uL澄清上清，按63/250的比例加入适量的ExoQuickTM外泌体沉淀溶液(systembio,USA)混匀，室温静置30分钟。2000g/min离心30min，小心去除上清，再次3000g/min离心5min，小心去除上清，底部所得沉淀即为外泌体，用适量1×PBS重悬。透射电镜观察并拍摄外泌体形态结构：取10uL外泌体重悬液小心加载到电镜制样专用铜网上，室温静置5min。接下来，用2％多聚甲醛固定(室温5分钟)，并用PBS洗三遍。用滤纸小心在边缘吸去多余液体，滴加2％的醋酸双氧铀，1min后滴加0.8％醋酸双氧铀与0.13％甲基纤维素的混合液。用滤纸小心在边缘吸去多余液体，自然风干后在透射电镜(JEM-1400,Hitachi,Shiga,Japan)下观察并拍摄。WB检测外泌体标志物：外泌体重悬液加入适量RIPA缓冲液按常规蛋白提取进行。得到的蛋白裂解液用CD9抗体(Cat.sc-9148；Santa Cruz Biotechnology,USA)和TSG101抗体(Cat.Ab133586；Abcam,U.K)进行WB。外泌体定量：使用BCA法(ThermoFisher Scientific,USA)对外泌体蛋白进行定量，结果如图3所示。

2、提取小鼠脾脏淋巴细胞：眼球取血后断颈处死小鼠，无菌条件下取出小鼠脾脏，浸泡在无血清的RPMI 1640培养基中，在200目筛网上轻柔并充分研磨脾脏，将脾细胞悬液转至15ml离心管，1000rpm离心10min，弃上清，加入3ml红细胞裂解液(北京索莱宝公司)混匀并裂解5min，1000rpm离心10min，弃上清并用10ml培养基重悬(重复3次)，最后用5ml培养基重悬淋巴细胞。

3、检测小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFNγ：取经免疫小鼠脾脏分离的淋巴细胞，分别用相应多肽(实施例2的3号和6号多肽)或已负载多肽的Dex刺激72h，收集上清液，根据试剂盒说明书进行IFNγ(R&D systems,USA)检测，结果如图4所示。

4、检测小鼠脾脏淋巴细胞肿瘤杀伤能力：取稳定表达ASTN2-PAPPA的小鼠食管鳞癌细胞为靶细胞(target cells，T)，CFSE染色标记，经免疫小鼠脾脏分离的淋巴细胞为效应细胞(effector cells,E)，以E：T＝10：1共培养5h，收集细胞，用PI(Propidium Iodide,Sigma,USA)孵育5min，流式细胞仪检测，CFSE和PI双阳性细胞即为效应细胞杀伤的肿瘤细胞，结果如图5所示。

以上结果显示，针对食管癌的最有效果的DEX疫苗(含有实施例2的3号或6号多肽的DC外泌体)制备成功。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 张灏

<120> 一种融合蛋白、细胞外泌体和肿瘤疫苗及其应用

<130> 2018

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1420

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ala Ala Ala Gly Ala Arg Leu Ser Pro Gly Pro Gly Ser Gly Leu

1 5 10 15

Arg Gly Arg Pro Arg Leu Cys Phe His Pro Gly Pro Pro Pro Leu Leu

20 25 30

Pro Leu Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Pro Leu Leu

35 40 45

Ala Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Arg Glu Pro Asp Ser Pro Cys Arg

50 55 60

Leu Lys Thr Val Thr Val Ser Thr Leu Pro Ala Leu Arg Glu Ser Asp

65 70 75 80

Ile Gly Trp Ser Gly Ala Arg Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala

85 90 95

Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Ala Gly

100 105 110

Thr Ala Ala Glu Ser Arg Leu Leu Leu Phe Val Arg Asn Glu Leu Pro

115 120 125

Gly Arg Ile Ala Val Gln Asp Asp Leu Asp Asn Thr Glu Leu Pro Phe

130 135 140

Phe Thr Leu Glu Met Ser Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ser Leu Val His

145 150 155 160

Trp Arg Gln Gln Trp Leu Glu Asn Gly Thr Leu Tyr Phe His Val Ser

165 170 175

Met Ser Ser Ser Gly Gln Leu Ala Gln Ala Thr Ala Pro Thr Leu Gln

180 185 190

Glu Pro Ser Glu Ile Val Glu Glu Gln Met His Ile Leu His Ile Ser

195 200 205

Val Met Gly Gly Leu Ile Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Phe Thr

210 215 220

Val Ala Leu Tyr Ala Gln Arg Arg Trp Gln Lys Arg Arg Arg Ile Pro

225 230 235 240

Gln Lys Ser Ala Ser Thr Glu Ala Thr His Glu Ile His Tyr Ile Pro

245 250 255

Ser Val Leu Leu Gly Pro Gln Ala Arg Glu Ser Phe Arg Ser Ser Arg

260 265 270

Leu Gln Thr His Asn Ser Val Ile Gly Val Pro Ile Arg Glu Thr Pro

275 280 285

Ile Leu Asp Asp Tyr Asp Cys Glu Glu Asp Glu Glu Pro Pro Arg Arg

290 295 300

Ala Asn His Val Ser Arg Glu Asp Glu Phe Gly Ser Gln Val Thr His

305 310 315 320

Thr Leu Asp Ser Leu Gly His Pro Gly Glu Glu Lys Val Asp Phe Glu

325 330 335

Lys Lys Ala Ala Ala Glu Ala Thr Gln Glu Thr Val Glu Ser Leu Met

340 345 350

Gln Lys Phe Lys Glu Ser Phe Arg Ala Asn Thr Pro Ile Glu Ile Gly

355 360 365

Gln Leu Gln Pro Pro Leu Arg Ser Thr Ser Ala Gly Lys Arg Lys Arg

370 375 380

Arg Ser Lys Ser Arg Gly Gly Ile Ser Phe Gly Arg Ala Lys Gly Thr

385 390 395 400

Ser Gly Ser Glu Ala Asp Asp Glu Thr Gln Leu Thr Phe Tyr Thr Glu

405 410 415

Gln Tyr Arg Ser Arg Arg Arg Ser Lys Gly Leu Leu Lys Ser Pro Val

420 425 430

Asn Lys Thr Ala Leu Thr Leu Ile Ala Val Ser Ser Cys Ile Leu Ala

435 440 445

Met Val Cys Gly Ser Gln Met Ser Cys Pro Leu Thr Val Lys Val Thr

450 455 460

Leu His Val Pro Glu His Phe Ile Ala Asp Gly Ser Ser Phe Val Val

465 470 475 480

Ser Glu Gly Ser Tyr Leu Asp Ile Ser Asp Trp Leu Asn Pro Ala Lys

485 490 495

Leu Ser Leu Tyr Tyr Gln Ile Asn Ala Thr Ser Pro Trp Val Arg Asp

500 505 510

Leu Cys Gly Gln Arg Thr Thr Asp Ala Cys Glu Gln Leu Cys Asp Pro

515 520 525

Glu Thr Gly Glu Cys Ser Cys His Glu Gly Tyr Ala Pro Asp Pro Val

530 535 540

His Arg His Leu Cys Val Arg Ser Asp Trp Gly Gln Ser Glu Gly Pro

545 550 555 560

Trp Pro Tyr Thr Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Asp Leu Val Thr Gly Glu

565 570 575

Gln Ala Pro Glu Lys Ile Leu Arg Ser Thr Phe Ser Leu Gly Gln Gly

580 585 590

Leu Trp Leu Pro Val Ser Lys Ser Phe Val Val Pro Pro Val Glu Leu

595 600 605

Ser Ile Asn Pro Leu Ala Ser Cys Lys Thr Asp Val Leu Val Thr Glu

610 615 620

Asp Pro Ala Asp Val Arg Glu Glu Ala Met Leu Ser Thr Tyr Phe Glu

625 630 635 640

Thr Ile Asn Asp Leu Leu Ser Ser Phe Gly Pro Val Arg Asp Cys Ser

645 650 655

Arg Asn Asn Gly Gly Cys Thr Arg Asn Phe Lys Cys Val Ser Asp Arg

660 665 670

Gln Val Asp Ser Ser Gly Cys Val Cys Pro Glu Glu Leu Lys Pro Met

675 680 685

Lys Asp Gly Ser Gly Cys Tyr Asp His Ser Lys Gly Ile Asp Cys Ser

690 695 700

Asp Gly Phe Asn Gly Gly Cys Glu Gln Leu Cys Leu Gln Gln Thr Leu

705 710 715 720

Pro Leu Pro Tyr Asp Ala Thr Ser Ser Thr Ile Phe Met Phe Cys Gly

725 730 735

Cys Val Glu Glu Tyr Lys Leu Ala Pro Asp Gly Lys Ser Cys Leu Met

740 745 750

Leu Ser Asp Val Cys Glu Gly Pro Lys Cys Leu Lys Pro Asp Ser Lys

755 760 765

Phe Asn Asp Thr Leu Phe Gly Glu Met Leu His Gly Tyr Asn Asn Arg

770 775 780

Thr Gln His Val Asn Gln Gly Gln Val Phe Gln Met Thr Phe Arg Glu

785 790 795 800

Asn Asn Phe Ile Lys Asp Phe Pro Gln Leu Ala Asp Gly Leu Leu Val

805 810 815

Ile Pro Leu Pro Val Glu Glu Gln Cys Arg Gly Val Leu Ser Glu Pro

820 825 830

Leu Pro Asp Leu Gln Leu Leu Thr Gly Asp Ile Arg Tyr Asp Glu Ala

835 840 845

Met Gly Tyr Pro Met Val Gln Gln Trp Arg Val Arg Ser Asn Leu Tyr

850 855 860

Arg Val Lys Leu Ser Thr Ile Thr Leu Ala Ala Gly Phe Thr Asn Val

865 870 875 880

Leu Lys Ile Leu Thr Lys Glu Ser Ser Arg Glu Glu Leu Leu Ser Phe

885 890 895

Ile Gln His Tyr Gly Ser His Tyr Ile Ala Glu Ala Leu Tyr Gly Ser

900 905 910

Glu Leu Thr Cys Ile Ile His Phe Pro Ser Lys Lys Val Gln Gln Gln

915 920 925

Leu Trp Leu Gln Tyr Gln Lys Glu Thr Thr Glu Leu Gly Ser Lys Lys

930 935 940

Glu Leu Lys Ser Met Pro Phe Ile Thr Tyr Leu Ser Gly Leu Leu Thr

945 950 955 960

Ala Gln Met Leu Ser Asp Asp Gln Leu Ile Ser Gly Val Glu Ile Arg

965 970 975

Cys Glu Glu Lys Gly Arg Cys Pro Ser Thr Cys His Leu Cys Arg Arg

980 985 990

Pro Gly Lys Glu Gln Leu Ser Pro Thr Pro Val Leu Leu Glu Ile Asn

995 1000 1005

Arg Val Val Pro Leu Tyr Thr Leu Ile Gln Asp Asn Gly Thr Lys

1010 1015 1020

Glu Ala Phe Lys Ser Ala Leu Met Ser Ser Tyr Trp Cys Ser Gly

1025 1030 1035

Lys Gly Asp Val Ile Asp Asp Trp Cys Arg Cys Asp Leu Ser Ala

1040 1045 1050

Phe Asp Ala Asn Gly Leu Pro Asn Cys Ser Pro Leu Leu Gln Pro

1055 1060 1065

Val Leu Arg Leu Ser Pro Thr Val Glu Pro Ser Ser Thr Val Val

1070 1075 1080

Ser Leu Glu Trp Val Asp Val Gln Pro Ala Ile Gly Thr Lys Val

1085 1090 1095

Ser Asp Tyr Ile Leu Gln His Lys Lys Val Asp Glu Tyr Thr Asp

1100 1105 1110

Thr Asp Leu Tyr Thr Gly Gly Phe Leu Ser Phe Ala Asp Asp Leu

1115 1120 1125

Leu Ser Gly Leu Gly Thr Ser Cys Val Ala Ala Gly Arg Ser His

1130 1135 1140

Gly Glu Val Pro Glu Val Ser Ile Tyr Ser Val Ile Phe Lys Cys

1145 1150 1155

Leu Glu Pro Asp Gly Leu Tyr Lys Phe Thr Leu Tyr Ala Val Asp

1160 1165 1170

Thr Arg Gly Arg His Ser Glu Leu Ser Thr Val Thr Leu Arg Thr

1175 1180 1185

Ala Cys Pro Leu Val Asp Asp Asn Lys Ala Glu Glu Ile Ala Asp

1190 1195 1200

Lys Ile Tyr Asn Leu Tyr Asn Gly Tyr Thr Ser Gly Lys Glu Gln

1205 1210 1215

Gln Met Ala Tyr Asn Thr Leu Met Glu Val Ser Ala Ser Met Leu

1220 1225 1230

Phe Arg Val Gln His His Tyr Asn Ser His Tyr Glu Lys Phe Gly

1235 1240 1245

Asp Phe Val Trp Arg Ser Glu Asp Glu Leu Gly Pro Arg Lys Ala

1250 1255 1260

His Leu Ile Leu Arg Arg Leu Glu Arg Val Ser Ser His Cys Ser

1265 1270 1275

Ser Leu Leu Arg Ser Ala Tyr Ile Gln Ser Arg Val Glu Thr Val

1280 1285 1290

Pro Tyr Leu Phe Cys Arg Ser Glu Glu Val Arg Pro Ala Gly Met

1295 1300 1305

Val Trp Tyr Ser Ile Leu Lys Asp Thr Lys Ile Thr Cys Glu Glu

1310 1315 1320

Lys Met Val Ser Met Ala Arg Asn Thr Tyr Gly Glu Ser Lys Gly

1325 1330 1335

Arg Ser Gln Cys Pro Gly Leu Asn Thr Arg Val Leu Ile Pro Thr

1340 1345 1350

Val Ser Tyr Ser Glu Glu Leu Leu Leu Ser Glu Gly Met Cys Phe

1355 1360 1365

His Leu Gln Lys Arg Met Asp Ser Pro His Glu Pro Ser Leu Ser

1370 1375 1380

Asn His Thr Gly Leu Ala Ser Gly His Ala Val Ile Thr Leu Cys

1385 1390 1395

Leu Leu Asp Glu Asp His Val Gly Ser Met His Ile Gln Ile Thr

1400 1405 1410

Phe Tyr Thr Arg His Pro Trp

1415 1420

<210> 2

<211> 4339

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

gattgatcta ccatggacta caaagacgat gacgacaagg ggatcatggc cgccgccggc 60

gcccggctca gccccggccc cggctcgggg ctccgggggc ggccgaggct ctgcttccac 120

ccggggccgc cgccactgct gccgctgctg ctgctgttcc tgctcctgct gccgccgccg 180

ccgctgctgg ccggcgccac cgccgctgcc tcgcgggagc ccgacagccc gtgccggctg 240

aagaccgtca cggtgtccac actgcccgcc ctgcgggaga gcgacatcgg ctggagcggc 300

gcccgcgccg gggccggggc tgggaccggg gccggagccg ccgccgccgc cgcgtccccg 360

ggctctcctg gctctgccgg caccgccgcc gagtcgcgcc tcctgctctt tgtgcgtaac 420

gagctgccgg ggcgcatcgc ggtgcaggac gacctggaca acaccgagct gcccttcttc 480

accctggaga tgtctggcac agcggcggac atctcgctgg tgcactggag acagcagtgg 540

ctggagaatg gcaccttgta cttccacgtc tccatgagca gctccgggca gctggcccaa 600

gccaccgccc ccactctcca ggagccctcg gagattgttg aggagcagat gcacatcctc 660

cacatttctg tgatgggtgg cctcatcgcg ctgctgctgc tgctgctggt gttcaccgtg 720

gcgctgtacg cccagcgacg ttggcagaag cgtcgccgca tcccccagaa gagcgcaagc 780

acagaagcca ctcatgagat ccactacatc ccatctgtgc tgctgggtcc ccaggcgcgg 840

gagagcttcc gttcatcccg gctgcaaacc cacaattccg tcattggcgt gcccatccgg 900

gagactccca tcctggatga ctatgactgt gaggaggatg aggagccacc taggcgggcc 960

aaccatgtct cccgcgagga cgagtttggc agccaggtga cccacactct ggacagtctg 1020

ggacatccag gggaagagaa ggtggacttt gagaagaaag cagcagctga ggcgactcag 1080

gagacagtgg agtccctgat gcagaagttc aaggagagtt tccgcgctaa cacgcccatc 1140

gagatcggtc agctgcaacc acccctgcgc agcacatcgg cagggaagag gaagcggagg 1200

agcaagtctc gaggaggaat cagctttggg agagccaagg ggacgtcggg ctcagaggca 1260

gacgatgaaa ctcagctgac attctacacg gagcagtacc gcagtcgccg ccgcagcaaa 1320

ggtttgctga aaagcccagt gaacaagaca gccctgacac tgattgctgt gagttcctgc 1380

atcctggcca tggtgtgtgg cagccagatg tcttgtccac tcactgtgaa ggtgactctg 1440

catgtgcccg agcacttcat agcagatgga agcagcttcg tggtgagtga agggagctac 1500

ctggacatct ccgactggtt aaacccagcc aagctttccc tgtattacca gatcaatgcc 1560

acctccccat gggtgaggga cctctgtgga caaaggacga cagatgcctg tgagcagctc 1620

tgcgacccag aaaccggaga gtgcagctgt catgaaggct atgcccctga ccctgttcac 1680

agacacctgt gtgtgcgcag tgactgggga cagagtgaag gaccttggcc ctacacgaca 1740

cttgagaggg gctatgatct ggtgacaggg gagcaagccc ctgaaaagat tctcaggtct 1800

actttcagct tgggccaagg cctctggctt cctgtcagca aaagctttgt ggttccgcct 1860

gtggagctgt ccatcaaccc cctggccagc tgcaagaccg atgtgctcgt cacggaagac 1920

cctgcagatg tcagggaaga agcgatgctg tccacatact ttgaaaccat caatgacctg 1980

ctgtcttcct tcgggccagt tcgtgactgc tctcggaaca atgggggctg cactcgcaac 2040

ttcaagtgtg tgtctgaccg gcaggtggat tcctcgggat gtgtgtgccc tgaggagctg 2100

aaacccatga aggatggctc tggctgctac gaccactcca aaggcattga ctgctctgat 2160

ggctttaatg gcggctgtga gcagctgtgc ctgcagcaga cgctgcccct gccctacgat 2220

gccacttcga gcaccatctt catgttctgc ggttgcgtgg aggagtacaa actggctcct 2280

gatggaaaat cctgcttaat gctctcagat gtctgcgagg gccccaagtg cctcaaacct 2340

gactccaaat tcaatgatac cctctttgga gagatgctac atggttacaa caaccggacc 2400

cagcatgtga accaaggcca agtcttccag atgaccttta gggagaacaa cttcatcaag 2460

gactttcccc agctggccga tgggctgttg gtgatcccgc tgccggtgga ggagcagtgc 2520

cggggggtcc tctccgagcc ccttccggac ctccaactgc tcactggaga tatcaggtat 2580

gatgaggcca tgggttaccc catggtgcag cagtggcggg tccggagcaa cctctaccgt 2640

gtgaagctca gcaccatcac cctcgcagca ggcttcacta atgttctcaa gattctgacc 2700

aaggagagca gtcgggagga gctgctgtcc ttcatccagc actatggctc ccactacatc 2760

gcagaggccc tctatggctc agagctcacc tgcatcatcc actttcccag caagaaggtc 2820

cagcagcagc tgtggctcca gtatcagaaa gagaccacag agctgggcag caagaaggag 2880

ctcaagtcca tgcccttcat cacctacctc tcaggtttgc tgacagccca gatgctgtca 2940

gatgaccagc tcatttcagg tgtggagatt cgctgtgagg agaaggggcg ctgtccatct 3000

acctgtcacc tttgccgccg gccaggcaag gagcagctga gccccacacc agtgctgctg 3060

gaaatcaacc gtgtggtgcc actttatacc ctcatccaag acaatggcac aaaggaggcc 3120

ttcaagagtg cactgatgag ttcctactgg tgctcaggga aaggggatgt gatcgatgac 3180

tggtgcaggt gtgacctcag cgcctttgat gccaatgggc tccccaactg cagccccctt 3240

ctgcagccgg tgctgcggct gtccccaaca gtggagccct ccagtactgt ggtctccttg 3300

gagtgggtgg atgttcagcc agctattggg accaaggtct ccgactatat tctgcagcat 3360

aagaaagtgg atgaatacac agacactgac ctgtacacag gaggattcct gagttttgct 3420

gatgacttac tctctggcct gggcacatct tgtgtagcag ctggtcgaag ccatggagag 3480

gtccctgaag tcagtatcta ctcagtcatc ttcaagtgtc tggagcccga cggtctctac 3540

aagttcactc tgtatgctgt ggatacacga gggaggcact cagagctaag cacggtgacc 3600

ctgaggacgg cctgtccact ggtagatgac aacaaggcag aagaaatagc tgacaagatc 3660

tacaatctgt acaatgggta cacaagtgga aaggagcagc agatggccta caacacactg 3720

atggaggtct cagcctcgat gctgttccga gtccagcacc actacaactc tcactatgaa 3780

aagtttggcg acttcgtctg gagaagtgag gatgagctgg ggcccaggaa ggcccacctg 3840

attctacggc gactggagag ggtgagtagc cactgctcca gcctcctgcg gagtgcctac 3900

atccagagcc gcgtggaaac agtgccctat cttttctgcc gcagcgagga ggtccggcct 3960

gcaggcatgg tgtggtatag catcctcaag gacaccaaaa tcacgtgtga ggagaagatg 4020

gtgtcaatgg cccgaaacac gtacggggag tccaagggcc ggagccagtg tcctgggcta 4080

aacacaagag tgctgattcc cactgtaagt tacagtgaag aacttctgct atctgagggc 4140

atgtgttttc atcttcaaaa aaggatggac agtccccatg aaccttccct ctccaaccac 4200

acaggccttg cttctggaca tgcagtgata actctctgtt tgctggatga agatcatgtt 4260

ggctctatgc acattcagat aaccttctac accagacacc cctggtgact agagggccct 4320

attctatagt tcacctaaa 4339

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Glu Pro Ser Leu Ser Asn His Thr Gly Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Thr Gly Leu Ala Ser Gly His Ala Val Ile

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Gly Ser Met His Ile Gln Ile Thr Phe

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Val Ser Tyr Ser Glu Glu Leu Leu Leu

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Ser Gly His Ala Val Ile Thr Leu

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

His Ile Gln Ile Thr Phe Tyr Thr Arg

1 5

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Leu Leu Ser Glu Gly Met Cys Phe His Leu Gln Lys Arg Met

1 5 10

Claims (4)

1.一种细胞外泌体，其特征在于，所述细胞外泌体中含有至少一种多肽；

所述细胞为树突状细胞；

所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.8所示。

2.一种肿瘤疫苗，其特征在于，所述肿瘤疫苗包含权利要求1所述的细胞外泌体。

3.权利要求1所述的细胞外泌体或权利要求2所述的肿瘤疫苗在制备治疗癌症药物中的应用，其特征在于，所述癌症为食管癌。

4.一种治疗癌症的药物，其特征在于，所述药物含有如权利要求1所述的细胞外泌体或权利要求2所述的肿瘤疫苗，所述癌症为食管癌。

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